Introduction to gene targeting and genome editing

Podobné dokumenty
Geneticky modifikované zvířecí. modely pro charakterizaci. funkce genů

Editace genomů. Genome editing, or genome editing with engineered nucleases (GEEN)

Programovatelné nukleázy: nejefektivnější nástroje pro editaci genomu ve službách biomedicíny

Transgeneze u ptáků: očekávání vs. realita

Editace genomů. Genome editing, or genome editing with engineered nucleases (GEEN)

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Terapeutické klonování, náhrada tkání a orgánů

Myš jako model vývojové biologie. Vendula Pospíchalová

Kmenové buňky, jejich vlastnosti a základní členění

Rich Jorgensen a kolegové vložili gen produkující pigment do petunií (použili silný promotor)

růstu a buněčného dělění

Nové přístupy v modifikaci funkce genů: CRISPR/Cas9 systém

Transgenní zvířata jejich příprava a použití

GUIDELINES FOR CONNECTION TO FTP SERVER TO TRANSFER PRINTING DATA

VY_32_INOVACE_06_Předpřítomný čas_03. Škola: Základní škola Slušovice, okres Zlín, příspěvková organizace

Buněčný cyklus - principy regulace buněčného růstu a buněčného dělění

REKOMBINACE Přestavby DNA

Introduction to MS Dynamics NAV

RNA interference (RNAi)

Inovace profesní přípravy budoucích učitelů chemie

Indukovaná pluripotence. Petr Vodička Liběchov 16/11/2016

VÝZNAM FYZIOLOGICKÉ OBNOVY BUNĚK V MEDICÍNĚ

USING VIDEO IN PRE-SET AND IN-SET TEACHER TRAINING

Bakteriální transpozony

Modifikace dědičné informace rostlin II

GENETICS OF CAT S COLORS GENETIKA ZBARVENÍ KOČEK. Chaloupková L., Dvořák J. ABSTRACT ABSTRAKT ÚVOD

Czech Republic. EDUCAnet. Střední odborná škola Pardubice, s.r.o.

Tento materiál byl vytvořen v rámci projektu Operačního programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost.

Od sekvencí k chromozómům: výzkum repetitivní DNA rostlin v Laboratoři molekulární cytogenetiky BC AVČR

Biotechnology in the Czech Republic where we are?

TechoLED H A N D B O O K

II/2 Inovace a zkvalitnění výuky cizích jazyků na středních školách

Využití DNA markerů ve studiu fylogeneze rostlin

Bioinformatika a výpočetní biologie KFC/BIN. I. Přehled

PREKLINICKÁ DATA PRO LPMT

Evoluce fenotypu VIII.

Některé významné aspekty vývojové biologie v medicíně

Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

Obecná a srovnávací odontologie. Vývojové souvislosti 1: vznik a vývoj zubu jako produkt genetických regulačních kaskád, odontogenní regulační kód

Úvod do studia biologie kmenových buněk. Jiří Pacherník tel:

DŮSLEDKY ZNEČIŠTĚNÍ OVZDUŠÍ Z DOPRAVY NA ZDRAVOTNÍ STAV POPULACE

MUTAGENEZE in vitro. postupy kterými se mění primární struktura DNA, především za účelem fenotypové změny

S t u d y P l a n W M TS

Laboratoř na čipu. Lab-on-a-chip. Pavel Matějka

Transportation Problem

ROLZ-2. Portable AV/Conference Center. Assembly Instructions

WORKSHEET 1: LINEAR EQUATION 1

Martin Vrbka 0/14. Institute of Machine and Industrial Design Faculty of Mechanical Engineering Brno University of Technology

Výukový materiál zpracovaný v rámci projektu EU peníze do škol. illness, a text

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Dynamic Development of Vocabulary Richness of Text. Miroslav Kubát & Radek Čech University of Ostrava Czech Republic

Výzkum kmenových buněk ve světle Úmluvy Martin Šolc 1/24

Molekulární genetika II zimní semestr 4. výukový týden ( )

