Řasy a sinice ve vodárenské a hygienické praxi PřF F UK, 28. 29. března b 2009 RNDr. Lenka Šejnohová, Ph.D. Botanický ústav AV ČR, v.v.i., Brno Mgr. Petr Pumann Státn tní zdravotní ústav, Praha RNDR. Jindřich ich Duras, Ph.D. Povodí Vltavy
Související přednášky Katedra Botaniky & Ekologie Botanika bezcévných rostlin (LS, Prášil): ekologie, taxonomie sinic a řas + determinace praktika Algologie I, II (ZS,LS, Škaloud et all.): podrobná taxonomie sinic a řas + determinace praktika. Ekologie sinic a řas (ZS, Nedbalová, Neustupa): Fytobentos a bioindikace prostředí. Eutrofizace. Vodní květy. http://botany.natur.cuni.cz/neustupa/ekologie-ras.html Vodní ekosystémy (LS, Černý): Přehled organismů sladkovodních lotických a lentických systémů.
Související přednášky - ÚŽP Hygiena (ZS, Prof. Bencko): Požadavky na kvalitu pitné vody; Způsoby zajištění pitné vody pro obyvatelstvo; Biologické metody monitorování znečištění životního prostředí. Limnologie (ZS, Doc. Stuchlík): koloběh vody, trofizace, acidifikace Znečišťování a ochrana vod (LS, Ing. Benešová): Pitná voda,požadavky na kvalitu, úpravárenství, zdravotní zabezpečení pitné vody. Environmentální mikrobiologie (LS, RNDr. Novotný): Mikroorganismy ve vodním prostředí: plankton, benthos, stratifikovaná mikrobní společenství.
Kdy půjdeme na oběd a kdy domů.. struktura přednášky So 28.3. 9-13h. Lenka Šejnohová kvantifikace, ekologie VKS, cyanotoxiny, bioindikace 13-14h: oběd 14-17h. Petr Pumann ČSN, vodárenství Ne 29.3. 9-12h. Jindřich Duras omezení VKS 12-13h. zápočtový testík
Zápočet, zkouška Zápočet Prezenční listina + Zápočtový testík ne 12-13h. Zkouška Test 40 otázek + doplňující mikroskopický rozbor Termín: domluva
Basic research X Aplikace vědy Význam naší přednášky propojení Praha x Brno
Sinice a řasy ve vodárenské a hygienické praxi Vodárny (VAK) - Detekce a odstranění šetrnost (toxicita) Rekreace (ZU,Povodí,BU,HBU) - Monitoring predikce, kvantifikace a determinace biomasy, detekce toxicity, zásahy na omezení rozvoje Bioindikace (VUV,Povodi,BU) -Determinace a výpočty indexů kvality vod Ekotoxikologické biotesty (RECETOX MU Brno, šir.spektrum soukromých firem) - Obětování sinic a řas v
Chci jít do praxe - jaké mám mít znalosti a zkušenosti Determinace Univerzita systém sinic a řas, praktické určování DP a Ph.D. Ekologie sinic a řas: kultura vs. ekosystém (nároky na světlo, teplo, vztah k živinám a znečištění, způsob přezimování a faktory způsobující rozvoj, predátoři) Kvantifikace Znalosti o produkci toxinů, slizů, odorů aj. jednotlivými zástupci a jejich účincích Výhodou řidičský průkaz
Determinace
Determinace praxe Dostupná determinační literatura = použív.v praxi - hygienici: sinice dostupné materiály v ČJ - Povodí: Susswasserflora von Mitteleurope - synonymika! Determinační kurzy www.sinice.cz www.szu.cz/voda www.czechphycology.cz Akreditace laboratoří
Ekologie - Vodní květ t sinic = sinice s aerotopy (vznášení na hladině) Optimální podmínky rozvoje: -trofizace (P) - životní strategie a ŽC (aerotopy, přezimování, reinvaze, predace) - dlouhé zdržení vody v nádrži - mechanismy proti predaci (sliz, velké kolonie, cyanotoxiny?) Komplikace - Ekosystém: nic to nežere, zastínění, snížení diverzity nádrže, bioakumulace cyanotoxinů v potravní pyramidě atd. - Rekreace: dermatotoxicita, neurotoxicita -Vodárenství: detekce a odstranění cyanotoxinů Determinace a kvantifikace: komplikovaná Centrum pro cyanobakterie a jejich toxiny
