ENVIRONMENTÁLNÍ TOXIKOLOGIE TERATOGENEZE Klára A. Mocová Laboratoř ekotoxikologie a LCA, Ústav chemie ochrany prostředí, Fakulta technologie ochrany prostředí, VŠCHT Praha
OBSAH Teratogeneze, teratogeny Příklady teratogeneze v historii Testy teratogenity
REPRODUKČNÍ A VÝVOJOVÁ TOXICITA Reprodukční toxicita negativně ovlivňuje schopnost reprodukce poškození samčích a samičích reprodukčních orgánů zvýšená potratovost snížení počtu potomstva ve vrhu Vývojová toxicita negativně ovlivňuje vývoj embrya a jedince do dosažení dospělosti embryotoxicita teratogeneze (především 17. 60. den nitroděložního vývoje plodu u člověka) postnatální vlivy toxických látek (např. vlivem laktace kontaminovaným mateřským mlékem u savců)
TERATOGENEZE Vznik poškození u plodu (malformace = znetvořené orgány, vrozené vývojové vady) Př. malformace polydaktylie (mnoho prstů), rozštěp rtu Faktory způsobující malformace = teratogeny Teratogeny chemické (rozpouštědla, léky...), fyzikální (RTG záření, vysoká teplota u člověka) i biologické (choroby viry, toxoplasmosa) Potencionálními teratogeny mohou být i mutagenní látky (např. těžké kovy)
TERATOGENEZE Vznik poškození orgánů u plodu v průběhu prenatálního vývoje (malformace, vrozené vývojové vady - VVV) Pozn.: VVV mohou mít i genetickou příčinu, pak se nejedná o teratogenezi, nýbrž mutagenezi Př. malformace: polydaktylie (= více než 5 prstů na jedné končetině), syndaktylie (= srůstání prstů) rozštěp rtu, rozštěp páteře, hydrocefalus (= nahromadění mozkomíšního moku v komorách mozku, deformity lebky, větší hlavička dítěte) VVV ledvin, VVV srdce (nejčastější)
TERATOGENY Teratogeny = faktory způsobující malformace Teratogeny chemické a fyzikální (RTG záření, vysoká teplota u člověka) i biologické - infekce matky: zarděnky, HIV a další viry, syfilis, toxoplasmosa - choroby matky: diabetes mellitus, fenylketonurie, poruchy funkce štítné žlázy, epilepsie Potencionálními teratogeny mohou být i mutagenní látky (např. těžké kovy) Testy teratogenity, především léky opatrnost v podávání léků v těhotenství nutná!
PŘÍKLADY TERATOGENŮ A JEJICH DŮSLEDKY Látka /faktor Ethanol PCB Methylrtuť Androgenní látky Vitamin A Thalidomid Radiace Infekce HIV Teratogenní projevy Fetální alkoholový syndrom, růstová i mentální retardace, mikrocefalus Nitroděložní retardace růstu, odbarvení pokožky Defekty na mozku, mentální retardace, epilepsie Maskulinizace ženských plodů, oboupohlavnost Defekty obličeje a neurální trubice, rozštěp patra Poškození končetin, srdeční vady Mikrocefalus, mentální retardace, malformace kostí Růstová retardace, mikrocefalus
Z HISTORIE Ve 20. století 3 nejznámější události spojené s teratogenezí: 1950 1962: methylrtuť: nemoc Mianamata (Japonsko) 1957 1963: thalidomid: malformace končetin (Německo i další) 1971: diethylstilbestrol: nádory v dospívání (USA)
MINAMATA Továrna na výrobu různých látek v japonském zálivu Minamata Methylrtuť v odpadní vodě z provozu Odtok kontaminace do moře Akumulace methylrtuti v rybách a mořských plodech Konzumace kontaminované potravy lidmi Plošné otravy a úhyn ryb, ptáků a koček (následované přemnožením krys) Dospělí lidé obvykle mnohem slabší příznaky otravy než děti narozené kontaminovaným matkám Příznaky u dětí: neschopnost chůze, třes rukou, ztráta zraku S každým dalším těhotenstvím snižování kontaminace matek první dítě nejvíce zasažené, ostatní děti méně či dokonce bez příznaků (kromě toho vylučování methylrtuti také mateřským mlékem)
