Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Pravděpodobnostní charakteristika regulace tvorby hlíz brambor v in vitro podmínkách Diplomová práce Vedoucí práce: RNDr. Ing. Marek Klemš, Ph.D. Vypracoval: Bc. Zdeněk Štěpán Brno

Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma: Pravděpodobnostní charakteristika regulace tvorby hlíz brambor v in vitro podmínkách vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. v Náměšti nad Oslavou dne. podpis diplomanta.....

Poděkování: Mé poděkování patří všem zaměstnancům Ústavu biologie rostlin, kterým upřímně děkuji za vytvoření krásného prostředí a za rady, které mi poskytli při psaní této práce. Vedoucímu práce RNDr. Ing. Marku Klemšovi, Ph.D. děkuji za cenné připomínky k diplomové práci a odborné konzultace. Dále děkuji i Dr. Ing. Heleně Fišerové, Mgr. Heleně Vítkové a Ing. Pavle Solnické za trpělivost a pomoc při laboratorním stanovení koncentrací fytohormonů.

Abstrakt: ato práce se zabývá problematikou tvorby hlízek rostlin bramboru za kultivačních podmínek in vitro v závislosti na dvou úrovních anorganického dusíku v kultivačním médiu a vlivy fytohormonů na proces tuberizace se zdůrazněním jejich vzájemných interakcí. Cílem je objasnit, která úroveň nitrátového dusíku tvorbu hlíz stimuluje a která inhibuje, a také odhalit vzájemnou interakci fytohormonů a jejich vliv na tuberizaci a tak alespoň částečně objasnit životní pochody v tuberizaci rostlin lilku bramboru. Výsledky ze studia vlivu úrovně dusíku na frekvenci tuberizace jsem zpracoval užitím statisticko-matematických metod. Z výsledků práce vyplývá, že snížená koncentrace dusíku v indukčním médiu stimuluje tuberizaci, zvýšení koncentrace ji inhibuje, avšak stimuluje zvětšování hlízek. Snížená produkce ACC a tedy etylénu vede k dřívější a silnější indukci tvorby hlízek, akumulace etylénu v kultivační baňce tvorbu hlíz potlačuje. Cytokininy naopak tuberizaci stimulují. Kyselina abscisová se zvyšovala na počátku aktivace lodyžních segmentů k tuberizaci u rostlin bramboru pěstovaných na médiu obsahujícím sníženou koncentraci dusíku. yto principy se v praxi uplatňují při produkci zdravé a vitální sadby hlíz brambor. Klíčová slova: tuberizace, lilek brambor, RIA, ABA, cytokininy, ELISA, ACC, plynová chromatografie, matematicko-statistické metody, nitrátový dusík, iontově selektivní elektroda

Abstract: his work deals with the problems of induction of tuber formation under two different levels of nitrogen sustenance of potato plants by in vitro cultivation conditions influenced by various phytohormones, the aim is to clear that if nitrogen in this conditions inhibits or inducts the tuber formation and also clear the effect of several phytohormones with emphasis on their interactions. he aim is to clear which level of nitrogen supports tuberization and which inhibit it and also clear if the concrete phytohormone stimulates of inhibits tuberization or other life process, thus to clear some life processes in tuberization of potato plant. he outcomes from the study of the influence of nitrogen level on tuberization frequency were processed with the use of statistical methods. It was found out that the decreased concentration of nitrogen supports tuberization and the increase in the nitrogen concentration inhibits it, but stimulates the growth of the tubers. he decreased concentration of ACC (and thus the ethylene) leads to earlier and stronger tuber induction and the accumulation of ethylene in the incubation vessels inhibits it. he cytokinins on the contrary stimulate the tuberization. he abscisic acid biosynthesis has increased at the start of the potato stem segment activation to tuberization by the plants grown on media containing decreased nitrogen. hese principles are important for production of healthy seed tubers. Key words: tuber formation, potato plant, RIA, ABA, cytokinins, ELISA, ACC, gas chromatography, mathematical and statistic methods, nitrate nitrogen, ion-selective electrode

Obsah:. ÚVOD. CÍL PRÁCE 3 3. SOUČASNÝ SAV ŘEŠENÉ PROBLEMAIKY 3 3.. uberizace 3 3... Indukce a růst stolonů 3 3... Ukončení růstu stolonů a tvorba hlízek 4 3.. Vnější faktory ovlivňující tvorbu hlíz, jejich kvantitu a kvalitu 5 3... Vliv teploty na tvorbu hlíz 5 3... Vliv vlhkosti na tvorbu hlíz 6 3..3. Vliv fotoperiody na tvorbu hlíz 7 3..4. Vliv minerální výživy na tuberizaci a zdraví lilku bramboru 9 3.3. Vnitřní faktory tvorby hlíz 3.3.. Hormonální regulace tvorby hlíz 3.3... Význam auxinů pro tuberizaci lilku bramboru 3.3... Význam cytokininů pro tuberizaci lilku bramboru 3.3..3. Význam giberelinů pro tuberizaci lilku bramboru 3 3.3..4. Význam kyseliny abscisové pro tuberizaci lilku bramboru 3 3.3..5. Význam etylénu pro tuberizaci lilku bramboru 4 3.3..6. Význam kyseliny jasmonové pro tuberizaci lilku bramboru 4 3.. Crosstalk fytohormonů při tuberizaci 5 4. MAERIÁL A MEODY ZPRACOVÁNÍ 6 4.. Přímé pozorování a ohodnocení počtu baněk s alespoň jednou vytvořenou mikrohlízkou 7 4.. Zkoumání vlivu úrovně dusíkaté výživy na vývoj obsahu kyseliny abscisové 8 4.3. Podstata metody RIA (radio-immuno assay) 9 4.4. Vliv úrovně dusíkaté výživy na vývoj obsahu cytokininů 9 4.5. Stanovení produkce etylenu a obsahu ACC metodou plynové chromatografie 4.6. Stanovení dusičnanových iontů 4.6.. Stanovení dusičnanových iontů v médiu za použití potenciometrie 4.6.. Stanovení dusičnanových iontů v rostlinné hmotě spektrofotometricky 4.7. Odvození regresní funkce pro indukci hlízek a možnosti jejího odvození u cytokininů 4.8. var regresní funkce pro morfologický pokus s indukcí hlízek 4 4.9.. Odvození regresní funkce pro indukci hlízek bez parametrů A a A 6 4.9.. Numerický výpočet parametrů regresní funkce MNČ 8 4.. Statistické zpracování výsledků morfologického pokusu, přímého pozorování a ohodnocení počtu baněk s alespoň jednou vytvořenou mikrohlízkou 8 4... Analýza rozptylu dvojného třídění k posouzení efektu sezónního opakování pokusu na indukci hlízek (na % baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou k celkovému počtu baněk) 3 4... Analýza rozptylu dvojného třídění k posouzení efektu ročního opakování pokusu na indukci hlízek (na % baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou k celkovému počtu baněk) 3 4..3. Analýza rozptylu dvojného třídění k posouzení vlivu jednotlivých souborů opakování pokusu na indukci hlízek (na % baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou k celkovému počtu baněk) 3