Proč jsou cyanobakterie tak úspešné? 1) Trofizace 2) Gas vezicles 65nm
Nejčastější rody sinic tvořící vodní květy Kokální: Microcystis Woronichinia Vláknité: Aphanizomenon Anabaena Planktothrix
Microcystis Rozšíření: sladké eutrofní vody celý svět (kromě pólů) výhradně plankton (pouze klidová stádia bentos) Počet druhů: svět cca 20 z toho 9 známo pouze z tropů (např. M. protocystis) některé kosmpolitní (např. M. aeruginosa, M.wesenbergii) ČR 4. (prý 10) poměrně uniformních Tvar a uspořádání buněk: kulovité buňky ve slizových koloniích Sliz: homogenní, bezbarvý, rozplývavý (M.aer.) či ohraničený (M.wes.) Velikost kolonií: mikro- i makroskopické práškovitý vodní květ Tvar kolonií: kulovité, laločnaté, děrované Rozmnožování: rozpadem kolonií Vnitřní struktury viditelné svět. mikr.: aerotopy
Určování Microcystis - molekulárně jsou všechny druhy rodu Microcystis jeden cluster - V PRAXI je lze ale dobře definovat morfologicky MORFOTOPY souvisí s nimi toxicita! Komplikace při určování:! - prokaryotní velmi staré organismy - chybí pohlavní rozmnožování - mimořádně adaptabilní některé znaky velice variabilní - různé fáze ŽC!!! NUTNÉ URČOVAT KOMBINACÍ VÍCE ZNAKŮ 1. Velikost b. 2. Tvar (forma) kolonií 3. Struktura slizu 4. Nahuštění b. v kolonii
Microcystis M. aeruginosa M. wesenbergii M. viridis M. ichtyoblabe
Kombinace znaků při určování morfotypů Microcystis A Vel. b.(um) Tvar kolonií 2 3,2 nepravidelně sférické Sliz Nahuštění b. Morfotyp/toxicita rozplývavý, nezřetelný pravidelně rovnoměrně, zprvu velice hustě SILNĚ TOXICKÝ M. ichtyoblabe B 4 7 krychlovité kopíruje okraje skupin b. nepravidelně Balíčkovité shluky TOXICKÝ M. viridis C 4 6 laločnaté, otvory rozplývavý pravidelně rovnoměrně TOXICKÝ M. aeruginosa D 5 9 laločnaté, otvory zřetelně náhodně hraničený, rozmístěné b. oddálen od b. NETOXICKÝ M. wesenbergii
Microcystis ichtyoblabe
Microcystis aeruginosa
Microcystis viridis
Microcystis wesenbergii
MORFOTYP VEL B VÝSKYT 1. M. firma >2.5 jezera sev. Evropa 2. M. natans >2.5 vzácně chladné oblasti 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. M. ichtyoblabe M. smithii M. viridis M. flos-aquae M. novacekii M. botrys M. aeruginosa M. wesenbergii >3.2 3.2-5.6 3.5-7 3.5-4.8 3-5.5 5-6 4-6 4-9 velice častý meso- až eutrofní nádrže čistá až mesotrofní jezera běžný eutrofní nádrže netvoří dominanty, sporný morfotyp tropické oblasti roztroušeně v nádržích jezerního typu běžný eutrofní nádrže běžný eutrofní nádrže V Ý Z N A M N É V P R A X I
Různé fáze životního cyklu = různá morfologie u stejného morfotypu (druhu) Microcystis
Microcystis studium faktorů pro přezimování a reinvazi v mikrokosmech
Microcystis dlouhodobá kultura ztráta GV
slizové stopky Woronichinia naegeliana
Planktothrix
A. flos-aquae Anabaena A. sigmoidea A. planctonica A. smithii
Aphanizomenon Cylindrospermopsis
Cylindrospermopsis raciborskii (WOLOZ.) SEEN.& SUBBA RAJU r. Planktothrix širší vlákna (5 µm) bez heterocytů (viz. záměny) Vlákno je zakončeno špičatým heterocytem Záměny-Planktothrix Nové určov ování
Zvyšování počtu lokalit a frekvence výskytu Cylindrospermopsis raciborskii v ČR 1979-2007 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1979 1992 1995 1996 2001 2002 2004 2005 2006 2007 počet lokalit s výskytem Cylindrospermopsis
