THE USE OF GENETICALLY MODIFIED PLANTS FOR REMEDIATION OF CONTAMINATED SOILS

THE USE OF GENETICALLY MODIFIED PLANTS FOR REMEDIATION OF CONTAMINATED SOILS VYUŽITÍ GENETICKY MODIFIKOVANÝCH ROSTLIN PRO REMEDIACI KONTAMINOVANÝCH ZEMIN Martina Nováková 1,2), Martina Macková 1,2), Tomáš Macek 2,1), Jan Fišer 1), Jáchym Šuman 1), Veronika Kurzawová 1) 1) Institute of Chemical Technology Prague, Faculty of Food and Biochemical Technology, Technická 5, 166 28 Praha 6, Czech Republic, e-mail: suram@vscht.cz 2) Czech Academy of Science, Joint Laboratory of ICT Prague and IOCB CAS, Flemingovo nam. 2, 166 10 Praha, Czech Republic Abstract: One possibility of the removal of environmental contaminants represents the biological remediation methods. These techniques don t destroy the environment and are public acceptable. Among biological methods the use of genetically modified organisms, such GM microorganisms or GM plants can be considered. Using genetically modified microorganisms on contaminated sites, however, hints on their viability on such sites and on the legislative problems. Research is therefore nowadays oriented to the possibility of using GM plants with increased degradative abilities. The aim is the formation of plants combining a high ability to accumulate, detoxify, or degrade xenobiotics and pollutants, with resistance toward the toxic compounds present and with suitable agrotechnical characteristics. There has been already prepared several transgenic plants to accumulate heavy metals or to degrade aromatic pollutants. Suitable genes for preparation of transgenic plants with increased heavy metals accumulation or tolerance to heavy metals are genes for peptides or proteins accumulating heavy metals, for glutathione, metallothioneins, or genes for metal transportes. Suitable genes for preparation of transgenic plants metabolising organic pollutants are genes from degradation pathways of such pollutants. This paper generally summarizes the various options of use of genetically modified plants for phytoremediation purposes. Keywords: Bioremediation, phytoremediation, genetically modified organisms, organic pollutants, inorganic pollutants, plants Abstrakt: Jednou z možností odstranění kontaminantů z životního prostředí je využití metod biologické remediace. Tyto techniky neničí vzhled životního prostředí a jsou akceptovány širokou veřejností. Mezi biologické metody patří i využití geneticky modifikovaných (GM) organismů, např. GM mikroorganismů nebo GM rostlin. Využití geneticky modifikovaných mikroorganismů na kontaminovaných plochách nicméně naráží na jejich schopnost přežít v kontaminovaném prostředí a zvláště na legislativní problémy. Proto je výzkum více orientován na využití GM rostlin se zvýšenou schopností degradovat kontaminanty životního prostředí. Cílem je připravit takovou rostlinu, která by dokázala polutant nejen akumulovat a detoxikovat nebo jej degradovat, ale aby byla také resistentní k daným koncentracím polutantu a aby její agrotechnologické vlastnosti byly pro pěstování výhodné. Již byla připravena řada transgenních rostlin akumulujících těžké kovy nebo degradujících aromatické polutanty. Vhodné geny pro přípravu transgenních rostlin se zvýšenou akumulací nebo tolerancí k těžkým kovům jsou geny pro peptidy nebo proteiny chelatující těžké kovy, pro glutathion, metalothioneiny nebo geny pro transportéry iontů kovů. Vhodné geny pro přípravu transgenních rostlin metabolizujících organické polutanty jsou geny z degradačních drah daných organických kontaminantů. Tento příspěvek shrnuje obecně jednotlivé možnosti použití geneticky modifikovaných rostlin pro fytoremediační účely. Klíčová slova: Bioremediace, fytoremediace, geneticky modifikované organismy, organické polutanty, anorganické polutanty, rostliny

