Monitoring estrogenního potenciálu odpadní vody na ČOV Mikulov RNDr. Barbora Jarošová Lenka Kapustová (studentka Gymnázia Mikulov) Verze 7 27.4.2011
Shrnutí Obsah Použité zkratky Úvod Materiál a metody Výsledky a diskuse ZÁVĚR
Shrnutí Od dubna 2010 do ledna 2012 probíhá dvakrát měsíčně v rámci projektu Otevřená věda II jednodenní stáž středoškolské studentky Gymnázia Mikulov Lenky Kapustové na pracovišti PřF MU - Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí. Pod vedením doc. Luďka Bláhy a RNDr. Barbory Jarošové se Lenka Kapustová věnuje hodnocení estrogenních látek v odpadních vodách, které nám k tomuto výzkumnému záměru pracovníci čistírny odpadních vod Mikulov laskavě poskytli. Tyto látky totiž patří mezi širší skupinu chemikálií se schopností interagovat s endokrinním systémem organismů (hormonální regulace) a mohou tak negativně působit na celkovou homeostázu, rozmnožování a chování. Známými zdroji jsou kromě nečištěných odpadních vod také vody vytékající zčistíren odpadních vod (ČOV). Řada zahraničních studií prokázala pomocí testů s tkáňovými kulturami (in vitro testy) přítomnost estrogenních látek v odpadních vodách v koncentracích, které již mají vliv na vodní organismy. Zde předkládáme průběžné výsledky analýz, ve kterých jsme s využitím in vitro testu hodnotili estrogenitu odpadní vody na přítoku a na odtoku z ČOV v Mikulově. Hladiny estrogenních aktivit ve vzorcích vody na přítoku a i na odtoku byly srovnatelné s daty ze zahraničních mechanicko-biologických ČOV s aktivačními nádržemi a naznačují velmi vysokou míru odstranění estrogenního potenciálu odpadní vody během čistírenských procesů (nad 99 %).
Použité zkratky ČOV...čistírna odpadních vod E2 17b-estradiol EDC...látka se schopností narušoval endokrinní systém organismů a negativně tak působit na jedince či jejich populace EEQ estrogenní ekvivalent OV...odpadní voda
Úvod I. V posledních desetiletích byly pozorovány změny reprodukčních orgánů u měkkýšů, ryb, aligátorů a jiných živočichů, ztenčování skořápek rybožravých ptáků nebo změny poměrů pohlaví u ryb [2, 3]. Tyto změny byly později dány do souvislosti s hormonálními poruchami způsobenými exogenními chemickými látkami (Endocrine Disruptors EDCs). Schopnost narušovat endokrinní systém organismů vykazuje široké spektrum látek uvolňovaných do vodního prostředí. Patří mezi ně látky ze skupin farmak (např. 17α-ethynylestradiol používaný v hormonální antikoncepci), surfaktantů, pesticidů, zpomalovačů hoření, těžkých kovů, látky z tzv. zboží denní potřeby (např. krémy s UV filtrem nebo mošusové látky přidávané do voňavek), dále různá aditiva průmyslových materiálů, přirozené hormony nebo některé látky obsažené v rostlinách (např. genistein v sóji) [1]. EDCs se vzájemně liší nejen svými fyzikálně chemickými vlastnostmi a hladinami, ve kterých jsou účinné, ale také způsobem (mechanismem) účinků. Díky celosvětově pozorované feminizaci samců ryb pod výpustmi z čistíren odpadních vod (ČOV), jsou dnes nejvíce prozkoumanou skupinou těchto látek tzv. (xeno)estrogeny, které mají, zjednodušeněřečeno, schopnost stimulovat estrogenní receptory v tělech exponovaných organismů, čímž napodobují tělu vlastní estrogenní hormony [1].
Úvod II. Hlavními známými zdroji EDCs jsou kromě nečištěných odpadních vod také vody vytékající zčov včetněčr Limitní koncentrace EDCs ve výtocích z ČOV zatím nejsou legislativou stanoveny (neplatí pro úpravny vody určené k druhotnému využití vody v domácnostech) ani v Evropské unii, ani jinde ve světě [4], nicméně Evropská unie vyžaduje, aby členské státy snižovaly koncentrace 41 tzv. Prioritních polutantů ve vodním prostředí (některé z nich - jako např. DDT - jsou prokázanými EDCs) a navrhuje mezi ně zařadit další xenobiotika, která nejsou dostatečně odstraňována na stávajících ČOV [5]. Organismy v reálném prostředí ale nejsou vystaveny jednotlivým chemickým látkám nýbrž jejich směsím. Hodnocení potenciálu vzorků vody narušovat endokrinní systém na základě znalostí jednotlivých v nich obsažených EDCs nemusí být přesné. Může docházet k nadhodnocení zanedbáním vlivu látek s antagonistickým účinkem nebo naopak k podhodnocení vlivem synergického působení látek ve směsích či díky neznalosti všech přítomných EDCs [6]. Další limitací je často finanční náročnost instrumentálních analytických metod. Tradiční chemické analýzy proto bývají doplňovány nebo nahrazovány biologickými metodami. Testy s tkáňovými kulturami (in vitro) umožňují kvantitativní hodnocení zmiňovaného potenciálu environmentálních směsí bez nutné znalosti chemického složení směsí a mechanismu interakcí jednotlivých látek [1]. Cílem naší studie je i) zhodnotit potenciál látek obsažených v komunální odpadní vodě narušovat endokrinní systém organismů estrogenním mechanismem a ii) zhodnotit účinnost ČOV v Mikulově v odstraňování estrogenního potenciálu odpadní vody. iii) zjistit jak se hladiny estrogenních látek a účinnost jejich odstranění na ČOV Mikulov liší v průběhu roku.