(Roz)Šíření Cylindrospermopsis Původně pantropický druh Další nálezy i subtropy - Thajsko (Li et al. 2001) - Vietnam (Nguyen et al. 2007) - Japonsko (Chonudomkul et al. 2004) - Nový Zéland (Wood & Stirling 2003) - Kuba (Komárek & Komárková 2003) - Brazílie (Branco & Senna 1994, Souza et al. 1998, Bouvy et al. 2000, Molica et al. 2001) - Chile (Lagos 1998) - Arizona (La Bounty& Burns 2005) Evropa - 1. výskyt Řecko jezero Kastoria (Skuja 1937)
Země Invaze Cylindrospermopsis v Evropě Rok nálezu Záznam Řecko 1937 Skuja Maďarsko 1942 Szalai Rakousko 1961 Claus Ukrajina 1968 1974 Kondratjeva Aksenova Panonská oblast - ČR (střední Evropa) 1977 1979 Hamar, Schmidt Horecká a Komárek Španělsko 1980 Romo and Miracle Slovensko 1988 Hindák Německo (Brand.) 1994 Krienitz and Hedewald Francie 1997 Couté Itálie 2003 Ventura Bulharsko 2003 Stoyneva Portugalsko 2003 Saker Holandsko 2005 Mooji
Možné příčiny objevení Cylindrospermopsis v Evropě 1) Lidský faktor - Zvýšený zájem determinátorů toxicita cylindrospermopsin 2) Environmentální faktory zvyšování průměrných teplot, zatížení prostředí živinami Invaze/expanze
Terminologie Invaze - šíření druhů do oblastí, kde nejsou původní - druhy nekontrolovatelně se šířící a agresivně vytlačující původní druhy Expanze -šíření původních druhů mimo svůj dosavadní areál rozšíření Toxicita cylindrospermopsin Alkaloid Účinky: inhibice enzymů - hepatotoxicita Saxitoxiny - imunotoxicita - neurotoxicita
Centrum pro cyanobakterie a jejich toxiny BU AV ČR & MU 1. Sekce cyanotoxinů Vedoucí sekce: Doc. Mgr. Luděk Bláha, PhD. analýzy cyanotoxinů, vlivy cyanotoxinů na ostatní organismy 2. Technologická sekce Vedoucí sekce: Doc. Ing. Blahoslav Maršálek, PhD. možnosti omezení rozvoje vodních květů sinic, metody pro detekci sinic 3. Sekce autekologie a biologie sinic Vedoucí sekce: RNDr. Lenka Šejnohová, Ph.D. autekologie sinic vodních květů, determinace fytoplanktonu a fytobentosu 4. Sekce popularizace a ekologické výchovy Vedoucí sekce: Ing. Eliška Maršálková, PhD. popularizace problematiky sinic, školení a semináře pro odbornou veřejnost
Monitoring vodních květů sinic v ČR
Organizace MVKS - historie Centrum pro cyanobakterie a jejich toxiny 1. Odběr r. 1994 Doc. Ing. B.Maršálek, CSc. Determinace: J.+J. Komárkovi Finanční zázemí: Sdružení flos-aquae 2. Odběr r. 1999 Rozšíření počtu lokalit (125) a vzorků (189) Navíc analýzy Mcyst!! 3. Od 2004 každoroční monitoring
Organizace MVKS Hlavní organizátor: Centrum pro cyanobakterie a jejich toxiny Spolupracující instituce: 24 lidí (celkem 8 institucí, především Podniky Povodí, ZU Liberec) Cíle: 1a) Jaké % fytoplanktonu tvoří v ČR sinice 1b) Jaké druhy sinic VK se v ČR pravidelně vyskytují 1c) V jakých sezónách dominují VK ve fytoplanktonu 2a) Monitoring výskytu Mcyst intra/extracel. 2b) Lze odvodit asociaci výskytu Mcyst a rodu/druhu 3) Porovnání výsledků s okolními evropskými státy
Česká republika 2006 - frekvence výskytu jednotlivých skupin fytoplanktonu hnědé řasy 64,4% zelené řasy 77,5% sinice 96,8% Anabaena 42,8% Aphanisomenon 46,8% Cylindrospermopsis 2,3% Microcys tis 67,1% Planktothrix 27,9% Woronichinia 43,7% frekvence výskytu = v kolika % vzorků byly jednotlivé skupiny nalezeny
