RŮSTOVÁ KŘIVKA BAKTERIÁLNÍ POPULACE I. lag fáze - adaptace na nové prostředí, b. se nemnoží naopak starší odumírají, vytvářejí se potřebné enzymy a zvětšují svůj objem. Délku lag fáze ovlivňuje složení prostředí, zejména velikost a stáří inokula II. fáze zrychleného růstu - kultura je plně přizpůsobena podmínkám prostředí, buňky se začínají množit s narůstající rychlostí dělení, zvyšuje se intenzita metabolismu, zvýšená citlivost na nepříznivé vlivy prostředí III. fáze logaritmická (exponenciální) - intenzivní množení, počet roste geometrickou řadou, aktivní metabolismus a rychlé využívání substrátu, rychlost dělení je konstantní, úbytek buněk odumíráním je minimální
IV. fáze zpomaleného růstu - postupné zbrzdění množení a celkového metabolismu, rychlost dělení se snižuje v důsledku vyčerpání živin a hromadění metabolitů V. fáze stacionární - vyrovnává se počet odumírajících b. s přírůstkem, nedostatek biologického prostoru VI. fáze poklesu (zrychleného odumírání)- nárůst úbytku buněk - převaha nad přírůstkem, rychlost dělení klesá pod nulovou hodnotu
Typy kultivace Statická Submerzní Kontinuální
SPORULACE bakterie r. Clostridium, Bacillus za nepříznivých podmínek přeměna vegetativní formu buňky v klidovou (dormantní) - nulový metabolismus a extrémní odolností - spora, endospora (tvoří se uvnitř jedné buňky) je to diferenciace na prokaryotní úrovni, řízena geny (spící), jejichž exprese probíhá na základě impulsů z prostředí, vypínány jsou geny dosud aktivní ke sporulaci dochází ke konci exponenciální fáze růstu, místo symetrického buněčného dělení dojde k asymetrickému dělení buňky. Vzniknou dvě nestejně velké poloviny s úplným genomem, ale s různou budoucností - spora a sporangium (tvorba spor trvá asi 10 hodin)
změna jaderného materiálu Průběh sporulace oba chromozomy vytvoří jediné vlákno umístněné podélně v buňce vytvoření sporového septa tvorba vychlípeniny směrem dovnitř buňky a vytvoření septa vznik prospory vychlípením septa vznikají z CM dvě další membrány - vnější a vnitřní, vzniká prespora dále může sporulace probíhat bez přívodu živin, důležité jsou vápenaté ionty tvorba obalových vrstev spory mezi vnější a vnitřní membránou se tvoří silná vrstva - kortex mezi kortexem a vnitřní sporovou membránou vzniká sporová stěna a vnější plášť u některých druhů exosporinum
zrání spory ztráta vody (15%) Průběh sporulace hromadění dipikolinátu vápenatého (DV) kys. dipikolinová (pyridin - 2,6-dikarboxylová kys.) chybí u vegetativních buněk ztráta vody a DV jsou příčinou vysoké termorezistence spor uvolnění spory z buňky jen u některých druhů BIOCHEMIE SPORULACE energii k syntéze sporových struktur z oxidace vnitrobuněčné kys. poly-ß-hydroxymáselné u aerobů nezbytný kyslík, u anaerobů kyslík sporulaci inhibuje potřeba kationtů NH 4, Mn, Ca, Co, Ni; aniontů PO 4, SO 4, NO 3
FYZIOLOGICKÉ VLASTVOSTI BAKTERIÁLNÍ SPORY Termorezistence snáší několikahodinový var usmrceny vlhkým teplem po 15-30 min. při 115 až 120 o C Zvýšená odolnost k jedovatým látkám spory nepřijímají např. barviva Mírně zvýšená radiorezistence vzniká nepohyblivostí volných radikálů vzniklých zářením Zvýšená rezistence k vysychání, hladovění a jiným nepříznivým vlivům
KLÍČENÍ BAKTERIÁLNÍCH SPOR nastává po přenesení spory do vhodných podmínek (voda, živiny, ph a teplota) začíná porušením kortexu, následuje příjem vody, uvolnění DV, prasknutí obalů (trvá 30 až 60 min.) lze urychlit tepelným šokem (60-80 o C/2-5 min.)