Úvod Snaha o odstranění polutantů z životního prostředí, popř. zabránění další kontaminace, vedla k přípravě mnoha geneticky modifikovaných rostlin. Jedním ze způsobů ochrany životního prostředí s použitím transgenních rostlin je jejich aplikace v oblasti fytoremediace. V současnosti je uplatňována snaha genetickými manipulacemi získat rostliny upravené na míru požadavkům fytoremediace (Macek a kol., 2008). Do rostlin se za účelem zlepšení jejich fytoremediačních vlastností vnášejí bakteriální, kvasinkové a savčí geny nebo se zvyšuje exprese již přítomných rostlinných genů. Exprese těchto genů by měla zajistit zvýšení účinnosti přirozených metabolických drah a schopností rostlin. Transgenní rostliny pro fytoremediaci anorganických látek Od devadesátých let dvacátého století byla charakterizována řada rostlinných mechanismů rezistence vůči kovům na buněčné i molekulární úrovni a identifikovány některé geny zodpovědné za tuto funkci (Zhang a kol., 2006). Přírodní hyperakumulátory, které lze nalézt v oblastech kontaminovaných těžkými kovy, jsou většinou rostliny malého vzrůstu, tvořící malé množství biomasy, tolerantní a specifické pouze pro jeden typ kontaminantu (Cunnigham a Ow, 1996; Chaney a kol., 1997). Znalosti mechanismů rezistence u přírodních hyperakumulátorů vedly k přípravě transgenních rostlin s vyšší rezistencí nebo vyšší akumulací těžkých kovů, které zároveň tvoří velké množství biomasy a jsou tak pro fytoremediace vysoce účelné. Na druhou stranu se objevila také snaha potlačit translokaci těžkých kovů do nadzemních částí rostliny u plodin určených pro konzumaci, aby se tak zabránilo šíření těžkých kovů potravním řetězcem (Zhang a kol., 2006). Rostlinné mechanismy rezistence spočívají v imobilizaci těžkých kovů v buněčné stěně, vyloučení kovů přes membránu, chelataci v cytoplasmě, oddělení ve vakuole, přeměně a volatilizaci kovů a syntéze stresových proteinů (Ma a kol., 1997; Guo a kol., 1998; Song a kol., 2001; Tang a kol., 2005). Klonováním genů klíčových enzymů tak lze dosáhnout požadované vlastnosti u transformované rostliny. Většina připravených transgenních rostlin pro fytoremediace anorganických polutantů je založena na znalostech mechanismů akumulace těžkých kovů, tzn. přenos těžkých kovů přes membránu nebo z kořenů do nadzemních částí rostliny, jejich chelatace v cytosolu s fytochelatiny, metalothioneiny, glutathionem a následné uskladnění ve vakuole. Byly však studovány také transgenní rostliny exprimující bakteriální gen pro deaminasu aminocyklopropankarboxylové kyseliny (ACC deaminasu) (Grichko a kol., 2000). ACC deaminasa přeměňuje ACC na α-ketobutyrát a amoniak, přičemž ACC je prekurzorem ethylenu v rostlinách. Proto připravené transgenní rostliny Lycopersicon esculentum (rajče jedlé) obsahující bakteriální ACC deaminasu produkují méně ethylenu než netransgenní druh. Transgenní rajčata s nižšími