MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DISERTAČNÍ PRÁCE

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DISERTAČNÍ PRÁCE BRNO 2012 ONDŘEJ MAMICA

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat Elektrofyzikální vlastnosti spermatu hřebců Disertační práce Vedoucí práce: Prof. Ing. Ladislav Máchal, DrSc. Vypracoval: Ing. Ondřej Mamica Brno 2012

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma Fyzikální vlastnosti ejakulátu hřebců vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Disertační práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího disertační práce a děkana Agronomické fakulty Mendlovy univerzity v Brně. dne..... podpis doktoranda.

Poděkování Úvodem bych chtěl především poděkovat prof. Ing. Ladislavu Máchalovi, Dr.Sc. za jeho pomoc, odborné vedení a velmi cenné rady při řešení tohoto výzkumu. Také děkuji doc. RNDr. Ivo Křivánkovi CSc. a doc. Ing. Liboru Severovi Ph.D. za pomoc při realizaci výzkumu zejména v oblasti fyzikálních vlastností ejakulátu hřebců. ANOTACE

Základním předpokladem úspěšné inseminace v chovu koní je výběr kvalitních plemenných hřebců, kteří produkují dostatečné množství ejakulátu v dobré kvalitě. Za tímto účelem vzniklo mnoho metod zabývajících se hodnocením kvality ejakulátu. Jednou z možných metod, doplňujícího vyšetření spermatu hřebců, jsme se zabývali v předložené disertační práci. Sledování fyzikálních vlastností ejakulátu bylo provedeno u 11 klinicky zdravých plemenných hřebců, kteří působí v rámci šlechtitelského programu českého teplokrevníka. Odebíráním ejakulátu bylo pro další zpracování získáno 95 vzorků, u kterých bylo dle metodiky provedeno měření elektrické vodivosti, dynamické viskozity a byly stanoveny základní kvalitativní a kvantitativní ukazatele. Naměřená elektrická vodivost ejakulátu hřebců se pohybovala v rozpětí hodnot od 0,32 S m -1 do 0,55 S m -1. Průměrná hodnota za celý experiment byla 0,38 S m -1. Dynamická viskozita vykazovala rozpětí hodnot od 88,0 mpa s do 189,0 mpa s s průměrnou hodnotou 130,19 mpa s. Z výsledků je patrná vysoce statisticky průkazná kladná lineární závislost mezi elektrickou vodivostí ejakulátu a koncentrací spermií (r p = 0,68; r p = 0,67; r p = 0,69; P 0,01). Výsledky dále ukázaly významné záporné korelace mezi elektrickou vodivostí ejakulátu a jeho objemem (r p = -0,43; r p = -0,42; r p = -0,38 P; 0,05). Pozitivní lineární závislost byla prokázána mezi elektrickou vodivostí ejakulátu a motilitou spermií (r p = 0,37; r p = 0,45; r p = 0,42; P 0,05). Mezi dynamickou viskozitou ejakulátu a základními ukazateli ejakulátu bylo dosaženo významného záporného vztahu pouze v jednom případě, a to u koncentrace vodíkových iontů (r p = - 0,46; P 0,05). Dosavadní výsledky otevírají možnost orientačního odhadu kvalitativních a kvantitativních ukazatelů ejakulátu na základě zjištěných fyzikálních vlastností. Před zavedením tohoto doplňujícího vyšetření hřebčího spermatu do praxe je však nutné ověření výsledků dalšími experimenty. Klíčová slova: hřebec, ejakulát, vodivost, viskozita. ANNOTATION

The basic precondition of the artificial insemination in horse breeding is the selection of quality stallions that produce enough of ejaculate of a good quality. Many methods of ejaculate quality evaluation have been developed for this purpose. One of possible methods, additional examination of stallion sperm, is the object of this dissertation. Monitoring of physical qualities of ejaculate was performed in 11 clinically healthy breeding stallions that are employed within breeding program of Czech hot-blooded horse 95 samples were collected for further examination of the electrical conductivity and the dynamic viscosity measurement and assesment of basic qualitative and quantitative indicators. Measured electrical conductivity of stallion ejaculate varied from 0,32 S m -1 to 0,55 S m -1. The mean value for whole experiment was 0,38 S m -1. The dynamic viscosity showed range from 88,0 mpa s to 189,0 mpa s with the mean value of 130,19 mpa s. Highly statistically significant positive linear dependence between the electrical conductivity of ejaculate and sperm concentration (r p = 0,68; r p = 0,67; r p = 0,69; P 0,01) is evident from the results. The results also showed significant negative correlation between the electrical conductivity of ejaculate and its volume (r p = -0,43; r p = -0,42; r p = -0,38 P; 0,05). Positive linear correlation was proved between the electrical conductivity of ejaculate and sperm motility (r p = 0,37; r p = 0,45; r p = 0,42; P 0,05). Concerning the dependence between the dynamic viscosity and the basic indicators of ejaculate, only the concentration of hydrogen inos showed significant negative correlation (r p = - 0,46; P 0,05). Present results open the possibility of orientational estimation of qualitative and quantitative indicators of ejaculate on the bases of measured physical qualities. Before application of this additional method of stallion sperm examination in practice, it is necessary to verify the results in other experiments. Key words: stallion, ejaculate, conductivity, viscosity. OBSAH 1. ÚVOD......9 2. LITERÁRNÍ PŘEHLED....10

2.1 Pohlavní soustava hřebce.......10 2.1.1 Varle (testis)....10 2.1.2 Nadvarle (epididymis)....11 2.1.3 Chámovod (ductus deferens)....11 2.1.4 Přídatné pohlavní žlázy (glandulae genitales accessoriae)....12 2.1.5 Pyj (penis).....13 2.2 Řízení pohlavní činnosti hřebců....13 2.3 Ejakulát hřebce... 14 2.3.1 Spermie... 14 2.3.2 Semenná plazma... 18 2.4 Spermatogeneze... 19 2.5 Výběr hřebců pro inseminaci, plodnost a pohlavní aktivita.... 20 2.6 Odběr spermatu od hřebců... 21 2.7 Hodnocení ejakulátu... 22 2.7.1 Barva, konzistence a pach ejakulátu... 23 2.7.2 Objem ejakulátu... 24 2.7.3 Motilita spermií....24 2.7.4 Koncentrace spermií....26 2.7.5 Koncentrace vodíkových iontů (ph ejakulátu)... 28 2.7.6 Morfologické vyšetření spermií... 29 2.8 Ředění a konzervace ejakulátu....32 2.8.1 Krátkodobá konzervace....32 2.8.2 Dlouhodobá konzervace...33 2.9 Fyzikální vlastnosti ejakulátu.....34 2.9.1 Elektrická vodivost ejakulátu.... 34 2.9.2 Dynamická viskozita.......37

3. CÍL PRÁCE... 39 4. MATERIÁL A METODIKA.....40 4.1. Materiál.....40 4.2. Metodika...53 5. VÝSLEDKY A DISKUSE....61 5.1. Výsledky...61 5.2. Diskuse.....80 6. ZÁVĚR......83 7. SEZNAM TABULEK, GRAFŮ A OBRÁZKŮ V TEXTU......86 8. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY......88

1 ÚVOD Chov koní, zejména sportovně využitelných plemen, je v České republice v současné době na vzestupu. Zvyšuje se nejen počet chovaných jedinců, ale také jejich plemenná hodnota, a to zejména možností importu kvalitních prochovaných plemenných hřebců ze zahraničí. Rozvojem nových biotechnických metod je dostupnost hřebců světových parametrů mnohem snazší. K tomuto trendu nejvíce přispělo zavedení inseminace do reprodukčního procesu koní. Díky inseminaci došlo k rozvoji dalších biotechnologických metod jako například krátkodobá konzervace, kryokonzervace spermatu hřebců, sexování spermií apod. U klisen je pomocí ultrasonografického vyšetření detekován říjový cyklus a diagnostikována ranná březost. Pokročilý výzkum umožnil manipulaci s embryi například jejich kultivaci, zamrazení nebo embryotransfer. Jsou vyvinuty metody pro klonování a tvorbu transgeních zvířat. Rozvoje také dosáhly statistické metody používané pro hodnocení plemenné hodnoty. Všechny uvedené metody přispěly nejen ke zkvalitnění chovu koní, ale v mnoha směrech zjednodušily chovatelům jejich práci. Reprodukční výkonnost plemenných hřebců ovlivňuje mnoho vnějších a vnitřních faktorů jako například plemenná příslušnost, věk, zdravotní stav, výživa, technologie chovu, úroveň ošetřování. Je žádoucí uvedené faktory pozorně sledovat a předcházet tak případným nežádoucím negativním změnám v reprodukčních schopnostech jednotlivých plemeníků. Pro odběry spermatu a výrobu inseminačních dávek je potřebné vybrat plemeníky, kteří produkují dostatečné množství ejakulátu dobré kvality. Úspěšnost inseminace se zvyšuje jsou-li sledovány kvalitativní a kvantitativní ukazatele ejakulátu i v průběhu připouštěcí sezóny. Jde o preventivní diagnostiku zdravotního stavu plemenného hřebce a případné odhalení poruch plodnosti. Pro funkční vyšetření ejakulátu existuje mnoho metod. Některé metody jsou více subjektivní, jiné vyžadují speciální laboratorní vybavení. Předkládaná disertační práce je zaměřena na využití fyzikálních vlastností ejakulátu jako možného doplňujícího vyšetření kvality spermatu hřebců. 9

2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Pohlavní soustava hřebce K zajištění rozmnožovací funkce se v procesu fylogenetického vývoje živočichů vyvinula řada specializovaných orgánů, které slouží k tvorbě pohlavních buněk a umožňují jejich spojení. I přes pohlavní dimorfismus mají samčí i samičí pohlavní orgány stejný vývodový původ a v zásadě i shodný stavební princip. Obojí se skládají z pohlavních žláz, vývodných cest a zevních částí. Další důležitou funkcí pohlavního ústrojí je syntéza a vyměšování pohlavních hormonů. Ty svým působením podmiňují nejen správný vývoj a normální funkci samotných pohlavních orgánů, ale i rozvinutí všech sekundárních pohlavních znaků zvířete, jeho růst, temperament, úroveň metabolických pochodů a v neposlední řadě i časové sladění pohlavních funkcí samců a samic (Marvan et al., 1998). Pohlavní orgány hřebce jsou tvořeny pohlavními žlázami (varlata), vývodnými cestami (nadvarlata, chámovody), přídatnými pohlavními žlázami (měchýřkovité žlázy, bulbouretrální žlázy a prostata) a kopulačním orgánem, pyjem (Jelínek, Koudela et al., 2003). 2.1.1 Varle (testis) Varlata jsou párové pohlavní žlázy tuhoelastické konzistence (Marvan et al., 1998). Sekreční funkci varlat představuje produkce pohlavních buněk spermií inkreční funkci tvorba specifických pohlavních hormonů androgenů (Věžník et al., 2004). Varle hřebce má vejčitý, ze stran mírně zploštělý tvar a jeho délka je 10 12 cm a hmotnost je 400 600 g. Velikostí varlat 3-letých teplokrevných hřebců se ve své práci věnuje (Parlevliet JM et al., 1991). Většina povrchu varlete je volná, pouze k jednomu okraji se podélně přikládá nadvarle. Varlata společně s nadvarlaty jsou uložena v kožním vaku šourku (Marvan et al., 1998). Vazivový obal varlete tvoří přepážky, oddělující lalůčky varlete. Těchto lalůčků je ve varleti asi 100 300. Parenchym lalůčků má jemně zrnitou strukturu a skládá se ze 2 4 stočených semenotvorných kanálků varlete, v nichž probíhají jednotlivé fáze spermatogeneze. Vedle zárodečného spermatogenního epitelu jsou ve stěně kanálků podpůrné (Sertoliho) buňky, ve kterých probíhá poslední fáze spermatogeneze 10

