1. Analýza sacharidů v medu pomocí kapilární elektroforézy Med je přírodní produkt, který vyrábí včely z nektaru různých rostlin. Jedná se o vodný přesycený roztok sacharidů, který obsahuje také komplexní směs dalších minoritních složek, jako jsou minerální látky, proteiny, vitaminy, organické kyseliny, flavonoidy, fenolové kyseliny, enzymy a fytosloučeniny. Složení a kvalita medu se liší především podle botanického a zeměpisného původu, ale je také ovlivněna environmentálními podmínkami, způsobem zpracování a skladování. Cukry jsou hlavními složkami medu a jejích obsah činí zhruba 95g na 100g sušiny. Nejvíce zastoupené jsou fruktóza a glukóza; disacharidy, trisacharidy a oligosacharidy jsou přítomny v medu v nižších koncentracích. Fruktóza je v medu přítomna ve větším množství než glukóza, podíl jejich koncentrací má vliv na chuť medu a také na jeho viskozitu nebo krystalinitu fruktóza má větší rozpustnost než glukóza. Bylo prokázáno, že na trhu je k dispozici pančovaný med, získaný pomocí úmyslného přidání sacharózového sirupu. Stanovení fruktózy, glukózy a sacharózy je obecný přístup pro popis kvality medu. Obr. 1. Stuktura glukózy, fruktózy a sacharózy. Obsah cukrů v medu může být stanoven různými metodami. Nejčastěji používaná je vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) s refraktometrickou detekcí. Mezi jiné metody patří HPLC s pulzní amperometrickou detekcí, iontově výměnná chromatografie s pulzní amperometrickou detekcí, plynová chromatografie s plamenově ionizační detekcí, plynová chromatografie s hmotnostně spektrometrickou detekcí nebo infračervená spektroskopie. Kapilární elektroforéza (CE) je využívána pro stanovení cukrů v medu a také v dalších potravinářských produktech, včetně šťávy, jogurtů, meruněk, vína, rýže a nápojů. Kapilární elektroforéza je vysoce účinná separační technika, která se v dnešní době stává stále běžnější technikou pro analýzu mnoha sloučenin. Ve srovnání s jinými analytickými technikami CE
nabízí výhody jako nízkou spotřebu rozpouštědel, krátkou dobu analýzy a potřebou malého objemu vzorku s minimální nutnosti jeho úpravy. CE je založena na elektroforetické migraci iontů v elektrickém poli. Separace je uskutečňována v kapiláře, která je vyrobena z taveného křemene a je pokryta vrstvou polyimidu, který zabezpečuje mechanickou odolnost. Polyimid je opticky nepropustný, proto v místě detekce je potřeba jeho vrstvu odstranit. Konce kapiláry jsou umístěny v nádobkách se separačním elektrolytem a do nádobek jsou vloženy platinové elektrody. Separace analytů probíhá vložením vysokého napětí, které je používáno v rozmezí od 0 do 30 kv. Separované analyty jsou poté sledovány pomocí detektoru, který je umístěn na opačném konci kapiláry než dávkovaný vzorek. Po naplnění kapiláry elektrolytem dochází k disociaci povrchových silanolových skupin (Si-OH). Vnitřní stěna tak získává záporný náboj, který je kompenzován kationty z elektrolytu. Po vložení elektrického pole na kapiláru dochází k pohybu těchto kationtů s jejich solvatačními obaly, což strhává celý objem kapiláry ve směru migrace kationtů. Tento jev se nazývá elektroomostický tok (electroosmotic flow, EOF) a ovlivňuje migraci všech látek ve vzorku - urychluje tedy migraci kationtů, unáší neutrální látky i anionty směrem k detektoru. Je tak možné během jedné analýzy detekovat jak kationty, neutrální látky, tak i anionty. Čím je vyšší ph elektrolytu, tím větší negativní náboj je rozprostřen na vnitřní stěně a tím rychlejší elektroosmotický tok pozorujeme. Elektroosmotický tok vykazuje téměř plošný rychlostní profil, který vede k velmi malému rozmývání zón separovaných látek, a proto se v elektromigračních separačních metodách setkáváme s mnohem užšími píky než v kapalinové chromatografii. Schéma vzniku elektroosmotického toku u povrchu křemenné kapiláry.