4..4. Analýza rozptylu dvojného třídění k posouzení vlivu koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu na indukci hlízek (na % baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou k celkovému počtu baněk) 33 4..5. Analýza rozptylu dvojného třídění k posouzení vlivu koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu na hmotnost hlízek 35 5. VÝSLEDKY POKUSŮ 36 5.. Vypočtené parametry regresní funkce pro indukci hlízek 36 5.. Vyhodnocení výsledků morfologického pokusu, přímého pozorování a ohodnocení počtu baněk s alespoň jednou vytvořenou mikrohlízkou 39 5.3. Statistické zpracování výsledků morfologického pokusu, přímého pozorování a ohodnocení počtu vzniklých hlízek k celkovému počtu segmentů 45 5.4. Zpracování výsledků pokusu se stanovením koncentrace cytokininů v čerstvé hmotě rostliny metodou přímá ELISA 47 5.4.. Vyhodnocení průběhu koncentrace cytokininu metatopolinu během fyziologické přípravy na tvorbu mikrohlízek 47 5.5. Kontrola složení média při zahájení a po skončení pokusů 74 5.6. Zpracování výsledků pokusu se stanovením obsahu dusičnatých iontů NO - 3 v čerstvé hmotě rostliny spektrofotometricky 74 5.7. Zpracování výsledků pokusu se stanovením vývoje koncentrace ACC u rostlin v lilku bramboru v závislosti na autoregulačních mechanismech 8 5.8. Zpracování výsledků pokusu se stanovením vlivu úrovně dusíkaté výživy na vývoj obsahu kyseliny abscisové 86 6. DISKUSE 9 7. ZÁVĚR 93 8. POUŽIÉ ZKRAKY 94 9. ODKAZY NA CIACE A SEZNAM POUŽIÉ LIERAURY 95. SEZNAM ABULEK, GRAFŮ A OBRÁZKŮ.. Seznam tabulek.. Seznam grafů.3. Seznam obrázků 6. ABSRAKY 7. PŘÍLOHY A ABULKOVÁ ČÁS 33

. ÚVOD Rostliny představují jeden z nejdůležitějších faktorů rozvoje lidské civilizace. Už od pradávných dob jsou zdrojem potravin, léčiv a různých surovin včetně paliv a tím zlepšují naše životní podmínky. Získáváme z nich léčiva pro člověka a zvířata (farmaka), ale i pro jiné rostliny (pesticidy - fytofarmaka). V neposlední řadě jsou rostliny zdrojem kyslíku, který je prvkem nezbytným pro tak základní součást života člověka a zvířat, jako je dýchání. V poslední době se různé součásti rostlinného těla (zejména však celulóza) používají na výrobu plastů biologického původu. Snaha zlepšit možnosti využití rostlin je zřejmě stejně stará jako samo zemědělství. Velký pokrok v tomto úsilí nastal ve. století, kdy došlo k výraznému rozvoji vědních oborů biotechnologie rostlin, šlechtění, výživy a fyziologie rostlin. Významnou postavou této oblasti lidské činnosti se stal Holanďan Gottlieb Haberlandt, který roku 9 jako první kultivoval listový mezofyl v podmínkách in vitro. Neznal sice ještě správné složení média z hlediska výživy, jeho kultura byla nesterilní, ale objev, že rostliny lze kultivovat na umělém médiu byl významným milníkem vědy o tkáňových kulturách. Jednou z rostlin, jež je velmi často kultivována in vitro, je rovněž lilek brambor, stará kulturní rostlina se značným hospodářským významem. vorba výnosu jeho hospodářsky významné části, hlízy, je předmětem zájmu vědců z mnoha vědních oborů, včetně fyziologie rostlin. Z endogenních látek (vzniklých uvnitř rostliny) lilku bramboru mají pro proces tvorby hlíz klíčový význam různé fytohormony, například cytokininy, ACC a kyselina abscisová. Posledně zmiňovaná látka má význam zejména jako indikátor stresu, při jehož snížení a ustálení hladiny této látky dochází k tvorbě hlíz. Kyselina abscisová (ABA) byla objevena dvakrát nezávisle na sobě WAREINGEM (965), jenž izoloval frakci z listů dormantního javoru (Acer pseudoplatanus), jež inhibovala růst segmentů koleoptilí a byla nazvána dormin a kolektivem vědců ADDICO et al. (968) jež izoloval podobnou frakci z opadlých mladých plodů bavlníku a nazval ji kyselinou abscisovou. Ukázalo se, že účinná látka dorminu a kyseliny abscisové je tatáž. Cytokininy jsou fytohormony, které v přítomnosti auxinů (rovněž rostlinné hormony) stimulují buněčné dělení. Rovněž regulují růst rostlin a formování rostlinného těla (VU et al. 6; SHIMIZU-SAO et al. 8). Fytohormony se většinou neuplatňují samy, ale zejména v různých vzájemných interakcích (MACHÁČKOVÁ et al. 997). Poznatky získané při mé práci by snad bylo možno použít pro optimalizaci pěstebních podmínek brambor či pro další modelování

chování rostlinných systémů z hlediska obsahu fytohormonů, jejich vzájemných interakcí a vlivu některých exogenních faktorů u lilku bramboru a možná i jiných rostlin, zejména pak z čeledi lilkovité. Pro dosažení optimální tuberizace, a to jak v podmínkách in vitro, tak in vivo, je důležité vytvořit vhodné podmínky složení kultivačního média, délku dne, teplotu a vybrat vhodný materiál. Pěstování brambor in vitro má značný společenský význam, a to jak pro množení, tak zejména pro ozdravování sadby brambor od různých virových chorob. Uplatňuje se rovněž v procesu šlechtění a dokonce i vytváření geneticky modifikovaných organismů. In vitro kultura bramboru se rovněž dá použít pro záchranu a uchování starých krajových odrůd této plodiny. Velkou výhodou systému pěstování brambor in vitro je jednotnost získaného materiálu, u kterého jsou vyloučeny negativní vlivy spojené s počasím a klimatickými podmínkami stanoviště. Existují však i nevýhody, z nichž největší je jakási odtrženost od vnější, skutečné přírody a nestandardnost fyziologických pochodů a morfologické stavby oproti rostlinám kultivovaným in vivo. I přes tuto menší nepřesnost je však možno výsledky získané pozorováním a pokusy s in vitro materiálem s určitým úspěchem použít pro vyvození závěrů například pro polní kulturu.

. CÍL PRÁCE Cílem práce bylo v in vitro kultivaci odvodit závislost tvorby hlíz na obsahu anorganického dusíku v kultivačním médiu, stanovit změny obsahu ABA, cytokininů, ACC a etylénu v jednotlivých částech rostliny pomocí moderních analytických metod, stanovit dynamiku změn anorganického dusíku v rostlinách a jejich částech a v médiu, pomocí fyziologické analýzy crosstalku fytohormonů odhalit podstatu zkoumaných fytohormonálních závislostí (závislost obsahu cytokininů na čase, závislost obsahu cytokininů na obsahu dusíku, závislost ACC, etylénu a ABA na čase a jejich vzájemné vztahy.), verifikovat, že obsah zkoumaných látek se s časem mění v závislosti na obsahu dusíku a konečně vytvořit alespoň hrubý model chování rostliny lilku bramboru při tuberizaci v podmínkách in vitro. ohoto cíle mělo být dosaženo pomocí statistických a matematických metod. Jednalo se především o využití dvoufaktorové analýzy rozptylu a o aproximaci hodnot sledovaných veličin regresní funkcí s využitím MNČ. Analýzou rozptylu jsem se snažil získat odpověď na následující hypotézy: Vede snížená koncentrace nitrátového dusíku v indukčním médiu k výraznější indukci tvorby hlízek u rostliny bramboru? Může mít zvýšení obsahu nitrátového dusíku v indukčním médiu za následek i zvýšení hmotnosti hlízek? Projevuje se efekt opakování pokusu na indukci hlízek stejně? 3. SOUČASNÝ SAV ŘEŠENÉ PROBLEMAIKY 3.. uberizace uberizace představuje klíčovou vývojovou etapu v životě rostliny bramboru, protože vede k rozmnožování rostliny a z hospodářského hlediska k vytvoření sklízeného produktu této plodiny. Je to proces vytvoření stonkové hlízy, který se skládá z dalších dílčích procesů indukce stolonů, jejich růst, zastavení růstu stolonů a tvorba vlastních hlízek. yto dílčí procesy se však navzájem překrývají (BROWN 8). 3... Indukce a růst stolonů Stolony představují boční prýty, které obvykle vznikají z bazálních podzemních internodií hlavních rostlinných stonků a vykazují diageotropický způsob růstu. Skládají 3