metamorfóza spermatid ve spermie. Ve vmezeřeném vazivu mezi stočenými semenotvornými kanálky jsou velké intersticiální (Leydigovy) buňky varlete s achromatickým jádrem a výrazným jadérkem. Jsou bohaté na granulární endoplazmatické retikulum, ve kterém je produkován samčí pohlavní hormon testosteron (Marvan et al., 1998; Jelínek, Koudela et al., 2003). 2.1.2 Nadvarle (epididymis) Nadvarle je důležitý úsek vývodných cest, v němž se spermie shromažďují a funkčně dozrávají. Je to orgán kyjovitého tvaru, na kterém rozlišujeme tři části: hlavu, tělo a ocas (Marvan et al., 1998). Spermie vytvářené ve varleti přecházejí do hlavy nadvarlete, kde se zahušťují a jsou zde fagocytovány poškozené a přestárlé spermie. Během průchodu spermií nadvarletem se mění jejich metabolická aktivita. V hlavě nadvarlete spermie vykazují intenzivní respiraci a sníženou glykolýzu, zatímco v ocasu nadvarlete je poměr obrácený. V těle nadvarlete se spermie setkávají se sekrety bohatými na tuky a další látky, které zvyšují odolnost jejich povrchových membrán. Spermie v nadvarleti zůstávají nepohyblivé a jejich celková metabolická aktivita je nízká. Nacházejí se zde v klidovém stavu, zvaném anabióza, který umožňuje prodloužení životnosti spermií. Doba průchodu celým nadvarletem trvá 8 11 dní (Jelínek, Koudela et al., 2003). Díky příznivým podmínkám si spermie ve vývodu nadvarlete zachovávají životnost a oplozovací schopnost po dobu 2 3 týdnů (Marvan et al., 1998). 2.1.3 Chámovod (ductus deferens) Chámovod je párová silnostěnná trubička spojující vývod nadvarlete s močovou trubicí (Marvan et al., 1998). Vystupuje z ocasu nadvarlete a dostává se tříselným kanálem po stěně dutiny břišní do dutiny pánevní až na dorzální plochu močového měchýře (Jelínek, Koudela et al., 2003). V úrovni hlavy nadvarlete se chámovod stává součástí semenného provazce, doprovázený cévami a nervy (Marvan et al., 1998). U hřebce se konečná část chámovodu rozšiřuje v ampuli, jejíž žláznatá část vylučuje sekret stimulující metabolickou aktivitu spermií. Spermie se z ampulí chámovodů dostávají společně se sekretem měchýřkovitých žláz ejakulačním kanálkem do močové trubice na semenném hrbolku (Jelínek, Koudela et al., 2003). 11

2.1.4 Přídatné pohlavní žlázy (glandulae genitales accessoriae) Přídatné pohlavní žlázy se nacházejí na pánevní části močové trubice. Vyměšují sekrety, které se při ejakulaci mísí se spermiemi a vytváří podstatnou část ejakulátu (Jelínek, Koudela et al., 2003). Tyto sekrety, vylučované do močové trubice, tvoří přirozené ředidlo spermiím. Obsahují látky, které slouží k jejich výživě a upravují spermiím prostředí během jejich průchodu močovou trubicí a pohlavním ústrojím samice. Patří k nim měchýřkovitá, předstojná žláza a bulbouretrální žláza (Marvan et al., 1998). Měchýřkovitá žláza je párový orgán protáhlého tvaru. U hřebce se také označují jako semenné váčky. Leží na dorzální ploše močového měchýře, laterálně od ampulí chámovodu, s nimiž společně vyúsťují ejakulačním kanálkem na semenném hrbolku do močové trubice. U hřebce jsou žlázy duté, váčkovitého vzhledu. Jejich sekret je vylučován ke konci ejakulace, tvoří 10 40 % objemu ejakulátu, má mírně kyselou reakci (ph kolem 6,08), obsahuje fruktózu, kyselinu askorbovou, citrónovou, flaviny a jiné látky. Cukry jsou hlavním energetickým zdrojem pro spermie (Jelínek, Koudela et al., 2003). Předstojná žláza (prostata) je tubuloalveolární žláza, která leží na krčku močového měchýře a začátku močové trubice, do níž vyúsťuje četnými vývody (Jelínek, Koudela et al., 2003). U hřebce je roztroušená a tělo prostaty je rozděleno na dva laloky, spojené můstkem (Marvan et al., 1998). Sekret prostaty je zásadité reakce a je vylučován při ejakulaci těsně před spermiemi a současně s nimi. Obsahuje volné aminokyseliny, neobsahuje však cukry a má relativně vysoký obsah anorganických solí, které udržují stejný osmotický tlak v ejakulátu (Jelínek, Koudela et al., 2003). Bulbouretrální žláza je párová a leží na dorzolaterální ploše rozšířeného bulbu močové trubice. U hřebce má téměř kulovitý tvar a hladký povrch. Parenchym žlázy je rozdělen vazivem na drobné lalůčky. Výměšek žlázy se shromažďuje v rozšířených prostorech nitrolalůčkových a mezilalůčkových vývodů a je nakonec odváděn do močové trubice několika vývody (Marvan et al., 1998). Sekret je převážně vylučován na konci ejakulace. Vytváří tzv. vaginální zátku v děložním krčku, která má zabránit zpětnému výtoku semene (Jelínek, Koudela et al., 2003). 12

2.1.5 Pyj (penis) Pyj je pářící orgán, který při kopulaci slouží k přenosu semene do pohlavních cest samice a k tomuto účelu je také tvarově přizpůsoben (Věžník et al., 2004). Pyj má válcovitý tvar a skládá se z fixované části kořene pyje a volné části těla pyje. Kraniální konec pyje, zakončen žaludem je v ochablém stavu ukryt v kožním vaku předkožce. Mohutný žalud u hřebce má tvar kloboučku s vyvýšeným valem na obvodu s centrální jamkou. Pyj je dlouhý 50 60 cm s průměrem 5 6 cm. Podstatu pyje tvoří párové topořivé těleso pyje, nepárové houbovité těleso pyje, močová trubice, pomocné svaly a nervy (Marvan et al., 1998). 2.2 Řízení pohlavní činnosti hřebců Reprodukční funkce samců jsou řízeny souhrou nervového a endokrinního systému. Regulační mechanismy jsou součástí geneticky zafixovaného vnitřního řídícího systému. Nadřazeným orgánem pro řízení pohlavní činnosti je centrální nervová soustava. Centra vlastního řízení jsou umístěna v mezimozku a v zadních partiích míchy. Mechanismus neurohumorálního řízení začíná v oblasti mozkové kůry. Tam jsou situovány podněty zrakové, čichové, hmatové a sluchové, které přicházejí z vnějšího prostředí, ale jsou tam situovány i podněty vnitřní. Po jejich registraci a integraci jsou přesunuty do hypotalamu a hypofýzy (Věžník et al., 2004). Dalšími složkami reprodukčního funkčního okruhu jsou gonády a vývodné pohlavní cesty. Koordinace mezi jednotlivými složkami řízení pohlavní aktivity se uskutečňuje neurohumorálně v obou směrech (Jelínek, Koudela et al., 2003). Hypotalamus s četnými nervovými buňkami představuje vlastní centrum pro řízení pohlavní činnosti. V hypotalamu jsou dvě místa, která mají klíčový význam pro řízení pohlavní činnosti a jsou označována jako přední a zadní sexuální centra. Zadní obsahuje četná jádra, ve kterých se na základě impulzů přicházejících z předního sexuálního centra vytvářejí neurosekrety, zvané též liberiny gonadotropin releasing hormon (GnRH). Pod vlivem hypotalamických GnRH se ve specializovaných buňkách adenohypofýzy vytvářejí dva gonadotropní hormony folikuly stimulující hormon (FSH) a luteinizační hormon (LH). FSH u samců stimuluje růst semenotvorných kanálků, tvorbu spermií, činnost Sertoliho buněk a produkci hormonu inhibinu. LH (u samců také označovaný jako intersticiální buňky stimulující hormon ICSH) působí 13

na intersticiální buňky (Leydigovy) a stimuluje tvorbu pohlavního hormonu testosteronu. Testosteron spolu s dalšími androgeny řídí vznik pohlaví a sexuální diferenciaci, stimuluje tvorbu sekundárních pohlavních znaků, růst pohlavního údu, růst a sekreční funkci přídatných pohlavních žláz, formování pohlavního pudu a samčího pohlavního chování. Hormon inhibin, vytvářený v podpůrných buňkách semenotvorných kanálků varlete zpětně působí na hypofýzu a brzdí tvorbu FSH (Jelínek, Koudela et al., 2003). Účinek pohlavních hormonů na výše nadřazená centra (adenohypofýzu a hypotalamus) označujeme jako zpětnou vazbu a jejím principem je, že ovlivňuje pozitivně nebo negativně jejich činnost, stimuluje nebo brzdí produkci nadřazených hormonů. Mechanizmus zpětných vazeb je podstatou autoregulace pohlavních funkcí (Jelínek, Koudela et al., 2003). 2.3 Ejakulát hřebce Ejakulát (sperma, semeno neboli chám) je bělavá viskózní tekutina. Skládá z buněčné části - spermií a tekuté části - semenné plazmy (Louda et al., 2001). Z formovaných elementů obsahuje ejakulát kromě spermií ještě odloupané epitelie, leukocyty aj. Největší podíl ejakulátu tvoří voda (90 98 % celkové váhy), z anorganických látek obsahuje sodík, draslík, chlór, fosfor, vápník, síru aj. Z organických látek bílkoviny, tuky, cukry a některé fermenty. Chemické složení ejakulátu, jeho množství, koncentrace spermií a jejich životnost jsou závislé na mnoha činitelích, jako je stav výživy, stáří, ustájení, pohyb, pohlavní využití samce aj. (Komárek et al., 1964). Semeno má druhově specifickou barvu, konzistenci, pach a jeho množství vyloučené při ejakulaci značně druhově kolísá. U lichokopytníků je objem ejakulátu relativně velký a koncentrace spermií nízká. Tyto základní hodnoty ejakulátu mají však poměrně velkou individuální variabilitu (Marvan et al., 1998). Kvalita semene musí odpovídat požadavkům stanovených normou pro každý druh plemeníků hospodářských zvířat (Louda et al., 2001). 2.3.1 Spermie Spermie svou morfologickou stavbou představují buňky připravené k samostatnému životu a cílené funkci (Věžník et al., 2004). Jsou nejdůležitější složkou 14

ejakulátu, protože jsou nositeli zárodečné hmoty a kyseliny deoxyribonukleové jako genetické informace (Gamčík, Kozumplík et al., 1992). Velikost a tvar spermií jsou druhově rozmanité a jejich společným hlavním znakem je pohyblivost a schopnost oplození (Jelínek, Koudela et al., 2003). Srovnání velikosti a tvaru spermií různých druhů savců je zřetelné z Obr. 1. Se zřetelem na přítomnost sexchromozomu jsou mezi spermiemi nepatrné hmotnostní rozdíly. Spermie s heterochromozomem Y, tzv. androspermie, mají nižší specifickou hmotnost než spermie s heterochromozomem X, tzv. gynospermie (Jelínek, Koudela et al., 2003). U jednotlivých druhů hospodářských zvířat je velikost spermií různá. Hřebčí spermie jsou 57,6 až 59,7 µm dlouhé (Věžník et al., 2004). Spermie se tvoří po dosažení pohlavní dospělosti v semenotvorných kanálcích varlete a celý proces jejich tvorby je označován jako spermatogeneze (Marvan et al., 1998). Gamčík, Kozumplík et al. (1992) doplňují, že spermie má při oplodnění splnit tři základní úlohy: musí aktivně vyhledat vajíčko, proniknout do něho a předat genetickou informaci od otce. Jakmile je porušena jedna z těchto funkcí, nedojde k oplodnění vajíčka. Obr. 1: Spermie různých druhů savců (Jelínek, Koudela et al., 2003) 15

