Elektromigrační metody

Transkript

1 Elektromigrační metody

2 Separační techniky Separace je selektivní převod látek mezi fázemi systému, nebo jejich rozdělení v jedné fázi v určitém směru. Separační techniky Rovnovážné techniky Nerovnovážné techniky Rovnovážné látky jsou převáděny přes fázové rozhraní dostatečně rychle Nerovnovážné látky jsou děleny na základě rozdílných rychlostí transportu GC, LC, PC, SFC, extrakce, spolusrážení, frakční krystalizace, rektifikace, destilace, sublimace Sedimentace, filtrace, ultrafiltrace, centrifugace, elektrostatická depozice, elektrodialýza, FFF, gelová a papírová elektrolýza, separace na molekulových sítech, kapilární elektroforéza Kombinace rovnovážných a nerovnovážných technik Elektrochromatografie, micelární elektrokinetická chromatografie

3 Elektromigrace Pohyb nabitých částic v kapalném prostředí vyvolaný vložením vnějšího stejnosměrného pole. Kapalné prostředí musí být vodivé tj. NE deioinizovaná VODA Elektromigrace = nerovnovážná separační technika Migrace nabitých částic (iontů, iontových asociátů, nabitých komplexů) v elektrickém poli je možná v roztocích elektrolytů, nejčastěji v PUFRECH Použitý elektrolyt, případně pufr = pracovní elektrolyt (background electrolyte, carrier electrolyte) plní podobnou úlohu jako mobilní fáze v kapalinové chromatografii vyplňuje separační lože na jeho složení závisí úspěšná analýza zajišťuje vodivé spojení celého separačního systému.

4 Analytická využitelnost elektromigrace Nabité částice ve stejnosměrném elektrickém poli se pohybují směrem k opačně nabité elektrodě určitou rychlostí, která je pro nabité částice různých látek různá = tj. tento fakt je možné využít k analytickým i preparativním účelům. Vedení elektrického proudu v kapalinách (roztocích elektrolytů) V kovech je vedení elektrického proudu zprostředkováno pohybem elektronů (uniformní částice s velmi malou hmotností). V roztocích elektrolytů je vedení elektrického proudu zprostředkováno všemi přítomnými kationty a anionty, přičemž velikost (hmotnost) těchto částic může nabývat malých hodnot (pro solvatované protony až po velké komplexy proteinů nebo polynukleotidů).

5 Vedení elektrického proudu je u elektrolytů popisována Ohmovým zákonem Katoda U = I.R Konduktivita G = 1/R Kohlrausch vodivost roztoku je dána nezávislou migrací iontů Anoda Při průchodu proudu roztokem elektrolytu migrují anionty směrem k anodě a kationty směrem ke katodě v ekvivalentním moižství nezávisle na sobě. Elektroneutralita roztoku zůstává zachována díky elektrolýze probíhající na obou elektrodách.

6 Na obou elektrodách současně probíhá elektrolýza, jejímž výsledkem je produkce protonů na anodě a produkce hydroxoniových iontů na katodě, což zajišťuje zachování elektroneutrality. Elektrolýzou, ale může dojít ke změně ph pracovního elektrolytu, tzn. s výhodou se využívá pufrů, které tyto změny vyrovnávají a navíc se používají inertní platinové elektrody ve tvaru tenkých drátků, kde dochází k potlačení elektrolýzy (malý povrch elektrody).

7 Instrumentace elektromigračních technik kapilární techniky x plošné techniky Separace probíhá v kapiláře Separace probíhá v gelu nebo papíru (podobně jako PC) Detektor Zdroj napětí + Pufr Jamky pro vzorky Elektrody Gel outlet inlet Pufr

8 Instrumentace elektromigračních technik kapilární techniky x plošné techniky Separace probíhá v kapiláře Separace probíhá v gelu nebo papíru (podobně jako PC)

9 Instrumentace elektromigračních technik kapilární techniky x plošné techniky Separace probíhá v kapiláře Separace probíhá v gelu nebo papíru (podobně jako PC)

10 Plošné i kapilární elektromigrační techniky jsou založeny na stejném principu tj. separace probíhá na základě rozdílných migrací analytů v separačním prostředí, které se ale liší. kapilární Separační prostředí gelová a papírová roztok elektrolytu (pufru) gelové médium + elektrolyt Separace probíhá v kapiláře (i.d. 25 až 100 m). Napětí vkládáné mezi elektrody 0 30 kv). Separace malých iontů i makromolekul. Složitější instrumentace, lepší účinnost separace, snadná detekce, automatizace X papír + elektrolyt gelové médium + elektrolyt Separace probíhá v gelovém prostředí vytvořeném mezi dvěma deskami nebo na papíru Napětí vkládáné mezi elektrody V). Separace pouze makromolekul Jednoduchá instrumentace, nízká účinnost, nutnost off-line detekce

11 Mikroseparační technika Elektroforéza na čipech Lab on chip Využití nanotechnologií Celá separace může proběhnout na chipu s křemíkovými kanálky během několika sekund.