HN NH N O - CH 3 N CH 3 P O O CH 3 Toxiny sinic = cyanotoxiny (1/4) N H O O N + O - NH O CH 3 O 3 SO H 3 C H H N NH NH NH NH H OH O O OCH 3 CH3 CH3 H 3C COOH CH 3 O N NH NH O H 2C O H 3C NH CH 3 NH NH NH O O COOH O NH HN NH2 O CH 3 CH 3 produkty metabolismu sinic (cyanobakterií) způsobující jejich toxicitu velmi rozmanitá skupina látek a) chemicky (heterocyklické sloučeniny alkaloidy, peptidické látky, lipidické látky, lipopolysacharidy) b) toxikologicky (různé mechanismy účinku, různé cílové orgány ) Cyanotoxiny lze obecně rozdělit na dvě velké skupiny: 1. CYTOTOXINY jedná se o sloučeniny, které vykazují nějaký typ biologické aktivity (inhibice enzymů, buněčných procesů, antibakteriální, antivirální, protinádorová aktivita), ovšem jejich akutní toxicita pro obratlovce je nízká (detailněji se o nich dále nebudeme zmiňovat) 2. BIOTOXINY klasické cyanotoxiny, vysoce toxické pro obratlovce již v malých dávkách: microcystiny a nodulariny, cylindrospermopsiny, anatoxiny a saxitoxiny, lipopolysacharidy, aplysiatoxiny a lyngbyatoxin Určovat
Metody stanovení cyanotoxinů 1. HPLC kapalinová chromatografie (obr.) 2. ELISA imunochemická metoda 3. MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie
Typy toxických účinků: Toxiny sinic = cyanotoxiny (2/4) hepatotoxicita (poškození jater) neurotoxicita (narušení funkce nervového systému)!!! dermatotoxicita (poškození kůže) imunotoxicita (poruchy imunitního systému) embryotoxicita (narušení vývoje plodu) genotoxicita (poškození genetické infromace) dráždivé účinky (na kůži, sliznice, trávicí soustavu) Sloučeniny zodpovědné za výše zmíněné účinky nebyly v některých případech dosud identifikovány, neustále jsou objevovány: - nové metabolity sinic s biologickou aktivitou - nové toxikologické vlastnosti již známých cyanotoxinů Týmy zabývající se studiem cyanotoxinů a jejich efektů na člověka i na celý ekosystém: ČR: Centrum pro cyanobakterie a jejich toxiny (společné pracoviště BÚ AV CR a MU v Brně. Určovat
Výzkum toxických účinků cyanobakterií a jejich frakcí na Vodní fotoautotrofní organismy Vodní bezobratlé - korýše hrotnatka velká Daphnia magna -akutnía chronickéúčinky Larvy obojživelníků FETAX test embryotoxicity a teratogeneze s embryi obojživelníků drápatka vodní (Xenopus laevis) Ryby embryolarvální test u kapra obecného spolupráce s Veterinární a farmaceutickou universitou v Brně In vitro testy dvě permanentní buněčné linie
Účinky na fotoautotrofní organismy studium interakcí s cizorodými látkami, citlivosti druhů Zelené řasy (Chlorophyta) Rozsivky (Chromophyta) Skrytěnky (Cryptophyta) Sinice (Cyanophyta) Vyšší rostliny
Organismy používané pro ekotoxikologické biotesty - konzumenti Daphnia magna Hrotnatka velká Potamopyrgus antipodarum Písečník novozélandský Pakomáři rodu Chironomus Tubifex tubifex Nitěnka obecná Artemia salina Thamnocephalus platyurus Test s vajíčky obojživelníků (drápatky) Spolupráce s VFU a MZLU - experimenty s rybami Spolupráce s VFU - experimenty s ptáky
Účinky na obratlovce Úhyny ryb spojené především se snížením obsahu kyslíku Hromadné úhyny ptáků v různých částech světa spojovány s masovými rozvoji sinic nejednoznačné důkazy Většinou souhrn více faktorů paraziti, UV, sinice, patogeny oslabení populací
Bioakumulace microcystinu-lr v rybí tkáni Bioakumulace MICROCYSTINU