koncentracemi ethylenu jsou méně náchylná ke stresu a jsou schopná růst v přítomnosti Cd, Co, Cu, Ni, Pb a Zn, případně je i akumulovat (Grichko a kol., 2000). Protože je však využití zemědělských plodin ve fytoremediacích nevhodné, byl gen pro ACC deaminasu vnesen i do rostlin Brassica napus (brukev řepka olejka) (Nie a kol., 2002; Arshad a kol., 2007), které tvořily i delší a hustší kořeny oproti netransgennímu druhu. Transgenní rostliny pro fytoremediaci organických látek Životní prostředí je v současné době kontaminováno nejen těžkými kovy, ale i organickými látkami, jako jsou např. organická rozpouštědla benzen, toluen, ethylbenzen, xylen (BTEX), výbušniny, polychlorované bifenyly (PCB), pesticidy aj. Aby rostliny mohly tyto látky lépe degradovat, v nejlepším případě až mineralizovat, lze vnášet do rostlinného genomu geny z prostudovaných bakteriálních degradačních drah. Úspěšně se tedy dají využít některé bakteriální, ale i savčí geny pro vnesení do rostlin za účelem zvýšení biodegradace nebezpečných látek. Z bakteriálních genů to jsou např. některé geny pro degradaci trinitrotoluenu (TNT) (French a kol., 1999; Hannink a kol., 2007), geny pro degradaci aromatických uhlovodíků (Shimizu a kol., 2002) a polychlorovaných bifenylů (Frančová a kol., 2001; Novakova a kol., 2009, 2010). Savčí geny, např. pro cytochrom P450, představují rovněž významnou kapitolu pro transformaci xenobiotik (Doty a kol., 2000; Inui a kol., 2000; Kawahigashi a kol., 2002, 2005).

V rámci práce naší laboratoře se zabýváme přípravou transgenních rostlin jak pro fytoremediaci anorganických polutantů, tak i organických polutantů (Novakova a kol., 2009, 2010). Pro transformaci rostlin za účelem získání rostliny s vyšší účinností degradovat organické polutanty byla použita rostlina Nicotiana tabacum a bakteriální geny bphc a todc1c2. Gen bphc kóduje 2,3- dihydroxybifenyl-1,2-dioxygenasu katalyzující štěpení aromatického kruhu dihydroxybifenylu a byl klonován ve fúzi s genem pro ß-glukuronidasu (GUS), s genem pro luciferasu (LUC) a s histidinovou kotvou (Novakova a kol., 2009). Geny todc1c2 byly klonovány s histidinovou kotvou (gen todc1) a kódují bakteriální dioxygenasu ISP TOL, která je součástí multikomponentního enzymu toluendioxygenasy a katalyzuje oxygenaci toluenu a jiných organických sloučenin. Toluendioxygenasa je enzym se širokou substrátovou specifitou, popsáno bylo již přes 60 substrátů, mezi něž patří také bifenyl, trichlorethylen, 2,3-dichlor-1-propen aj. Materiály a metody Zdrojové organismy Jako zdrojové organismy lze využít celou škálu prokaryot i eukaryot. V případě klonování genu bphc byla použita bakterie Pandoraea pnomenusa B-356 (Hein a kol., 1998), kdy byl gen bphc klonován ve fúzi s genem pro ß-glukuronidasu (GUS), s genem pro luciferasu (LUC) a s histidinovou kotvou. V případě klonování genů todc1 a todc2 byly tyto amplifikovány z bakterie Pseudomonas testosteroni F1. Bakteriální kmeny Pro metody klonování lze využít např. kmeny (v případě klonování genů bphc a todc1c2) Escherichia coli DH5α, Escherichia coli S17-I, Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pmp90rk), Agrobacterium tumefaciens C58C1 (pch32). Bakterie jsou kultivovány v médiu dle Luria- Bertani (LB) při 37 C (E. coli) nebo 28 C (A. tumefaciens). Příprava transgenních rostlin Před samotnou transformací