Bakalářské práce. Magisterské práce. PhD práce

Projekty ve výuce cizího jazyka

Zjistit, jak žáci zvládli učivo prvního pololetí. Pomůcky: Psací potřeby Zdroje: vlastní. III_2-05_54 Half term test, 6yr - řešení

where NANOSPIDERTM was born cxi.tul.cz

POSLECH. M e t o d i c k é p o z n á m k y k z á k l a d o v é m u t e x t u :

Byznys a obchodní záležitosti

Inovace bakalářského studijního oboru Aplikovaná chemie

Melting the ash from biomass

EU peníze středním školám digitální učební materiál

Translation Model Interpolation for Domain Adaptation in TectoMT

Compression of a Dictionary

Project 3 Unit 7B Kelly s problem

Využití molekulárních markerů v systematice a populační biologii rostlin. 10. Další metody

Interakce viru klíšťové encefalitidy s hostitelským organismem a patogeneze infekce

Tabulka 1 Stav členské základny SK Praga Vysočany k roku 2015 Tabulka 2 Výše členských příspěvků v SK Praga Vysočany Tabulka 3 Přehled finanční

RNA molekuly. Analýza genové exprese pomocí cytometrických (a jiných) metod. Analýza exprese a funkce microrna. Úrovně regulace genové exprese

Výuka genetiky na Přírodovědecké fakultě UK v Praze

DNA se ani nezajímá, ani neví. DNA prostě je. A my tancujeme podle její muziky. Richard Dawkins: Řeka z ráje.

Vztah genotyp fenotyp

Questions and Answers

Základní pravidla dědičnosti - Mendelovy a Morganovy zákony

Komplexní systémy: úvod

COMPETENT AUTHORITY responsible for ensuring compliance with Regulation (EC) No 21/2004:

Struktura a analýza rostlinných genomů Jan Šafář

Postup objednávky Microsoft Action Pack Subscription

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Molekulární biotechnologie č.12. Využití poznatků molekulární biotechnologie. Transgenní rostliny.

POSLECH. M e t o d i c k é p o z n á m k y k z á k l a d o v é m u t e x t u :

Gymnázium, Brno, Slovanské nám. 7 WORKBOOK. Mathematics. Teacher: Student:

STUDIUM SKLOKERAMICKÝCH POVLAKŮ V BIOLOGICKÉM PROSTŘEDÍ

Výukový materiál zpracovaný v rámci operačního programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost

Existence trade-offs záleží na proximátních mechanismech ovlivňujících znaky

EXACT DS OFFICE. The best lens for office work

Transpozony - mobilní genetické elementy

IMUNOGENETIKA I. Imunologie. nauka o obraných schopnostech organismu. imunitní systém heterogenní populace buněk lymfatické tkáně lymfatické orgány

Zásadní gramatické struktury (pro SOU) Michal Kadlec, Dis

Střední průmyslová škola strojnická Olomouc, tř.17. listopadu 49

Litosil - application

CHAIN TRANSMISSIONS AND WHEELS

GENETICKY MODIFIKOVANÉ ORGANISMY. Prof. Jaroslav DROBNÍK Přírodovědecká fakulta Karlovy Univerzity Sdružení BIOTRIN

(molekulární) biologie buňky

O původu života na Zemi Václav Pačes

Škola: Střední škola obchodní, České Budějovice, Husova 9. Inovace a zkvalitnění výuky prostřednictvím ICT

VOŠ, SPŠ automobilní a technická. Mgr. Marie Šíchová. At the railway station

Digitální učební materiál

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin

Molekulární mechanismy diferenciace a programované buněčné smrti - vztah k patologickým procesům buněk. Aleš Hampl

Transkript:

Introduction to gene targeting and genome editing Slavomír Kinský, PhD Institute of Molecular Genetics of the ASCR, v.v.i. The presentation is supported from the project OP EC CZ.1.07/2.3.00/30.0027 Founding

How to study the function of genes? Mouse 22,000

...we know identities of genes, their sequences and organization in genomes... chromosom 12 http://www.ensembl.org/index.html

How to create mouse models of human diseases Generation of transgenic mice

Animal transgenic models 1974 Rudolf Jaenisch... First transgenic mouse 1989 first knock-out mouse... M.R.Capecchi, M.J. Evans, O. Smithies (Nobel price 2007) Menchaca et. al 2013 Rosie; 1997 Freitas et al. 2007 Houdebine et al. 2000 Sasaki et al. 2009 Kim et al. 2011 Park et al. 2001 Wongsrikegao et al. 2011