12 Kapilární elektromigrační techniky Kapilární zónová elektroforéza (CZE) Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF) Kapilární gelová elektroforéza (CGE) Kapilární izotachoforéza (CITP) Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) Kapilární elektrochromatografie (CEC) Stejná instrumentace, různé principy separace analytů

13 Katoda Základní popis elektromigrace, rychlost migrace, mobilita Anoda Do tohoto systému vyplněného roztokem elektrolytu nadávkujeme velmi malou zónu vzorku obsahující ionty IR 1 IR 2 U = IR 1 + IR 2 Situace se změní v případ sériově zapojených odporů

14 Separace probíhá po vložení stejnosměrného napětí mezi anodu a katodu. E U L E intenzita elektrického pole U... Napětí vkládané mezi elektrody L celková délka separačního prostředí (celková délka kapiláry) Katoda - L Anoda + l l efektivní délka kapiláry (vzdálenost, kterou analyt urazí při migraci od místa injekce do bodu detekce) Část L l se na separaci nepodílí

15 Rychlost migrace nabité částice vep l t m t = 0, E = F t = t 1, E = E e F f + Po vložení napětí mezi elektrody začnou na nabitou částici působit dvě síly, působící navzájem opačně: elektrická F e odporová, třecí F f

16 Elektrická síla Fe qe U q L Odporová síla F f 6 rv 6 r l t m Mezi rychlostí pohybu a intenzitou elektrického pole je přímá úměrnost v ee e elektroforetická mobilita l t m U e L q 6 r U L tm 6 r Ll qu t m migrační čas

17 Experimentálně měřenou veličinou je migrační čas t m, ze kterého lze vypočítat pouze tzv. zdánlivou mobilitu μ av. NENÍ tedy fyzikální konstantou Výpočet zdánlivé mobility z migračního času Zdánlivá mobilita je vektorovým součtem efektivní mobility a mobility EOF av Ll tmu av ef eof Zbavit se všech omezujících závislostí Limitní (iontová) mobilita lim = f (T) Fyzikální konstanta tabelována

18 1. Měřit při konstantní teplotě Jak na to? 2. Měřit při jednotkové viskozitě (nebo extrapolovat na jednotkovou) 3. Extrapolovat na nulovou iontovou sílu 4. Měřit při 100% disociaci (protonizaci) analytu (a = 1) 5. Eliminovat vliv elektroosmotického toku (změřit mobilitu EOF) Efektivní mobilita definovatelná pro slabé elektrolyty a analyty podléhající vedlejším komplexačním nebo asociačním rovnováhám slabá kyselina HA HA HA HA H + H + HA A - A - solvent (HA) solv (H + ) solv + (A - ph KHA ) solv H A HA a A A HA

19 Migrovat budou pouze ionty A - směrem k anodě, ale protože disociační rovnováha je velmi rychlá, budou se současně k anodě pohybovat neutrální molekuly HA. Rychlost migrace bude, ale závislá na množství disociovaných molekul HA v pracovním elektrolytu (tj. na stupni disociace). Rychlost migrace (efektivní mobilita) je tím větší, čím je větší stupeň disociace a je maximální pro 100% disociaci (protonizaci) ef lim a ef x i i Elektroforetická mobilita = f (T, ph, viskozity, složení a koncentrace elektrolytu, stupně disociace analytu, vedlejší komplexotvorné rovnováhy apod.) Analogicky jako pro slabé kyseliny, lze zavést podobnou úvahu i pro slabé báze. i

20 Praktický důsledek disociačních rovnováh: Pro migraci v elektrickém poli musí být analyt buď ve formě aniontu nebo kationtu. 0 ph 14 Oblast protonizace slabých bazí Oblast disociace slabých kyselin ph < 3 separace kationtů (slabých bazí) ph 3 až 9 separace aniontů i kationtů ph > 9 separace aniontů (slabých kyselin)

21 Sekvenace lidského genomu - využití kapilární elektroforézy Sekvenátor DNA = kapilární elektroforéza s fluorescenční detekcí Pro dosažení výsledků sekvenace v reálném čase se využívá 96 kapilár najednou a dávkování probíhá z mikrotitrační destičky