Biotoxiny (3/4) klasické cyanotoxiny, vysoce toxické pro obratlovce již v malých dávkách Biotoxiny lze rozdělit do pěti skupin: 1) Microcystiny a nodulariny 2) Cylindrospermopsiny 3) Anatoxiny-a, anatoxin-a(s) a saxitoxiny 4) Lyngbyatoxin a aplysiatoxiny 5) Lipopolysacharidy 1) Microcystiny a nodulariny cyklicképeptidy u obratlovců působí primárně na játra (hepatotoxicita), ale mohou poškozovat i jiné orgány (plíce, střeva, ledviny), mají genotoxické a podle nejnovějších informací rovněž neurotoxickéúčinky při chronické expozici podpora nádorového bujení (karcinogeneze) Byly prokázány u rodů: Anabaena, Anabaenopsis, Hapalosiphon, Microcystis, Nodularia, Nostoc, Oscillatoria, Planktothrix, dále některé pikoplanktonní sinice 2) Cylindrospermopsiny heterocyklickélátky poškození jater (hepatotoxicita), dále ledvin, plic, sleziny, střev, genotoxicita, pravděpodobný lidský karcinogen Byly prokázány u rodů: Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Raphidiopsis Určovat
Biotoxiny (4/4) Anatoxiny-a, anatoxin-as a saxitoxiny celkem 3 různé typy heterocyklických sloučenin, které různými způsoby narušují přenos nervových vzruchů (neurotoxicita) Byly prokázány u rodů: Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Raphidiopsis Lyngbya, Oscillatoria, Phormidium, Planktothrix Lyngbyatoxin a aplysiatoxiny heterocyklické sloučeniny, látky vyvolávající podráždění a záněty (např. kůže, dermatotoxicita) Byly prokázány u rodů: Lyngbya, Oscillatoria, Schizothrix Lipopolysacharidy látky vyvolávající záněty a podráždění (kůže, zažívacího traktu apod.) součást buněčné stěny všech sinic, o rozdílech v toxicitě mezi jednotlivými rody / druhy / kmeny není dosud příliš mnoho informací Určovat
MICROCYSTINY OCH 3 CH 3 CH 3 H 3C COOH CH 3 O N NH NH O H 2C O H 3C NH CH 3 NH NH NH O O COOH O O CH 3 CH3 NH HN NH2 cyklické peptidy, 70 forem producenti Microcystis, Planktothrix, Anabaena, Anabaenopsis, Nostoc mechanismus účinku: inhibice proteinfosfatáz PP1 a 2A - u obratlovců primárně hepatotoxicita - ovlivněny mohou být i další orgány (plíce, ledviny, imunitní systém) -chronicky promoce karcinogeneze! relativně stabilní a odolné vůči rozkladu! komplikace při výrobě pitné vody nutné nákladné technologie
MICROCYSTINY = riziko? Vyhl. 252/2004 Sb. Vyhl. 135/2004 Sb. pitná voda dermální kontakt náhodná ingesce a vdechnutí OCH 3 CH3 CH3 H 3C rekreace O NH NH COOH CH 3 O NH O CH 3 N NH HN NH2 NH O O H 2C H 3C NH NH COOH O O CH 3 CH 3 ryb y zelenina? RIZIKA SPOJENÁ S PŘÍJMEM MICROCYSTINŮ KONTAMINOVANÝMI POTRAVINAMI NEJSOU VŮBEC REGULOVÁNA
Metody hodnocení kvantity fytoplanktonu 1) Koncentrace chl-a (µg/l) ČSN ISO 10260 2) Počet buněk/ml ČSN 75 7712 TNV 75 7717 3) Objemová biomasa
1) Koncentrace chl-a Terén - sonda Fluoro-Probe celk. chl-a + rozdělení na 4sk. (Cyanophyta, Chlorophyta, Chromophyta, Cryptophyta) http://www.sinice.cz/cz/popularizacni/fluoroprobe.htm Laboratoř - extrakce ethanolem chl-a (ČSN ISO 10260) - mikrodestičky Genios výhody: malá časová náročnost, v případě sondy měření in situ+profil vodního sloupce : zachycení reálných poměrů biomas jednotlivých skupin a druhů (x b/ml) nevýhody: nevíme nic o druhovém složení (znát aspoň dominantu jednotlivých skupin? příp. toxicita) : sonda finanční náročnost : živé vzorky
2) Počet buněk/ml Průtoková cytometrie počet buněk jednotlivých tax. skupin výhoda: časová nenáročnost, přesnost, možnost zpracovat velké množství vzorků nevýhoda: finanční nedostupnost, živé vzorky, písek, kolonie Počítací komůrky Bürker Cyrus I., Cyrus II.