THALIDOMID Lék na spaní a zklidnění Od roku 1957 (Německo) Jiné komerční názvy: Kontergan, Isomin, Proban byl doporučován také těhotným ženám proti těhotenským nevolnostem několik tisíc dětí s malformacemi končetin (zkrácené kosti, prsty vyrůstající z krátkých paží apod.) Cca 3500 případů v Německu (volný prodej) V USA málo případů (lék byl na předpis) V Japonsku asi 350 případů Další země méně (převážně západní Evropa) Nedostatečně otestován (pro potkana bezpečný, později zjištěno, že pro primáty již nebezpečný)
DIETHYLSTILBESTROL (DES) syntetický estrogen (1938, USA) podáván na ženské obtíže např. menopausa u těhotných žen se doporučoval jako prevence spontánních potratů po narození děti zcela bez viditelných potíží problémy u dětí až v období dospívání abnormality pohlavních orgánů a nádory pohlavních orgánů u obou pohlaví problémy u žen matek mnohem méně často
TĚHOTENSTVÍ: VLIV BABIČEK NA VNUČKY Průběh těhotenství neovlivňuje výlučně zdraví matky a jejího nenarozeného potomka (v děloze), ale v případě narození dcery se případné nepříznivé vlivy mohou projevit i ve třetí generaci (tj. na dětech porozené dcery vnoučatech matky) Vajíčka se u ženy začínají vyvíjet již v prenatálním období. Očekává-li těhotná žena narození dcery, mohou se se nepříznivé vlivy projevit jak na dceři, tak i na dceřiných vajíčkách (tj. na případných vnoučatech).
POZNÁMKY K ONTOGENEZI vyvíjející se organismus je velice citlivý (buňky a orgány, které rostou, jsou velmi zranitelné) totéž platí i pro obnovující se tkáně u člověka (např. děložní sliznice u ženy v období pravidelných menstruačních cyklů) zde riziko karcinogeneze Kelsey a Kelsey (USA) pokusy s chininem na králících: králičí matka schopna v játrech rychle chinin odbourat, plod však tuto schopnost nemá a chinin v něm zůstává mnohem déle. Plod a novorozenec jsou zcela jiní než dospělí Další příklad: rostlinný estrogen ze sóji isoflavon matka jej snadno vyloučí, u plodu se kumuluje a může posléze způsobit deformace či rakovinu pohlavních orgánů (Todaka et al., 2005)
TESTY NA OBRATLOVCÍCH obecně snaha snížit počet použitých zvířat v testování (etické, logistické a ekonomické důvody) nahradit savčí modely alternativními testy (např. tkáňovými kulturami) nejoblíbenějším savčím modelem je potkan méně častým myš nebo králík; králík je větší velikosti, proto má i větší nároky na prostor apod. Př.: kompletní otestování látky na reprodukční a vývojovou toxicitu (včetně teratogeneze) vyžadovalo použití 3910 ks. obratlovců v celkové výši 446 000; odhad nákladů na reprodukční a vývoj. toxicitu: 90 % všech zvířat nutných k provedení veškerých nutných testů a až 70% nákladů potřebných na registraci chemikálie