se z prodloužených internodií, spirálně uspořádaných šupinovitých lístečků a hákovité špičky s apikálním meristémem. Obecně se iniciují nejdříve v bazálních kmenových uzlinách a teprve až potom ve vyšších uzlinách. Stolony mohou být iniciovány z nadzemních stonkových uzlin a tato schopnost se projevuje tvořením vzdušných hlízek. Stolonizace z nadzemních uzlin se zřídka projevuje v polní kultuře, pro niž je typická tvorba výhonků s velkým množstvím listů, jež potlačuje růst z laterálních pupenů. Přiměřená vlhkost a temnota podporuje stolonizaci v bazálních uzlinách, ale jen v přítomnosti dominantního vrcholku stonků (BROWN 8). Autor při vzniku stolonů sledoval nejprve prodlužování laterálních pupenů, a to v průběhu jednoho dne od pasážování při pěstování v nepřetržité temnotě. Při růstu stolonů dochází k prodlužování buněk a jejich příčnému dělení, čímž vznikají podélné celky buněk (VREUGDENHIL et al. 999). Při jiném pokusu během prvních čtyřech dnů kultivace pupeny vyrostly v cm dlouhé stolony s osmi internodiemi. Dva bazální listy nikdy nevyrostly. První internodium nad dvěma bazálními listy (počítáno od báze k apexu pupenu) bylo jediné dostatečně prodloužené k tomu, aby vytvořilo stolon. (XU et al. 997). 3... Ukončení růstu stolonů a tvorba hlízek Vývojová změna spojená s tvorbou hlízek začíná indukcí jejich tvorby, kdy apex stolonu získává schopnost hlízku vytvořit. Indukce zahrnuje signály z prýtu, které je možno přenést jeho transplantací (BROWN 8). Fyziologická změna, ke které dochází během indukce, se nejdříve projeví postupným zpomalováním a ustáváním prodlužování buněk stolonu. Dochází také ke zvětšování šířky koncové části stolonu a jeho radiálnímu růstu (VREUGDENHIL et al. 999). Při pěstování ve tmě dochází nejdříve ke ztluštění kolem první uzliny nad dvěma bazálními listy (XU et al. 997). Důvodem je zahájení podélného dělení, které je s průběhem času stále intenzivnější a postupně k němu dochází nejen v apikální, ale i v subapikální oblasti. Plochy dělení buněk se postupně stávají náhodnými (VREUGDENHIL et al. 999). Průměrná velikost buňky v této oblasti se zvětší v průběhu pokusu z na 35 µm. Prvním viditelným náznakem tuberizace je zduřenina subapikální oblasti špičky stolonu. Během indukce hlízek dojde ke změně orientace cytoskeletu koncové části stolonu z podélné do radiální osy, což umožňuje příčný růst buněk. Na začátku radiální expanze stolonu dochází ke zvětšení turgoru pletiv, což může být součástí tuberizačního stimulu. Během procesu tuberizace se zastaví mitotická aktivita apikálního meristému a změny metabolizmu 4

sacharidů mají za následek rychlou akumulaci škrobu a pro hlízky specifických glykoproteinů (především patatinu) v nově utvářených buňkách hlízky. Během růstu hlízy pokračuje buněčné dělení (zejména v perimedulární oblasti hlízy), zvětšování jejího objemu a hromadění škrobu (BROWN 8). Bazální část hlízy, která v případě pěstování ve tmě představovala /3 délky hlízy, tvořila -3 mm dlouhá horní část prvního internodia, celé druhé internodium tvořilo střední část hlízy a třetí internodium tvořilo horní část hlízy (XU et al. 997). Indukce hlízek a tuberizace jsou citlivé na podmínky prostředí. vorba hlíz je obvykle podporována krátkou fotoperiodou doprovázenou vysokou intenzitou osvětlení a nízkými dávkami dusíku. uberizace je také citlivá na teplotu, je potlačována vysokými teplotami, kdežto růst hlízek je podporován nízkými teplotami. Fotoperiodická cesta regulující krátkodenní indukci hlízek zahrnuje prvky fotoperiodické cesty kvetení, jako například proteiny fytochrom B, constans a flowering locus. Pro tuberizaci je nutný přenos indukčního signálu z prýtu do vrcholku stolonu (BROWN 8). 3.. Vnější faktory ovlivňující tvorbu hlíz, jejich kvantitu a kvalitu Vnější faktory tvorby hlíz představují vlivy vnějšího prostředí na rostlinu lilku bramboru, které tuberizaci buď stimulují, nebo naopak inhibují (potlačují), přičemž jejich celkový vliv se navzájem sčítá či odečítá. Vnější faktory tuberizace společně s genetickou výbavou rostlinky bramboru regulují stav a vývoj vnitřních faktorů tuberizace. Vnějších vlivů je celá řada teplota, vlhkost, fotoperioda, minerální výživa, agrotechnika a jiné. 3... Vliv teploty na tvorbu hlíz NAM et al. (5) pozoroval nejvyšší aktivitu derivátů lipooxygenázových metabolitů podporujících indukci tuberizace při teplotě 5 C a se vzrůstající teplotou se snižoval. Obsahy dalších látek podporujících tuberizaci, kyseliny jasmonové, kyseliny tuberonové a glykosidu kyseliny tuberonové reagovaly na teplotní podmínky podobně jako lipooxygenázové metabolity (NAM et al. 8; OROSHY et al. 9). eplota během in vitro pěstování může ovlivnit množství vytvořených mikrohlízek (WANG et HU 98; AKIA et AKAYAMA 994). Podle OROSHY et al. (9) způsobovaly nižší teploty v průběhu vývoje rostliny vyšší počet hlízek, jejich vyšší hmotnost, větší 5