Hlavička spermie má zploštělý oválný tvar a její pól kryje čepičkovitý obal akrozom (Marvan et al., 1998). Hlavička spermie hřebce je dlouhá 6,3 µm a široká 3,2 µm (Věžník et al., 2004). Akrozom je složen z mukopolysacharidů a obsahuje četné enzymy uplatňující se při pronikání spermie do vajíčka a jeho oplození. Hlavičku tvoří především jádro s kondenzovaným chromatinem a obsahujícím deoxyribonukleovou kyselinu nesoucí genetické informace pro vlastnosti nového jedince (Jelínek, Koudela et al., 2003). Podle Věžníka et al. (2000) se kategorie zbobtnání akrozomu projevila jako významný ukazatel rezistence membránového systému spermií při krátkodobých i dlouhodobých testech. Věžník et al. (2004) k tomu dodává, že vnější a vnitřní list akrozomové čepičky tvoří při své bázi intimní spojení obou listů se sníženým obsahem akrozomální hmoty, takže se jeví při barvení jako světlejší a označuje se ekvatoriální segment. Dlouhá osa akrozomu k dlouhé ose hlavičky je rozdílná u jednotlivých druhů zvířat. U hřebce pokrývá akrozom 60 % dlouhé osy hlavičky spermie. Dále uvádí, že hlavička spermie je ve své posteriorní části tvořena kalíškem jádra. Tento útvar je představován tmelovým materiálem spojujícím jadernou membránu s membránou cytoplazmatickou a vytvářející tak pevnější strukturu, více odolnou než je struktura akrozomu. Membrány anteriorní části hlavičky se podílí na procesu kapacitace a aktivace akrozomálních zymogenů v enzymy především s proteolytickým účinkem funkčně podobným trypsinu. Membrána v postakrozomální oblasti, tedy především v horní části kalíšku jádra se zúčastní fůze spermie s vajíčkem a hraje i úlohu při jeho detekci. Celou hlavičku kryje cytoplazmatická membrána a její integrita je podmínkou rezistence buněk. Na bazální části hlavičky je konkávní vchlípení tzv. implantační rýha, do níž je vklíněna hlavice bičíku. Boční ohraničení implantační rýhy je tvořeno bazálními granuly, která představují fibrilárně uspořádaný chromatin (Věžník et al., 2004). Bičík spermie představuje pohybové ústrojí spermie. Bičík je spojen s hlavičkou krčkem (centriolovou částí). Bičík spermie je tvořen spojovacím oddílem, hlavním oddílem, a koncovým (terminálním) oddílem (Jelínek, Koudela et al., 2003). Spojovací část bičíku je u hřebčí spermie dlouhá 8,6 µm a hlavní část měří 43,7 µm. Hlavice bičíku je vytvořena z proximálního centriolu, který dá vznik implantační ploténce a z přední části distálního centriolu, který dá základ tvorby bičíku. Vzniklá segmentovaná chorda svým tvarem představuje rozšířenou hlavici bičíku. Svým zúžením, které vystupuje z implantační jamky, se pevně přikládá k hladkým chordám. Je jich 9 16

obdobně jako filament centriolového válce a tvoří chordový obal komplexu osových vláken. Tyto útvary vznikají z přední části distálního centriolu a ten je proto označován jako flagelotvorný nebo axonemogenní. Axonema nebo soubor osových vláken je tvořen dvěma ústředními mikrotubuly. Kolem nich je uspořádáno 9 párů vláken označovaných za dublety, složených z elementu A a elementu B, přičemž A je vlákno plné a B je tvořeno mikrotubulem. Z každého elementu A vystupují dvě styčná ramena k elementu B sousední dublety. Raménka tvoří peptidy (dynein) s ATPázovou aktivitou a takto uvolněná energie je transformovaná do bílkovin (tubuliny) kontraktilních vláken. V průběhu tohoto procesu dochází k prodlužování a zkracování molekulárního uspořádání těchto bílkovin, čímž dochází k přenosům prostorových sil a pohybu bičíku (Věžník et al., 2004). Vadám na bičíku, které připomínají Dag defekt, se ve své práci věnoval (Hellander JC et al., 1991). Spojovací (mitochondriální) oddíl bičíku navazuje na centriolový oddíl. Je charakterizován přítomností značného podílu mitochondrií (Kudláč in Jelínek, Koudela et al., 2003). Věžník et al. (2004) k tomu doplňuje, že jedna mitochondrie tvoří asi tři čtvrtiny závitu. Mitochondrie tvoří závitnici o 70 80 závitech s pravotočivým směrem vinutí. Kliment et al. (1989) naopak uvádí, že na mitochondriálním oddílu je osové vlákno obalené levotočivě spirálovitě probíhajícím vláknem, tzv. mitochondriální membránou, která tvoří respirační aparát spermie. K mitochondriím dodává, že jsou široké asi 0,12 μm a dlouhé 1,3 μm. Mitochondriální membrány, které tvoří součást membránového systému spermie, jsou stejně jako celý bičík krytý povrchovou membránou. Membrána bičíku má však odlišnou antigenní strukturu od membrány hlavičky spermie. Zatímco hlavička spermie má plazmatickou membránu původní spermatidy, bičík po penetraci a jeho morfologickém dotváření má povrchovou membránu nově přetvořenou. Zakončení spojovací části bičíku je přesně vymezeno prstencovým trojbokým útvarem o vyšší elektronoptické denzitě, který se připisuje druhé části rozděleného distálního centriolu (Věžník et al., 2004). Hlavní oddíl bičíku je nejdelší částí celé spermie. V porovnání s mitochondriálním oddílem je hlavní oddíl tenčí. Jeho podkladem je komplex osových vláken (Gamčík, Kozumplík et al., 1992). Hlavní část nemá výrazné rozdíly ve stavbě, ale je kryta zajímavou fibrózní pochvou. Tento útvar je složen ze dvou longitudálních elementů probíhajících paralelně s osovými vlákny. Z těchto elementů vybíhá oběma směry řada ramen obepínajících osová vlákna a hladké chory. Fibrózní pochva je nejen útvarem strukturálně podporujícím skladbu bičíku, ale svou tvarovou pamětí napomáhá pružnosti bičíku při 17

jeho kmitavém a rotačním pohybu (Věžník et al., 2004). Koncový oddíl bičíku je tvořen pouze osovým vláknem bez chord a fibrózní pochvy (Jelínek, Koudela et al., 2003). Gamčík, Kozumplík et al. (1992) doplňují, že v druhé polovině koncového oddílu jedna z dvojice mikrotubulů zaniká. Přítomné jsou pouze jednoduché mikrotubuly. Jejich počet a uspořádání nejsou konstantní. Celá spermie je kryta cytoplazmatickou membránou, která představuje základní ochranu spermie. Je velmi citlivá na změnu osmotického tlaku a velmi lehce dojde k jejímu poškození (Marvan et al., 1998). 2.3.2 Semenná plazma Semenná plazma je fluidní část spermatu po odstranění spermií centrifugací nebo filtrací. Separací semenné plazmy centrifugací se ve své práci věnovali (Jasko D.J. et al., 1991). Dospěli k závěru, že po odstranění semenné plazmy, naředění spermatu odtučněným mlékem a glukózou, následným pomalým ochlazením na 5º C si spermie zachovaly podobné pohybové charakteristiky po celých 24 hodin. Plazma obsahuje množství látek, které nejsou obvykle nacházeny v organismu zvířete. A také obsahuje látky, které jsou v mnohem větších koncentracích než kdekoliv jinde v těle. Mnoho z těchto látek je více spojováno s rostlinným organismem než s živočišným (Setchell in Cupps, 1991). Je to tekutina druhově specifického množství a barvy, rozdílného ph a konzistence. Představuje přirozené prostředí pro spermie, umožňuje jejich výživu a transport v pohlavních orgánech samice. Má relativně stálý osmotický tlak a vyznačuje se velkými pufračními schopnostmi (Jelínek, Koudela et al., 2003). Semenná plazma obsahuje velké množství molekul produkovaných především přídatnými pohlavními žlázami (Poiani, 2006). V malém množství se na jejím složení podílí i tekutina, která má svůj původ ve varleti, nadvarleti, chámovodu a v močové trubici. Semenná plazma představuje svým objemem hlavní podíl ejakulátu, u hřebce tvoří 95 98 %. Množství semenné plazmy vyloučené při jedné ejakulaci druhově značně kolísá (Marvan et al., 1998). 18

2.4 Spermatogeneze Proces spermatogeneze se uskutečňuje v pravidelných cyklech a probíhá kontinuálně v průběhu celého reprodukčního období života. V počáteční etapě nemá spermatogeneze ještě pravidelný cyklický charakter a výsledkem je vyšší obsah nezralých forem spermií v ejakulátu. S dosažením plné pohlavní dospělosti a stabilizací neuroendokrinní regulace pohlavních funkcí probíhá spermatogeneze u většiny hospodářských zvířat v pravidelných cyklech v průběhu celého roku a v podstatě se nedá ani urychlit ani zpomalit. Pravidelné cykly následují za sebou v přesných časových intervalech, přičemž každý cyklus začínáni o čtvrtinu délky cyklu později než předcházející. Délka jednoho spermatogenního cyklu je druhově rozdílná a u hřebce se pohybuje kolem 54 dní. Proces spermatogeneze s přihlédnutím na převažující charakter změn se dělí na období spermatocytogeneze a období spermiogeneze, respektive spermatohistogeneze (Jelínek, Koudela et al., 2003). Přesnější rozdělení průběhu spermatogeneze vyplývá ze schématu, znázorněného na obr. 2. STÁDIUM MITÓZY (Období rozmnožování) SPERMATOCYTOGENEZE OBDOBÍ RŮSTU STÁDIUM MEIÓZY (Období zrání) SPERMATOGENEZE GOLGIHO STÁDIUM SPERMIOGENEZE (SPERMATOHISTOGENEZE) Období metamorfózy STÁDIUM AKROZOMOVÉ ČEPIČKY STÁDIUM KAUDÁLNÍ MANŽETY STÁDIUM ZRÁNÍ Obr. 2: Schéma procesu spermatogeneze (Jelínek, Koudela et al., 2003) 19

Stádium mitózy je charakterizované opakovaným mitotickým dělením původních kmenových buněk A-spermatogonií (primordiálních gonocytů). Každá mateřská buňka A-spermatogonie se rozdělí na dvě nestejně velké dceřinné buňky. Jednu větší a podobnou mateřské buňce, která zůstává po delší dobu v latentním stádiu, v tzv. interfázi, a druhou, menší intermediární buňku, která se opětovně několikrát dělí a výsledkem jsou buňky typu B-spermatogonie. V závěru rozmnožovací fáze se B-spermatogonie rozdělí na spermatocyty I. řádu, tzv. primární spermatocyty (Jelínek, Koudela et al., 2003). Do období růstu vstupují spermatocyty I. řádu a v tomto stádiu pouze zvětšují svůj objem v důsledku zmnožení zásobních látek v cytoplazmě (Marvan et al., 1998). Stádium meiózy je charakterizováno dvěma po sobě následujícími děleními, jejichž výsledkem je redukce počtu chromozomů na polovinu diploidní se mění na haploidní. Vstupují do něj spermatocyty I. řádu a v prvním meiotickém dělení vznikají dva spermatocyty II. řádu. Druhým meiotickým dělením vznikají čtyři spermatidy, které jsou charakterizovány přítomností vždy jen jednoho sexchromozomu X chromozomu nebo Y chromozomu (Jelínek, Koudela et al., 2003). V průběhu období metamorfózy se okrouhlá a nepohyblivá spermatida mění ve štíhlou a pohyblivou spermii. Dochází ke sledu následujících změn. Jádro spermatidy se prodlouží, oploští, posune k apikálnímu pólu buňky a tímto začíná formování hlavičky spermie. Na předním pólu jádra se složitým procesem vytváří z Golgiho aparátu akrozom. Oba buněčné centrioly se přesouvají k zadnímu pólu hlavičky a dávají vznik krčku a osovému vláknu bičíku spermie. Metamorfované spermie se uvolňují z výběžků podpůrných buněk a dostávají se do lumen semenotvorných kanálků a do vývodných cest. (Jelínek, Koudela et al., 2003). Spermatogenní cykly neprobíhají v celém semenotvorném kanálku varlete synchronně, ale nastupují postupně a vlnovitě se šíří po celé délce semenotvorného kanálku. I přes svůj cyklický charakter je spermatogeneze plynulým procesem, který zajišťuje pravidelný přísun spermií do vývodných cest varlete plemeníka (Marvan et al., 1998). 2.5 Výběr hřebců pro inseminaci, plodnost a pohlavní aktivita Pojem dobré plodnosti u hřebce zahrnuje dobrou kvalitu jeho ejakulátu a dobré libido sexualis chuť ke skoku. Pohlavní aktivita hřebce je převážně ovlivňována 20