TESTY VÝVOJOVÉ TOXICITY (TERATOGENITY): WEC TEST Whole-Embryo Culture test (WEC) probíhá na potkaních nebo myších embryích embrya stará 9,5 dne se kultivují po 48 hod in vitro pozitivní kontrola 5-fluoracyl (toxická látka) negativní kontrola penicilin (bezpečná látka) dvoukrokový test: 3 embrya na 1 koncentraci (koncentrační řada s faktorem násobení 10) 7 embryí na 1 koncentraci, kdy se použije z předchozího testu nejvyšší koncentrace s žádným efektem a koncentrace s min. 50% efektem oproti kontrole + 2 koncentrace uprostřed tohoto intervalu hodnotí se růstové parametry, morfologické znaky a výskyt malformací (např. defekty na lebce, ocasu...) validovaný test (ECVAM 2006 alternativní testy)
TESTY TERATOGENITY NA OBRATLOVCÍCH - FETAX Test FETAX Frog Emryo Teratogenity Assay Xenopus Drápatka vodní Xenopus laevis (africká žába) Test probíhá na vajíčkách a v raných embryonálních stádiích. Sledované znaky: úhyn, malformace NICEATM, 2000
FETAX Testovací organismus: drápatka vodní, Xenopus laevis Velikost: samice až 13 cm, samci 7-8 cm Počet embryí v jedné misce: 25 Sledovaná odezva: úhyn, malformace Opakování: 2 Objem testované koncentrace: 10 ml Teplota: 24±2 C Doba expozice: 96 hodin Osvětlení: světelný cyklus 16 h / 8 h (světlo / tma) Pomůcky a zařízení: binokulární lupa zvětšující 30krát, inkubátor, atlas malformací
FETAX XENOPUSLAEVIS zdroj: www.wikipedia.org
ONTOGENEZE ŽÁBY
ONTOGENEZE ŽÁBY
TESTY TERATOGENITY NA OBRATLOVCÍCH - RYBY Další testy na jiných obojživelnících a rybách (výhodou jsou vysoké počty vajíček u daných skupin obratlovců) Test na embryotoxicity na daniu pruhovaném (Danio rerio) destičkové uspořádání (24 jamek) začátek testu 48 h po oplodnění 20 vajíček / koncentrace expozice trvá 48 h (12 h světlo / 12 h tma) sleduje se velikost vajíček, pozice oka, pohyby...
SAVČÍ MODELY o Ryby a obojživelníci jsou člověku vývojově ještě dost vzdálení o Lépe mít savčí model o Oblíbený modelový organismus je např. myš Přesto ani myš nemusí být dostačujícím modelem např. s ohledem na prenatální ontogenezi a tedy i teratogenezi má myš zcela odlišnou morfologii dělohy než člověk: myší děloha má tvar U a uvnitř až 15 embryí (plodů) liská děloha kulovitý tvar a obvykle jen 1 embryo (plod) Situace s thalidomidem ukázala nutnost v některých případech testovat teratogenitu na primátech
INDEX TERATOGENITY Index teratogenity (TI) LC50 letální koncentrace TC50 teratogenní koncentrace LC50 TI = TC50 Hodnota LC50 se získá z měření úhynu embryí, TC50 z hodnocení malformací Čím je index teratogenity vyšší, tím vyšší představuje látka riziko, že bude mít v životním prostředí teratogenní účinky Předpokládá se, že látky s TI < 1,5 nepředstavují z hlediska teratogeneze závažné riziko
INTERAKTIVNÍ ČÁST: MALFORMACE RYBÍCH EMBRYÍ Od přednášejícího obdržíte obrázky s rybími embryi. Vaším úkolem je nyní roztřídit je na zdravá embrya a embrya s malformacemi
POUŽITÁ LITERATURA Gupta, R.C.: Reproductive and Developmental Toxicology. Elsevier. Amsterdam, Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San Diego, San Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo 2011. Kimball J.W.: Biology. WCB Publishers. Dubuque, Melbourne, Oxford 1998. Mori, Ch., Todaka, E.: Environmental Contaminants and Children s Health. Sustainable Health Science for Future Generations. Maruzen Planet. Tokyo 2008.
DĚKUJI ZA POZORNOST Tento projekt (57/2013/B4: Inovace předmětu Environmentální toxikologie) je podporován ze zdrojů Fondu Rozvoje Vysokých Škol.