úlohy 11. cvičení z Botaniky pro obor TP 2004 1/6 46. VLIV NEDOSTATKU JEDNOTLIVÝCH MAKROBIOGENNÍCH PRVKŮ NA RŮST ROSTLIN Princip: Pozorování vlivu deficience výživy lze dobře provést kultivací rostlin ve vodních kulturách, nebotˇ lze snadno připravit roztok, v jehož složení se určitý prvek nevyskytuje. Při přípravě deficitních roztoků je nutno dbát toho, aby současně s deficitem sledovaného prvku neklesla koncentrace i dalších iontů. Potřeby: klíční rostliny kukuřice (Zea mays L.) nebo slunečnice (Helianthus annuus L.), zásobní roztoky živin : 10 % Ca(NO 3 ) x 4H O, 10 % KNO, 10 % NaNO, 5 % CaSO x2h O, 2 2 3 3 4 2 5 % MgSO 4 x7h 2 O, 2,5 % KH 2, 2,5 % NaH 2, 10 % KCl, směs mikroelementů, směs FeCl 3 s chelatonem III, destilovaná voda, odměrné válce, pipety, kultivační nádoby, indikátorové papírky. Příprava směsi Fe+Chelaton III 2,7g FeCl 3 rozpustit ve 100ml dest.vody, 3,7g Chelatonu III rozpustit ve 100 ml dest. vody a oba roztoky smísit. Příprava směsi mikroelementů : v 1 litru destilované vody rozpustit 0,7g CuSO 4 x5h 2 O, 3g MnSO 4 x7h 2 O, 2g H 3 BO 3, 0,5g ZnSO 4 x7h 2 O, 0,1g (NH 4 ) 2 MoO 4. Provedení: Podle následující tabulky připravíme pokusné varianty s deficitem jednotlivých makroelementů. Celkové množství živin dávkujeme podle objemu kultivačních nádob. Přehledná tabulka č. V uvádí dávkování živin na přípravu jednoho litru kultivačního roztoku. Aby se jednotlivé soli nevysrážely, je zapotřebí při přípravě živného roztoku dodržovat tento postup : nejprve odpipetovat uvedená množství zásobních roztoků do odměrné 1000 ml baňky a pak doplnit destil. vodou objem po rysku. Takto rozpuštěné ředěné soli postupně slévat do větších kalibrovaných nádob. Nejprve fosforečnany, pak za neustálého míchání Ca(NO 3 ) 2, KCl, MgSO 4, CaSO 4, nakonec směs Fe+Chelatonu III. a mikroelementů. Na začátku kultivace rostlin ve vodních kulturách připravíme živné roztoky o poloviční koncentraci. Po týdnu roztoky upravíme doplněním živin na celkový objem kultivační nádoby. Výsledky: U 5 rostlin z pokusné varianty stanovíme v týdenních resp.dvoutýdenních intervalech, následující charakteristiky: - délka kořenového systému - čerstvá hmotnost kořenů, obilek a nadzemní části - poměr hmotnosti kořenů : nadzemní části (čerstvá hmotnost, sušina) - velikost listové plochy (celkové a jednotlivých listů) - stanovení obsahu chlorofylu v listech (a, b, a+b, a:b) - stanovení obsahu karotenoidů, poměr chlorofylu a karotenoidů výpočet viz. kapitola rostlinná barviva - stanovení rychlosti fotosyntézy - výpočet viz.kapitola fotosyntéza - stanovení intenzity transpirace - výpočet viz. kapitola vodní provoz - stanovení vodního sytostního deficitu - výpočet viz.kapitola vodní provoz - zjištění počtu průduchů - návod viz. kapitola vodní provoz - záznam symptomů deficience jednotlivých prvků (pruhovitost, zasýchání špiček, hnědnutí kořenů...) - záznam ph roztoků 1