délku a hmotnost stolonů. Nejranější tvorba hlízek byla zaznamenána při teplotě 5 C, nicméně jejich růst probíhal nejlépe při teplotě -5 C (NAM et al. 8; OROSHY et al. 9). Podle WANG et HU (98) je průměrný počet mikrohlízek nižší při vyšší teplotě v in vitro kultuře (8 C ve světelné i temnostní fázi) než při nižších teplotách ( C ve světelné i temnostní fázi). Nejoptimálnější teplota pro tuberizaci v podmínkách in vitro je podle WANG et HU (98) C, podle AKIA et AKAYAMA (994) je to teplota mezi 5 a 8 C. Růst a vývoj bramborových hlíz v polních podmínkách jsou silně negativně ovlivňovány vysokou teplotou půdy a vzduchu (EWING 98). Rostlina bramboru je nejlépe adaptována na průměrnou teplotu 7 C (INGRAM et MCCLOUD 984). Vysoká teplota zpožďuje iniciaci stolonů a hlízek (GREGORY 956) a raný růst hlízek, pro který jsou optimální teploty 5-9 C (VAN DAM et al., 996). Vysoká teplota rovněž zpožďuje depozici produktů sacharidového metabolismu do hlíz a tvorbu sušiny hlíz, což má za následek nízké sklizňové indexy (SRUIK et EWING, 995). MENZEL (985) ve své práci uvádí, že nízká teplota potlačuje růst stonků a zrychluje tvorbu sušiny hlíz. Zpoždění ve tvorbě hlízek nicméně může vést k vyšší konečné úrodě, ale to jen tehdy, pokud je vegetační doba dostatečně dlouhá k tomu, aby rostliny mohly mít prospěch z delšího fungování svých nadzemních částí (SRUIK et EWING, 995). Nicméně SRUIK et al. (989) při vyšších teplotách pozorovali zvýšené větvení stolonů, což může vést k většímu celkovému počtu vytvořených hlízek. Jde zde však zřejmě o interakci mnoha vnějších faktorů, jež nakonec celkovou sklizeň hlízek určí. Navíc bylo pozorováno, že pokud jsou teploty během temnostní i světelné fáze stejné, je výnos mikrohlízek vyšší, než pokud se teplota během temnostní a světelné fáze střídá (WANG et HU 98). Naproti tomu BENNE et al. (99) pozorovali, že změny teplot mezi světelnou a temnostní fází jsou pro vývoj celé rostliny (včetně indukce tuberizace) výhodné. 3... Vliv vlhkosti na tvorbu hlíz Lilek brambor je v polních podmínkách mělce kořenící plodinou, která negativně reaguje na výkyvy v dodávkách vody a vyžaduje častější zavlažování než některé jiné plodiny (DURRAN et al. 973; FULON 97). Na úrodě bramborových hlíz se projevují negativně i malé chyby v managementu zavlažování. Do budoucna se může stát důležitým plánované zavlažování podle evapotranspirace plodiny a tlaku vody v půdě. Na vodním stresu působícím na rostlinu bramboru se navíc podepisuje i 6

to, že tato plodina bývá většinou pěstována na půdách s nižší a střední vododržností (SHOCK et al. 7). Brambory zavírají svá stomata při daleko nižším vodním stresu než jiné plodiny (WRIGH et SARK 99). Z toho vyplývá, že vodní stres (i slabý) významně ovlivňuje fyziologické procesy v rostlinách bramboru a tudíž i kvantitu a kvalitu bramborových hlíz. Rovněž snížená dostupnost živin při vodním stresu negativně ovlivňuje úrodu brambor. Proto je rostlina bramboru citlivá na nedostatečné zavlažování. Lilek brambor začíná na podmínky závlahy reagovat ještě před iniciací hlízek (SHOCK et al. 7). Delší doba trvání vodního stresu způsobeného suchem způsobuje snížení počtu nasazených hlízek na stonek (MACKERRON et JEFFERIES 986). SHOCK et al. (99) pozorovali významné snížení úrody při tlaku vody v půdě pod 6 kpa. Podle řady autorů (ELDREDGE et al. 99; HILLER et al. 985; HOOKER 98; REX et MAZZA 989; SHOCK et al. 993) jsou s vodním stresem a prudkými změnami půdní vlhkosti spojeny fyziologické poruchy hlíz, jako například hnědý střed, duté srdéčko, sekundární růst či citlivost k otlakům. Negativně je ovlivněn rovněž obsah škrobu a sušiny (HANG et MILLER 986; MILLER et MARIN 987; SARK et MCCANN 99; WESERMAN et al. 994; SHOCK et al. 993). Rovněž však příliš velká vlhkost a nadměrné zavlažování mohou negativně ovlivnit kvalitu i kvantitu hlíz, které jsou pak vodnaté, a rostlina nadměrně trpí chorobami. Negativní efekt při příliš intenzivní závlaze má rovněž vyplavování živin a nízká aerace půdy (SHOCK et al. 998). U rostlin pěstovaných na příliš vlhkých půdách se objevuje zduření lenticel (IMM et FLOCKNER 966) a projevuje se u nich sekundární růst (BRADY et PRA 955; BUSHNELL 956; HOLDER et CARY 984). Úroda hlízek se snižuje s nadměrnou závlahou (SHOCK et al. 7). Přílišná vlhkost v raných fázích vývoje hlízek může způsobit vznik hnědých skvrn dužniny bramboru (HILLER et KOLLER 984). 3..3. Vliv fotoperiody na tvorbu hlíz uberizace rostlin bramboru je silně ovlivňována délkou dne, přičemž krátké dny a dlouhé noci tuberizaci podporují. uberizační odpověď na světlo je však závislá na druhu, genotypu a prostředí (GREGORY 965; MENDOZA et HAYNE 976; EWING 985;). U některých komerčních kultivarů bramboru se však tuberizace projevuje i při nepřetržitém osvětlení, pokud jsou teploty nízké nebo proměnlivé tak, 7

aby rostliny měly termoperiodu (GREGORY, 965; WHEELER et IBBIS, 986). o naznačuje, že vliv prostředí může být zrušen různými jinými stimuly prostředí, jako je ozáření intenzivním světlem či proměnlivé teploty (EWING, 985; WHEELER et al., 99). Zatímco kulturní brambor je na fotoperiodu relativně málo citlivý, tak plané druhy, jako například Solanum demissum Lindl. nebo Solanum tuberosum L. ssp. andigena jsou při své tuberizaci na fotoperiodu kompletně odkázány (AMADOR et al. ). yto druhy tuberizují pouze při pěstování v podmínkách krátkého dne, pěstování za dlouhého dne či přerušení noční tmy má za následek inhibici tuberizace (EWING et SRUICK 99). Proto jsou tyto druhy ideálním modelem pro studium fotoperiodického ovlivnění tuberizačního procesu. Je totiž možné mít u nich celé skupiny rostlin, které jsou čistě na základě fotoperiody indukovány či neindukovány k tuberizaci. Důležitější pro tyto druhy než délka dne je ale délka noci (AMADOR et al. ). RASUMOV (93) pozoroval, že rostliny Solanum demissum Lindl. a Solanum acaule Bitter tuberizovaly nejlépe, když jim byly v raných fázích růstu poskytnuté dlouhé dny, následované krátkými dny, což naznačuje obligátní požadavek na krátké dny pro tuberizaci u těchto druhů. Ale například na Solanum tuberosum L. cv. Guapa měla fotoperioda z hlediska tuberizace jen minimální vliv. Největší sušinu a hmotnost měly rostliny ošetřené dlouhými dny, největší počet hlíz byl u rostlin pěstovaných na podmínkách krátkého dne (RASUMOV 93). Nejlepší antituberizační účinek na rostliny pěstované na krátkém dni mělo dlouhé přerušení temnostní fáze červeným světlem. ento účinek inhibující tuberizaci však může být zvrácen, a to pokud jsou rostliny ihned po ošetření tímto světlem ošetřeny dlouhovlnným červeným světlem. Zřejmě se zde uplatňuje vliv fotoreceptoru fytochromu (BAUIS et EWING 98). Práce AMADOR et al. () ukázala, že fytochrom PHYB má zásadní vliv na tuberizaci zejména u planých druhů brambor, částečně však také u kulturního bramboru. Použitím protismyslného přístupu se u krátkodenního druhu Solanum tuberosum L. ssp. andigena se podařilo dokázat, že rostliny s redukovaným množstvím PHYB ztratily fotoperiodickou kontrolu tuberizace a tuberizovaly jak při krátkodenním, tak i dlouhodenním ošetření (JACKSON et al. 996). Zdá se, že PHYB poskytuje negativní kontrolu, tj. inhibuje tuberizaci za světelně nepříznivých podmínek. Roubovací experimenty dokázaly, že tento fotoreceptor kontroluje syntézu roubem přenosného signálu inhibujícího tuberizaci, který se vyskytuje u dlouhodenních rostlin a chybí nebo je neaktivní u PHYB-protismyslných rostlin (JACKSON et al., 998). Za dlouhodenních podmínek, nepříznivých pro tuberizaci, v rostlinách lilku bramboru 8