ročním obdobím, přesto schopnost k páření v průběhu roku přetrvává. Produkce spermatu je závislá na ročním období, velikosti varlat, frekvenci odběru, plemenné příslušnosti a věku hřebce (Louda et al., 2001). Pickett et al. (1975) uvádí, že v podzimním a zimním období je celková produkce spermií v ejakulátu poloviční než na jaře a v létě. Podle Hughese et al. (1975) probíhá období pohlavní aktivity u koní chovaných na severní polokouli od dubna do září, i když v dnešních chovech je možné připouštět a inseminovat takřka po celý rok (Hughes et al., 1975 in Gamboa et al., 2010). U hřebců působících v inseminaci je důležité odhadnout jejich celkovou denní produkci spermií proto, aby se mohl stanovit optimální počet klisen, které lze daným hřebcem zapustit. Pro odhad denní produkce spermií lze využít i měření velikosti varlat (Love et al., 1991 in Louda et al., 2001). Berndtson et al. (1974) uvádí, že sexuální chování hřebců je ovlivňováno hladinou testosteronu v krevní plazmě a zjistil, že na jaře je jeho hladina vyšší a postupně klesá asi na polovinu v říjnu (Berndtson et al. in Louda et al., 2001). Období puberty je u hřebců definováno věkem, kdy ejakulát obsahuje alespoň 50 milionů spermií s aktivitou vyšší než 10 %. Těchto hodnot se u hřebců dosahuje ve věku okolo 83 týdnů. V období puberty u hřebců průkazně stoupá hladina testosteronu v krevní plazmě (Louda et al., 2001). Stevart a Roser (1995) zjistili vliv věku a plodnosti hřebců na koncentraci inhibinu ve varlatech. Zjistili nižší hladinu inhibinu u hřebců se sníženou plodností a pohlavní aktivitou než u hřebců s dobrou plodností (Louda et al., 2001). Do plemenitby se hřebci chladnokrevných plemen zařazují ve věku 3 let, teplokrevných plemen pak ve věku nad 4 roky, vždy po absolvování výkonnostních zkoušek nebo po zhodnocení výsledků na dostihové dráze (Louda et al., 2001). 2.6 Odběr spermatu od hřebců Sperma se odebírá od hřebců, kteří vyhovují předepsaným zdravotním podmínkám. Při odběru se dodržují předepsané bezpečnostní předpisy. Při odběru spermatu a jeho zpracování se dbá na vytvoření podmínek, aby v inseminační dávce byl co nejnižší počet nepatogenních zárodků. Penis hřebce musí být pravidelně ošetřován a dezinfikován (Louda et al., 2001). K odběru ejakulátu se používají vagíny různého typu a původu. K odběru hřebčího ejakulátu se používají vagíny buď otevřeného typu, kde sperma se odebírá do 21

samostatné odběrové nádobky. U uzavřeného typu je ejakulát získáván přímo do nádobky, která je součástí umělé vagíny. Otevřené typy vagín umožňují od sebe oddělit jednotlivé frakce ejakulátu a získat tak semeno s vyšší koncentrací spermií (Love, 1992 in Kareskoski, 2011). Při použití toho typu vagíny je tedy možné nechat odtéct první, prespermatickou frakci semene, která může obsahovat i nežádoucími mikroorganismy. A taky závěrečnou, postspermatickou frakci obsahující především hustý gel s velmi malým počtem spermií. Takto získaný ejakulát je lépe skladovatelný než ejakulát celkový, který obsahuje všechny tři frakce (Gordon, 2004). K odběru ejakulátu hřebce do umělé vagíny je třeba více pokusů 2 až 3. Ejakulace následuje po několika frikčních pohybech a trvá 5 35 sekund, v průměru 16 sekund (Louda et al., 2001). Technikou odběru ejakulátu manuální stimulací se ve své práci zabýval (McDonnell SM et al., 1991). Metodu lze použít u hřebců, kteří vzhledem ke svému věku nebo zranění nemohou být odebíráni do umělé vagíny technikou skoku hřebce na fantom. Hřebci zařazeni do inseminace se odebírají jednou za den. Nácvik probíhá po dobu jednoho týdne, kdy se objem ejakulátu postupně zvyšuje. Při zhoršující se kvalitě získaného ejakulátu je třeba prodloužit sexuální pauzu (Louda et al., 2001). Frekvencí odběru ejakulátu od hřebců se ve své studii zabývali (Sieme H. et al., 2003). Dospěli k závěru, že klisny inseminovány spermatem hřebců, od nichž byl ejakulát odebírán jedenkrát denně, zabřezávaly výrazně lépe, než klisny inseminovány spermatem hřebců s denní frekvencí odběrů dvakrát za den. Ovšem hřebci s vyšším počtem odběrů dosáhli lepších výsledků než hřebci, u kterých byl interval odběrů jedenkrát za dva dny. Kůň je sezónní zvíře reagující na prodlužující se den. V průběhu sezóny může dojít u hřebců k výkyvu kvality spermatu v některých sledovaných parametrech ejakulátu. Jsou prokázány sezónní rozdíly v nižší kvalitě ejakulátu v zimním období a znatelné zlepšení kvality s rostoucí fotoperiodou. Nejlepších parametrů kvality ejakulátu bylo dosaženo v období od března do května. Proto je vhodné soustředit odběrovou sezónu zejména na toto roční období (Gamboa S et al., 2006). 2.7 Hodnocení ejakulátu Ejakulát určený pro účely inseminace se získává pouze od licentovaného plemeníka. Kvalita ejakulátu k inseminaci musí odpovídat požadavkům stanovených normou pro každý druh plemeníků hospodářských zvířat. Hodnocení a zpracování odebraného semene se provádí ve specializované laboratoři. Základní vyšetření 22

ejakulátu musí být zahájeno do 10 minut po odběru. Vzhledem k tomu, že stanovení oplozovací schopnosti ejakulátu je velmi obtížné, používá se řada zkoušek. Těmi se provede komplexní vyšetření a posoudí se jeho vhodnost k dalšímu zpracování a následné inseminaci. U získaných ejakulátů plemeníka se sledují základní ukazatele jako: pach, barva a konzistence, objem, motilita, koncentrace, morfologie spermií a ph. Velký ekonomický význam má zařazení pouze kvalitních jedinců do plemenitby (Louda et al., 2001). Základní vyšetřovací metody spermatu tvoří metody nezbytně nutné pro vyhodnocení kvality ejakulátu pro jeho zmrazování a použití k inseminaci. Rozdělují se tedy na metody vyšetření čerstvého spermatu po jeho odběru a na metody vyšetření zmrazeného spermatu určeného pro použití k inseminaci (Kliment et al., 1989). V rámci ochrany zvířat před nákazami a hromadnými infekčními i neinfekčními chorobami hraje vyšetření významnou roli. Stále se vyskytuje velký počet inseminačních dávek, jejichž kvalitativní ukazatele neodpovídají provozním podmínkám a hygienickým kritériím (Věžník et al., 2000). 2.7.1 Barva, konzistence a pach ejakulátu Barva, konzistence a pach se posuzují smyslově, bezprostředně po odběru ejakulátu. Konzistence se posuzuje u každého ejakulátu ve sběrači v dopadajícím nebo procházejícím světle. Husté sperma dobré jakosti je neprůhledná vazká tekutina, zpravidla smetanového mírně zrnitého vzhledu. Zrnité shluky spermatu se pomalu pohybují. Řídké sperma špatné jakosti je vodnaté, průsvitné a bez zrnitosti. Konzistence hřebčího ejakulátu je spíše vodnatá. Barva se posuzuje proti světlu. Dobré sperma je u hřebce bílé až šedavě bílé barvy, záleží na koncentraci spermií v ejakulátu. Špatné sperma, nehodící se k inseminaci, bývá zabarveno silně žlutozeleně nebo zeleně přimísením hnisu, moče nebo nežádoucími mikroorganismy. Špatné je i sperma s příměsí krve. Pach se posuzuje čichem ve sběrači. Dobré sperma má slabý specifický pach připomínající pach kravského mléka. Nazelenalé sperma páchne močí. Hnilobný zápach svědčí o přimísení hnisu. Dobré sperma má být prosté cizích příměsí a částic (Louda et al., 2001). 23

2.7.2 Objem ejakulátu Důležitým kvantitativním ukazatelem ejakulátu je objem. Objem ejakulátu je variabilní a značně kolísá. Zjišťuje se měřením v kalibrovaném válci nebo vážením na laboratorní automatické váze. Stanovení objemu ejakulátu je primárně důležité, neboť tato informace je potřebná ke kalkulaci vhodného poměru ředění semene pro výrobu inseminačních dávek (Louda et al., 2001). Objem hřebčího ejakulátu kolísá od 50 do 200 cm 3. Objem je závislý na hmotnosti hřebce a plemenné příslušnosti. Chladnokrevná plemena produkují 150 cm 3, teplokrevná 60 cm 3, lehká arabská 45 cm 3. Požadavek na minimální objem ejakulátu hřebce je 10 cm 3 (Louda et al., 2001). Průměrný objem hřebčího ejakulátu se pohybuje okolo 70 cm 3 (Jelínek, Koudela et al., 2003). Objem inseminační dávky pro krátkodobou konzervaci činí většinou 10 cm 3 naředěného hřebčího spermatu (Louda et al., 2001). 2.7.3 Motilita spermií Důležitým spermatologickým ukazatelem je také motilita spermií, která je dána progresivním pohybem spermie vpřed za hlavičkou. Hodnotí se charakter pohybu, určuje se směr a rozsah kmitů hlavičky spermie. Přímý progresivní pohyb je znakem funkční plnohodnosti spermie (Mortimer, 1997). Motilita se určuje podle procenta pohyblivých spermií v nativním preparátu. Nejvyšší hodnocení, tedy 100 %, získává ejakulát, ve kterém mají všechny spermie přímočarý progresivní pohyb vpřed za hlavičkou. Z funkčního hlediska je tento pohyb spermií nezbytným předpokladem pro jejich průnik do oocytu (Věžník et al., 2004). K inseminaci je možno využívat ejakulát, který obsahuje spermie s pohyblivostí 70 % a více. Vyšetření motility spermií se provádí ihned po odběru a po skladování (Louda et al., 2001). Kvalita spermií je ovlivněna více faktory a je obtížné definovat, které faktory nejlépe pojednají o kvalitě spermatu. V současné době se většina chovatelů a většina inseminačních stanic spoléhá na subjektivní hodnocení pohyblivosti spermií jako na jediný determinant kvality spermií v inseminační dávce, ale podle Malmgrena (1997) je právě korelace motility spermií s plodností většinou velmi nízká. Při všech formách pohybu biologických organismů spočívá základ v převodu chemické energie v mechanickou. Z toho je zřejmé, že ve svém principu jsou shodné, 24

i když ve svém působení mohou být funkčně odlišné. Efektorem tohoto děje jsou kontraktilní proteiny, které jsou schopny buďto samy nebo spolu s aktivními komponentami využívat ATPázovou aktivitu k získání energie. Dýchací řetězce zabezpečující výměnu látkovou k tvorbě ATP a jsou lokalizovány ve vnitřní mitochondriální membráně. V matrix mitochondrií jsou lokalizovány enzymatické systémy cyklu kyseliny citrónové. Úroveň oxido-redukčních aktivit mitochondrií je ukazatelem potenciální energetické zásoby spermií (Věžník et al., 2004). Kliment et al. (1989) upřesňuje, že pro pohyb spermií je tedy nezbytný ATP, ale rezervy v buňce vystačí sotva na 30 s pohybu. Proto tvorba ATP musí být nepřetržitá. Gamčík, Kozumplík et al. (1992) dodávají, že mechanismus přenosu energie není dosud přesně znám. Předpokládá se, že při hydrolýze ATP je uvolněná energie transformována do bílkovin kontraktilních vláken bičíku spermie. V průběhu tohoto procesu dochází k prodlužování a zkracování molekulárního uspořádání těchto bílkovin, čímž je vyvolán pohyb bičíku. Hlavička spermie se na metabolických procesech nepodílí. Podle Garnera (1991) je schopnost pohybu spermií jednou z jejich nejunikátnějších vlastností. Klasické hodnocení motility zahrnuje jak hodnocení procenta motilních spermií, tak i rychlost progresivního pohybu. Přesnost při hodnocení motility vyžaduje pečlivou kontrolu teploty spermatu během přípravy a hodnocení (Garner in Cupps, 1991). V ejakulátu je pohyb spermií nahodilý, neorientovaný. Spermie se velmi rychle přesměrují v případě, že vznikne proudění tekutiny. Rychlost proudění tekutiny ovlivňuje také rychlost pohybu spermií. Při svém pohybu rotují spermie kolem své osy s frekvencí 3 15 otáček za sekundu. U alterovaných spermií postupně mizí rotace a pohyb se stává plochý, přičemž se přímočarý pohyb mění v kruhový (Věžník et al., 2004). Louda et al. (2001) doplňuje, že s prodlužující se dobou po odběru dochází u ejakulátu k tzv. vitální degeneraci spermií, při které se rychlost přímočarého pohybu zpomaluje a tento se mění na pohyb kruhový. Postupně následuje pohyb přerušovaný a trhavý, který později ustává. Základním způsobem kvantitativního stanovení motility spermií je subjektivní stanovení počtu pohyblivých spermií pomocí mikroskopického vyšetření. Na podložní laboratorní sklíčko se odebere kapka spermatu, která se podle potřeby může naředit citrátem sodným zahřátým na teplotu asi 39 C, přikryje se tenkým krycím sklíčkem a posuzuje se pomocí mikroskopu při 200 až 300 násobném zvětšení. Hodnotí se minimálně tři zorná pole a odhadem se stanoví procentické zastoupení spermií 25