22 Takto vypadá záznam z detektoru a vyhodnocení probíhá pomocí počítače.

23 Pro elektroforetickou separaci je nutné, aby analyty byly nabité (anionty, kationty, komplexy nebo asociáty s výsledným nenulovým nábojem). Neutrální (a hydrofobní) analyty lze separovat elektroforeticky, pomocí micelární fáze. Všechny elektromigrační metody umožní pouze separaci analytů, ale neumožní detekci, tj. podobně jako u chromatografických metody je nutno zařadit detektor pro detekci separovaných analytů. Kapilární elektromigrační metody On-line detekce Off-line detekce On-line detekce = detekce probíhá na místě před koncem kapiláry (různá celková délka kapiláry a efektivní délka kapiláry) Katoda - l L Anoda + Detekční okénko

24 Separační prostředí v kapilárních technikách Křemenná kapilára vyrobená z taveného křemene (nejčastěji používaná) Teflonová kapilára vyrobená z teflonu Křemenná kapilára nejčastěji 25 až 100 m vnitřní průměr, vnější průměr 375 m. Pro snadnou manipulaci a snadný odvod tepla generovaného průchodem proudu uvnitř kapiláry je kapiláry pokryta polyimidem. Délka v desítkách cm až do 1 m. Pro on-line detekci je někdy nutné odstranit vrstvu polyimidu, tak aby mohl vzniklým detekčním okénkem procházet např. paprsek UV-Vis, nebo fluorescenčního záření. Pro on-line vodivostní detekci není nutné polyimid odstraňovat. V případě teflonové kapiláry není nutné vytvářet detekční okénko (teflon je UV- Vis transparentní).

25 UV-Vis (DAD) detekce Fluorescenční detekce Vodivostní detekce Hmotnostní spektrometrie Ampérometrická detekce Radiometrická detekce Nejčastější typy detekcí Nejčastěji využívané detekce NMR, cirkulární dichroismus, refraktometrie, IR spektrometrie Detekci je nutné zvolit podle typu analytu, podle množství informací, které je možné danou detekcí získat, podle náročnosti instrumentace, ceny apod. Absolutně nejčastěji je CE spojována s UV-Vis (Detektor diodového pole, DAD) detektorem

26 Schématické možnosti spojení CE technik s ostatními separačními a detekčními technikami

27 Detektor diodového pole diode array detector Seskupení několika tisíc fotodiod, které úplně pokrývají vymezený interval vlnových délek. Foton po dopadu na fotodiodu vyvolá fotoelektrický proud. Tento proud vybije kondenzátor, se kterým je dioda spojena. Měří se proud, který je nutný na opětné dobití kondezátoru. Vyhodnocení signálů provádí počítač. DAD detektor umožňuje snímat signál při jedné nebo několika vybraných vlnových délkách a navíc ukládá do paměti absorpční spektrum detekovaného analytu. Podobný výstup má i tzv. CCD detektor (Charge Coupled Device CCD) snímač s nábojovou vazbou. Schéma DAD detektoru 3D záznam (t, A, λ)

28 Typy detekčních technik využívaných v CE detekční metoda detekční limit koncentrační limit výhody / nevýhody n [mol] c [mol.l -1 ], (V=10nl) UV-VIS absorpce univerzální - diodové pole nabízí spektrální informaci Fluorescence citlivý - většinou vyžaduje derivatizaci vzorku Laserem indukovaná fluorescence velmi citlivý - většinou vyžaduje derivatizaci vzorku Amperometrie citlivý - selektivní jen pro elektroaktivní látky - vyžaduje speciální elektroniku a kapilární modifikaci Konduktometrie univerzální - vyžaduje speciální elektroniku a kapilární modifikaci Hmotnostní spektrometrie citlivý a nabízí strukturní informace - interface mezi CE a MS je složitý Nepřímá UV, fluorescence a amperometrie 10 až 100 krát nižší než přímé metody - univerzální - nižší citlivost než u přímých metod Ostatní:: Radioaktivita, tepelná kapacita, refraktometrie, cirkulární dichroismus, Ramanova spektrometrie...

