OSNOVA PEDNÁŠKY Molekulární biologie prokaryot Prokaryotický genom, jeho složky a vzájemné interakce A. Bakteriální chromozom B. Plazmidy (F-, R-, Ti-, Col-plazmidy), C. Prokaryotické mobilní elementy (IS, Tn) Mutace baktérií, jaderná segregace, fenotypové zdržení, fluktuaní test, metody selekce mutant Reparace mutaních poškození DNA Využití transpozon ke studiu prokaryotického genomu (Transpozonová mutageneze) Zpsoby penosu genetické informace u prokaryot Doporuená literatura: Rosypal S. a kol.: Obecná bakteriologie, SPN Praha 1981. Joset F.: Guespin-Michel J. Prokaryotic Genetic. Blackwell Science ltd. 1993. Lewin B.: Genes V-VII, Oxford University Press, Oxford, New York Tokyo 1994-2000. Maloy S.R. et al.: Microbial Genetics, 2. vydání, Jones and Barlett Publ, Boston-London, 1994. Birge E.A.: Bacterial and bacteriophage genetics. Springer 2000. Rosypal S. a kol. Úvod do molekulární biologie. 1998-2002. A. Konjugace B. Transdukce, kapsdukce C. Transformace Restrikní a modifikaní systémy prokaryotických bunk Evoluce bakteriálního genomu Význam prokaryot z hlediska molekulární biologie - Modelové organismy pro studium základních biologických proces - krátká generaní doba, vysoký poet jedinc - snadná kultivace na definovaných pdách (alespo u vtšiny) - dobe pístupné studiu, snadná izolace biol. makromolekul a struktur - možnost sledování genomových zmn v krátkých asech - studium evoluce
Praktický význam prokaryotických organism - patogenita (parazitismus, symbioza) - využití v biotechnologiích (kvasný prmysl, píprava nápoj a potravin) - producenti významných látek (antibiotika, enzymy, farmaka, sekundární metabolity) - producenti cizorodých látek pipravených metodami GI (inzulin, hormony aj). - píprava probiotik - píprava vakcín - využití extrémofil a jejich produkt Srovnání velikosti genom prokaryot a eukaryot U prokaryot neplatí paradox hodnoty C
replikony Obsah GC = 22-75mol% Prokaryota s lineárním chromozomem Streptomyces (ambofaciens, lividans) 10 Mb Borrelia burgdorferi (B. hermsii) 0.95 Mb Coxiella burnetii 2,1 Mb Paracoccus denitrificans -ti molekuly DNA 2 Mb; 1,1 Mb; 0,64 Mb, dv jsou lineární Agrobacterium tumefaciens
Genom Agrobacterium tumefaciens C58 Sekvencované genomy prokaryot BAKTERIE Velikost Poet gen rok genomu (kb) Haemophilus influenzae KW20 1830 1850 1995 Mycoplasma genitalium G-37 580 468 1995 Synechocystis sp.pcc 6803 3573 3168 1996 Mycoplasma pneumoniae M129 816 677 1996 Escherichia coli K12-MG1655 4639 4289 1997 Helicobacter pylori 26695 1667 1590 1997 Bacillus subtilis 168 4214 4099 1997 Borrelia burgdorferi B3 1230 1256 1997 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 4411 3959 1998 Aquifex aelicus 1551 1544 1998 Treponema pallidum Nichols 1138 1041 1998 Chlamydia trachomatis serovar D 1042 896 1998 Rickettsia prowazekii Madrid E 1111 834 1998 Helicobacter pylori J99 1643 1495 1999 Chlamydia pneumoniae CWL029 1236 1052 1999 Thermotoga naritima MSB8 1860 1877 1999 Deinococcus radiodurans RI 3284 3187 1999 Vibrio cholerae EI Tor N16961 4033 3885 2000 Campylobacter jejuni NCTC 11168 1641 2106 2000 Chlamydia pneumoniae AR39 1229 