rostlin je nejprve amplifikován požadovaný gen, který je následně pomocí metod genového inženýrství vnesen do zvoleného rostlinného vektoru pod kontrolou vhodně vybraného promotoru. Využití agrobakteriálního přenosu je v současnosti jednou z hlavních technik využívaných pro vnesení požadovaných genů do rostlinného genomu (Barret a kol., 1997). Tato metoda přenosu genetické informace do rostlinných buněk je založena na přirozené vlastnosti půdních bakterií Agrobacterium tumefaciens a Agrobacterium rhizogenes infiltrovat poraněnou tkáň vyšších rostlin a vnášet své specifické geny do rostlinného genomu. Při laboratorní přípravě transgenních rostlin infikuje kmen agrobakteria, obsahující připravený vektor poraněné buňky, rostliny, které následně regenerují a jednotlivé regeneranty jsou pěstovány na selekčním médiu s cílem získat pouze ty, které obsahují nový transgen. Testování transgenních rostlin Výsledné transgenní rostliny jsou dále testovány na přítomnost transgenu metodou PCR a dále na přítomnost transkribované mrna metodou RT-PCR. Exprimované proteiny jsou poté studovány technikami např. SDS-PAGE, MALDI-TOF, Western blot, popřípadě jsou tyto rekombinantní proteiny izolovány z rostlinných pletiv a podrobeny analýze. Vlastnosti transgenních rostlin využitelných pro fytoremediační účely musí být dále studovány z hlediska jejich viability na toxických substrátech a fytoremediačních schopností, ať je to akumulace anorganických polutantů, nebo metabolizace organických polutantů. Výsledky a diskuse V naší laboratoři se již dlouhodobě zabýváme tématikou bioremediací polutantů životního prostředí pomocí mikroorganismů metabolizujících nejen polychlorované bifenyly (PCB) (Beranova a kol., 2007; Dudkova a kol., 2009; Uhlik a kol., 2009), dále fytoremediací těchto polutantů vybranými druhy rostlin (Mackova a kol., 2009; Rezek a kol., 2009; Zlamalikova a kol., 2009), kooperací rostlin a mikroorganismů v procesu remediace (Stursa a kol., 2009; Trbolova a kol., 2009; Vrchotova a kol., 2009), stimulací indigenní mikroflory utilizující tyto látky (Leigh a kol., 2006, Uhlik, 2009) nebo ekotoxicitou a genotoxicitou vybraných polutantů (Lovecka a kol., 2007). Tato práce přináší do dané

problematiky nové poznatky, možnost fytoremediace s využitím geneticky modifikovaných rostlin, které ve svém genomu obsahují geny důležité např. pro degradaci bifenylu, PCB, popř. toluenu a jiných organických polutantů. Závěr Použití geneticky modifikovaných rostlin pro fytoremediace prozatím nebylo realizováno v praxi v širším měřítku, přesto je však známo několik úspěšných příkladů, které prokázaly vyšší účinnost akumulace anorganických látek, degradace organických látek nebo i vyšší rezistenci nových transgenních rostlinných druhů k různým polutantům, a některé z nich jsou již uváděny do životního prostředí. Poděkování: Tato práce byla podporována granty MSMT 1M06030, ME-09024-BIOAROM, MSM 6046137305 a EU grantem Minotaurus FP7 KBBE-2010-4-265946. Literatura: Arshad M., Saleem M., Hussain S. 2007. Perspectives of bacterial ACC deaminase in phytoremediation. Trends Biotechnol. 25, pp. 356-362. Barret C., Cobb E., McNicol R., Lyon G. 1997. A risk assessment study of plant genetic transformation using Agrobacterium and implications for analysis of transgenic plants. Plant Cell Tissue Organ. Cult. 47, pp. 135-144. Beranova K., Kochankova L., Macek T., Mackova M. 2007. Rhizoremediation for decontamination of long-term PCB contaminated soil with focus on microbial diversity. J. Biotechnol. 