Nejčastěji využívaným detektorem je spektrofotometrický založený na měření absorbance v detekčním okénku na kapiláře. Při průchodu látky absorbující záření při zvolené vlnové délce je zaznamenán úbytek intenzity záření, signál je sledován v závislosti na čase a výsledný záznam se nazývá elektroferogram. Sledovány jsou obvykle látky, které obsahují chromofor; je však možné využít nepřímé spektrofotometrické detekce, kdy elektrolyt obsahuje vhodnou absorbující látku pro sledování látek, které neabsorbují záření při zvolené vlnové délce. Při průchodu neabsorbující látky přes detekční okénko dochází ke snížení koncentrace absorbující látky ze základního elektrolytu a je zaznamenán pokles absorbance. Jeho míra odpovídá množství látky podobně jako u přímé spektrofotometrické detekce. Glukóza, fruktóza a sacharóza neobsahují žádnou snadno ionizovatelnou funkční skupinu, pro získání záporného náboje na molekule je potřeba silně alkalického prostředí, při ph vyšší než 12 dochází k disociaci hydroxylových skupin. Tyto látky také neobsahují funkční skupinu absorbující záření v rozsahu 190 600 nm, je tedy zapotřebí využít výše zmíněné nepřímé spektrofotometrické detekce. Silný elektroosmotický tok generovaný na povrchu kapiláry v takto zásaditém základním elektrolytu by znemožňoval analýzu těchto aniontů; z tohoto důvodu je do základního elektrolytu přidán cetyltrimethylammonium bromid (CTAB) - kationtový tenzid, který interaguje se záporně nabitým povrchem kapiláry, čímž se změní náboj povrchu na kladný a tím dojde k potlačení a obrácení směru elektroomostického toku, čímž je zkrácen čas analýzy. Praktická část Vybavení: Agilent HP 3D CE s UV detektorem, vypalovač detekčních okýnek, ultrazvuk, váhy Pomůcky: Kádinky, odměrné baňky, odměrný válec, nylonové filtry s velikostí pórů 0,45 µm, křemenná kapilára (s vnitřním průměrem 50 µm a celkové délky 32,5 cm), řezátko, vialky, eppendorfky Chemikálie: sorbová kyselina, NaOH, cetyltrimethylammnoium bromid, standardy glukózy, fruktózy a sacharózy, deionizovaná voda
Pracovní postup Příprava elektrolytu: - 20 mm kyselina sorbová, 40 mm NaOH, 0,2 mm cetyltrimethylammonium bromid - odpovídající množství sorbové kyseliny rozpusťte v deionizované vodě - přidejte odpovídající množství NaOH - v plastové nádobce připravte 10 ml 0,2 mm roztoku cetyltrimethylammonium bromidu v připraveném roztoku kyseliny sorbové a NaOH Příprava standardů: - ze zásobních roztoků odpipetujte odpovídající množství standardů pro přípravu směsi sacharidů do jedné směsi o koncentraci 1 mg/ml Příprava vzorku: - vzorek medu navažte na koncentraci 50 g/l do 50 ml nádoby, rozpusťte v deionizované vodě, umístěte do ultrazvuku na 5 minut a poté přefiltrujte přes nylonový filtr - vzorek zřeďte 10x a napipetujte do vialek Příprava separační kapiláry: - podle pokynů vedoucího cvičení uřízněte potřebnou délku separační kapiláry - ve vzdálenosti 8,5 cm odstraňte pomocí vypalovače vrstvu polyimidu a okénko otřete gázou navlhčenou v metanolu - podle pokynů vedoucího cvičení umístěte kapiláru do interface a vložte kapiláru do přístroje
- kapiláru promyjte 5 minut 1M NaOH, 5 minut vodou, a následně separačním elektrolytem; nastavte parametry metody (-20 kv, detekce při 254 nm, nástřik 50 mbar 3 sekundy) Měření vzorků: - proměřte standardní směs sacharidů, postupně přidávejte jednotlivé standardy do směsi ve vialce pro ověření identity jednotlivých píků a pro zjištění jejich migračního pořadí - proměřte vzorek medu, v případě potřeby vzorek dále nařeďte - metodou standardního přídavku stanovte množství jednotlivých sacharidů ve vzorku Vyhodnocení: Porovnejte záznamy analýzy standardů a vzorku, na základě migračních parametrů určete, které ze sacharidů se nachází v medu. Pomocí metody standardního přídavku stanovte množství sacharidů ve vzorku. Otázky k prozkoušení: 1. Jaké jsou hlavní složky medu a která složka slouží k prokázání pančování medu? 2. Vysvětlete princip nepřímé UV detekce v kapilární elektroforéze. 3. Proč je do základního elektrolytu přidán cetyltrimethylamonium bromid? 4. Jaké další separační metody by mohly sloužit pro určení těchto sacharidů?
Doporučená literatura: 1. Baker D.R., Capillary electrophoresis: Techniques in analytical chemistry. John Wiley and Sons Ltd, New York 1995. 2. Analytické separační metody, Karolinum Praha 2004, Štulík K. a kol. 3. Teoretické základy a separační principy kapilárních elektromigračních metod, Chemické listy, 91 (1997) 320 329, V. Kašička. 4. Simpson B.K.: Food Biochemistry and Food Processing, 2012. 5. Damodaran S.: Fennema's Food Chemistry, Fourth Edition, 2007.