1052 2000 Chlamydia trachomatis MoPn Nigg 1069 924 2000 Pseudomonas aeruginosa PAO1 6264 5570 2000 Neisseria meningitidis Z2491 2184 2121 2000 Xylella fastidiosa 2679 2904 2000 E. coli 0157:H7 EDL933 4100 (K12+1387) 2001 Mycobacterium leprae 3268 ~2000 2001 ARCHAEA Methanococcus jannaschii DSM 2661 1664 1750 1996 Methanobacterium 1751 1918 1997 thermoautotrophicum Archaeoglobus fulgidus DSM 4303 2178 2493 1997 Pyrococcus horikoshii (shinkaj) 1738 1979 1998 Aeropyrum pernix K1 1669 2620 1999 Pyrococcus abyssi GE5 1765 1765 - EUKARYOTA Saccharomyces cerevisiae S288C 12,07 6294 1997 Caenorhabditis elegans 97,00 19099 1998 Drosophila melanogaster 137,00 14100 2000 Arabidopsis thaliana 115,40 25498 2000 Lidský genom (Collins) 2693(84%) 31780 2001 Lidský genom (Venter) 2654(83%) 39114 2001 Typy sekvencí prokaryotického genomu Kódující oblasti (ORF se známou nebo neznámou funkcí) Inzerní sekvence Transpozony Profágy a defektní fágy Sekvence pepisované do RNA (rrna, trna) Repetice (15 stovky bp) Polynukleotidové sekvence a tandemové repetice Krátké roztroušené repetitivní sekvence Dlouhé roztroušené repetitivní elementy Mosaikové repetitivní elementy Hypervariabilní mikrosatelity, mononukleotidová opakování Chi-místa a jim podobné (oktanukleotidy) Rhs elementy(9,6 kb u E. coli)
Výsledky získané ze srovnání sekvencovaných genom (30 genom - 45 Mbp DNA 44 000 ORF, z nichž polovina má dosud neznámou funkci) 1. Poet informaních gen (nap. geny pro replikaci, transkripci nebo translaci aj) je v každém genomu zhruba stejný, i když se jejich velikosti liší až 5x. Tyto procesy vyžadují základní sadu protein. 2. Poet gen ostatních funkních kategorií (biosyntéza aminokyselin, získávání energie, metabolismus a transport, regulaní funkce) je mnohem variabilnjší a má tendenci se zvtšovat 3. Se zvtšováním velikosti genomu pibývá paralogních gen a zvtšuje se též biochemická komplexita organismu. 4. Jedna tvrtina ORF u každého druhu je jedinená a nemá významnou sekvenní homologii k žádné dostupné proteinové sekvenci. Horizontální penos gen (z analýzy 17 kompletních genom bakterií a 7 archeií rozdíly v obsahu GC a používání kodon) Poet HT gen kolísá od 1,56 do 21,4%. asto penášené geny: operaní geny pro komunikaci (regulace, bunné procesy) a bunnou strukturu Mén asto penášené geny: informaní geny (replikace, transkripce, translace aj) Vtšina HT gen je jen v jedné nebo dvou vývojových liniích. Nkteré z tchto gen jsou geny tvoící ásti profág, ostrovy patogenity, transpozony, intergázy, rekombinázy. Genomické ostrovy (bloky DNA se znaky mobilních genetických element) - fitness ostrovy ekologické ostrovy saprofytické ostrovy symbiosové ostrovy ostrovy patogenity TYPY REPETICÍ V PROKARYOTICKÝCH GENOMECH A. Polynukleotidové sekvence a tandemové repetice Trinukleotid TGG nejastjší trinukleotid E. coli (souást penta nebo oktanukleotid) Nonamer AAGTGCGGT (uptake signal sequence USS) H. influenzae - 1465 kopií Tandemov opakované polynukleotidové sekvence (GTG)n nebo (GCC)n - vysoce repetitivní u E. coli, S. typhimurium a Shigella sp. Short tandemly repeated repetitive (STRR) sequences - heptanukleotidová opakování u sinice Calothrix Major polymorphic tandem repeat (MPTR) - polymorfní 10-bp DR u Mycobacterium tuberculosis a dalších mykobakterií (podobnost s místy Chi a roztroušenými REP elementy) B. Krátké roztroušené repetitivní sekvence (kratší než 50 bp) REP (repetitivní extragenové palindromatické sekvence) 38 bp, 500 REP u E. coli PU (palindromic units) u E. coli a S. typhimurium. Mnohokopiový 26-mer (Ngrep) u Neisseria gonorrhoeae a N. meningitidis Mnohokopiový 24-mer DR element u Mycobacterium bovis (38 kopií) C. Dlouhé roztroušené repetitivní elementy (vtší než 50 bp) intergenic repeat unit (IRU) enterococcal repetitive intergenic consensus (ERIC) 126 bp nebo zkrácené formy. Chromozomová lokalizace se liší u kmen a druh ERIC-like sekvence celá bakteriální íše. RLEP (545-1063 bp) u Mycoplasma leprae 28 (0,6% genomu) Mx-rep u Myxococcus xanthus - 87 pb jádrová sekvence Dr-rep (SARK) u Deinocccus radidurans Element o variabilní délce (150-192 bp RepMP2, RepMP1, SDC1 (150 bp 1 kb) u Mycplasma pneumoniae, v genomu 8-10 kopií.. RepMP2-like u Staphylococcus D. Mosaikové repetitivní elementy Bacterial Interspersed Mosaic Elements (BIME) (kombinace REP a sedmi dalších repetitivních motiv). 500 u E. coli a dalších G- enterobakterií (Klebsiella pneumoniae, S. typhimurium) REP MP 1 300 bp element ohraniený kratšími reeptitivními sekvencemi u M. pneumoniae. BOX elementy rozptýlené repetitivní elementy u G+ (Streptococcus pneumoniae).
Chromozomové pestavby Podmínny pítomností opakujících se sekvencí = substrát pro homologní rekombinace Genetická organizace prokaryotického genomu - velmi kompaktní genom s malými mezerami mezi geny - vtšina genomu obsazena strukturními geny - malá ást (11%) tvoena nekódující DNA - operonové uspoádání gen (vtšinou funkn píbuzné) - poadí gen není u prokaryot konzervováno
Fyzikální organizace bakteriálního chromozomu - ds DNA, neobalené jadernou membránou - vazba malých protein typu HU (histon-like) - 10 5 molekul, ovlivujících flexibilitu DNA (ohýbání DNA do kruh) - 50 superhelikálních smyek, bez úasti RNA - kontrola stavu superhelicity: topoizomeráza, gyráza rozmotání po replikaci, pichycení na membránu - Struktura chromozomu E. coli 4,6 Mbp, 50% GC, 1 m Charakteristika plazmid dsdna kružnicová nebo lineární, velikost: 1-1000 kb Základní typy plazmid: kryptické - funkce neznámá epizomální - reverzibilní intergace do chromozomu hostitele konjugativní - schopné penosu konjugací mobilizovatelné penositelné za pítomnosti konjugativního plazmidu Píklady plazmid: * F-plazmidy (fertilitní faktor, konjugativní) - zodpovdné za konjugaci, píp. mobilizaci jiných plazmid * R-plazmidy (R-faktory) - zodpovdné za rezistenci k antibiotikm, ada z nich konjugativní * kolicinogenní (Col-plazmidy) - tvorba protein s antibiotikovým charakterem (Enterobacteriaceae) * Ti-plazmidy (tumory indukující) - tvorba nádor u dvoudložných rostlin (Agrobacterium tumefaciens) * plazmidy odbourávající organické sloueniny (Pseudomonas) * plazmidy podílející se na fixaci vzdušného dusíku (Rhizobium). * Plazmidy používané jako vektory pro penos DNA (pbr322, puc)