2a) Počet b./ml výhody/nevýhody výhoda: dostupné, finančně nenáročné, možnost fixáží nevýhoda: časová náročnost, hlavní problém taxonomicky různorodé skupiny - různé typy a velikosti stélek bičíkatci útíkají, praskají kolonie sinice bez desintegrace velká variabilita odhadu dle osoby, po desintegraci komplikace určit druh vlákna sinice svazečky, různé velikosti vláken chyba ve velikostech 5µm sinice vs. zelená koule 50 µm brána stejným počtem 1 vnitřní struktury v buňkách PROBLÉM při počítání-jiná rovina na sklíčku, koncentrování Přesný plán metodiky promyslet: (fixace), zkoncentrování, desintegrace, počítání, výpočet podle vzorce
2b) Počet b./ml fixace 1 Lugolův roztok 10 g jodidu draselného se rozpustí ve 20 ml vody, přidá se 5 g krystalického jodu a smíchá se s 50 ml 10% kyseliny octové. Po promíchání se nechá 1 den ustát. výhoda: - fixace rozsivek fytobentos, šupinaté chrysomonády pro TEM - fixace VK při koncentraci lze využít centrifugaci (TNV 75 7717) nevýhoda: - sinice (fotografování změna barvy, zakrytí fotosyntetických barviv nemožnost použít fluorescenci!!-problém pikocyanobakterie)
2b) Počet b./ml fixace 2 Formaldehyd výsledná koncentrace ve vzorku 1,5-2% výhoda: - zachování fluorescence, fotografování (ale je krátkodobé!) nevýhoda: -VK při koncentraci se musí využít vakuová filtrace -vyblednutívzorku během krátkého časového intervalu-fluroscence nefunkční - rozsivky a šupinaté chrysomonády porušení struktur SiO2 - citlivé buňky praskají (skrytěnky, vacuolarie atd.)
2b) Počet b./ml fixace shrnutí 1) Je-li možnost zpracovat vzorek živý (lednice uchování cca max. týden-vk ale jen den!, uvést do protokolu) 2) Fixace zvážit účel analýzy a hustotu vzorku jaké tax. skupiny jsou ve vzorku mám možnost použít fluorescenci? (formaldehyd sinice VK; Lugol rozs., chrysomonády, citlivý bičíkatci) 3) Je-li možnost: vzorek fixovat dvojmo obě metody fixace (ale problém místa, peněz za fixáže/vzorkovnice, čas zpracování )
2c) Počet b./ml -zkoncentrovánívzorku KDY? - počet b. < 50tis.b/ml PROČ? - bez zkoncentrování nezaznamenáme některé zástupce, které se pak mohou rozvinout v dominantu.. CO VĚDĚT PŘEDEM? - Přibližné SLOŽENÍ, abychom neeliminovali některé skupiny zvolenou metodikou JAK? - centrifugace - vakuová filtrace
Centrifugace Vakuová filtrace
2e) Počet b./ml Vlastní počítání Bičíkatci např. skrytěnky v živém vzorku: projetí celého Burkra před zahajením počítání ostatních skupin Vlákna a svazečky vláken: - dle ČSN délka vláken/5 = počet buněk Kolonie - desintegrace Doporučení fluroscence - výskyt pikocyanobakterií norma ČSN: Stanovení pikoplanktonu je orientační - po desintegraci Microcystis