FYZIKÁLNÍ ÚČINKY PROSTŘEDÍ NA BAKTERIE Vlhkost - bakterie obsahují 80% vody, zástava činnosti, smrt nebo konzervace (lyofilizace) Osmotický tlak - vnitřní prostředí bakterií vykazuje přetlak 0,5 až 2,0 MPa, rozdíl je kompenzován pevností b. stěny osmotolerantní, osmofilní halotolerantní, halofilní Koncentrace vodíkových iontů intracelulární ph je 6,5 rozsah od ph prostředí od 4,5 do 8,0 bakterie octového kvašení ph 1,0; Alcaligenes faecalis 9,0 mykobakteria - acidorezistence
FYZIKÁLNÍ ÚČINKY PROSTŘEDÍ NA BAKTERIE Záření - 3 kategorie jevů žádné nebo malé změny (sluneční záření) zachycení sluneční energie a transformace v energii ATP (fotosyntéza) ztráta biologické funkce molekul NK, bílkovin (ÚV záření) NK maximum absorpce 260nm bílkoviny 180 až 280 nm
Genetika bakterií ULOŽENÍ GENETICKÉ INFORMACE V BAKTERIÁLNÍ BUŇCE Chromozom bakterií je tvořen dsdna svinutou do dvoušrobovice, terciální struktura - klubko obsahuje miliony nukleotidů Extrachromozomální genomy plazmidy profágy (genomy bakteriofágů)
Bakteriální genom Většina genů bakterií je uložena v chromozomu bakteriální buňky, jedna kruhová molekula obsahuje asi 4000 kbp. Další geny mohou být uloženy na plazmidech (několika tisíců párů bází až 100 kbp) Kruhová DNK chromozomozomu a plazmidů obsahuje genetickou informaci nezbytnou pro jejich replikaci Poznána sekvence celého genomu Haemophilus influenzae (1995) V roce 2000 kompletní sekvence genomu Pseudomonas aeruginosa a původce cholery člověka Vibrio cholerae Dnes popisy sekvence genomu nejméně 70druhů bakterií
REPLIKACE BAKTERIÁLNÍHO CHROMOZOMU při dělení buňky každá dceřinná b. dostane jednu kopii chromozomu replikace probíhá symetricky, jednosměrně, za současného rozplétání dvoušroubovice mechanismus replikace je složitý, na jednom řetězci probíhá spojitě a na druhém formou Okazakiho fragmentů, protože DNA polymeráza může prodlužovat řetězce DNA jen od 3 konce replikace probíhá rychlostí tisíců nukleotidů za sekundu
REPLIKACI DNA BLOKUJÍ NĚKTERÁ ANTIBIOTIKA!!! Rifampicin - brání syntéze RNA primeru (ne však primerů Okazakiho fragmentů) Kys. nalidixová- ruší funkci A subjednotky enzymu gyrázy Coumermycin - blokuje B subjednotku gyrázy Akridinová barviva, chromomycin, daunomycin, aktinomycin D - inretkalují mezi řetězce DNA a znesnadňují jejich rozplétání
TRANSKRIBCE GENETICKÉ INFORMACE přenos informace z DNA na ribosomy (transkribce) je zprostředkován mediátorovou RNA mrna se syntetizuje jako kopie jednoho řetězce DNA dvoušrobovice DNA je při transkribci rozevírána a mrna je syntetizována DNA dependentní RNA polymerázou
TRANSLACE GENETICKÉ INFORMACE translace (překlad) g. informace z NK do polypeptidů na ribosomech se účastní tři RNA: rrna, mrna, trna rrna s proteiny tvoří strukturu ribosomu a navazuje mrna trna dodává aktivované aminokyseliny tvorbu polypeptidů rovněž zajišťuje řada enzymů Transkribce a translace jsou těsně spojeny, aminokyseliny jsou zabudovány do bílkoviny během dvou vteřin. Při transkribci a translaci negativně působí chloramfenikol, erytromycin, kasugamycin, puromycin, streptomycin, tetracyklin a další.