dochází ke zvýšení hladiny giberelinů, které tuberizaci inhibují (JACKSON et al. 996). Rostliny pěstované na krátkém dni vykazovaly nižší hladinu cytokininů, ale i giberelinů (AKSENOVA et al. 8). Na fotoperiodě závislá tuberizace se dělí do pěti chronologických stádií: percepce krátkých dnů (ůčastní se jí především listy), adaptace na krátké dny, vytvoření tuberizačního signálu v listech a jeho přenos stonkem do podzemní části rostliny, vznik hlízek a změna metabolismu související s tvorbou hlízek. U rostlin silně indukovaných k tuberizaci krátkým dnem se zejména u planých druhů vyžadujících krátkodenní podmínky k tuberizaci, mohou vytvářet hlízky přímo na hlavním stonku (MARÍNEZ-GARCÍA et al. ). 3..4. Vliv minerální výživy na tuberizaci a zdraví lilku bramboru Minerální výživa představuje důležitý faktor tvorby výnosu lilku bramboru, a to jak v podmínkách in vivo, tak in vitro (WANG et HU 985). Rostliny, jež mají málo fosforu, produkují velmi malé hlízky, ukládají do hlízek více cukru, ale mají celkově o něco méně sušiny než rostliny dostatečně hnojené; navíc jsou citlivé vůči chorobám a v období sklizně jsou již často přezrálé; rostliny mají méně kořenů, méně je i stolonů a ty jsou kratší; dužnina hlíz je hnědě tečkovaná (PAVLISA et BLUMENHAL ). Dostatek fosforu v době tuberizace zvyšuje množství vytvořených hlízek (FREEMAN et al. 998, JENKINS et ALI ). Celková sklizeň je při vyšších dávkách fosforu vyšší (ROSEN et BIERMAN 8). Rovněž podporuje nárůst zelné hmoty (HASSANPANAH et al. 9). Brambor je na počátku svého růstu náročný rovněž na příjem dostatečného množství dusíku, jeho nadbytek však tuberizaci inhibuje (SALLKNECH et FARNSWORH 979; WAIMENA et al. 983). Význam dusíku spočívá především v tom, že rostlinám umožňuje utilizovat uhlík. Dostatečný přísun dusíku zvyšuje intenzitu růstu rostlin, vede k větším listovým povrchům a rozměrům hlízek (HASSANPANAH et al. 9). Rostliny dostatečně zásobené dusíkem jsou rovněž odolnější proti skvrnitosti listů (PANDEY.) Avšak nadbytečný přísun dusíku, zejména v pozdějších fázích růstu, způsobuje nadměrný vývin stonků a listů na úkor růstu hlíz, což je důsledek velkého množství aminokyselin a amidů, které se nepřeměňují v proteiny. Způsobuje tedy snížení kvantity a kvality hlíz. Nižší dávka dusíku vede ke zvýšení počtu hlízek na rostlinu, ale snížení velikosti hlízek (SARKAR et NAIK 998; MCDOLE 978; SAYANARAYANA et ARORA 985). Dalším z důsledků nízkého příjmu dusíku je snížená fotosyntéza, protože spodní listy za 9

takovéto situace žloutnou a opadávají. Zvýšení poměru mezi amonným a nitrátovým dusíkem v médiu vedlo ke snížení počtu a hmotnosti hlízek (GARNER et BLAKE 989). Pro vysoké sklizně brambor je potřeba rostlinám lilku bramboru dodat dostatečnou dávku draslíku (ERREBHI et al. 998). Dostatečné hnojení draslíkem naopak celkovou sklizeň zvyšuje (WESERMANN et al. 994). Nadměrné hnojení draslíkem však snižuje hmotnost hlízek (MCDOLE 978). Sušina a velikost hlízek se při příliš vysokých dávkách draslíku rovněž snižuje (ERMAN et al. 953; IMM et MERKLE 963). 3.3. Vnitřní faktory tvorby hlíz Jedná se o faktory tuberizace, jež mají svůj původ uvnitř rostliny. Odvozují se však určitým způsobem od vnějších faktorů tuberizace, závisejí na nich a jsou jimi ovlivňovány. Jedná se především o vliv fytohormonů, na němž tuberizace (stejně jako jiné životní pochody lilku bramboru a rostlin obecně) závisejí. 3.3.. Hormonální regulace tvorby hlíz Fytohormony většinou představují zásadní endogenní faktor tuberizace. Slouží k odstartování přeměny stolonu v hlízu, udržují její růst a po čase vyvolají její dormanci, aby nedošlo k vyrašení v podmínkách, které jsou nevhodné pro růst nadzemních částí rostliny. Některé fytohormony však naopak tvorbu hlíz inhibují či vyvolávají jejich rašení. Hormony buď vznikají přímo v hlíze bramboru, nebo jsou do ní transportovány. Korelativní hormonální signály na dlouhou vzdálenost jsou významnými posly v tuberizačním procesu, ale i v koordinaci růstu a vývoje rostlin, a z tohoto důvodu jsou významné z vědeckého i zemědělského hlediska. Kvantitativní analýza těchto hormonálních signálů během transportu je obtížná a z mnoha důvodů nejsou její výsledky v současné době příliš spolehlivé. Celkově tyto signály garantují vývoj rostliny optimálně nastavený k předurčenému habitu rostliny. Záležitost hormonální regulace je navíc ještě komplikována tím, že transportními cestami těchto látek může být xylém, floém, apoplast a symplast (BANGERH 8). Chování těchto signálů je velmi komplexní, zahrnuje oběh, zpětný obrat a interakce ( crosstalk ) mezi signálními molekulami stejné nebo různé povahy (JESCHKE et al. 997; MARSCHNER et al. 996; HARUNG et al. ; DODD 5; REWAVAS 5).

Metabolickým obratem se v těchto pracích myslí putování minerálu nebo hormonu, který je transportován z kořene do výhonku xylémem a retranslokován po nasátí do floému zpět do kořene. Zpětný obrat potom znamená přijetí toho samého hormonálního signálu do xylému a jeho opětovný transport do výhonku. 3.3... Význam auxinů pro tuberizaci lilku bramboru Ačkoliv se věří, že auxiny jako látky podporující buněčně dělení mají příznivý vliv na tuberizaci, skutečná pozorování efektů exogenně aplikovaných auxinů mají často protichůdné výsledky. HARMEY et al. (966) pozoroval zvětšení velikosti a ranější tvorbu indukovaných hlízek po ošetření IAA, kdežto u OBAA-SASAMOO et SUZUKI (979) byl obsah auxinů v rostlinách bramboru největší ve fázi před iniciací tuberizace a v jejím průběhu se snižoval. Při nízké koncentraci sacharózy v médiu (%) zvyšovala IAA celkovou biomasu rostlin. Se zvyšující se koncentrací sacharózy v médiu se příznivý vliv IAA na celkovou biomasu snižoval a při vysokých dávkách sacharózy (8%) v médiu IAA celkovou biomasu snižovala. IAA podporovala růst kořenů a hlízek a inhibovala růst stolonů. Při vysoké koncentraci sacharózy (8% v médiu) IAA růst hlízek inhibovala (ROMANOV et al. ). V pokusu ZHANG et al. (5) došlo k prodloužení délky stolonu se zvětšující se dávkou IAA. IAA zvyšovala počet a hmotnost kořenů, ale snižovala délku kořenů. Snižovala počet hlízek, ale zvyšovala jejich hmotnost a příčný průměr. SULE (3) pozoroval zvýšení produkce etylenu a inhibici růstu stolonů po ošetření auxiny. Vliv exogenních auxinů na tuberizaci závisí na použité koncentraci nižší koncentrace ( 5 µm) indukuje tuberizaci, kdežto vysoká koncentrace ji inhibuje (WANG et HU, 98). Podle MANGA et al. (984) nízká koncentrace,4-d (,- µm) podporuje počet vytvořených hlízek v in vitro kultuře. V jejich experimentu vysoká koncentrace,4-d ( µm) vyústila ve zvýšenou tvorbu stolonů a inhibici vytváření hlízek. ANJUM et VILLIERS (997) při nižší koncentraci,4-d pozorovali zvýšené množství vytvořených hlízek. 3.3... Význam cytokininů pro tuberizaci lilku bramboru Podle ZAKARIA et al. (8) byla tvorba hlízek nejranější (objevila se už po 3,3 dne) u média s obsahem mg.l - BA, jiná koncentrace (ať už vyšší, nebo nižší)