131, pp. 243. Cunningham S. D., Ow D. W. 1996. Promises and prospects of phytoremediation. Plant Physiol. 110, pp. 715 719. Doty S. L., Shang T. Q., Wilson A. M., Tangen J., Westergreen A. D., Newman L. A., Strand S. E., Gordon M. P. 2000. Enhanced metabolism of halogenated hydrocarbons in transgenic plants containing mammalian cytochrome P450 2E1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12, pp. 6287-6291. Dudkova V., Demnerova K., Bedard D. L. 2009. Microbial dechlorination of polychlorinated biphenyls. FEBS J. 276, pp. 178. Frančová K., Macek T., Demnerová K., Macková M. 2001. Transgenní rostliny potenciální nástroj pro dekontaminaci polutantů životního prostředí. Chem. Listy 95, pp. 630-637. French C. E., Rosser S. J., Davies G. J., Nicklin S., Bruce N. C. 1999. Biodegradation of explosives by transgenic plants expressing pentaerythriol tetranitranitrate reductase. Plant Physiol. 17, pp. 491-494. Grichko V. P., Filby B., Glick B. R. 2000. Increased ability of transgenic plants expressing the bacterial enzyme ACC deaminase to accumulate Cd, Co, Cu, Ni, Pb, and Zn. J. Biotechnol. 81, pp. 45-53. Guo X. X., Zhao H., Shi D. J., Xu J., Xu X. D., Ru B. G. 1998. Expression of mouse MT-1 cdna in filamentous cyanobacterium to enhance its metal-resistance. Acta Bot. Sin. 40, pp. 320 324. Hannink N. K., Subramanian M., Rosser S. J., Basran A., Murray J. A. H., Shanks J. V., Bruce N. C. 2007. Enhanced transformation of TNT by tobacco plants expressing a bacterial nitroreductase. Int. J. Phytoremediat. 9, pp. 385-401. Hein P., Powlowski J., Barriault D., Hurtubise Y., Ahmad D., Sylvestre M. 1998. Biphenyl-associated meta-cleavage dioxygenases from Comamonas testosteroni B-356. Can. J. Microbiol. 44, pp. 42-49. Chaney R. L., Malik M., Li Y. M., Brown S. L., Brewer E. P., Angle J. S., Baker A. J. M. 1997. Phytoremediation of soil metals. Curr. Opin. Biotechnol. 8, pp. 279-284. Inui H., Kodama T., Ohkawa Y., Ohkawa H. 2000. Herbicide metabolism and cross-tolerance in transgenic potato plants co-expressing human CYP1A1, CYP2B6 and CYP2C19. Pestic. Biochem. Physiol. 66, pp. 116-129.

Kawahigashi H., Hirose S., Hayashi E., Ohkawa H., Ohkawa Y. 2002. Phytotoxicity and metabolism of ethofumesate in transgenic rice plants expressing the human CYP2B6 gene. Pestic. Biochem. Physiol. 74, pp. 139-147. Kawahigashi H., Hirose S., Inui H., Ohkawa H., Ohkawa Y. 2005. Enhanced herbicide cross-tolerance in transgenic rice plants co-expressing human CYP1A1, CYP2B6, and CYP2C19. Plant Sci. 168, pp. 773-781. Leigh M. B., Prouzova P., Mackova M., Macek T., Nagle D. P., Fletcher J. S. 2006. Polychlorinated biphenyl (PCB)-degrading bacteria associated with trees in a PCB-contaminated site. Appl. Environ. Microbiol. 72, pp. 2331-2342. Lovecka P., Zlamalikova J., Demnerova K., Mackova M., Kochankova L. 2007. Bacterial and plant systems as bioremediation and ecotoxicity models. J. Biotechnol. 