BAKTERIOFÁGY obligátní parazité bakteriálních buněk, nemají vlastní metabolismus mají podle své velikosti různou genetickou výbavu (od 3 do 160 genů) systém bakteriofágů je založen na tvaru kapsidy, druhu nukleové kyseliny
SCHÉMA REPLIKAČNÍHO CYKLU 1. INFEKCE BAKTERIOFÁGA bakteriofág nasedne na určité místo povrchu bakteriální buňky, receptory bakteriofág vpraví do buňky svou NK (profág) a bílkovinný obal zůstává mimo bakterii neobalená NK (extrachromozomální genom) se může vkládat do chromozomu bakterie
2. POMNOŽENÍ BAKTERIOFÁGA v bakterii dojde k replikaci profága, syntéze kapsidy a dalších bílkovin, k lyzi buňky a uvolnění infekčních bf. tj. lytická infekce - virulentní fág profág může v bakterii zůstat v klidovém stavu buď vložen do specifického místa chromozomu nebo mimo něj - bakterie se stává lysogenní lysogenní stav lze pomocí UV nebo mutagenů vrátit k lytické infekci 3. MATURACE BAKTERIOFÁGA NK a složky kapsidy se syntetizují na sobě nezávisle, po dosažení patřičné koncentrace se NK vbalí do kapsidy při infekci b. buňky více bakteriofágy může dojít k rekombinaci genomů a část fágů má hybridní charakter
SCHÉMA REPLIKAČNÍHO CYKLU BAKTERIOFÁGA 4. UVOLNĚNÍ BAKTERIOFÁGA fágový lysozym na pevné půdě dvůrek (plak), tekuté médium vyčeření Využití: fágová typizace
PLAZMIDY rozsáhlá skupina extrachromozomálních genomů jsou tvořeny kruhovou dsdna, která se replikuje nezávisle na chromozómu velikost od 1,5 do 400 kb (1 kilobaze - jeden gen) kryptické plazmidy nesou pouze geny pro existenci plazmidu plazmidy mohou nést geny, které samy nepotřebují a doplňují genetickou informaci bakterie, což jí může zvýhodnit (adaptace na změny prostředí) - Vir, Col, R plazmidy
PŘENOS GENETICKÉ INFORMACE intracelulárně intercelulárně vertikální přenos na přímé potomstvo kopií chromozomu, profágů nebo plazmidů horizontální přenos mezi nepříbuznými buňkami (i mezi různými druhy, rody)
A. INTERCELULÁRNÍ PŘENOS GI je zajišťován transdukcí, transformací a konjugací. 1.TRANSDUKCE je přenos zprostředkovaný bakteriofágy přenášen je jakýkoliv fragment chromozomální nebo plasmidové DNA svou délkou odpovídající maximálně délce genomu fága, proto, že při maturaci fága může být omylem vbalen do kapsidy místo DNA vlastní (frekvence přenosu určitého genu je10-4 -10-8 ) recipient se získanými vlastnostmi se označuje transduktant
2. TRANSFORMACE je přenos GI přímo čistou DNA, která vnikla do buňky recipienta z vnějšího prostředí. Griffithův pokus v r. 1928 (vysvětlil Avery v r. 1944) frekvence přenosu max. 5.10-2 transformovaný příjemce se nazývá transformant zvláštním případem transformace je transfekce (vnesení purifikovaného genomu fága vede k infekci a vytvoření kompletních bakteriofágů) mechanismus transformace je důležitým nástrojem šíření genů mezi bakteriemi uměle se vpravuje DNA do buněk elektroporací (vystavení buněk el. šoku, což vede ke krátkodobé depolarizaci BM a to umožní vniknutí cizorodé DNA do buněk) pro udržení a expresi musí být fragmenty DNA integrovány do chromozomu, plazmidu nebo profága
PŘENOS GENETICKÉ INFORMACE 3. KONJUGACE je přenos fragmentu DNA plasmidem z dárce na příjemce po navázání přímého kontaktu obou buněk pomocí sex pili dárce. je to jednosměrný proces fenotypicky změněný recipient je transkonjugant
B. INTRACELULÁRNÍ PŘENOS GI zajišťují transponovatelné elementy, inserční sekvence a transposony. Inserční sekvence (IS) - sobecké geny IS jsou úseky DNA dlouhé 750-1500bp, které mají na koncích 20-40 párů bazí odpovídajících si pořadím v invertované repetici (IR). Proto se IS s pomocí IR mohou navzájem vázat IS obsahují dále geny pro vlastní replikaci, vložení nové kopie do jiného místa téhož nebo jiného genomu, informaci pro tvorbu represoru, který brzdí replikaci a transpozici, aby nedošlo k inaktivaci genomu buňky porušením genů v IS nebyly prokázány geny měnící fenotyp bakterie
Transposony (Tn) skákavé geny jsou transponovatelné elementy dlouhé několik tisíc nukleotidů, které kromě genů pro translokaci a represi nesou ještě další, pro sebe nepotřebné informace nejdůležitější vektor v intracelulárním přenosu GI může přenést geny rezistence z chromozomu na plazmid a opačně v Tn byly nalezeny geny řídící rezistenci k antibiotikům a chemoterapeutikům, těžkým kovům, UV záření, řídící tvorbu enterotoxinů, adherenčních fimbrií
Integrony jsou delší úseky DNA, které se mohou, podobně jako transposony, intracelulárně přemístňovat do různých míst DNA. Integron je to tedy integrovaný segment DNK, kterýobsahuje integrázu, promotor a integrační místo pro genové kazety pravidelně obsahují gen řídící rezistenci k sulfonamidům je součástí Tn 21 a některých R plasmidů Bakteriofág MU (mutátor) má unikátní způsob množení, DNA se replikuje reduplikací za současné translokace fágového genomu na různá místa chromozomu hostitele. působí jako bakteriofág transdukující
ZMĚNY GENOMU BAKTERIÍ mohou vznikat rekombinací nebo mutací Rekombinace je nové uspořádání znaků uvnitř genomu nebo výměna částí mezi různými genomy. Mutace jsou dědičné změny genomu vedoucí ke změněné funkci jeho složek. Vitální mutace -změna fenotypu buňky. Letální mutace - zahynutí buňky Spontánní mutace -změny genetického základu, které vznikají vlivem záření radionuklidů zemské kůry, kosmickým zářením, chemickými vlivy, chybami v replikaci (průkaz fluktuačním testem). Indukované mutace -vznikají záměrným zásahem člověka fyzikálními a chemickými mutageny (UV záření, beta částice, akriflavinová barviva, aktinomycin D).