29 Elektroosmotický tok EOF Fyzický tok kapaliny kapilárou, který je vyvolaný vložením stejnosměrného elektrického pole mezi elektrody a je důsledkem vlastností fázového rozhraní mezi pohyblivou (kapalnou) částí a nepohyblivou (vnitřní stěna kapiláry) částí kapiláry. Objem kapiláry = několik l Průtokové rychlosti jsou velmi malé, řádově ve stovkách až tisích nl/min. Elektroosmotický tok zde plní podobnou úlohu jako pumpy v HPLC, ale pro vlastní separaci je někdy výhodné EOF potlačit. Základní výhodou EOF je plošný profil toku kapaliny v kapiláře, který je dán malými vnitřními rozměry kapiláry

30 Plošný profil EOF HPLC, CZE s potlačeným EOF CZE

31 Přibližný model vzniku EOF Kapilára pro separaci je vyrobena z taveného křemene. Na vnitřním povrchu kapiláry jsou situovány tzv. silanolové skupiny 1. Vodné prostředí (pracovní elektrolyt) hydratuje silanolové skupiny, jejich kyselý vodík může v závislosti na ph vodného prostředí disociovat -SiOH + H 2 O -SiO - + H 3 O + 2. Disociací vznikne na vnitřní stěně kapiláry přebytek záporného elektrického náboje, který je okamžitě kompenzován stejně velkým nábojem kationtů přítomných v pracovním elektrolytu. Tyto kationty jsou k záporně nabitým silanovým skupinám silně přitahovány, takže se stanou součástí vnitřní stěny kapiláry a vzniká nepohyblivá Sternova elektrická dvojvrstva. K této nepohyblivé dvojvrstvě jsou přitahovány ionty z volného pracovního elektrolytu v těsné blízkosti dvojvrstvy uvnitř kapiláry, ale tyto již nejsou poutány velkou elektrickou silou a mohou migrovat v elektrickém poli (tvoří tzv. difuzní dvojvrstvu)

32 3. Vložením stejnosměrného elektrického pole mezi elektrody, začnou kationty migrovat směrem ke katodě a zároveň budou odpuzovány od kationtů, které jsou umístěny v nepohyblivé dvojvrstvě. Protože kationty migrují směrem ke katodě i se svými solvatačními (hydratačními obaly) dochází k pohybu celé kapaliny uvnitř kapiláry směrem od anody ke katodě.

33 Důsledky EOF na migraci iontů EOF se pohybuje směrem od anody ke katodě v případě klasické křemenné kapiláry bez modifikace vnitřního povrchu. EOF je silně závislý na ph, složení a koncentraci pracovního elektrolytu, dielektrické konstantě použitého rozpouštědla a viskozitě elektrolytu EOF unáší směrem ke katodě jak kationty, tak neutrální látky tak i anionty a umožňuje tak provést separaci kationtů i aniontů zároveň. Neutrální látky separovány nejsou tvoří společnou zónu. EOF může separaci urychlit příliš rychlý EOF může separaci zhoršit EOF zprostředkovává pohyb nenabitých neionizovaných aditiv pracovního elektrolytu (např. nativní cyklodextriny).

34

35 Vliv proměnných parametrů na EOF Proměnná Důsledek poznámky Elektrické pole úměrná změna EOF - při snížení el. pole se snižuje účinnost a rozdělení - při zvýšení el. pole roste Jouleovo teplo ph pufru EOF klesá při nízkém ph - vhodný pro změnu EOF Iontová síla pufru Teplota Organická aditiva Tenzidy Neutrální hydrofilní polymery Kovalentní pokrytí stěny kapiláry Radiální elektrické pole a vzrůstá při vysokém ph zvýšením koncentrace pufru dochází k stlačení elektrické dvojvrstvy a k poklesu potenciál (pokles EOF) dochází ke změně viskozity (2-3% na 1K) mění potenciál a viskozitu (modifikace EOF), změna solvatace analytu adsorpcí na stěnu kapiláry mění povrchový náboj adsorbuje se na povrch kapiláry, zvyšuje viskozitu změna povrchového náboje v důsledku odstínění vlivu silanolových skupin ovlivnění potenciálu - může měnit náboj nebo strukturu analytu - vysoká iontová síla generuje vysoký proud a Jouleův ohřev - nízká iontová síla může způsobovat adsorpci vzorku - při rozdílné vodivosti pufru a vzorku může docházet k deformaci píků - nízká koncentrace omezuje zakoncentrování - odtud vyplývá nutnost termostatování - experimentálně snadno proveditelné - změna ovlivňuje selektivitu - změna permitivity prostředí - aniontové tenzidy zvyšují EOF (v závislosti na koncentraci) - kationtové tenzidy snižují EOF, nebo dokonce mění jeho směr - mohou významně měnit selektivitu - klesá EOF stíněním povrchového náboje a změnou viskozity - možné mnohé modifikace pokrytí - problematická stabilita, nereprodukovatelnost - obtížná instrumentace