tuberizaci významně oddalovala. Nejdelší doba od pasážování do vytvoření první hlízky uplynula u média bez obsahu BA (, dne). Počet hlízek na nádobu se zvyšoval s obsahem cytokininu až po obsah mg.l - BA, potom se začal s rostoucí koncentrací BA v médiu významně snižovat. Koncentrace mg.l - BA poskytovala nejvyšší hmotnosti vytvořených mikrohlízek. Podle SHIBLI et al. () cytokininy zpomalují až inhibují tvorbu kořenů a podporují přeměnu listnatých stonků ve stolony. WANG et HU (98) uvádějí, že pro podporu a indukci tuberizace vyvolanou cytokininy je potřeba koncentrace sacharózy v médiu o velikosti alespoň 4% (ZAKARIA et al. 8). O cytokininech je známo, že podporují dělení buněk (SKOOG et MILLER 957), inhibují jejich prodlužování (VANDERHOEF et KEY 968) a podporují růst jejich objemu (SCO et LIVERMAN 956), což jsou všechno buněčné životní pochody nezbytné pro tuberizaci. KODA et OKAZAWA (983) pozorovali u prodlužujících se špiček stolonů nízký obsah cytokininů, avšak poté, co došlo ke zduřování a tvorbě hlízek, se jejich koncentrace ve špičce stolonu, proměňující se v hlízku, zvýšila. Po ukončení tuberizačního procesu se obsah cytokininů v nově vzniklých hlízkách poněkud snížil. Cytokininy jsou syntetizovány v kořenech, ale rovněž v nadzemní části rostliny (NORDSRÖM et al. 4). V pokusu, jehož cílem bylo zjistit místo biosyntézy cytokininů, tito autoři oddělili kořeny a výhonky Arabidopsis a inkubovali je zvlášť v tekutém médiu obohaceném o 3% H O. Značení deuteriem in vivo vyústilo v izotopometrický shluk pro kořen a výhonek, což jasně demonstrovalo kapacitu syntetizovat H-zeatinribosid-5 -monofosfát v obou typech pletiv. oto pozorování, že nadzemní část rostliny je významným zdrojem biosyntézy cytokininů, bylo impulzem pro další experiment, kde použili tabák k objasnění místa tohoto zdroje. Analyzovali rozměr zásoby a rychlost biosyntézy H-zeatinribosidu a H-zeatinribosid-5 - monofosfátu v izolovaných listech různých velikostí: velké listy, kde růst skončil, listy ve fázi růstu a malé listy s aktivním buněčným dělením a pouze limitovaným růstem. Největší kapacitu syntetizovat H-zeatinribosid a H-zeatinribosid-5 -monofosfát měly mladé vyvíjející se listy s aktivním buněčným dělením, což se také odráží v rozměru endogenní zásoby těchto fytohormonů. Kořeny zprostředkovaná syntéza cytokininů závisí na vyvinutých postranních kořenových primordiích (NORDSRÖM et al. 4). ito autoři kvůli objasnění lokalizace kořeny zprostředkované syntézy cytokininů použili dvojitého mutanta axr4- Χ aux-7, který nevytváří takřka žádné postranní kořeny (HOBBIE et ESELLE 995). Kvantifikace zásob endogenních ribotidů odhalila, že tento mutant obsahoval významně snížená množství isopentenyladenosin-

5 -monofosfátu, což ukazovalo, že snížené množství kořenových meristémů vyústilo ve snížení množství produkovaného isopentenyladenosin-5 -monofosfátu (jednostranný t test; p >,5), přičemž došlo pouze k menší, nevýznamné redukci zásoby H- zeatinribosid-5 -monofosfátu. 3.3..3. Význam giberelinů pro tuberizaci lilku bramboru Gibereliny podporují tvorbu a prodlužování stolonů (SMIH et RAPPAPOR 969). GA stříkaná na listy způsobovala velkou délku stolonů, a to jak u krátkodenního, tak u dlouhodenního ošetření (HAMMES et NEL 975). MENZEL (98) pozoroval inhibici tvorby hlízek při ošetření vysokými koncentracemi GA. IZIO (977) dokázal, že zřejmě všechny gibereliny tuberizaci inhibují, avšak podle MARKAROV (99) se může za krátkodenního ošetření tuberizace projevit i při ošetření gibereliny, je však zpožděná, hlízky jsou menší a na rostlině jich vznikne méně. V pokusu XU et al. (998) docházelo se zvyšující se koncentrací GA 4/7 ke zpožďování tuberizace, její redukci a snížení synchronnosti tuberizačního procesu. Při koncentraci,3 µm GA 4/7 se první hlízky vytvořily ve 4. dni, při koncentraci µm GA 4/7 však až ve. dni. Se zvyšující se koncentrací GA 4/7 se snižovala šířka hlízek a zvyšovala se délka stolonů. Čím vyšší byla koncentrace GA 4/7, tím méně pravidelný měly hlízky tvar a byly menší. Při koncentraci µm GA 4/7 se nevytvořily žádné hlízky a stolony byly extrémně dlouhé. Pokud byly rostliny pěstovány na médiu bez obsahu GA 4/7, na stolonech se objevily hlízky. Jestliže byly tyto rostliny s hlízkami přemístěny do média s obsahem,5 µm GA 4/7, došlo ke zvratu ve vývoji hlízek a z apikální oblasti těchto hlízek vyrašily opět stolony. Jejich velikost však zůstala nezměněna. Z toho plyne, že GA mají svůj význam především pro stolonizaci. 3.3..4. Význam kyseliny abscisové pro tuberizaci lilku bramboru KODA et OKAZAWA (983) pozorovali, že při pěstování rostlin bramboru v médiu, jež obsahovalo pouze sacharózu a kyselinu abscisovou docházelo se zvyšováním její koncentrace v médiu ke zvětšování počtu založených hlízek; tyto hlízky se však bez dodání ostatních hormonů jen minimálně zvětšovaly, což naznačuje, že kyselina abscisová má význam zejména pro založení hlízek, nikoliv pak už pro jejich růst. Podle 3