ZÁKLADNÍ PRINCIPY TECHNIKY KLONOVÁNÍ GENŮ Genové inženýrství - konstrukce rekombinantní molekuly DNA spojováním genů různých organismů za účelem pomnožení cloned DNA (cdna) nebo k výrobě produktu této DNA (genů) Nástroje GI Restrikční endonukleázy (restriktázy) - enzymy rozpoznávající přesné pořadí nukleotidů na dsdna a štěpí ji tak, že místa přerušení jsou navzájem o 2-6 basí posunuta nebo uprostřed specifické sekvence vznik kohezivních (lepivých) konců, které mají tendenci se spojovat (př. Eco RI) štěpení uprostřed specifické sekvence bez vzniku lepivých konců (př. Hind II)
ZÁKLADNÍ PRINCIPY TECHNIKY KLONOVÁNÍ GENŮ DNA ligázy, přítomné ve všech buňkách, opětovně spojují lepivé nebo tupé konce řetězců dsdna v nové molekuly. mohou spojit úsek jakékoliv dsdna vzniklý účinkem restriktázy s úsekem dsdna vyštěpeným stejnou restriktázou z jiné molekuly DNA (plazmidové, chromozomální, bakteriální,, rostlinné, hmyzí nebo savčí) vzniká tak hybridní DNA různého původu Klenow enzym (DNA polymeráza) - umožňuje reparovat nekompatibilní lepivé konce na tupé a ty pak ligovat.
ZÁKLADNÍ PRINCIPY TECHNIKY KLONOVÁNÍ GENŮ Transformace bakterií a selekce rekombinantů na tyto dva závěrečné kroky se vztahuje pojem klonování DNA transformace je proces vniknutí DNA plasmidu do bakterie selekce rekombinantů je klonovací krok, při kterém vybíráme klon obsahující inzertovanou DNA ve vektoru. Současně selektujeme i transformanty a to jednoduše růstem na agaru obsahujícím antibiotikum, pro které nese transformující plasmid selektivní marker
ZÁKLADNÍ PRINCIPY TECHNIKY KLONOVÁNÍ GENŮ Vektory - plasmidy, bakteriofágy, kosmidy (zkonstruované kombinací plasmidů s kohezními konci genomu fága lambda), fágmidy (kombinace bakterifágů a plazmidů) dnes na trhu kompletně zmapované vektory a vhodné hostitelské kmeny bakterií Genové knihovny - sbírky bakterií s vloženými cizími geny
EXPRESE KLONOVANÝCH GENŮ Převedení informace kódované v klonovaném genu na funkční protein (např. lidský insulin). Jsou zapotřebí tři kroky: transkribce DNA do mrna translace mrna do proteinové sekvence posttranslační modifikace proteinu signální sekvence (aminokyseliny navíc) - jsou odštěpeny během pasáže přes cytoplasmatickou membránu do periplasmatického prostoru) proteolysa proenzymu (u proinzulinu je štěpen střed molekuly - natažení 35 aminokyselin) Zvýšení exprese genu ovlivňují: počet kopií vektora (plasmid) v buňce síla promotoru sekvence ribosome binding site (RBS) proteolysa (peripl. prostor -mnoho proteáz)