36 Měření mobility EOF Měření EOF probíhá nejčastěji s využitím tzv. EOF markerů 1. Neutrální molekula rozpustná v prostředí pracovního elektrolytu. 2. Neměla by interagovat pokud možno s analyty ani se složkami pracovního elektrolytu. 3. Měla by být snáze detekovatelná. Benzen, mesityloxid (4-methyl-3-penten-2-on), aceton, močovina, krotonaldehyd (2-butenal) = všechny tyto markery jsou použitelné pro UV detekci případně pro vodivostní detekci. Marker migruje stejnou rychlostí jako se kapilárou pohybuje EOF a unáší všechny neutrální látky, proto musí být marker EOF rovněž neutrální. V některých případech postačí jako EOF marker voda obsažená v dávkovaném vzorku která se v UV oblasti projeví jako negativní pík na základní linii Z elektroforegramu se odečte migrační čas EOF markeru a mobilita se vypočítá.

37

38 Hydrodynamické dávkování V t P.d L P. g. h

39 Běžně se v kapilární CE technikách dávkuje řádově v nanolitrech = CE by mohla být poměrně velmi citlivou metodou. ALE: Např. pro on-line UV detekci platí Lambert-Beerův zákon A = e.l.c e. Molární dekadický absorpční koeficient l. Délka optické dráhy c látková koncentrace Sample overloading = v praxi se nastřikuje zóna vzorku ne delší než 1-2% celkové délky kapiláry Pro on-line UV-Vis detekci je délka optické dráhy rovná průměru kapiláry tedy pouze desítky m

40 Spojení CE-MS Citlivá detekční a identifikační technika, univerzální detekce Technické problémy při spojení a rutinních analýzách.

41 Schéma komerčního spojení CE s ortogonálním ESI-MS

42 CE lze on line spojit s MS jako kapalinovou separační techniku s měkkými ionizačními technikami: ESI = ionizace elektrosprejem APCI = chemická ionizace za atmosférického tlaku CE lze off-line spojit s ionizací desorpcí laserem (MALDI ionization) pro analýzu biomakromolekul. CE-ESI, CE-APCI analýza nízkomolekulárních látek a látek se střední molekulovou hmostností (fragmenty peptidů, fragmenty DNA) CE-MALDI analýza vysokomolekulárních látek a látek se střední molekulovou hmostností.

43 Analýza drog CE-ESI-MS

44 Elektroferogram, kvantitativní a kvalitativní analýza Rozlišení, kvantitativně popisuje míru separace dvojice analytů. Čím je rozlišení větší, tím budou od sebe dvě složky lépe separovaný. V praxi se snažíme dosháhnout rozlišení 1,5 nebo většího V CE technikách je separace primárně řízena účinností nikoli selektivitou jak je tomu u chromatografických technik. Postačí tedy velmi malá diference v mobilitách (<0,05% v mnoha případech), pokud máme dostatečně velkou účinnost píků (tj. řádově 10 4 až Rozlišení vyjádřené pomocí mobilit separovaných částic

45 Migrační čas odpovídá kvalitativní charakteristice analytu Plocha (výška) píku odpovídá kvantitativní charakteristice

46 Kvantitativní analýza 1. Metoda kalibrační křivky 2. Metoda interního standardu Metoda kalibrační křivky vyžaduje konstantní nástřik vzorku i standardů. Změří se závislost plochy na koncentraci standardu v koncentračním rozmezí, které je očekáváno ve vzorku. Sestrojí se kalibrační graf a z něho po změření plochy stanovovaného analytu odečteme koncentraci. Metoda interního standardu používá se interní standard (IS) IS = látka, která se určitě ve stanovaném vzorku nevyskytuje a zároveň migruje blízko zóny analytu. IS se přídá jak do kalibračních roztoků tak do vzorku tak, aby jeho koncentrace byla všude stejná. Do kalibrační závislosti se pak vznáší poměr plochy analytu a IS. Metoda IS je přesnější, protože eliminuje chyby při nástřiku

47 Pro kvantitativní analýzu se nástřik provádí téměř výhradně hydrodynamicky. Elektrokinetický nástřik diskriminuje analyty ve vzorku podle jejich klesající mobility, tj. ionty s vyšší pohyblivostí se nadávkují ve vyšším množství oproti iontům méně pohyblivějším. Charakteristiky účinnosti Vycházejí z kolonové chromatografie a z teorie tzv. teoretického patra. Ideální = Gaussovský pík Reálný pík se gaussovskému pouze blíží!