XU et al. (997) ABA stimuluje tuberizaci a snižuje délku stolonů. Podstatou jejího vlivu je podle nich snížení vlivu giberelinů na tuberizaci. MENZEL (98) objevil, že se zvyšující se koncentrací ABA dochází ke zkrácení doby od založení experimentu do objevení se první hlízky. PALMER et SMIH (969) naopak pozorovali inhibici tuberizace pod vlivem ABA. XU et al. (997) uvádějí, že se koncentrace ABA v průběhu vývoje pupenu ve stolon a nakonec v hlízku snižuje. 3.3..5. Význam etylénu pro tuberizaci lilku bramboru Podle MINGO-CASEL et al. (974) etylén tuberizaci v nižších dávkách stimuluje, avšak ve vyšších inhibuje potlačením vlivu cytokininů a oxidu uhličitého. Při nadbytku etylénu jsou hlízky protáhlé a neobsahují téměř žádný škrob. Při vysokých dávkách etylénu v kultivačním médiu a nedostatečném obsahu oxidu uhličitého se na bázi stolonů rostlin bramboru vytvářely čistě bílé kalusy bez obsahu chlorofylu. Nadměrný obsah etylénu u rostlin bramboru dále způsoboval diageotropický růst, vznik tvrdého hákovitého zakončení stolonu a tenčí a kratší stolony. 3.3..6. Význam kyseliny jasmonové pro tuberizaci lilku bramboru Kyselina jasmonová podporuje tuberizaci, přičemž tato stimulace je větší u ranějších kultivarů bramboru a s délkou vegetace potřebné k založení hlíz slábne. Pozitivní vliv této látky na tuberizaci je velmi silný (KODA et al. 99). KODA et KIKUA () pozorovali rovněž vliv doby délky vegetace bramboru potřebné pro vytvoření hlíz na velikost tuberizační odpovědi na kyselinu jasmonovou nejlépe po dodání kyseliny jasmonové tuberizovaly rané kultivary, menší hlízky, jichž se vytvořilo méně, měly středně pozdní rostliny a pozdní rostliny reagovaly na kyselinu jasmonovou jen velmi slabě. Naopak ale u extrémně pozdních kultivarů KODA et KIKUA () pozorovali silnější příznivý vliv kyseliny jasmonové na tuberizaci. Podle CENZANO et al. (3) u hákovitých zakončení apexů stolonů kyselina jasmonová zvyšuje tloušťku meristémů a snižuje délku listových primordií. Urychluje diferenciaci vodivých pletiv v hlízce, konkrétně pak přeměnu prokambia v xylém. Způsobuje změnu tvaru průřezu buněk hlízek z mnohostěnu na přibližný ovál. Zvyšuje rovněž rozměry buněk hlízek. Způsobuje také zduřování pupenů hlíz. Rovněž byl pozorován inhibující vliv kyseliny 4

jasmonové na růst stolonů při vyšších koncentracích (7,5, µm) u raných kultivarů. Kyselina jasmonová neměla žádný účinek na počet hlízek. U raných kultivarů kyselina jasmonová podporovala tvorbu sušiny. Jasmonová kyselina zvyšuje redukující a celkové cukry v hlízkách včetně obsahu škrobu (SARKAR et al. 6). 3.. Crosstalk fytohormonů při tuberizaci Crosstalk jako jeden ze základních regulačních mechanismů rostlin představuje interakci mezi jedním nebo dvěma hormonálními signály na velkou vzdálenost v reakci na hormonální signál, kterým může být buď zvýšení, nebo snížení obsahu jiného fytohormonu (ROSS et al. ; HAVER et al. 3; HARIG et BECK 6), nebo interakce mezi signálními molekulami rozdílných skupin (např. mezi hormonálními a - minerálními signály jako např. NO 3 a cytokininy nebo mezi bórem a polárním auxinovým transportem (AKEI et al. ; COLLIER et al. 3; RAHAYU et al. 5; WANG et al. 6), nebo hormonální a cukerné signály (HAVELANGE et al. ; HARIG et BECK 6; ROLLAND et al. 6). Zdá se, že výše uvedené interakce mezi těmito signály na dlouhou vzdálenost hrají nejvýznamnější roli, protože na rozdíl od ostatních signálních molekul jsou schopny ovlivňovat a regulovat takřka všechny vývojové procesy v rostlinách (BANGERH 8). Auxiny podle názoru REDMANA et al. (4) představují aktivátor genu AtCKX6, jenž je zodpovědný za tvorbu cytokininoxidázy/dehydrogenázy, jejímž účinkem je odbourávání izoprenoidních cytokininů v rostlině. Poté, co hladina auxinů vystoupá na určitou úroveň, dojde k odstartování aktivace cytokininoxidázy/dehydrogenázy, která odbourává cytokininy typu zeatinu a izopentenyladeninu a jejich ribosidů. Podle REDMANA et al. (4) je tento stav pouze dočasný, rostlina se přizpůsobí zvýšenému obsahu cytokininoxidázy/dehydrogenázy a i přes tuto její hladinu začne obsah cytokininů znovu růst. Poměr auxinu a cytokininu určuje podle SKOOGA et MILLERA (957) morfogenní odpověď; vysvětlují to tak, že odbouráváním cytokininu cytokinin oxidázou/dehydrogenázou postupně vrůstá poměr auxinu a cytokininu nad vyrovnaný poměr a tím se posílí tvorba bočních kořenů, dojde k potlačení dominance apexu hlavního kořene, posílení apikální dominance apexu prýtu a tvorbě bočních větví, lístků a pupenů. Pokud je naopak poměr auxinu a cytokininu nižší než vyrovnaný, je podporována tvorba hlavního (tj. kůlového) kořene, dochází tedy k posílení apikální 5

dominance kořene, dále k potlačení apikální dominance apexu prýtu, tvorbě bočních větví, lístků a pupenů. NORDSRÖM et al. (4) nepozorovali vliv cytokininů na obsah auxinů v rostlině. KEFELI et KALEVICH (3) popsali, že mezi růstem rostliny a obsahem IAAoxidázy existuje inverzní závislost. Obsah IAAoxidázy tedy klesá se zrychlujícím se růstem většiny rostlin. Cytokininy v rostlině jsou ovlivňovány obsahem nitrátového dusíku a ten ovlivňuje obsah cytokininů. ABROL et al. (983) popsal zvýšení koncentrace nitrátreduktázy a tedy i nitrátového metabolismu u rostlin, jimž byl uměle dodáván benzyladenin. SAMUELSON et LARSSON (993) pozorovali zvýšení hladiny zeatinribosidu při intenzivním nitrátovém hnojení u kořenů ječmene. U okřehku (rod Lemna) došlo ke snížení obsahu cytokininů při deficitu dusíku (HORSEINSSON et ELIASSON 989). I podle řady dalších autorů dochází při zvýšení obsahu dusíku v kultivačním médiu rostlin ke zvýšení obsahu cytokininů v rostlině a naopak k jejich snížení při zvýšení dusíkatého hnojení (KUIPER et al. 988). Je již znám i mechanismus tohoto ovlivnění - (SAKAKIBARA et al. 6) zjistili, že nitrátové ionty zvyšují produkci IP (adenosinfosfát isopentenyltransferázy), což je enzym biosyntézy některých cytokininů; zvýšení aktivity enzymu vede ke zvýšení syntézy cytokininových produktů. Je však známo i opačné ovlivnění exogenně dodané cytokininy zvyšují množství nitrát reduktázy v rostlině, což vede k rychlejší přeměně nitrátové formy dusíku na amoniakální a proto i k úbytku nitrátového dusíku v rostlině, zvyšujícímu se zároveň se zvyšujícím se množstvím cytokininů v rostlině (LU et al. 99). RADIN (984) popisuje zvýšení obsahu ABA při nedostatku dusíku u řady rostlin. U tabáku popisuje LIN et al. (999) snížení obsahu ABA při vysokých dávkách dusíku. Podle ELIASSON (975) auxin vyvolává a podporuje tvorbu ABA, která pak způsobuje dormanci laterálních pupenů a tak zabraňuje jejich vyrašení. U rostlin tabáku exogenně aplikovaná IAA stimuluje tvorbu etylénu indukcí a následným posílením tvorby ACC syntázy, avšak u řepy (Beta sp.) nikoliv existují zřejmě autoinhibiční mechanismy, které tvorbu etylénu stimulovanou IAA inhibují (YU et al. 979). 4. MAERIÁL A MEODY ZPRACOVÁNÍ Základním materiálem použitým při vypracování diplomové práce byly jednonodální segmenty lodyžek lilku bramboru (Solanum tuberosum L.) odrůdy Karin. 6