úlohy 11. cvičení z Botaniky pro obor TP 2004 2/6 Tab. č. V: Složení kultivačních živných roztoků (modifikace Knopova roztoku). Zásobní ml zásobního roztoku na přípravu 1litru roztoku roztok kontrola -N -P -K -Ca -Mg -Fe 10 % Ca(NO 3 ) x 2 4H 2 O 10-10 12,5-10 10 10 % KNO 3 2,5-2,5-2,5 2,5 2,5 10 % KCl 1,2 3,7 2,5-1,2 1,2 1,2 2,5 % 10 10 - - 10 10 10 KH 2 5 % MgSO 4 x 7H 2 O 5 % CaSO 4 x 2H 2 O 5 5 5 5 5-5 - 20 - - - 5-10 % - - - - 10 - - NaNO 3 2,5 % - - - 10 - - - NaH 2 Směs FeCl 3 s chelatone m III Směs mi- Kroelement ů Destilovaná voda 1 1 1 1 1 1-1 1 1 1 1 1 1 969,3 959,3 978,0 970,5 979,3 969,3 970,3 Závěr : Stanovíme vliv deficitu zvoleného makroelementu na tvorbu kořenu (délka a hmotnost) a nadzemní biomasy (hmotnost a listová plocha) a zjištěné údaje z deficitní varianty porovnáme s kontrolou (rostliny pěstované ve vybalancovaném živném roztoku). Pro obě varianty stanovíme průměrnou hodnotu a metodou konfidenčních intervalů statisticky vyhodnotíme rozdíly. Vyžádejte si informace od ostatních dvojic a sestavte souhrnnou tabulku symptomů nedostatků všech makroelementů. 2
úlohy 11. cvičení z Botaniky pro obor TP 2004 3/6 Tab. č.vi: Výskyt, příjem, distribuce, inkorporace a metabolické funkce makroelementů. Upraveno podle Larchera (1988). Makroelement Přijímané formy - + dusík NO 3, NH4 Inkorporace v rostlině volný NO 3 bílkoviny nukleové kys. funkce v místa rostlině hromadění zákl.složka Mladé prýty protoplazmy a pupeny, enzymů semena zásob.orgány příznaky nedostatku Zakrslý růst předčasné žloutnutí růst kořenů, vřetenovitý tvar rostlin fosfor H -2 H2 - volné ionty, estery,fytin, nukleotidy, fosfatidy základní metabolismus a syntézy přednostně v reprodukčníc h orgánech než vegetativních Reprodukční poruchy, krsnutí tmavě zelené až fialové skvrny draslík K + rozpuštěn v buněčné šťávě, adsorbován hořčík Mg 2+ rozpuštěný a adsorbovaný ion,vázaný v komplexech vápník Ca 2+ rozpuštěný v solích,krystalický a inkrust. jako chelát, organický v pektátech síra -2 SO 4 z půdy SO 2 ze vzduchu volné ionty, vázaná v-sh,- SS, estery, koenzymy, bílkoviny podpora hydratace synergisté: Na +, NH + 4 antagonisté: Ca 2+, osmoregulace regulace hydratace(anta g.s Ca 2+ ) fotosyntéza, přenos fosfátů (synerg.mn a Zn) regulace hydratace (antag.k +, Mg 2+ ), aktivace enzymů,regula ce dlouživého růstu složka protoplazmy a enzymů meristémy korový parenchym, místa intenzívního metabolismu listy listy stromová kůra listy a semena Poruchy vodní bilance, zvlněné okraje starších listů Intervenální chlorózy starých listů, zakrslý růst Zasýchání vrcholů,deformace listů, zpomalen růst kořenů Chloróza mladých listů, podobné jako u dusíku 3
56. EXTRAKCE A ROZDĚLENÍ LISTOVÝCH BARVIV úlohy 11. cvičení z Botaniky pro obor TP 2004 4/6 Princip : Organickými rozpouštědly jsou z listů extrahována barviva, která jsou lokalizována na membráně plastidů. Získaný extrakt je možno rozdělit chromatografií na papíře nebo na tenké vrstvě (TLC). Tenkovrstevná chromatografie představuje metodu dělení látek na tenké vrstvě silikagelu, který je nanesen na hliníkovou folii. Chlorofyly (a,b) a karotenoidy jsou barviva v listech zelených rostlin, která mají rozhodující význam pro fotosyntézu. Jsou to lipochromy, tzn. že charakteristickou vlastností je rozpustnost v tucích a tukových rozpouštědlech. Jsou značně citlivá vůči světlu a vzdušnému kyslíku. Rozkladnými produkty chlorofylů jsou feofytiny, karoteny přechází přes epoxydy na bezbarvé sloučeniny. a) příprava