48 Šířka píku při základně Účinnost vyjádřená jako počet TP Vztah pro výpočet N z elektroforegramu

49 Pro CE techniky lze předpokládat, že k rozmytí píků (a tím ke ztrátě účinnosti a separace) dochází pouze díky podélné difúzi. Pak platí: D difúzní koeficient analytu. Toto je ovšem značně idealizovaný popis, který neplatí na reálné systémy = N bude vždy menší než udává tento vztah. Příspěvky všech faktorů ovlivňující rozmytí píků (injekce, teplota, adsorpce, detekce, elektrodisperze)

50 Micelární elektrokinetická chromatografie MEKC Elektromigrační technika umožňující separaci neutrálních (hydrofóbních, nepolárních) látek v elektrickém poli. MEKC může být použitá i pro separaci látek nabitých. Separace probíhá v křemenných kapilárách v pracovním elektrolytu (pufru) s přídavkem tenzidu TENZID látka, která snižuje a ovlivňuje povrchové napětí, mezipovrchové napětí a smáčivost. Molekula tenzidu se vždy skládá z hydrofóbní části (nepolární) a z hydrofilní částí (polární). Hydrofilní část Hydrofóbní část

51 Tenzidy umožňují rozpouštění (solubilizaci) nepolární, hydrofóbních látek, které jsou bez přádavku tenzidů špatně rozpustné ve vodě (polárním rozpuštědle), nebo jsou úplně ve vodě nerozpustné. Aniontové Kationtové Tenzidy Neiontov é Amfoterní

52 Nejpoužívanější tenzidy v MEKC SDS je nejvyužívanější tenzid pro separace neionogenních látek pomocí MEKC

53 CMC kritická micelární koncentrace Koncentrace tenzidu nad, kterou za daných podmínek (T, typ rozpouštědla, iontové síle ) vytvářejí molekuly (monomery) tenzidů v roztoku tzv. nadmolekulární útvary - MICELY Příklad micely aniontového a kationtového tenzidu Hydrofóbní jádro Hydrofilní obal micely Hydrofóbní jádro interaguje s nepolárními (hydrofóbními) látkami, hydrofilní obal interaguje s polárními látkami nebo s ionty opačného znaménka.

54 Agregační číslo N Počet monomerů tenzidu tvořící za daných podmínek strukturu tenzidy (typicky pro iontové tenzidy jsou to řádově desítky molekul). SEPARACE POMOCÍ MEKC se odehrává v pracovních elektrolytech o neutrálním až alkalickém ph (nejčastěji 7 až 9) za přítomnosti silného (rychlého) elektroosmotického toku, který napomáhá separaci uskutečnit.

55 Nenabité látky se elektrickém poli bez přítomnosti tenzidů pohybují stejnou rychlostí jako se pohybuje EOF, ale nedochází k jejich separaci. Použijeme-li nepř. aniontový tenzid (SDS) o koncentraci rovnou jeho CMC nebo vyšší v daném pracovním elektrolytu, můžou nenabité látky interagovat s hydrofóbními jádry micely a budou se tedy pohybovat stejnou rychlostí jako je rychlost pohybu micely a vzájemná separace neutrálních látek je řízena rozdílnými hodnotami tzv. rozdělovacích koeficientů popisující míru interakce mezi micelou a neutrální látkou. V případě použití SDS migrují micely proti směru EOF!

56 Vztah kapacitního faktoru (má stejný význam jako v kapalinové chromatografii) a rozdělovacího koeficientu.

57 Příklad separace zneužívaných drog pomocí MEKC 8,5 mm borát, 8,5 mm fosfát, 85 mm SDS, 15% acetonitril, ph 8,5

58 Kapilární gelová elektroforéza (CGE) Elektromigrační technika kombinující výhody separací v křemenných kapilárách a separací v gelových médiích v plošném uspořádání. Vhodná pouze pro separace makromolekul (oligomerů a peptidů, fragmentů nukleových kyselin, polysacharidů apod.) Pracuje se v pokrytých kapilárách (kovalentně se na Si-OH skupiny navážou derivatizací např. trimethylsilylskupiny) -Si-O-Si(CH 3 ) 3 V takto pokrytých kapilárách není EOF!!!

59 Kapiláry pro CGE jsou navíc ještě vyplněny gelem a pracovním elektrolytem, tak aby mohlo docházet k průchodu elektrického proudu. Používají se buď chemické gely nebo fyzikální gely

60 Chování gelů v závislosti na koncentraci v roztoku

61 K separaci CGE dochází na základě rozdílné rychlosti pohybu molekul v elektrickém poli a na základě různé schopnosti procházet přes póry v gely tj. separace především založena na rozdílné velikosti (hydrodynamickém poloměru). Používané gelové média: polyakrylamidový gel, agarosový gel, alkylcelulózové gely (hydroxyethylcelulosa, hydroxymethylcelulosa, hydroxymethylpropylcelulosa) Polyethylenglykoly,