yto lodyžky byly pěstovány metodou in vitro na MS médiu (MURASHIGE et SKOOG 96) s obsahem 3 g.l - sacharózy, 8 g.l - agaru a ph = 5,8 při trvalém osvětlení. Nastříhané jednonodální segmenty byly pěstovány rovněž metodou in vitro, ale médium již bylo modifikováno na indukční obsahovalo 8 g.l - sacharózy, 8 g.l - agaru, ng.l - benzyladeninu a podle varianty pokusu µm anorganického dusíku (varianta se sníženým dusíkem), 4 µm anorganického dusíku (kontrolní varianta) a nebo 65 7 µm anorganického dusíku (varianta se zvýšeným dusíkem). Segmenty byly pěstovány na fotoperiodě 8/6 8 hodin světla a 6 hodin tmy (důvodem je stimulace tuberizace zkráceným dnem). Z tohoto pěstebního schématu bylo odvozeno několik pokusů. V pokusu číslo byl zkoumán vliv úrovně dusíkaté výživy na procento baněk s alespoň jednou vzniklou hlízkou v průběhu času, u pokusu číslo byl zkoumán vliv úrovně dusíkaté výživy na dynamiku koncentrace kyseliny abscisové v jednotlivých částech a také celém jednonodálním segmentu lilku bramboru v průběhu času, pokusy číslo 3, 4, 5 byly obdobou pokusu číslo, v případě pokusu číslo 3 byly zkoumány cytokininy, v případě pokusu číslo 4 CO, v případě pokusu číslo 5 etylen, v případě pokusu číslo 6 kyselina -aminocyklopropan--karboxylová a v případě pokusu číslo 7 jsme analyzovali vývoj hladiny dusíku. Použitými metodami byly v případě pokusu číslo přímé pozorování s ohodnocením počtu baněk s alespoň jednou mikrohlízkou, v případě pokusu číslo metoda RIA (radio-immuno assay), v případě pokusu číslo 3 byly vzorky nejdříve vyčištěny metodou HPLC a následně analyzovány metodou ELISA, v případě pokusu číslo 4 a 5 plynová chromatografie (GC). Kyselinu aminocyklopropan--karboxylovou jsme určili nepřímo rovněž plynovou chromatografií. Číselné výsledky získané analýzou vzorků byly následně zanalyzovány statisticky a matematicky. 4.. Přímé pozorování a ohodnocení počtu baněk s alespoň jednou vytvořenou mikrohlízkou Při založení pokusu číslo, byly všechny připravené baňky očíslovány s použitím polepovacích štítků. Následně byly do baněk s kultivačními médii přeneseny lodyžky lilku bramboru. Až do třetího týdne po založení pokusu byly všechny varianty pravidelně odvětrávány, aby se eliminoval inhibující vliv nepřiměřeně vysokého obsahu plynného fytohormonu etylénu nebo jiných plynů produkovaných během kultivace. Od 7

třetího týdne se začaly tvořit hlízky. Každý týden byl zaznamenán počet baněk s alespoň jednou vytvořenou hlízkou, a ten byl po skončení pokusu využit k výpočtu. 4.. Zkoumání vlivu úrovně dusíkaté výživy na vývoj obsahu kyseliny abscisové Při založení pokusu byly označeny jednotlivé varianty. V příslušných časových intervalech ( h, 48 h, 68, 456 h, 67 h a 8 h) byly odebrány vzorky z jednotlivých rostlinných orgánů. Vzorky byly skladovány při - C a následně lyofilizovány. Poté byla provedena extrakce ABA do vody, centrifugace vzorků a RIA analýza (viz kap. 4.3.). Pracovní postup RIA analýzy byl následující: - Nejdříve jsem si připravil standardy a vzorky. Připraveny byly B (minimální vazba), B M (maximální vazba), standardy a vzorky do mikrozkumavek. - Přidal jsem µl 3 H-kyseliny abscisové ( dpm/vzorek); specifická aktivita 3,7 MBq mmol -. - Přidal jsem µl protilátky MAC. - Přidal jsem µl 5% PBS. - Inkuboval jsem 45 minut v lednici při teplotě 4 C. - Přidal jsem 5 µl % (NH 4 ) SO 4. - Inkuboval jsem 3 minut při laboratorní teplotě. Připravil jsem centrifugaci. - Centrifugoval jsem cca minut při 5 ot/min a 4 C. - Odstranil jsem supernatant odsávačkou. - Přidal jsem ml 5% (NH 4 ) SO 4. - Vortexoval jsem (roztřepával sraženinu). - Centrifugoval jsem cca 8 minut při 5 ot/min a 4 C. - Odstranil jsem supernatant odsávačkou. - Přidal jsem µl destilované H O. - Vortexoval jsem. - Přidal jsem ml dioxanového scintilátoru. - Pevně jsem mikrozkumavky uzavřel, vložil do měřících ampulí, měřil na Packard RI-CARB 9R. 8

Získané výsledky jsem následně zpracoval. Časové intervaly odběru vzorků pro určování koncentrace byly rovnoměrně rozloženy po přechodové charakteristice od zahájení až do ukončení pokusu. Počet časových bodů musí být větší jak počet parametrů regresní funkce tj. rovnic oprav musí být více jak počet neznámých tj. parametrů regresní funkce, aby mohlo dojít ke zprostředkujícímu vyrovnání laboratorně získaných hodnot koncentrací. 4.3. Podstata metody RIA (radio-immuno assay) Principem RIA je kvantitativní stanovení, při kterém se využívá schopnost monoklonální protilátky MAC 5 (QUARRIE et al. 988) rozpoznat molekulu ABA, a to s velmi vysokou specifitou. Principem je zde kompetice nativní nebo standardní ABA (hapten) a radioaktivně značené 3 H-kyseliny abscisové (radioligand) ve vazbě na protilátku MAC 5. Pokud je množství protilátky MAC 5 a 3 H-kyseliny abscisové konstantní a nativní kyselina abscisová je v přebytku, dochází k vytěsňování radioligandu z vazby s protilátkou a k vazbě haptenu s protilátkou. Komplexy haptenprotilátka a radioligand-protilátka se vytvářejí až po inkubaci při nízké teplotě (+4 C). Oddělení volných haptenů a radioligandů od komplexů protilátek s haptenem či radioligandem se provádí vysrážením v síranu amonném, odděleny jsou následně centrifugací. 3 H-aktivita sedimentu je následně změřena kapalnou scintilací na scintilačním spektrofotometru PACKARD ri CARB 9 R, výsledky jsou přepočteny na obsah kyseliny abscisové analytu v,,pg pomocí programu Securia Packard. Kalibrační křivka je sestrojena za použití standardní kyseliny abscisové (+/- cis, trans-kyselina abscisová, Sigma). 4.4. Vliv úrovně dusíkaté výživy na vývoj obsahu cytokininů Pro vlastní analýzu obsahu cytokininů byla použita extrakce, purifikace, HPLC separace a přímá ELISA kvantifikace cytokininů. Lyofilizovaný rostlinný materiál byl homogenizován do Bieleskiho fixáže. Poté byly odstraněny lipidy a lipofilní barviva (chlorofyl), a to centrifugací extraktu (metanol: chloroform: voda = 3 : 5 : ) po doplnění o polovinu objemu vodou (BIELESKI 964). ak byl oddělen supernatant s cytokininy (vodný metanol) od chloroformu (obsahuje barviva, lipofilní látky aj.). Po odpaření metanolu do vodného zbytku byly ribotidy cytokininů štěpeny kyselou 9