extraktu chlorofylu Potřeby : rostlinný materiál /listy kukuřice (Zea mays L.), hrachu (Pisum sativum L.) /, aceton, MgCO 3 (nebo CaCO 3 ), mořský písek, třecí miska, odměrný válec, kádinky, odměrnou baňku (25 ml), Provedení : Odvážené množství rostlinného materiálu (0,5g) nadrobno nastříháme do třecí misky a po přidání MgCO 3 (pro neutralizaci buněčné šťávy) a písku rozetřeme. Přidáme 2 ml acetonu a ještě pokračujeme v homogenizaci. Směs zfiltrujeme přes malý filtr smočený v acetonu do 25 ml odměrné baňky. Filtrát musí být čirý! Dokonalejší filtrace je dosaženo použitím Büchnerovy nálevky se sintrem S3 nebo G4. Dalšími dávkami acetonu kvantitativně převedeme barviva do odměrné baňky a doplníme objem po značku. Než přistoupíme k další manipulaci s extraktem (TLC, měření na spekolu) uchováváme extrakt v ledničce. b) chromatografie Potřeby : acetonový extrakt, chromatografická deska SILUFOL, mikropipeta, vyvíjecí činidlo ( benzin: isopropanol: voda=100:10:0,25), chromatografická kyveta. Provedení : Asi 2 cm od spodního okraje naneseme 0,5 ml extraktu. Dbáme toho, aby velikost nanesené skvrny byla co nejmenší a aby nedošlo k porušení povrchu. Desku umístíme téměř v kolmé poloze do chromatografické kyvety, ve které je 1-2cm vrstva vyvíjejícího činidla. Start nesmí být ponořen! Jakmile čelo dosáhne téměř okraje desky, chromatogram vyjmeme. Výsledky : Vyhodnotíme pořadí rozdělených pruhů barviv na chromatogramu podle schématu obr. č. 17. Chromatogram lze použít pro kvantitativní stanovení přítomných barviv. Jednotlivé pruhy s barvivy vystříháme. Tyto proužky silufolu vložíme do popsaných zkumavek a přidáme 2 ml rozpouštědla. Zkumavky uzavřeme a 2 minuty extrahujeme. Čiré extrakty separovaných barviv použijeme k proměření absorpčního spektra. A max (maximální absorbance) pro lutein je při 445 nm, pro violaxantin při 441 nm, pro neoxantin při 435 nm, pro karoten při 447 nm. 4
úlohy 11. cvičení z Botaniky pro obor TP 2004 5/6 Obr. č. 19: Schéma pořadí rozdělených pruhů barviv na chromatogramu čelo - karoten (žlutý) feofytin (šedý) chlorofyl a (modrozelený) chlorofyl b (žlutozelený) karotenoidy - lutein (žlutý) violaxantin -"- neoxantin -"- zeaxantin -"- start -... Rf = vzdálenost START - ROZDĚLENÁ LÁTKA vzdálenost START ČELO 62. GRAVIMETRICKÉ STANOVENÍ INTENZITY FOTOSYNTÉZY Z PŘÍRŮSTKU SUŠINY LISTOVÝCH TERČÍKŮ Princip : Intenzitu fotosyntézy lze měřit také z přírůstků sušiny fotosyntetizujícího pletiva. Měření se provádí na terčících vyseknutých z listových čepelí. Metoda je založena na zjištění, že fotosyntéza terčíků probíhá po dosti dlouhou dobu velmi pravidelně a téměř stejně intenzívně jako u intaktního pletiva. Protože asimiláty nemohou z izolovaných terčíků odtékat, hromadí se a zvyšují hmotnost jejich sušiny. Přírůstek sušiny za určitou dobu (G t ) fotosyntézy se zjistí porovnáním hmotnosti sušiny terčíků před (v čase 0, G o ) a po expozici (v čase t, G t ). Potřeby : Listy cukrovky (Beta vulgaris L.), kukuřice (Zea mays L.), aparatura s expoziční komorou, molitanové podložky, kroužky z PVC, korkovrt, pinzeta, sušárna, váhy, váženky. Provedení : Z nejširších částí čepelí vysekneme korkovrtem terčíky tak, aby nezahrnovaly silnější svazky cévní. 