62 Nástřik se v případě CGE provádí elektrokineticky, jinak by došlo k vytlačení gelu z kapiláry ven! Nejčastější gely pro CGE a jejich aplikace

63 Pro detekci se nejčastěji používá fluorescenční detekce, případně UV spektrofotometrická detekce. Separace polydeoxythymidylových kyselin v polyakrylamidovém gelu (PAGE)

64

65

66

67 Kapilární elektrochromatografie (CEC) Kombinace elektromigračních technik s kapalinovou chromatografií. Pro separaci se uplatňují mechanismy migrace nabitých částic v elektrickém poli a interakce se stacionární fází Uspořádání typické pro CEC pro separaci se používají křemenné kapiláry, které navíc obsahují stacionární fází podobně jako v kapalinové chromatografii.

68 CEC nepotřebuje vysokotlakou pumpu pro zajištění pohybu mobilní fáze (MF) přes kapiláru, pumpou je v tomto případě generovaný EOF. Profil průtoku MF přes kapiláru v případě LC Profil průtoku MF přes kapiláru v případě CE

69 K vytvoření EOF přispívá jak náboj vnitřní stěny kapiláry tak náboj na částicích stacionární fáze. Pro CEC se nejčastěji využívají kapiláry o vnitřním průměru 100 m, které jsou vyplněny částicemi stacionární fáze o průměr 3 až 5 m. Nejčastější typ SF je C8 a C18 fáze tzv. reversní fáze.

70 Stacionární fáze je v kapiláře umístěna mezi dvě polopropustné frity (zadrženy jsou částice SF nikoliv molekuly MF) Detekční okénko následuje ve volné části kapiláry za fritou tak, aby mohlo docházet k on-column detekci.

71 EOF v kapilárách s C8 a C18 stacionární fázi v kyselé a bazické oblasti

72 Jako mobilní fáze se vždy používá vodný pufr s přídavky organických rozpouštědel (methanol, acetonitril, dimetylformamid, dimethylsulfoxid).

73 Separace aromatických uhlovodíků CEC na C18 stacionární fázi.

74 Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF) Kapilární elektromigrační technika, která umožňuje separovat amfolyty na základě rozdílných hodnot pi. Nejčastěji používaná pro separaci (ale i stanovení hodnot pi) peptidů a proteinů. Umožňuje provést separaci dvojice amfolytů, lišící se o 0,005 hodnoty pi. Schéma CIEF

75 Pro úspěšnou CIEF je potřeba vytvořit v kapiláře gradient ph, což se provádí tak, že se kapilára vyplní roztokem směsi amfolytů, které slouží pro vytvoření gradientu ph a vzorku. Anoda spolu s anodickým koncem kapiláry je ponořena do elektrolytu o kyselém ph a katoda do roztoku o basickém ph. Po aplikaci stejnosměrného napětí dojde k vytvoření gradientu ph podél kapiláry: ph se mění spojitě z kyselé oblasti až do bazické směrem od anody ke katodě. Současně nabité amfolyty vzorku migrují směrem k opačně nabité elektrodě a protože procházejí postupně oblastmi s měnícím se ph - mění se i jejich výsledný náboj. V místě kde je ph shodné s pi přestane separovaný amfolyt migrovat, vytvoří velmi úzkou zónu, kde dochází k jeho zakoncentrování. Proces zakoncentrování je označován jako fokusování. Roztok amfolytů je komerčně dostupný a je tvořen směsí sloučenin s rozdílnými hodnotami pi mající bazické amino- a kyselé karboxy- skupiny.

76 Nejčastěji se pro CIEF používá rozmezí ph 3 10 Anolyt asi 0,02 M kyselina fosforečná Katolyt asi 0,02 M hydroxid sodný

77 CIEF se provádí v kapilárách, kde je potlačen EOF ( EOF = 0) Pro potlačení EOF se používá kovalentní pokrytí polyakrylamidem dynamické pokryté methylcelulosou Výhodou CIEF je dávkování vzorku do celého objemu kapiláry, lze tedy nadávkovat větší objem vzorku o nižších koncentracích než v případě jiných elektromigračních technik. Po skončení fokusace je potřeba oddělené zóny fokusovaných amfolytů vytlačit do detektoru tzv. mobilizace fokusovaných zón Hydrodynamická mobilizace Elektroforetická mobilizace