131, pp. 129. Ma M., Tsang W. K., Kwan K. M. F., Lau P. S., Wong Y. S. 1997. Preliminary studies of the identification and expression of metallothionein-like gene in Festuca rubra. Acta Bot. Sin. 39, pp. 1078-1081. Macek T., Kotrba P., Svatos A., Novakova M., Demnerova K., Mackova M. 2008. Novel roles for genetically modified plants in environmental protection. Trends Biotechnol 26, pp. 146-152. Mackova M., Prouzova P., Stursa P., Ryslava E., Uhlik O., Beranova K., Rezek J., Kurzawova V., Demnerova K., Macek T. 2009. Phyto/rhizoremediation studies using long-term PCB-contaminated soil. Environ. Sci. Pollut. Res. 16, pp. 817-829. Nie L., Shah S., Rashid A., Burd G. I., George Dixon D., Glick B. R. 2002. Phytoremediation of arsenate contaminated soil by transgenic canola and the plant growth-promoting bacterium Enterobacter cloacae CAL2. Plant Physiol. Biochem. 40, pp. 355-361. Novakova M., Mackova M., Chrastilova Z., Viktorova J., Szekeres M., Demnerova K., Macek T. 2009. Cloning of the bacterial bphc gene into Nicotiana tabacum to improve the efficiency of PCB phytoremediation. Biotechnol. Bioeng. 102, pp. 29-37. Novakova M., Mackova M., Antosova Z., Viktorova J., Szekeres M., Demnerova K., Macek T. 2010. Cloning the bacterial bphc gene into Nicotiana tabacum to improve the efficiency of phytoremediation of polychlorinated biphenyls, Author`s view. Bio. Bugs 1, pp. 419-423. Rezek J., Macek T., Mackova M., Triska J. 2007. Plant metabolites of polychlorinated biphenyls in hairy root culture of black nightshade Solanum nigrum SNC-9O. Chemosphere 69, pp. 1221-1227. Shimizu M., Kimura T., Koyama T., Suzuki K., Ogawa N., Miyashita K., Sakka K., Ohmiya K. 2002. Molecular breeding of transgenic rice plants expressing a bacterial chlorocatechol dioxygenase gene. Appl. Environ. Microbiol. 68, pp. 4061-4066. Song L. Y., Shi D. J., Ni Y., Luo N., Shao N., Yu M. M., Ru B. G. 2001. The integration and expression of ββ mutant gene of human liver metallothionein in Synechocystis sp. PCC 6803 by homology recombination. Acta Bot. Sin. 43, pp. 399 404. Stursa P., Uhlik O., Kurzawova V., Kochankova L., Macek T., Mackova M. 2009. Rhizosphere bacteria and their role in degradation of PCB. FEBS J. 276, pp. 184. Tang C. F., Liu Y. G., Zeng G. M., Li X., Xu W. H., Li Ch. F, Yuan X. Z. 2005. Effects of exogenous spermidine on antioxidant system responses of Typha latifolia L. under Cd2+ stress. J. Int. Plant Biol. 47, pp. 428 434. Trbolova L., Dudkova V., Mackova M., Macek T. 2009. Secondary metabolites of plants and their contribution to bacterial degradation of xenobiotics. FEBS J. 276, pp. 293. Uhlík O. 2009. Přístupy k analýze diversity bakterií metabolizujících bifenyl v reálné kontaminované půdě. Disertační práce, VŠCHT Praha. Uhlik O., Jecna K., Mackova M., Vlcek C., Hroudova M., Demnerova K., Paces V., Macek T. 2009. Biphenyl-metabolizing bacteria in the rhizosphere of horseradish and bulk soil contaminated by

polychlorinated biphenyls as revealed by stable isotope probing. Appl. Environ. Microbiol. 75, pp. 6471-6477. Vrchotova B., Mackova M., Macek T. 2009. Transformation of chlorobenzoic acids by plant-bacteria associations. FEBS J. 276, pp. 295. Zhang R. Q., Tang Ch. F., Wen S. Z., Liu Y. G., Li K. L. 2006. Advances in research on genetically engineered plants for metal resistance. J. Int. Plant Biol. 48, pp. 1257-1265. Zlamalikova J., Demnerova K., Mackova M., Hajslova J., Pulkrabova J., Hradkova P., Napravnikova M., Macek T., Stiborova H. 2009. Plant uptake of hexabromocyclododecane (HBCD). FEBS J. 276, pp. 296.