Nobel price for physiology/medicine in 2007 Mouse model publications models of human diseases M. Räß, Infrafrontier

Gene targeting: a) Knock-out mutants b) Knock-in mutants c) Conditional mutants LoxP LoxP - Tissue specific or developmental specific mutants

Example of mouse knock-in mutant

Why mouse? Functions of individual genes should be studied in complexity of whole organisms Mouse genome became the 2nd mammalian genome, which was completely sequenced... Number of genes in both (mouse, human) is about... 20,000-22,000 Mouse and human differ in only several hunderts genes Additional advantages of the mouse model: Fysiology of human and mouse is very similar; pathology of many diseases is reproducible Mouse breeding is economical and relatively easy Mouse breeding is efective: large litters & short generation time

How to create transgenic mouse

How to create transgenic mouse 1. Injection into pronuclei (PNI) >>>> trangenesis by injection of DNA into fertilized oocytes 2. Injection of ES cells into developing embryo >>>> gene targeting by homologous recombination in Embryonic stem cells Micromanipulator

I. Pronuclear microinjection generation of transgenic mouse with random insertion intron Pspec Gene of interest Poly A Injection NA into fertilized oocytes (zygotes) Transfer into recipient (foster) mather Transgenic mouse Bockamp et al., 2002, adapted

Pronuclear microinjection (PNI) Tg unit, IMG Tg unit, IMG Tg unit, IMG

Early development of mouse embryo Zygota (0,5 dpc) 2- buněčné embryo (1,5 dpc) 8- buněčné embryo (2,5 dpc) Morula (3 dpc) Blastocysta (3,5 dpc) Blastocysta (4,5 dpc)

Pronuclear microinjection (PNI) and generation of transgenic mouse transfer into foster mother Adult mouse (7-8 weeks) In 3 week newborn In next 3 weeks Weaning of pups

I. Pronuclear microinjection example Promoter, enhancer, intron reporter - GFP (venus) Intron, poly A signal

I. Pronuclear microinjection II. random insertion gene is present in every cell - transferred into germ line expression is often controlled by associated regulatory elements the expression is influenced by the insertion place generally, the expression must not be achieved in every cell! Carefull evaluation of founder - line selection Positional effects The expression of some transgenes can be dependent on the place of insertion

How to create transgenic mouse by using of ES cells

Embryonic stem cells (ES cells) are pluripotent stem cells derived from the inner cell mass of a blastocyst, an early-stage preimplantation embryo. Mouse embryo

Generation of mutants by deletion cassete - by DNA cloning Cassette with Long homology arms which are difficult to construct

Transgenic Mouse Production by BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) Transgenes

Homologous recombination is always necessary for integration of vector DNA in proper genomic locus

Embryonic stem cells & homologous recombination

Embryonic stem cells & homologous recombination

Transgenic models from ES cells (pluripotent cells) Injection in 8-cells embryo stage or into blastocyst transfer into foster mother... In 3 week chimeric mouse is born

Chimeric mouse and generation of transgenic mouse black: No germ line transmission Chimera light brown - founder: Strong possibility for trasnmission Chimera brown/black- founder: Weak possibility for transmission ES cell derived from 129 Strain

How to create conditional mutant mouse - Mutation of gene is a) tissue specific b) induced by tamoxifen (in particular time)

Conditional gene targeting in ES cells loxp site / Cre recombinase Frt site / Flp recombinase P Exon 1 Exon 2 Lox P Lox P exon1 Exon 2

Conditional knock-out mouse cells injection chimera mouse kříženec

Conditional gene targeting in ES cells P Exon 1 Exon 2 floxed Pliver Cre pa Cre Pliver Exon 2