pohybujících se vpřed za hlavičkou. Mikroskop je opatřen fázovým kontrastem a mikroskopický stolek je vyhříván destičkou na teplotu 39 C ± 1 C (Louda et al., 2001). Podle Severy et al. (2008) je hodnocení motility spermií složité a je ovlivněno teplotou a schopnostmi hodnotitele, což vede k vysoké variabilitě ve výsledcích mezi jednotlivými laboratořemi a laboranty. Všechny tyto faktory je potřebné eliminovat zavedením objektivních a standardizovaných metod, a to jak pro praktické, tak i pro výzkumné účely. Lze tedy využít i objektivních metod, kdy se pro hodnocení motility spermií využívá počítačová technika (Věžník et al., 2004). Pohyblivost spermií lze také zjistit pomocí in vitro analýzy, kdy se měří schopnost spermií penetrovat roztokem inertního média a zjišťuje se absorbance pomocí spektrofotometru (Foster et al., 2011). Pro objektivní hodnocení motility spermií je možné použít zařízení SQA (Sperm Quality Analyzer), který zaznamenává změny v optické hustotě paprsků světla procházejících kapilárou se vzorkem ejakulátu. Tyto změny jsou registrovány fotometrickými čidly a převádějí tyto informace na číselné výstupy (Hoogewijs et al., 2011). Nejpřesnější metodou objektivního hodnocení je automatická počítačová analýza CASA (Computer- Aided Sperm Analysis) pro vyšetřování semene, kdy se k hodnocení motility spermií využívá kombinace mikroskopu, kamery a počítačového softwaru (Love, 2011). Aktivita spermií hřebčího ejakulátu kolísá od 60 do 80 %, v mimosezónním období je nižší. Při krátkodobé konzervaci by motilita spermií měla být alespoň 50 %, u spermatu určeného pro dlouhodobou konzervaci by motilita spermií měla být minimálně 70 % (Louda et al., 2001). Podle Věžníka (2004) je rychlost pohybu spermií okolo 50µm s -1 a procento pohyblivých spermií by mělo být více než 60 %. Morrell et al. (2008) zjistili při subjektivním hodnocení motilitu spermií v rozmezí 55 až 75 % u teplokrevných plemen hřebců. 2.7.4 Koncentrace spermií Koncentrace spermií, neboli hustota ejakulátu, je dána funkční aktivitou semenotvorného epitelu varlat, věkem, zdravotním stavem plemeníka, připraveností a technikou odběru ejakulátu u daného plemeníka. Plemeníci s opakovaně nízkou koncentrací spermií v ejakulátu, tzv. oligospermií, která je geneticky podmíněna, se vyřazují (Louda et al., 2001). 26

Existuje několik metod ke zjištění koncentrace spermií v ejakulátu. Nejlevnější metodou je přímé počítání spermií s využitím mikroskopu, kdy se hustota spermatu stanovuje odhadem podle vzájemného uložení spermií v zorném poli, rozlišuje se ejakulát hustý, středně hustý a řídký. Tato metoda je méně přesná (Gordon, 2004). Odhadem se koncentrace spermií zjišťuje na inseminační stanici jen ve výjimečných případech. Je to spíše způsob, který je vhodný v polních podmínkách u plemeníků využívaných v přirozené plemenitbě. Dále je možné provádět stanovení hustoty spermatu spermiodenzimetrem podle Karrase, kdy se určité množství spermatu promíchá s 1 % roztokem NaCl v tzv. Karrasově klínu a z jeho stupnice se odečte ještě dobře viditelná hodnota. Podle tabulky se stanoví koncentrace v 1 cm 3, chyba se pohybuje okolo ± 5 % od skutečného počtu spermií. U haemocytometrické metody se provádí stanovení koncentrace spermií počítáním spermií v Bűrkerově komůrce. Počítáním spermií v Bűrkerově komůrce se také kontroluje přesnost měření některých přístrojů používaných ke stanovení koncentrace spermií, jako je např. fotometr (Louda et al., 2001). Počítání spermií je časově velmi náročnou, proto byly vyvinuty i jiné alternativní metody zjišťování hustoty spermatu. Počet spermatických buněk se určuje z naředěných vzorků ejakulátu pomocí speciálních zařízení (Gordon, 2004). Jedním z nich je například fotokolorimetr, který funguje na základě měření stupně zakalení standardního vzorku, ve kterém je rozptýleno odměřené množství spermatu. Přesnost tohoto přístroje je závislá na jeho dobré funkci a na přesně vypracované kalibrační křivce. Existují i modifikované fotokolorimetry, určené speciálně pro vyšetření ejakulátu jednotlivých druhů hospodářských zvířat (Louda et al., 2001). Zatímco plně automatizované přístroje k počítání spermií jsou technologicky nejvíce sofistikované a nepochybně nejpřesnější, jejich nákladná pořizovací cena znemožňuje rozšíření zavedení této technologie stanovení množství aviárních spermií do běžné praxe. Několik laboratoří prokázalo, že množství spermatických buněk v kapiláře po odstředění, někdy nazýváno také jako spermatokrit, vysoce koreluje s počtem spermií zjištěných pomocí přímého počítání. Tato technika se jeví jako zajímavá, protože je poměrně laciná a je zde nutné pouze běžně dostupné vybavení používané k zjišťování počtu červených krvinek. Mnoho výzkumných laboratoří také prokázalo vysokou korelaci mezi propustností paprsku světla skrz ejakulát a koncentrací spermií stanovenou odhadem. K těmto účelům zjišťování koncentrace spermií v ejakulátu 27

mohou být využity relativně finančně nepříliš nákladné spektrofotometry, které navíc vyžadují pouze minimální odbornou znalost (Gordon, 2004). Koncentrace spermií v ejakulátu hřebců je variabilní a pohybuje se v rozmezí od 0,1 do 0,3 10 6 mm -3 (Louda et al., 2001) a při každodenním odběru se koncentrace postupně snižuje (Novák in Šmerha et al., 1980). Frakce bohatá na spermie může dosáhnout koncentrace až 0,8 10 6 mm -3. Husté semeno má koncentraci více než 0,2 10 6 mm -3, středně husté semeno 0,08 až 0,2 10 6 mm -3 a řídké semeno 0,03 až 0,08 10 6 mm -3. Celkový počet spermií kolísá od 6 do 48 10 9 spermií. Při krátkodobé konzervaci ejakulátu je požadována koncentrace spermií minimálně 0,1 10 6 mm -3, při dlouhodobé konzervaci by koncentrace spermií měla být minimálně 0,12 10 6 mm -3. Inseminační dávka krátkodobě konzervovaná by měla obsahovat 300 10 6 spermií a dlouhodobě konzervovaná 300 až 400 10 6 spermií (Louda et al., 2001). Podle zjištění Morrella et al. (2008), kteří prováděli fotometrické měření, se koncentrace spermií u teplokrevných plemen hřebců pohybovala v rozpětí 162 10 6 ml -1 až 356 10 6 ml -1. Gamboa et al. (2010), kteří sledovali vliv ročního období na kvalitativní a kvantitativní ukazatele ejakulátu u skupiny zdravých hřebců, zjistili, že koncentrace spermií klesala -1 v průběhu roku, od září do května z hodnot 228 na 210 10 6 ml a od května do července se pohybovala okolo 164 10 6 ml -1. 2.7.5 Koncentrace vodíkových iontů (ph ejakulátu) Obecně je reakce vodíkových iontů čerstvého ejakulátu blízká neutrální hranici. Počáteční alkalická reakce je výrazná především u oligospermických nebo aspermických ejakulátů. Může také poukazovat na patologické změny sekretů přídatných pohlavních žláz, případně na jiné příměsi v ejakulátu a je tedy doprovázena poruchami plodnosti. U semene obsahujícího vyšší koncentraci fruktózy a vyšší počet spermií, dochází následkem spotřeby fruktózy a nahromadění kyseliny mléčné k rychlému snížení ph. U některých druhů hospodářských zvířat existuje nárazníková pufrovací schopnost, která vyrovnává kolísání hladiny ph v semenu. Hřebec takovouto pufrační schopnost téměř postrádá, jeho sperma je tedy velmi citlivé na výkyvy ph. Při určitém stupni ph = 6 ustává pohyb a dojde ke stavu anabiózy, ve kterém mohou spermie přežít delší dobu. Obnovení pohybu je možno dosáhnout přidáním alkalických látek nebo zahřáním spermatu. Tohoto jevu je využíváno ke krátkodobé konzervaci spermatu chlazením. 28

Koncentrace vodíkových iontů se zjišťuje orientačně. V terénu pomocí lakmusových papírků, v laboratořích pomocí ph-metrů. Kyselost spermatu je výrazem činnosti a zdravotního stavu přídatných pohlavních žláz. Měla by být stanovena do 15 min. po odběru, jelikož se životní pochody spermií mění. Ejakulát hřebců by měl mít ph v rozmezí od 6,7 do 7,5, pokud ph stoupne na 7,8 (výrazně alkalické ph), znamená to, že nebyl získán celý ejakulát (Louda et al., 2001). Věžník et al. (2004) uvádí ph hřebčího ejakulátu 7,2. 2.7.6 Morfologické vyšetření spermií Morfologie spermií je důležitým parametrem pro hodnocení kvality spermatu. Poruchy spermatogeneze vedou ke vzniku morfologických abnormalit spermií (Malmgren, 1997). Kuster et al. (2004) uvádí, že zjišťování počtu abnormálních spermií při morfologickém vyšetření hraje důležitou roli pro stanovení fertility, je důležité také pro selekci plemeníků a k odhadu vhodnosti ejakulátu ke skladovatelnosti, popřípadě kryokonzervaci a pro účely umělé inseminace. Vyšší procento výskytu morfologicky změněných spermií může mít za následek poruchy plodnosti (Saacke et al., 2000). Gamčík, Kozumplík et al. (1992) upřesňují, že morfologicky abnormální spermie můžou ovlivnit plodnost vytvořením defektní zygoty, blokováním fertilizace normálních spermií, příp. omezením jejich pohybu. Na snížení fertility a na výskyt patologických spermií mohou mít výrazný vliv nejen chemické a fyzikální faktory, ale především stres a věk samců (Auroux a Dulioust, 1995). Mimo všeobecných anomálií, které se běžně stanovují ve spermatologických laboratořích, jde ve většině případů o rozličné defekty ve stavbě spermií, které se dají zjistit pouze elektronovými mikroskopy, cytologickými, cytochemickými a histologickými metodami (Louda et al., 2001). Při hodnocení morfologie spermií lze využít celé řady různých metod a barviv, jako jsou barvení podle Hancocka (Root- Kustritz et al., 1998), barvení podle Farellyho (Boersma et al., 2001), barvení podle Čeřovského (Věžník et al., 2004), barvení podle Papanicolaoua (Kalahanis et al., 2002; Menkveld et al., 2003). Posuzují se odchylky od normální struktury spermie (Věžník et al., 2004). Podle místa vzniku se změny spermií rozdělují na primární a sekundární (Louda et al., 2001). Primární změny spermií Tyto vady vznikají v průběhu spermatogenního cyklu. Patří sem degenerativní formy spermií, změny tvaru hlavičky, změny v nukleoplazmě, 29