2f) Počet b./ml Vzorec Burker b./ml Počítáme buňky uvnitř čtverce a ty, které leží nebo se dotýkají 2 zvolených stran (obvykle se volí horní a pravá str.) VZOREC počet buněk v 50ti čtvercích * 5 000 = b/ml (pravidlo - spočítat min. 400b. jinak počítat dál a pak např. 100čtverců * 2 500 = b/ml - nezapomenout na vydělení při metodách zkoncentrování) doporučení: vytvoření vzorce v Excelu pak jen vkládání počtu buněk jednotlivých druhů nutné mít tlusté krycí sklo (užší sklíčko podhodnocení cca na 80%)
3) Objemová biomasa (biovolume) Manuální výpočet (počet b. x objem) Program - Fyto-N (JU, České Budějovice) výhody: zachycení reálných poměrů biomas jednotlivých skupin a druhů (x b/ml) nevýhody: časová náročnost program Fyto-N OK
ÚČEL METODIKA - ČAS Jednorázová univerzální metoda použitelná v každý čas na každém místě prakticky neexistuje CO TEDY? Pravidla 1) Použít během 1 projektu příp. u projektů, budeme co budememe srovnávat výsledky, 1 metodiku 2) V současnosti norma OK chlorofyl-a počet b./ml (biovolume ale přesnější sinice/řasy vel.b ) Vždy zvážit základní otázku: Účel projektu - je nutná detailní kvantitativní analýza? fytoplankton s VK nutné 2x počítání - před a po desintegraci..
Praxe na BU AVČR Brno Hodnocení kvantity fytoplanktonu: Monitoring: Sonda Fluoro-Probe kombinace s počtem b/ml Věděcky zaměřené projekty: Fluoro-Probe s biovolume (objemová biomasa) Počítání buněk/ml - Burker, většinou využití vakuové filtrace (VK) s celulozním filtrem 0.2um, desintegrace ultrazvukem, biovolume využití programu FYTOn
Problémy spojené s kvantifikací rodu Microcystis (b/ml) 1) AEROTOPY vznášení při zahušťování a při počítání v komůrce 2) VELKÉ KOLONIE buňky se navzájem překrývají PODHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ
Aerotopy? = paralelní sdružení proteinových měchýřků (gas vezicles=gv), které jsou naplněné směsí vzduchu AEROTOPY Syntéza: - závislá na okolních podmínkách -u Microcystis v sedimentech rapidní snížení jejich množství Funkce: vznášení ve vodním sloupci a na hladině konkurenční boj o světlo s ostatními fotosyntet. organismy 65nm PLYNOVÉ MĚCHÝŘKY
Centrifugace Vakuová filtrace
Injekční stříkačka s KOH - rychlá, levná úplná desintegrace kolonií Microcystis se současnou destrukcí aerotopů
Modelový příklad Jarní vzorek fytoplaktonu - eutrofní nádrž pod 50tis.b/ml -předpokládáme výskyt sinic VK A) 1) vakuová filtrace (např. 50ml-100ml na 5ml-10ml do zkumavky) 2) 0,5ml prohlédnout druhové složení výskyt Microcystis -%odhad morfotypů 3) 0,5ml Burker spočítat ostatní druhy než Microcystis (vlákna změření délek) 4) 2ml desintegrace vzorku (ultrazvuk, stříkačka) 4) spočítání desintegrovaných buněk Microcystis (urychlí se fluorescencí, neplavou mají popraskané GV) 5) dosazení do vzorce (nezapomenout na vydělení při zkoncentrování!) B) 1) fixace lugologým roztokem (pozor znemožníme si počítání buněk Microcystis pomocí fluorescence po desintegraci; při přefixování nelze použít ultrazvuk na desintegraci kolonií) 2) centrifugace 10ml 2x na 1ml 3) dále se pokračuje bodem 3) jako v předchozím případě Vždy nutné!!! použitou metodiku zanést do protokolu!!!!