Materiál a metody Odpadní voda (OV) byla pracovníky ČOV Mikulov pro účely této studie vzorkována měsíčně od září 2010 po březen 2011 (vzorkování bude pokračovat až do září 2011) na přítoku a na odtoku z ČOV Mikulov. Slévané směsné vzorky byly odebírány automatickým vzorkovačem každých 120 min po dobu 24 hodin a (vzorek typu B). Objem vzorku na přítoku a odtoku zčov se podle potřeby laboratoří RECETOX lišil od 150 ml do 0,5 l. Vzorky OV byly studentkou Gymnázia Mikulov do 24h po odběru dopraveny do laboratoří RECDETOX, kde byly filtrovány přes filtry ze skleněných vláken o velikosti pórů 0,6 µm (Marchery-Nagel). Ihned po filtraci následovala extrakce na tuhou fázi (Solid Phase Extraction, SPE). Byly použity extrakční kolony SDB Waters Oasis (3 cc, 60 mg sorbentu). Aktivace sorbentu byla provedena převedením 3 ml 100% MeOH kolonou a dále 4 ml destilované H 2 O bez použití podtlaku. Vzorky byly převedeny za použití podtlaku (max. 1,3 kpa, průtok max. 10 ml/min). Po převedení vzorku byly kolony sušeny proudem vzduchu cca 15 min. Eluce byla provedena 1,2 3 ml 100% MeOH bez použití podtlaku. Extrakty vzorků přítoků byly díky extrakci 125krát zakoncentrovány. Extrakty vzorků odtoků byly dále pomocí proudu dusíku odpařeny na objem, který tvořil 1333násobný koncentrát vody. Extrakty vzorků byly skladovány při 18 C po dobu několika týdnů do zahájení testování estrogenity. Estrogenita vzorků byla hodnocena pomocí buněk lidského karcinomu prsu (buněčná linie MVLN) stabilně transfekovaných genem pro luciferázu. Syntéza enzymu luciferázy je řízena aktivací estrogenního receptoru. V přítomnosti estrogenních látek je tedy produkován enzym, který lze snadno stanovit pomocí měření emitovaného luminiscenčního světla (Obr.1). Výsledky lze kvantifikovat a využit ke stanovení celkové koncentrace přítomných estrogenů [7]. Testování vzorků bylo prováděno v 96-jamkových kultivačních deskách, celý test od nasazení buněk do jamek po změření aktivity luciferázy trval 48h a byl prováděn za sterilních podmínek v laminárním boxu (Obr. 2). Vzorky byly testovány minimálně v šesti koncentracích a každá koncentrace dále v minimálně třech opakováních. Množství estrogenní aktivity je vyjádřeno v toxických ekvivalentech standardního estrogenu 17βestradiolu (E2). Hodnota estrogenního ekvivalentu (EEQ) tak vyjadřuje, jaká koncentrace E2 by způsobila stejný efekt, který byl pozorován u hodnoceného vzorku.