změny na akrozomu, tvarové změny bičíku a další vývojové anomálie (Louda et al., 2001). Sekundární změny spermií Tyto změny nastávají při dlouhém pobytu spermií v ocasu nadvarlete, dále v průběhu ejakulace, špatnou manipulací odebraného spermatu, nesprávné přípravě preparátů. Tyto změny jsou projevem kvalitativních změn v semenné plazmě a nesprávného technologického postupu při zpracování spermatu. Patří sem změny hlavičky, změny akrozomu, torze bičíku (Louda et al., 2001). Při posuzování morfologických změn na spermiích rozdělujeme patologické formy spermií do následujících skupin (rozdělení dle Loudy et al., 2001): Vývojové tvarové anomálie degenerativního charakteru Počítají se všechny formy spermií, které se vyvinuly atypicky a nemají normální diferenciaci, hlavičku s akrozomem, spojovací část bičíku a bičík samotný. Nejčastěji jde o atypické tvary hlaviček, kdy hlavička bývá často menší a abnormálně barvitelná. Řadíme sem i takové spermie, u nichž se nevytvořil normální bičík, ale místo něj pouze vakovitý nebo kyjovitý tvar. Také spermie s dvojitým bičíkem nebo se zdvojenou hlavičkou a jiné. V normálním ejakulátu by se nemělo vyskytovat více než 5 % těchto změn. Vyšší procento je ukazatelem vážnější poruchy spermiogeneze (Louda et al., 2001). Patologické formy ve tvaru hlaviček Změny jsou nejčastějšími odchylkami při poruchách spermiogeneze a provázejí nejčastěji vznik degenerativních nebo zánětlivých procesů ve varlatech. Celkově by neměl výskyt těchto anomálií překročit hranici 5 %. Nejčastěji se vyskytují hlavičky zúžené, hruškovité, abnormálně veliké, abnormálně malé, asymetrické, oválné, citronovité. Dále pak spermie s abnormální strukturou hlavičky, která může být proláklá, plošná, příliš široká nebo s úzkým klenutím. Všechny tyto změny patří mezi změny primární (Louda et al., 2001). Změny na akrozomu Nejčastější anomálií je akrozom zbobtnalý. K této změně dochází i při manipulaci se spermatem, zejména když se dostane do sběrače se spermatem voda. Akrozom obvykle praskne a akrozomová hmota se vylije do prostředí. Mezi další změny vnitřní struktury akrozomu patří kondenzace akrozomové hmoty k přednímu okraji hlavičky, zřasení předních okrajů hlaviček, různé granulace v akrozomové substanci a jiné, které bývají obvykle sekundárního charakteru (Louda et al., 2001). Změny na spojovací části Rozpoznání těchto změn vyžaduje již poměrně značné zkušenosti a citlivost oka, aby byly zachyceny jemné změny, mezi které patří 30

hlavně zkrácení spojovací části, její prodloužení, ztluštění, zúžení, přerušení spojovací části v některém úseku, ve kterém probíhá pouze holé osové vlákno, nebo rozvázání mitochondriální spirály, která se při bedlivé prohlídce jeví jako vinoucí se nitkový závit (Louda et al., 2001). Patologické změny na bičících Nejčastěji se jedná o stočení bičíku kolem protoplazmatické kapky, obvykle na konci spojovací části bičíku. Může to být stočení bičíku do tvaru houslového klíče, zavinutí bičíku do klubka. Řadíme sem i tzv. Dagdefekt, kdy dochází k abnormálnímu vyvinutí bičíku v důsledku toho, že se bičíkové fibrily nevyvinou v uspořádání 2+9+9, ale ve vnějším kruhu obvykle skupina fibril chybí. Tato anomálie je popisována jako změna s dědičnou predispozicí. Dále sem patří abaxiální upevnění bičíku, kdy bičík nevychází ze středu, ale z okraje hlavičky a dekapitace, tj. oddělení hlaviček od bičíků. Velmi často však může jít o arteficiální změny, které vznikají při nesprávném zhotovení roztěru (Louda et al., 2001). Nezralé spermie Jedná se o spermie se zadrženou protoplazmatickou kapkou na krčku proximální, nebo v průběhu spojovací části distální. Při vyšším výskytu nezralých spermií v ejakulátu je třeba sledovat výskyt dalších vývojových vad (Louda et al., 2001). Změny v nukleoplazmě Tyto změny se posuzují při použití speciálního barvení, znázorňující jadernou substanci. Mezi nejčastější změny patří miliární vakuoly při předním okraji hlavičky, makrovakuoly, nepravidelné uspořádání deoxyribonukleových kyselin v jádře nebo slabá barevná reakce nukleoplazmy. V ejakulátu nemá být více než 15 % těchto anomálií (Louda et al., 2001). Při hodnocení patologických spermií je nutno dodržovat zásadu, že z jednorázového vyšetření nelze vyvozovat konečné závěry a že je nutné vyšetření opakovat vždy 3 5denních intervalech. Celkem se posuzuje při jednom vyšetření 300 500 spermií. Používá se olejové imerze a zvětšení 1000 1500krát (Louda et al., 2001). Podle Bilgiliho et al. (1985) a Root-Kustritze et al. (1998) při hodnocení morfologie spermií je velmi významný lidský faktor, respektive zkušenosti examinátora, dokonce důležitější než použitá metoda barvení spermatu. Výsledky morfologického vyšetření jsou pak individuální a mohou se lišit. Kliment et al. (1989) uvádí, že se nejčastěji používá světelná mikroskopie. Při procesu fixace a barvení může však dojít ke vzniku četných artefaktů, a proto každá laboratoř by měla pro komparaci těchto artefaktů požívat dvě různé techniky. Také z tohoto důvodu se jeví jako výhodné 31

použití automatických softwarových metod obrazové analýzy (Hidalgo et al., 2006). Gravance et al. (1995) vyvinuli automatizovanou analýzu velikosti spermií. Pomocí ní jsou zaznamenávány průměrné hodnoty délky, šířky, plochy a obvodu hlavičky a pomocí výpočetní techniky jsou získané údaje vyhodnocovány. Brito et al. (2011) prověřovali rozdílnost metod barvení spermií pro posouzení jejich morfologie a vliv lidského faktoru při morfologickém vyšetření spermií a zjistili, že existují značné odchylky ve výsledcích. Uvádějí, že metoda barvení spermií má statisticky průkazný vliv na výsledné hodnoty morfologického posouzení spermií. Zjistili, že průměrné hodnoty morfologicky normálních spermií se pohybují od 36,7 %, přes 39,3 % až po 50,3 % při použití třech různých metod barvení hřebčích spermií. Stejně tak zjistili, že i vliv laboranta na výsledné hodnoty morfologického posouzení spermií je statisticky průkazný a uvádějí hodnoty v rozmezí od 37,5 % do 47,4 % morfologicky normálních spermií v ejakulátech hřebců (Brito et al., 2011). Věžník et al. (2004) uvádí, že procento celkového výskytu patologicky změněných spermií by mělo být nižší než 40 %, výskyt primárních změn by neměl být vyšší než 15 %. Stejně tak Louda et al. (2001) uvádí, že v ejakulátu při krátkodobé konzervaci by mělo být minimálně 60 % morfologicky normálních spermií, při dlouhodobé konzervaci minimálně 70 %. 2.8 Ředění a konzervace ejakulátu 2.8.1 Krátkodobá konzervace Semeno určené pro krátkodobé použití se uchovává při teplotě 4 6 C, kdy přežívání spermií je nejdelší (Louda et al., 2001). Varner et al. (1988) a Moran et al. (1992) také uvádějí, že sperma by mělo být pomalu ochlazeno na teplotu 4 až 6 C. Tato teplota je považována za optimální skladovací teplotu pro udržení jak motility spermií, tak i pro zachování oplození schopnosti spermií. Při vyšších teplotách skladování může dojít v aerobních podmínkách k rozvoji nežádoucích bakterií (Aurich, 2008 a Price et al., 2008). Je-li semeno zchlazováno příliš rychle, může utrpět chladový šok, při kterém dochází k nevratným změnám na membráně spermie a ztrátě progresivního pohybu (Moran et al., 1992 in Louda et al., 2001). Kayser et al. (1992) doporučuje rychlé zchlazování neředěného ejakulátu z 37 C na 20 C, dále pak pomalé zchlazování rychlostí 0,05 C za minutu z 20 C na 5 C (Kayser et al., 1992 in Louda 32

et al., 2001). K ředění se většinou používají ředidla na bázi odstředěného mléka, glukózy a vaječného žloutku. Po ředění je sperma nasáto do jednorázové injekční stříkačky v množství 10 cm 3 a umístěno do chladničky o teplotě 4 C na 1 hodinu. Pro chlazení ejakulátu a pro udržení vhodné stálé teploty je nejlepší použít speciálních chladících kontejnerů Equitainer, nicméně pořizovací cena těchto zařízení je vysoká ve srovnání s méně sofistikovanými kontejnery. Tyto kontejnery jsou výhodné především v případě, pokud je sperma dodáváno na delší vzdálenosti. Toto balení a přesné chlazení spermatu pomáhá udržet jeho kvalitu i v případě extrémních klimatických teplot (Brinsko et al., 1999 a Nunes et al., 2007). Konzervací se snižuje aktivita intracelulárního vápníku ve spermiích a dochází k porušení buněčné homeostaze. Oplozovací schopnost krátkodobě konzervovaného spermatu se pohybuje od 24 do 48 hodin (Louda et al., 2001). Při delším uchovávání krátkodobě konzervovaného semene schopnost zabřeznutí dramaticky klesá (Jasko et al., 1992). Počet aktivních spermií v inseminační dávce pro klisny by neměl klesnout pod 100 milionů při použití krátkodobě konzervovaného spermatu (Louda et al., 2001). 2.8.2 Dlouhodobá konzervace Narůst využívání asistované reprodukce v chovu koní podmiňuje použití mrazeného hřebčího spermatu. Výhody vyplývající z využití kryokonzervace spermatu jsou četné a zahrnují lepší přístup ke spermatu hřebců v optimální době pohlavního cyklu klisny. Kromě toho, mrazené sperma může být uloženo v tekutém dusíku v podobě menších dávek pro použití reprodukčních biotechnických metod, jako je např. intracytoplazmatická injekce spermií při in vitro oplození (Choi et al., 2002). Úspěch kryokonzervace spermií je u hřebčího ejakulátu obecně považován za nižší než u ejakulátu býka (Watson, 2000). Po několik desetiletí jsou v mlékárenském průmyslu vybíráni býci, jejichž ejakulát je vhodný ke kryokonzervaci, to vede k vytvoření uniformní populace býků, jejichž spermie vykazují přiměřenou oplození schopnost po rozmrazení (Loomis a Graham, 2008). Naproti tomu u hřebců se běžně používá selekce na sportovní výkonnost, rodokmen a exteriér a nedbá se přitom tolik na jejich plodnost (Varner et al., 2008). Problematikou hodnocení plodnosti dlouhodobě konzervovaného hřebčího spermatu po rozmražení inseminační dávky se ve své práci zabývali (Kuisma et al., 2005). Kromě některých výjimek je plodnost u dlouhodobě konzervovaného ejakulátu po rozmražení obecně nižší než při použití chlazeného nebo čerstvého 33

hřebčího spermatu. V uplynulých letech mnoho laboratoří testovalo a navrhovalo různé způsoby zmrazení ejakulátu a především různé složení ředidel inseminačních dávek ve snaze zlepšit kvalitu a využití zmrazeného spermatu hřebce. U hřebců existují výrazné individuální rozdíly v mrazitelnosti ejakulátu. Aurich et al., (1996) došli k závěru, že individuální složení semenné plazmy ovlivňuje vhodnost hřebců pro kryokonzervaci spermatu. S ohledem na oplozovací schopnost spermií po rozmrazení se v současné době stále testují a vyvíjejí nové metody, které efektivně ovlivňují kryokonzervaci hřebčího semene (Salazar et al., 2011). Také se uvažuje o zavedení metody dodávat chlazené sperma hřebců do zařízení, které se specializují na kryokonzervaci spermií a přitom by tak umožnili hřebci zůstat v domovské stáji (Crockett E.C. et al., 2000). Rozhodujícím přínosem pro dlouhodobou konzervaci ejakulátu bylo poznání kryokonzervačního účinku glycerinu na přežívání savčích spermií objevené v roce 1949. K dokonalosti metod přispělo i použití tekutého dusíku jako chladícího média. V průběhu zmrazování a rozmrazování spermií dochází ke složitým procesům přeměny skupenství vody a koncentrace roztoků v buňce i mimo ní a tím i k zatížení buněčné membrány. Důsledkem těchto procesů je přežívání jenom určitého počtu spermií (30 50 %). Mražená inseminační dávka by měla tedy obsahovat více aktivních spermií než inseminační dávka při krátkodobé konzervaci. Doporučuje se, aby mražená dávka obsahovala minimálně 250 milionů aktivních spermií. Semeno se po naředění a po ekvilibraci a zchlazení na 4 C plní do pejet a mrazí v párách tekutého dusíku. Rozmrazování inseminační dávky se provádí ve vodě o teplotě 45 50 C po dobu 10 20 sekund (Louda et al., 2001). 2.9 Fyzikální vlastnosti ejakulátu 2.9.1 Elektrická vodivost ejakulátu Elektrický náboj spermie má zápornou hodnotu, v elektrickém poli se tedy pohybuje k anodě. Elektrický náboj spermie je spjat s elektrickým potenciálem. Na stabilitu či proměnlivost elektrického potenciálu spermií mají vliv četné faktory. K pozvolné ztrátě elektrického náboje spermií dochází také postupným stárnutím ejakulátu, zvyšující se koncentrací kyseliny mléčné. Ztráta elektrického náboje má za následek ztrátu pohyblivosti spermie a vznik aglutinací. Elektrický potenciál spermií lze měřit pomocí elektrické vodivosti ejakulátu. 34

