Kurz 1 Úvod k biochemickému praktiku

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Kurz 1 Úvod k biochemickému praktiku"

Luděk Beneš
před 7 lety
Počet zobrazení:

1 Kurz 1 Úvod k biochemickému praktiku Pavla Balínová

2 Důležité informace Kroužkový asistent: RNDr. Pavla Balínová ová adresa: místnost: 410 studijní materiály jsou dostupné v aplikaci Výuka:

3 Osnova semináře organizace praktik pravidla bezpečnosti práce v laboratoři laboratorní vybavení práce s automatickou pipetou informace k jednotlivým úlohám praktik rozdělení studentů do pracovních skupinek a přidělení praktické úlohy na první týden praktik

4 Organizace praktik (lab. kolečko B1 B4) 4 úlohy / 4 týdny / 8 pracovních stolů - rozdělení kroužku do 8 pracovních skupin SPEKTROFOTOMETRIE - B1 (stanovení koncentrace kreatininu v moči) CHROMATOGRAFIE - B2 (TLC lipofilních barviv) TITRACE - B3 (stanovení acidity žaludeční šťávy) POTENCIOMETRIE - B4 (měření ph fosfátového pufru)

5 Pravidla bezpečnosti práce v laboratoři jsou dostupná v aplikaci Výuka:

6 Laboratorní vybavení, práce s automatickou pipetou

7 Informace k jednotlivým úlohám praktik SPEKTROFOTOMETRIE (stanovení koncentrace kreatininu v moči) analyzovaný vzorek: vlastní moč 1. bezbarvý kreatinin je převeden na barevný produkt chemickou reakcí v alkalickém prostředí (Jaffého reakce) 2. měření absorbance standardních roztoků kreatininu a vzorku moče pomocí spektrofotometru ve viditelné oblasti 3. koncentrace kreatininu ve vzorku se zjišťuje z naměřené absorbance pomocí kalibrační křivky

8 Spektrofotometrie výpočty v praktiku příprava kalibračních roztoků ze zásobního standardního roztoku kreatininu (ředění) naředění vzorku moči přepočet hmotnostní koncentrace na molární Zjištění koncentrace: 1. Lambert-Beerův zákon 2. Kalibrační křivka 3. Výpočet pomocí hodnot (A, c) standardních roztoků

9 Spektrofotometrie Lambert-Beerův zákon A = e x l x c nebo T = 10 -(e x l x c) A = absorbance (A = -log T) T = transmitance (T = 10 -A ) e = molární absorpční ( extinkční ) koeficient l = tloušťka kyvety (v cm) c = molární koncentrace

10 Spektrofotometrie kalibrační křivka 3 a více standardů zpracovaných stejnou metodou lineární kalibrační křivka A = e x l x c y = kx + q

11 Spektrofotometrie - výpočet pomocí hodnot (A, c) standardních roztoků stand. roztok zkoumané látky A st = c st x l x e A st / c st = l x e vzorek zkoumané látky A vz = c vz x l x e A vz / c vz = l x e l x e = l x e A st / c st = A vz / c vz c vz = A vz x (c st / A st ) c vz = A vz x f f = průměr všech (c st / A st ) použitých při experimentu

12 Spektrofotometrie - příklady 1) standard: A = 0,600, c = 15,0 mm vzorek: A = 0,200, c =? 2) standard: T = 0,30 vzorek: T = 0,60 Je c vz nižší nebo vyšší než c st? 3) c 1 = 0,1 mm c 2 = 0,01 mm Kolikrát byl vzorek naředěn? 4) vzorek o c = 0,2 mm byl naředěn 100x Jaká je jeho koncentrace po naředění?

13 CHROMATOGRAFIE (TLC lipofilních barviv) = adsorpční planární kapalinová chromatografie mobilní fáze: toluen (nepolární) stacionární fáze: destička se silikagelem (polární) standardy barviv porovnání Rf neznámý vzorek: obsahuje 2 různá barviva

14 Chromatografie vyhodnocení chromatogramu planární chromatografie (př. TLC) Porovnání skvrn se standardy R f = a/b R f = retardační faktor a = vzdálenost start střed skvrny b = vzdálenost start čelo mobilní fáze Obrázek převzat z (listopad 2006)

15 TITRACE (ODMĚRNÁ ANALÝZA) (stanovení acidity žaludeční šťávy) reaguje HCl ze žaludeční šťávy odměrný roztok: NaOH neutralizační titrace indikátor: fenolftalein (bezbarvý fialový) z koncentrace HCl se vypočítá ph žaludeční šťávy zjišťuje se ph před a po stimulaci (= na lačno a po jídle )

16 Titrace - výpočet koncentrace vzorku založen na znalosti stechiometrie chemické reakce a A + b B c C + d D a, b, c, d = stechiometrické koeficienty = látkové množství (n) A = odměrný roztok, B = analyzovaná látka a / b = n(a) / n(b) c = n / V n = c x V c = molární koncentrace (mol/l), n = látkové množství (mol), V = objem roztoku, a, b = stechiometrické koeficienty a x n(b) = b x n(a) a x c B x V B = b x c A x V A

17 POTENCIOMETRIE (měření ph fosfátového pufru) elektrochemická metoda založená na měření napětí elektrochemického článku za bezproudého stavu dvě elektrody: indikační (měřící) elektroda referentní (srovnávací) elektroda v praktiku stanovení ph pomocí ph-metru (= upravený potenciometr)

18 Potenciometrie roztoky fosfátového pufru o různém složení kalibrace přístroje pomocí standardů skleněná kombinovaná elektroda ( dvojče )

19 Potenciometrie - pufry roztoky schopné vyrovnávat výkyvy ph: po přidání silné kyseliny nebo zásady změní své ph jen nepatrně používají se k udržování stabilní hodnoty ph složení pufrů: konjugovaný pár: kyselina / zásada * slabá kyselina + její sůl např. octanový pufr * slabá zásada + její sůl např. amonný pufr * 2 různé soli vícesytné kyseliny např. fosfátový pufr * amfoterní látky např. proteiny

20 Potenciometrie výpočet ph pufrů Henderson-Hasselbalchova rovnice ph = pk a + log (c s / c a ) (pro kyselý pufr) poh = pk b + log (c s / c b ) (pro bazický pufr) ph = 14 poh pk = disociační konstanta slabé kyseliny (pk a ) nebo báze (pk b ) c s = aktuální koncentrace soli v pufru c a = aktuální koncentrace slabé kyseliny v pufru c b = aktuální koncentrace slabé báze v pufru

21 Potenciometrie výpočet ph fosfátového pufru výpočet ph všech připravených roztoků ph = pk(h 2 PO 4- ) + log c(hpo 4 2- ) / c(h 2 PO 4- ) Výsledná hodnota ph pufru je závislá nejen na koncentraci složek, ale i na poměru složek pufru po smíchání tj. poměru objemů obou složek pufru ph = pk a + log n(hpo 4 2- ) / n(h 2 PO 4- ) ph = pk a + log (c s x V s ) / (c a x V a )

Podobné dokumenty

Úvod k biochemickému. mu praktiku. Vladimíra Kvasnicová

Úvod k biochemickému. mu praktiku. Vladimíra Kvasnicová Úvod k biochemickému mu praktiku Vladimíra Kvasnicová organizace praktik pravidla bezpečné práce v laboratoři laboratorní vybavení práce s automatickou pipetou návody: viz. aplikace Výuka automatická pipeta