50 kusů terčíků použijeme pro stanovení sušiny v čase 0. Terčíky vložíme do váženky a vysoušíme v sušárně při teplotě 95 o C po dobu 1 hodiny. Dalších 50 kusů terčíků vkládáme do molitanové podložky. Pro dokonalejší manipulaci je vhodné vložit do výseče v molitanu PVC kroužek. Terčík je tak vypodložen a nekroutí se. Podložky s terčíky se vkládají do komory, v níž budou po dobu 3-6 hodin terčíky intenzívně nasvětleny. Molitan musí být neustále nasáklý vodou! Po skončení expozice se stanoví sušina exponovaných terčíků (G t ). Výsledky : Stanovíme intenzitu fotosyntézy P N : P N S... plocha segmentů Gt Go = t doba expozice S. t G o,g t hmotnosti sušin 5
úlohy 11. cvičení z Botaniky pro obor TP 2004 6/6 57. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ OBSAHU LIPOCHROMŮ ABSORPČNÍ ANALÝZOU Princip : Základem metod absorpční analýzy je závislost absorpce elektromagnetického záření ve viditelné, ultrafialové nebo infračervené oblasti spektra na složení zkoumané látky v určitém absorbujícím prostředí. Absorpční analýza ve viditelné oblasti elektromagnetického záření se nazývá kolorimetrie. Základní vlastností atomů a molekul je schopnost emitovat a absorbovat elektromagnetické záření o jistých vlnových délkách. Závislost mezi absorpcí elektromagnetického záření a složením absorbující látky (při konstantní tloušťce vrstvy) vyjadřuje Lambert-Beerův zákon: "Prochází-li monochromatické záření s počáteční intenzitou I o vrstvou absorbujícího prostředí o tloušťce l, pak se zeslabuje jeho intenzita na hodnoti I." Absorpce se zvyšuje se zvyšujícím se obsahem a vrstvou absorbujícího prostředí. Absorbance (dříve Extinkce) platí pro výraz log I o /I. Potřeby : střička s destilovanou vodou, aceton, acetonový chlorofylový extrakt (viz. pok. č. 50), buničitá vata, filtrační papír, spekol. Provedení : Provedeme měření při vlnové délce 645 nm, při níž má maximum absorpce chlorofyl b a potom při vlnové délce 663 nm, při níž má maximum absorpce chlorofyl a. Výsledky : Naměřené hodnoty absorbance chlorofylů dosadíme do rovnic. Tímto výpočtem získáme hodnotu vyjadřující množství chlorofylu v mg. l -1 rozpouštědla při tloušťce kyvety 1 cm. A 663, A 645 a A 440 jsou hodnoty naměřené absorbance chlorofylu při vlnových délkách 663 a 645 a karotenoidů při 440. chlorofyl a (c a ) = 12,7.A 663-2,69.A 645 chlorofyl b (c b ) = 22,9.A 645-4,68.A 663 chlorofyl a+b (c a+b ) = 8,02.A 663 + 20,2.A 645 karotenoidy c k = 4,968.A 440-0,268. (c a +c b ) Vzhledem k tomu, že vzorek se nezpracovával do objemu 1l, ale podle objemu odměrné baňky (25 ml), navíc v některých případech musel být vzorek ředěn (pro nedostatečný rozsah stupnice spekolu), je zapotřebí hodnoty získané z rovnic upravit podle ředění. 1) stanovíme kolik mg chlorofylu (c a,c b ) a karotenoidů c k se nachází v původním extraktu, tedy i v navážce listů 2) c a,b (mg). objem (ml) 1000 (ml) = mg chlorofylu 2) přepočteme množství chlorofylu a, b, a+b a karotenoidů na jednotku hmotnosti čerstvé hmoty (g) nebo na jednotku plochy (m 2 ), v případě, že byla stanovena listová plocha vzorku. 3) vypočítáme c a : c b, c a+b : c k Závěr : Hodnoty sestavit do přehledné tabulky. 6