Hodnotami vodivosti ejakulátu u kanců se zabývali již Kozumplík a Kudláček (1980). Hodnoty měřili při teplotě 25 C a uvádějí rozpětí 1233 1346 S mm -1. Vztah mezi relativní permitivitou, konduktivitou a kvalitativními znaky ejakulátu kanců a býku se zabýval Máchal et al. (1977). U čerstvých ejakulátů býků konstatuje vypočtené negativní fenotypové korelace mezi objemem ejakulátu a sledovanými elektrickými vlastnostmi ejakulátu r p = -0,17 až -0,72. Naměřené průměrné hodnoty měrné vodivosti měřené čtyřelektrodově i dvouelektrodově v semenné plazmě býků byly vyšší 0,90 a 0,75 než v celém ejakulátu 0,84 a 0,69 S mm -1. Hodnoty měrné vodivosti ejakulátu kohoutů měřené čtyřelektrodově zjišťovali Máchal a Křivánek (2002). Průměrné hodnoty vodivosti ejakulátu kohoutů se pohybovaly v rozpětí 0,84 až 1,02 S mm -1 a jsou vyžší než byly hodnoty zjištěné dříve v ejakulátu býků. Měrná vodivost měřená čtyřelektrodově. Nositeli kondukčních proudů, které vznikají v elektrolytech, což jsou všechny biologické materiály, jsou volné ionty, které se mohou ve vodivých látkách pohybovat mezi ostatními částicemi. Tyto částice jsou buď neutrální, proto na ně vnější elektrické pole nepůsobí, nebo jsou vázány na málo proměnné polohy v krystalové mřížce. Překážejí pohybu nositelů náboje a kladou tak odpor vedení elektřiny. Pro prostorovou hustotu elektrického proudu i v závislosti na elektrostatickém poli intenzity E platí Ohmův zákon v diferenciálním tvaru: i E, definovaná jako: n e t 2m n - prostorová hustota nábojů e - náboj pohyblivé částice t - střední doba letu částice mezi dvěma srážkami m - hmotnost nositele proudu Pro daný rozměr vodivého vzorku se definuje jeho vodivost vztahem: G S l 35

G - vodivost vzorku (S) σ - l - délka vzorku S - plocha vzorku (m 2 ) -1 ) Při veškerých měřeních je pochopitelně třeba stanovovat měrnou vodivost σ, která je pro danou frekvenci konstantou vzorku a ne vodivost G, kde závisí její velikost na ploše a délce vzorku. V literatuře je často měrná (specifická) vodivost nahrazena pojmem vodivost, ovšem s jednotkou S m -1. Pro vztah mezi napětím na vzorku U, kondukčním proudem I uvnitř a vodivostí G platí integrální tvar Ohmova zákona: G I U Z tohoto vztahu je vidět, že pokud udržíme konstantní napětí na kontaktech měřící sondy, je vodivost přímo úměrná velikosti procházejícího proudu mezi kontakty. Elektrická vodivost biologického materiálu je netriviální funkcí kmitočtu. Tato funkce umožňuje vyšetřovat strukturu a složení buněčných tkání. Přitom je třeba zaměřit svou pozornost především na oblasti vyšších kmitočtů radiovln a mikrovln, ve kterých vznikají dielektrické vlastnosti biologických materiálů (Milion a Blahovec, 1984). Při dopadu mikrovlnné energie, vyzařované zářičem na měřenou látku, dochází k odrazu části energie od povrchu měřené látky a zbytek prochází měřenou látkou, kde se část elektromagnetické energie přemění na teplo. To je vyhodnoceno jako útlum procházejících mikrovln a současně dochází k fázovému posunu elektromagnetické vlny. Útlum je způsoben interakcí elektromagnetického pole mikrovln šířícího se měřenou látkou se strukturou hmoty měřené látky. Měřenou látku můžeme většinou považovat za nedokonalé dielektrikum s určitou dielektrickou vodivostí, která vzniká pouze v časově proměnném elektrickém poli v měřené látce, související s rozkmitáním molekul hmoty, s deformační polarizací a podobně (Brandt, 1963). V současné době se ve světě využívá dielektrických vlastností zejména k vysokofrekvenčnímu ohřevu a sterilizaci, ale také k posouzení kvality a homogenity biologických materiálů. Taborsak a Basic (1984) popisují dielektrický 36

vysokofrekvenční ohřev mléka při procesu zahušťování mléka, během kterého je zřejmá změna relativní permeability a ztrátového úhlu měřeného při konstantní teplotě. Provádí se také měření dielektrických vlastností potravin, konkrétně vepřového, drůbežího, rybího masa a brambor při konstantní teplotě (Simov yan, 1987; Stuchlý, 1987). Maksimets a Savgira (1989) se zabývali dielektrickými změnami potravin během ohřevu. 2.9.2 Dynamická viskozita Viskozita kapaliny je charakteristickou vlastností reálné kapaliny. Je mírou toho, jak se kapalina brání tečení. Například tlustá vrstva medu se podstatně více brání roztékání než stejně tlustá vrstva vody. Proto říkáme, že med je viskóznější než voda. Viskozitu nesmíme zaměňovat s hustotou. Například oleje mají menší hustotu než voda, takže plavou na povrchu, ale viskozitu mají mnohem větší. Viskozita kapalin je analogická smykovému tření mezi pevnými tělesy, při viskózním proudění se kinetická energie přeměňuje na teplo podobně jako při vzájemném pohybu těles za působení tření. Viskozita je důsledkem smykového napětí, vznikajícího mezi jednotlivými vrstvami kapaliny při jejím toku. Odpovídá síle potřebné v určitém médiu k posunu 1 kg za 1s o 1m. Tuto vlastnost vyjadřujeme koeficientem viskozity η (dynamickou viskozitou), pro který při laminárním proudění platí vztah: η = τ dv / dy kde τ je smykové napětí vznikající při proudění kapaliny a dv/dy gradient rychlosti určovaný ve směru kolmém ke směru proudu. Jednotkou dynamické viskozity je 1 Pa s (pascalsekunda, 1 kg m -1 s -1 ). Laminárním nazýváme takové proudění, při kterém proudová vlákna probíhají souběžně a kapalina se nepromíchává. Podíl dynamické viskozity a hustoty kapaliny nazýváme kinematická viskozita ν ν = η ρ 37

Jednotkou kinematické viskozity je m 2 s -1. Vztah, uvedený výše jako první, vyslovil Newton. Proto se kapaliny, pro které je splněn, nazývají newtonské. Viskozita kapalin závisí na teplotě a tlaku. S rostoucí teplotou klesá, s rostoucím tlakem vzrůstá. Vliv tlaku je však většinou zanedbatelný, projevuje se až při velmi vysokých tlacích. U tekutin se viskozita při stálém tlaku snižuje s rostoucí teplotou, protože se snižují přitažlivé síly mezi molekulami tekutiny. Pro vodu je závislost f t n normálním tlaku p vynesena na obr. 1. (Groda B. a Vítěz T. 2009)., při Obr. 3: Závislost viskozity vody na teplotě (převzato z Groda B. a Vítěz T. 2009) 38

3 CÍL PRÁCE Cílem práce bylo zhodnotit reprodukční výkonnost plemenných hřebců, kteří působí v rámci plemenné knihy českého teplokrevníka a studovat fyzikální vlastnosti ejakulátu hřebců - elektrickou vodivosti ejakulátu a dynamickou viskozitu ejakulátu. Dalším cílem bylo vyhodnotit vzájemný vztah zjištěných hodnot fyzikálních vlastností ejakulátu ke zjištěným kvalitativním a kvantitativním ukazatelům ejakulátu hřebců. 39

4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Materiál Sledování bylo provedeno na plemenných hřebcích, kteří byli v majetku Zemského hřebčince Tlumačov, státního podniku. Hřebci byli různého věku, různých plemen a všichni byli využíváni v inseminaci. Od hřebců byl odebírán ejakulát a následně byl zpracován formou krátkodobě konzervovaných inseminačních dávek čerstvého zchlazeného spermatu. Plemenní hřebci byli ustájeni ve stejných podmínkách. Krmná dávka obsahovala objemnou složku - luční seno a vojtěškotravní senáž a část jadrnou, která se skládala z ovsa a granulované krmné směsi obohacené o minerální látky a vitamíny. Složení doplňkové granulované krmné směsy je uvedeno na obr. 4. Podíl jadrné složky byl závislý na pohybové aktivitě plemenných hřebců. Mladší hřebci byli v době odběru spermatu zařazeni do sportovní testace, u těchto hřebců byl podíl jadrné složky vyšší v závislosti na výdeji energie při sportovní zátěži. Seznam plemenných hřebců zařazených do pokusu: 814 Catango Z 2825 Genius Lysák 2765 Cassilius 2745 Oscar 2901 Lancelot 2943 Dahoman IV-CZ Tamarix 6127 Vernius 2997 Aristo Z 2782 Ballast s.v. 1359 Colato R 2815 Catalin IV-33 40

Obr. 4: Složení doplňkové granulované směsy 41

814 CATANGO Z Cantus Zita Caletto I Monoline Ahorn Z Tschita Cor de la Bryere Deka Roman Usa Alme Heureka Capitol I Oruma Holštýnský teplokrevník, bělouš, narozen 20.4. 1989 Tělesné míry hřebce: kohoutková výška pásková 176 cm, hůlková 164 cm, obvod hrudi 187 cm, obvod holeně 21 cm 42

2825 GENIUS LYSÁK Genius - 11 Questa K Genius 728 Komparse Amoural VC 1692 Q - 23 Gepard Welfenglück Komparse Seila H Arsenik Gleida H Quoniam H 895 Alarm Český teplokrevník, ryzák, narozen 12.5. 1999 Tělesné míry hřebce: kohoutková výška pásková 180 cm, hůlková 170 cm, obvod hrudi 193 cm, obvod holeně 22 cm 43

2765 CASSILIUS 5039 Cassini I Ranka Capitol I Wisma Landgraf I Jersey Capitano Folia Caletto II Prisma Ladykiller Wartburg Urioso Estella Holštýnský teplokrevník, světlý hnědák, narozen 26.2. 1997 Tělesné míry hřebce: kohoutková výška pásková 175 cm, hůlková 164 cm, obvod hrudi 190 cm, obvod holeně 21 cm 44

2745 OSCAR Celano Jodessa Capitol Wabrina H Darnels Odessa Capitano Folia Lord Ilexa H Lucky Boy R. Perle Jasper 33 STB Ritta A Holandský teplokrevník, bělouš, narozen 20.4. 1996 Tělesné míry hřebce: kohoutková výška pásková 177 cm, hůlková 166 cm, obvod hrudi 195 cm, obvod holeně 20,5 cm 45

2901 LANCELOT Lancer II Zuckerpuppe Landgraf I Inula Cantus Ma Jolie Ladykiller Warthburg Fantus Nachtblume Caletto I Monoline Tumbled Cro Holštýnský teplokrevník, hnědák, narozen 11.5. 2002 Tělesné míry hřebce: kohoutková výška pásková 180 cm, hůlková 169 cm, obvod hrudi 192 cm, obvod holeně 22 cm 46

2943 DAHOMAN IV - CZ "Tamarix" 4 Dahoman XI /Dah. X - 3 583 Koheilan IV 57 /Tamariš 218 Dahoman X 523 Shagia XXIII 10 182 Koheilan IV 335 Tobrok 34 Dahoman IX Etna Km 1146 II 3327 Shagya XXIII 422 Koheilan III 55 153 Koheilan III 167 Siglavy Bagdady 2 151 Tobrok 198 Rasim II 7 Shagya-arab, bělouš, narozen 1.3. 2001 Tělesné míry hřebce: kohoutková výška pásková 174 cm, hůlková 162 cm, obvod hrudi 195 cm, obvod holeně 20,5 cm 47