78 Hydrodynamická mobilizace Po fokusaci se zóny vytlačí do detektoru pomocí pumpy (nevhodné pro kapiláry, které jsou vyplněné gelem). Elektroforetická mobilizace Po fokusaci se zóny mobilizují porušením vytvořeného gradientu ph. Buď se vymění anolyt za roztok NaOH (katolyt a anolyt budou mít stejné složení) nebo se katolyt vymění za roztok kyseliny fosforečné. Jestliže je anolyt vyměnen ze roztok NaOH, budou OH - ionty migrovat směrem k anodě. Na + ionty budou migrovat směrem ke katodě, ale nebudou způsobovat změnu ph. Naopak OH - budou postupně titrovat jak separované amfolyty, tak i amfolyty tvořící gradient. Fokusované amfolyty (proteiny) budou mít záporný náboj a migrovat k anodě. Podobná mobilizace se dá provést přídavkem soli do anolytu nebo katolytu.

79 CIEF směsi proteinů v polyakrylamidové kapiláře

80 Kapilární izotachoforéza (CITP) Ideální separační a zároveň prekoncentrační kapilární elektromigrační metoda Liší se uspořádáním elektrolytů (pufrů), které jsou používány pro separaci nabitých látek oproti ostatním elektromigračním metodám.

81 CITP používají se 2 rozdílné elektrolyty: LEADING electrolyte (vedoucí elektrolyt) TERMINATING electrolyte (koncový elektrolyt) Leading elektrolyt obsahující iont stejného znaménka jako separované ionty, přičemž má největší mobilitu. Terminating elektrolyt obsahující iont stejného znaménka jako separované iont, příčemž má nejmenší mobilitu. Separované ionty benzoát + salicylát Jaké složení musí mít leading a terminating?

82 Při CITP se pracuje za konstantního proudu, což je rozdílné oproti ostaním elektromigračním technikám. Při CITP analýze se separované molekuly pohybují konstantní rychlostí, tj. mobilita všech separavoných složek je stejná. v =. E = konst. Jestliže je rychlost pohybu separovaných látek konstantní a mobilita částice je daná elektroforetickou pohyblivostí, pak se během separace mění intenzita elektrického pole v jednotlivých zónách. Intenzita elektrického pole je nejmenší v zóně vedoucího elektrolytu a největší v zóně koncového elektrolytu. Tento jev je příčinou toho, že v CITP migrují zóny analytů ostře ohraničené a nedochází k jejich promíchání difuzí.

83 Další výhoda CITP schopnost koncentračního přizpůsobení zón Pracuje-li se za konstatního proudu, pak existuje konstatní poměr mezi koncentrací a mobilitou daného iontu v jeho zóně. Zóny, které jsou koncentrovanější než je koncentrace vedoucího elektrolytu zvětší svůj objem tj. zředí se do širší zóny. Naopak zóny, které mají nižší koncentraci než vedoucí elektrolyt zmenší svůj objem a zakoncentrují se do užší zóny. Tento důsledek je obsažení v řešení Kohlrauschovi regulační funkce, která má pro uniunivaletní elektolyty tvar: c L cs L L. c s s c

84 Vzájemné koncentrační přizpůsobení zón separovaných analytů podle koncentrace vedoucího elektrolytu je velmi výhodné. ITP se tedy používá jako on-line prekoncentrační technika pro zakoncentrování analytů do úzkých zón s následnou separací takto zakoncentrovaných zón analytů pomocí CZE. Toto on-line spojení dvou elektromigračních separačních technik je označováno jako transient titp-cze Klasická CZE s UV detektorem dosahuje bez prekoncentrace detekčních limitů řádově okolo jednotek M, s použtím titp-cze se dosahuje detekčního limitu až 1000 x nižšího.

85 Jako detektory se používají nejčastěji: vodivostní detektory UV-Vis detektory.

86 Kapilární zónová elektroforéza Nejvyužívanější mód elektromigračních technik Separace je dosaženo na základě rozdílných pohyblivostí nabitých částic ve stejnosměrném elektrickém poli Separace je ovlivněna mobilitou a směrem EOF a VŠEMI komlexotvornými, interakčními rovnováhami, kterým mohou podléhat separované analyty. Tyto rovnováhy se využívají pro ovlivnění mobilit separovaných iontů za účelem dosažení požadované separace. Obecně stačí, aby rozdíl mezi mobilitami separovaných částic byl větší než 0,05%.

87 Nejvyužívanější typy rovnováh v CZE Vliv ph Tvorba komplexů Tvorba iontových asociátů Tvorba host-guest komplexů Vliv nevodných rozpouštědel Vliv ionogenních a neionogenních tenzidů Vliv síťujícího prostředí Tyto rovnáváhy lze libovolně kombinovat, takže lze docílit separace i velmi podobných sloučenin jakou jsou např. polohové nebo optické izomery