Obr. 1: Schéma molekulárního mechanismus estrogenního děje (převzato z [8]). Xenoestrogen - xenobiotikum s estrogenním účinkem, ER - estrogenní receptor, HSP - pomocné proteiny (Heat Schock Proteins), ERE úseky DNA, na které se váže aktivovaný ER (Estrogen Responsive Elements)
Výsledky a diskuse Doposud proběhlo měření a vyhodnocení vzorků odebraných v měsících září, říjen a listopad 2010. Estrogenní potenciál naměřený v extraktech vzorků přítoků se pohyboval od 31 do 67 ng/l EEQ (Tabulka 1), což jsou hladiny v těchto typech vzorků běžně stanovované i na jiných ČOV v ČR nebo v zahraničí [9,10,11]. Extrakt odtokové vody z měsíce září, října i listopadu nevykázal žádnou estrogenní aktivitu nad limitem detekce 0,3 ng/l EEQ použitého testu (Graf 1), což ukázalo vysokou účinnost ČOV v odstranění estrogenního potenciálu (větší než 99 %). Podobně vysoká účinnost odstranění estrogenity byla již dříve pozorována na biologickomechanických ČOV s aktivačními nádržemi, kde dochází k úspěšné nitrifikaci případně i denitrifikaci [12]. Tabulka 1: Estrogenní potenciál extraktů vzorků odpadní vody naměřený pomocí MVLN in vitro testu. Datum vzorkování Počasí v průběhu 48h před dokončením odběru 27.9.2010 Vydatnější dešťopvé srážky 19.10.2010 16.11.2010 Převážně zataženo, občas dešťové srážky Převážně zataženo, občas mírné mrholení Typ vzorku Estrogenní potenciál [ng/l EEQ] přítok 31 odtok <0,3 přítok 54 odtok <0,3 přítok 67 odtok <0,3 odstranění estrogenity [%] >99 >99 >99
Estrogenní potenciál vzorků odpadní vody - září 2010 Procenta odpovědi ( % luminiscence) 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1,2 3,7 11,1 33,3 100 500 3,9 7,8 15,6 31,3 62,5 125 41,7 83,3 166,7 333,3 666,7 1333,3 MeOH E2 v MeOH [pm/jamka] Přítok září 2010 [násobek zakoncentrování] Odtok září 2010 [násobek zakoncentrování] Graf 1: Ukázka naměřeného průběhu křivek dávka-odpověď pro kalibrační křivku 17β-estradiolu (E2) a pro vybrané vzorky. Vzorek na přítoku vykazuje zřejmou estrogenitu (s koncentrací vzorků vzrůstá indukce estrogenně-závislé luciferázy), naopak odtok není estrogenní (minimální indukce analyzované luciferázy)
Závěr Účinnost čistírny v Mikulově odstraňovat estrogenní potenciál odpadní vody se z dosavadních výsledků její velmi vysoká, více než 99 %, což je velmi vysokéčíslo i ve srovnání s podobnými typy čistíren v Evropě. Studie bude pokračovat nejméně do září 2011. Díky ochotě zaměstnancůčov Mikulov, konkrétně především panu Dubinovi a paní laborantce, studentka střední školy Lenka Kapustová s podporou projektu Otevřená věda II zpracovává i hodnotí estrogenní potenciál reálných vzorků z životního prostředí za použití moderních biologických metod s tkáňovými kulturami. Kromě vytvoření příležitosti pro jmenovanou studentku podílet se na reálném výzkumu v oblasti životního prostředí, tato spolupráce přispívá k porozumění variabilitě hladin estrogenních látek v odpadních vodách.
Použitá literatura 1. Jedlickova, B., K. Hilscherova, et al., Látky narušující hormonální rovnováhu organismù a celková toxicita odpadní vody Roční studie na ČOV v Brně Modřicích. Vodní hospodářství, 2010. 2. Sumpter, J.P., Johnson, A. C., Lessons from endocrine disruption and their application to other issues concerning trace organics in the aquatic environment. Environmental Science & Technology, 2005. 39: p. 4321-4332. 3. Sumpter, J.P., Endocrine disrupters in the aquatic environment: An overview. Acta Hydrochimica Et Hydrobiologica, 2005. 33(1): p. 9-16. 4. Bolong, N., et al., A review of the effects of emerging contaminants in wastewater and options for their removal. Desalination, 2009. 239(1-3): p. 229-246. 5. Belgiorno, V., et al., Review on endocrine disrupting-emerging compounds in urban wastewater: occurrence and removal by photocatalysis and ultrasonic irradiation for wastewater reuse. Desalination, 2007. 215(1-3): p. 166-176. 6. Leusch, F.D.L., et al., Efficacy of an advanced sewage treatment plant in southeast Queensland, Australia, to remove estrogenic chemicals. Environmental Science & Technology, 2005. 39(15): p. 5781-5786. 7. Hilscherova, K., et al., Cell bioassays for detection of aryl hydrocarbon (AhR) and estrogen receptor (ER) mediated activity in environmental samples. Environmental Science and Pollution Research, 2000. 7(3): p. 159-171. 8. Macíková, P., Specifické mechanismy toxicity různých typů vzorků vodního prostředí. Diplomová práce, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno, 2008. p.84 9. Vethaak, A.D., Rijs, G.B.J., Schrap, S.M., Ruiter, H., Gerritsen, A., Lahr, J., Estrogens and Xeno-estrogens in the Aquatic Environment of the Netherlands: Occurrence, Potency and Biological Effects. 2002, Dutch National Institute of Inland Water Management and Waste Water Treatment, Lelystad, The Netherlands. 10. Murk, A.J., et al., Detection of estrogenic potency in wastewater and surface water with three in vitro bioassays. Environmental Toxicology and Chemistry, 2002. 21(1): p. 16-23. 11. Nakada, N., et al., Identification of estrogenic compounds in wastewater effluent. Environmental Toxicology and Chemistry, 2004. 23(12): p. 2807-2815. 12. Svenson, A., A. S. Allard, et al.., Removal of estrogenicity in Swedish municipal sewage treatment plants. Water Research, 2003. 37(18):p. 4433-4443.