Tamoxifen-inducible Cre loxp system

New tools to target genes and genomic DNA Zinc-finger, TAL-efector nucleases, CRISPR/Cas9 system

programmable nucleases -mediated gene modifications Zinc Finger Nucleases Cys2-His2 zinc finger domain Artificial arrays of 3-6 Zinc Fingers (9 18 bp) C-terminal fusion with endonuclease (FokI) ZFN Transcription Activator-Like Effectors nucleases (TALENs) Central Repeat Domain (CRD) responsible for DNA binding CRD consisting of 34aa highly homologous repeat modules DNA specifity determined by aminoacids 12 and 13 of each repeat repeat variable diresidues (RVDs) CRISPR/Cas9 system interspaced short palindromic repeats (CRISPR) systems CRISPR RNAs (crrnas) in complex with CRISPR-associated (Cas) proteins Modular assembly allows efficient and low-cost generation of TALEN vectors Mali et al., Science 2013

KO mouse generation by homologous recombination in ES cells vs TALEN technology Time 0 10 weeks 14-20 weeks 24-44 weeks Generation of targeting construct Electroporation of ES cells Injection of ES cells into blastocyst Chimeric mice born Mice breeding/ germline KO-het mice born Time 0 2-3 weeks 6-7 weeks Design, generation and evaluation of TALENs Microinjection into zygotes KO/mutant mice born

Thank you for your attention Slavomír Kinský, PhD Institute of Molecular Genetics of the ASCR, v.v.i. The presentation is supported from the project OP EC CZ.1.07/2.3.00/30.0027 Founding

1. Organizmy, které byly geneticky modifikovány vnesením jednoho nebo více cizorodých genů se nazývají: a) transgenní b) ligační c) inzerční 2. Jakým způsobem NENÍ možné vytvořit transgenní myš? a) použitím DNA metyláz a restrikčních endonukleáz b) injikací transgenu do pronuklea (PNI) c) injikací geneticky pozměněných embryonálních buněk do vyvíjejícího se embrya (zygoty) 3. Embryonální kmenové buňky jsou pluripotentní. Co to znamená? a) jsou to potomci totipotentních buněk a mohou produkovat jakékoliv typ buňky kromě buňky totipotentní b) mohou produkovat pouze jediný typ buněk c) jsou to buňky schopné intenzivního dělení 4. Která z uvedených metod vám umožní zkonstruovat transgenní myš rychleji? a) injikací konstruktu nesoucí transgen do myšího oocytu b) použití modifikovaných myších embryonálních buněk na vytvoření chiméry 5. Co se rozumí pod pojmem knock-in mutace? a) cílená delece několika nukleotidů pomocí homologní rekombinace b) inzerce protein-kódující DNA sekvence procesem homologní rekombinace v definovaném místě genomu c) transverze protein-kódující DNA sekvence procesem nehomologní rekombinace

6. Co se rozumí pod pojmem kondicionální mutace? a) mutace vedoucí ke translokaci části chromozomu b) inzerce DNA sekvence kódující fluorescenční protein c) mutace, kdy je možné modifikaci sledovaného genu vyvolat kdykoli během života zvířete v předem definovaných tkáních 7. Které z nasledujících tvrzení o embryonálních kmenových buňkach jsou správne? a) embryonální kmenové buňky jsou diferencované buňky vyizolovány z pozdejšího stádia vývinu embrya b) embryonální kmenové buňky jsou pluripotentní kmenové buňky nacházející se ve vnitřní buněčné mase raného embrya ve stadiu tzv. blastocysty c) embryonální kmenové buňky nejsou schopné obnovy poškozené nebo opotřebované části a udržovat homeostazi organizmu 8. Které z uvedených tvrzení o homologní rekombinace NENÍ správné: a) umožňuje inaktivovat nebo nahradit endogenní kopii genu transgenem b) je proces uplatňující se při opravě dvouřetězcových zlomů DNA c) umožňuje integraci transgenní molekuly nespecificky, t.j. kdekoli v genomu 9. Která z nasledujících možností představuje embryonální vývoj od nejrannejšího po nejstarší stadium embrya? a) morula blastula gastrula zygota b) zygota morula blastula gastrula c) zygota blastula gastrula morula 10. Co je to chiméra z pohledu genetických manipulací? a) vyhynulý živočich z doby pravěku b) organizmus, který se vyvinul z embryonálních buňek pocházejících ze 2 různých zdrojů v laboratoři c) organizmus, který vznikl z buňek nebo genů pocházející z 2 a více různych druhů živočichů