6127 VERNIUS Mill Pond (FR) Vernisáž Mill Reef (USA) Royal Wey (FR) Dakota (IRE) Verona Never Bend Milan Mill Sicambre Right Away Stupendous Ardneasken Masis Vesera Anglický plnokrevník, tmavý hnědák, narozen 30.1. 1995 Tělesné míry hřebce: kohoutková výška pásková 175 cm, hůlková 165 cm, obvod hrudi 187 cm, obvod holeně 21,5 cm 48

2997 ARISTO Z Artos Z Cartarise Z Alme Z Glorita Carthago Z Cerise Z Ibrahim Girondine Gotthard Akita (V) Capitol I Perra Calando I U- Capitola Holštýnský teplokrevník, ryzák, narozen 5.6.2001 Tělesné míry hřebce: kohoutková výška pásková 177 cm, hůlková 168 cm, obvod hrudi 192 cm, obvod holeně 22,2 cm 49

2782 BALLAST s.v. Bulat Archa - 2 3059 Balans Ulzburg Aceton Chloja 2192 Argonavt 2752 Babočka 3669 Galapeter I 60610 Hole 3776 Aldato 63595 Zinobie Heidekrug Geding Ruský holštýnský teplokrevník, hnědák, narozen 7.2. 1986 Tělesné míry hřebce: kohoutková výška pásková 178 cm, hůlková 165 cm, obvod hrudi 198 cm, obvod holeně 22 cm 50

1359 COLATO R Carthago Z Dance Girl T Capitol I Perra Lancer I Vajanga Capitano Folia Calando I Kerrin Landgraf I Inula Silvester Medium Holštýnský teplokrevník, hnědák, narozen 1993 Tělesné míry hřebce: kohoutková výška pásková 178 cm, hůlková 167 cm, obvod hrudi 190 cm, obvod holeně 22 cm 51

2815 CATALIN IV 33 Catalin IV - Mot. 808 Furioso XLVI - 3 Catalin II - Mot. 694 Furioso XXXV - 20 Furioso XLVI - Mot. 584 Furioso X - 106 Catalin I - Mot. 675 Furioso XXXI - 19 Furioso XXXV - K 614 Furioso XXVI - 3 Furioso XXV - Mot. 597 North Star II - 5 Furioso X - K 270 Furioso XV -25 Furioso, hnědák, narozen 3.8. 1990 Tělesné míry hřebce: kohoutková výška pásková 178 cm, hůlková 168 cm, obvod hrudi 197 cm, obvod holeně 22 cm 52

4.2 Metodika Sledování fyzikálních vlastností ejakulátu bylo prováděno u 11 klinicky zdravých plemenných hřebců různého věku a různých plemen teplokrevných koní, které mohou působit v rámci šlechtitelského programu českého teplokrevníka. Praktická část disertační práce proběhla v devíti odběrových termínech. V roce 2007 bylo v každém odběrovém termínu provedeno 11 odběrů ejakulátu. V roce 2008 bylo v každý odběrový termín provedeno 10 odběrů spermatu. Těmito odběry bylo pro další zpracování k dispozici 95 vzorků ejakulátů, u kterých bylo dle metodiky provedeno měření elektrické vodivosti spermatu, dynamické viskozity spermatu a stanoveny základní kvalitativní a kvantitativní ukazatele ejakulátu. Sperma bylo získáváno za běžného provozu reprodukčního centra a prioritou bylo zajištění potřebného množství ejakulátu pro výrobu inseminačních dávek, které byly následně distribuovány chovatelům. Vlastní odběry ejakulátu se uskutečňovaly v prostorách reprodukčního centra Zemského hřebčince Tlumačov. Hřebci byli odebíráni na fantomu (odběr plemenného hřebce je zachycen na obr. 1). Pro odběr byla použita umělá gumová vagína typu Missoury vyrobená firmou Minitüb, která je znázorněna na obr. 2. Pro odběr každého plemenného hřebce byla do vnitřního prostoru umělé vagíny použita jednorázová vložka z PVC, na jednom konci zatavena a sloužila jako sběrač ejakulátu. Umělá vagína se před odběrem temperovala na teplotu v rozmezí 40 C až 42 C. Přirozenou kluzkost vnitřního prostoru vagíny zajišťovala bílá vazelína. Ke spuštění pohlavních reflexů někteří hřebci vyžadovali přítomnost říjící se klisny. Většina hřebců byla dostatečně excitována čichovými a vizuálními podměty v připouštědle. Bezprostředně po odběru ejakulátu od hřebce bylo provedeno v laboratoři reprodukčního centra základní vyšetření ejakulátu: - stanovení ph ejakulátu, - stanovení objemu ejakulátu, - stanovení aktivity spermií, - stanovení koncentrace spermií. Následně byly vzorky ejakulátu převezeny do laboratoře ústavu Reprodukce hospodářských zvířat na MZLU v Brně. Zde byly měřeny fyzikální vlastnosti ejakulátu: - měření elektrické vodivosti ejakulátu, - měření dynamické viskozity viskozimetrem. 53

Obr. 5: Odběr plemenného hřebce na fantomu Obr. 6: Umělá vagína typu Missoury 54

Stanovení objemu ejakulátu Objem ejakulátu byl stanoven bezprostředně po odběru hřebce v kalibrované kádince, temperované na tělesnou teplou 39º C ± 1º C. Objem ejakulátu byl určen s přesností ± 5 cm 3. Stanovení ph spermatu Koncentrace vodíkových iontů ve spermatu hřebců se měřila pomocí stolního přístroje CyberScan Ion 510 sondou Polilyte Lab pracující v rozmezí hodnot ph od 0 do 14 při teplotě roztoku od 10º C do 80º C. U přístroje byla nejdříve provedena tři bodová kalibrace mezinárodně uznávanými pufrovacími roztoky ph 4,01; ph 6,86; ph 9,18. Následně se sonda opláchla v destilované vodě a poté vložila do zkumavky se vzorkem. Po změření hodnoty ph bylo opláchnutí sondy v destilované vodě opakováno. K měřící sondě se vložil teplotní senzor, který zaznamenával teplotu vzorku a hodnota ph vzorku byla automaticky kompenzována. Stanovení aktivity spermií Hodnocení motility spermií se provedí subjektivní metodou pozorování vzorku ejakulátu pod mikroskopem. Na podložní sklíčko vyhřáté na teplotu 39º C ± 1º C se ihned po odběru vloží kapka ejakulátu, přikryje se tenkým krycím sklíčkem a posuzuje při 200 až 300 násobném zvětšení. Hodnotí se minimálně tři zorná pole a odhadem stanovuje procentické zastoupení spermií pohybujících se vpřed za hlavičkou. Vedle pohybu přímočarého vpřed za hlavičkou je třeba sledovat i ostatní druhy pohybu, které se hodnotí jako závadné (kolébavý, kruhový, na místě, zpět). Nežádoucí je i shlukování spermií tzv. aglutinace. Stanovení koncentrace spermií Stanovení koncentrace spermií v ejakulátu se provádí hemocytometrickou metodou počítání v Bürkerově komůrce. Do melanžéru se nasaje 3% roztok NaCl ke značce /4975 µl/ a obsah se nechá vytéct do zkumavky. Mikropipetou nasajeme 25 µl spermatu, přidáme do zkumavky a obsah pečlivě promícháme 1 2 minuty. Kapku zředěného vzorku opatrně kápneme ke hraně krycího sklíčka Bürkerovy komůrky a necháme vtéci do prostoru počítací mřížky. Na krycí sklíčko uchycené svorkami 55

jemný tlak palci a roztíracími pohyby docílíme stejnoměrného rozvrstvení spermií po celé ploše všech čtverečků. Komůrku položíme na stolek mikroskopu a zvolíme 300 až 400 násobné zvětšení. Počítáme spermie, které leží uvnitř čtverečku o velikosti 1/25 mm 2 x 1/10 mm a všechny spermie, jejichž hlavičky leží nebo se dotýkají horní a levé strany čtverečku. Spermie počítáme v deseti náhodně vybraných čtvercích a výsledný počet dosadíme do vzorce: X = PS Č Z V PČ PS počet celkově napočítaných spermií Č - plocha čtverce (1/26 mm 2 ) Z - stupeň zředění (200) V - výška komůrky (1/10 mm) PČ počet počítaných čtverců (10) Měření elektrické vodivosti ejakulátu Měrná vodivost ejakulátu hřebců byla stanovena bioimpedančním spektroskopickým analyzátorem, který umožňuje měřit elektrickou vodivost jako funkci frekvence o rozsahu měření 10 Hz až 100 khz, a je tedy možné stanovit i případný fázový posuv elektrického signálu uvnitř vzorku a kapacitní složku vodivosti. Pro vyloučení chyby z přechodové impedance, byla pro měření použita speciální čtyřkontaktní sonda. Pro vodivostní sondu platí vztah: K G, kde K (m -1 ) je vodivostní konstanta sondy stanovena pomocí normálové kapaliny, 20 % roztok NaCl s měrnou vodivostí 19 61 S m -1. Princip čtyřkontaktního měření spočívá v tom, že dvě elektrody sondy jsou napájecí, na které se přivádí elektrický signál dané frekvence, a dvě elektrody jsou snímací. V našem případě je sonda vybavena ještě pátou, zemnicí elektrodou s nulovým potenciálem. Snímací elektrody, které měří velikost napětí uvnitř vzorku, jsou připojeny 56

na střídavý elektronický voltmetr se vstupním elektrickým odporem řádově stovky MΩ. Tím se zcela vyloučuje vliv přechodového odporu vzorek - snímací kontakty. U vzorků byla zjišťována frekvenční závislost vodivosti pomocí vnitřní elektroniky přístroje Z01, který je schopen přelaďovat frekvenci automaticky s krokem 10 s. Většina dostupných komerčních přístrojů používá při měření stejnosměrné napětí a proud, což je ovšem pro měření kapalin a biologických materiálů nevhodné, neboť během měření dochází na kontaktech sondy k elektrolýze a k nárůstu přechodového elektrického odporu. Měření dynamické viskozity ejakulátu Dynamická viskozita ejakulátu hřebců byla stanovena pomocí rotačního viskozimetru TR9. V případě rotačního viskozimetru je vzorek podrobován smyku mezi dvěma definovanými plochami, z nichž jedna vykonává otáčivý pohyb, přičemž se vyhodnocuje brzdný účinek vzorku při různých rychlostech otáčení. V našem pokusu byly otáčky viskozimetru od 0,3 do 200 ot. / min. Nejběžnější typ rotačního viskozimetru se dvěma souosými válci V a V, mezi kterými je měrná kapalina K, je schematicky znázorněn na obr. 7. 1 2 Obr. 7: Schéma základních typů uspořádání rotačních viskozimetrů 57

Jeden z válců (v tomto případě vnější) se při měření uvede do rotačního pohybu a registruje se moment síly M působící přitom na vnitřní stálou úhlovou rychlostí válec V 2. V uvedeném případě se měří stočení torzního vlákna T, na kterém je zavěšen válec V 1, metodou světelného paprsku odráženého zrcátkem Z. V komerčních přístrojích se otáčivý moment měří zpravidla elektricky, což umožňuje r, r jeho další snadné zpracování, eventuálně zápis. Jsou-li známy poloměry válců 1 a výška smýkané vrstvy kapaliny h, lze vypočítat viskozitu podle rovnice: 2 M. 1 2 r r 2 1 2 M A. ; Pa. s, 4.. h. kde A je přístrojová konstanta. Rovnice byla odvozena za předpokladu stabilního laminárního toku ve štěrbině a při zanedbání koncových a hranových efektů. Pro eliminaci jejich vlivu byla navržena řada korekcí. Určité problémy vyvolává také skutečnost, že v různých bodech měřené kapaliny ve válcové mezeře je různá rychlost smykové deformace. Dále je nutno počítat s ohřevem vzorku během měření, který se zvyšuje s viskozitou a rychlostí otáčení. Rotačním viskozimetrem tedy snadno získáme hodnoty smykového napětí (platí, že M ) pro různé hodnoty rychlostního gradientu D, jehož hodnota je dána rychlostí otáčení a poloměrem válců (hodnoty jsou pro každé uspořádání tabelovány). Souhrnně je možno o reometrech se souosými válci říci, že je k dispozici řada komerčních přístrojů nejrůznějšího provedení, rozsahů a přednosti, z nichž je nutno vybírat vždy podle konkrétních požadavků vyplývajících hlavně ze struktury a typu viskozitní anomálie měřené kapaliny (Buchar 1990). Obr. 8: Různé úpravy měrného prostoru rotačních viskozimetrů 58