Bioindikace a monitoring ekologického stavu povrchových vod Princip bioindikace - sledování kvality (druhové složení, diverzita), kvantity, deformací, fyziologických, biochemických změn bioty jedinec, populace: Fytoplankton Fytobentos Makrofyta Zooplankton Zoobentos Ryby Výhody bioindikace (x chemicko-fyzikální parametry) - odraz dlouhodobějšího stavu lokality (365dní, 24h denně) -záznam impaktů interakcí faktorů ( např. polutantů)
Bioindikace PovVod v ČR a EU dnes Rámcová směrnice WFD EU 2000 (Water Framework Directive) cíl: dosažení dobrého ekologického stavu všech vodních útvarů (3 markery sledování: biologické, hydromorfologické, chemicko-fyzikální parametry) ČR projekt ARROW - Akční plán MŽP - implementace WFD Výzkumný a vodohospodářský ústav (VUV) vytvoření metodik: odběrů a zpracování dat výběr referenčních lokalit sledování a hodnocení stavu Tradice makroozoobentos Fytoplankton, fytobentos -pracnáimplementace v ČR (determinace - zkušenosti)
Fytoplankton, fytobentos -implemetacewfd v ČR Metodiky Marvan, Kozáková (2006): Metodika odběru a zpracování fytobentosu stojatých vod. VUV, TGM. Marvan, Heteša (2006): Metodika odběru a zpracování fytobentosu stojatých vod. VUV, TGM. Komárková (2006): Metodika odběru a zpracování fytoplanktonu stojatých vod. VUV, TGM. Marvan, Heteša (2006): Metodika odběru a zpracování fytoplanktonu tekoucích vod. VUV, TGM. Výběr a charakterizace referenčních lokalit Revize indikačních seznamů (synonymika úú) Podklad saprobitní index - Sládečkovi 1996, 1997 indexy Situační monitoring Povodí, VUV Hodnocení: software Omnidia (Francie)? různé trofie, saprobity, salinity, kyslíku, ph, diverzity (ČR: SLA, ± ROTTův index Tr. Sap. Rakousko)!!! Typologie toků (podloží, n.m.v.)
Bioindikace - fytoplankton Tekoucí vody -omezení: pouze dolnítoky řek s omezeným uplatněním fytobentosu a ve výjimečných případech (ovlivnění toku stojatými vodami) Stojaté vody - kvalitativní a kvantitativní rozbor
Bioindikace - fytobentos Tekoucí voda -větší výpovědní hodnota než fytoplankton Stojaté vody kombinace s fytoplanktonem - využití při algicidních zásazích k hodnocení změn ekologického stavu nádrže
Jaderná elektrárna Dukovany - biofilmy Zelené vláknité řasy (Cladophora, Microspora) přirůstající na podklad, tvoří velké biomasy, na povrchu stélek epifytické rozsivky rodů Cocconeis, Fragilaria, Rhoicosphaenia, Gophonema
Bioindikace fytobentos - rozbory hodnocení Pleurosira laevis indikace zvýšené salinity
Program Omnidia hodnocení kvality vody rozsivky
Lokalita se zvýšenou trofií a saprobitou - hodnocení Omnidia povlaky sinic ř. Chroococcales, Oscillatoriales Navicula goepertiana indikátor zvýšené trofie i saprobity
Van Dam 1994 ph Catégories ph requirements Trophic state Oxygen requirements 1 acidobiontic ph optimum <5,5 1 oligotroaphentic 1 continuously high (100% sat.) 2 acidophilic ph optimum 5,5<pH<7 2 oligo-mésotraphentic 2 fairly high (>75% sat.) 3 neutrophile ph optimum about 7 3 mésotraphentic 3 moderate (>50% sat.) 4 alkaliphilous mainly occurring at ph >7 4 méso - eutroaphentic 4 Low (above 30% sat.) 5 alkalibiontic exclusively occurring at ph >7 5 eutraphentic 5 very low (about 10% sat.) 6 indifférent No apparent optimum 6 hypereutraphentic 7 indifférent Salinity Cl- (mgl-1) Salinity( ) N-Hétérotrophy ([N] orga.) MOISTURE 1 fresh <100 <0,2 1 Sensitive N-autotrophic 1 Strictly aquatic 2 fresh brackish <500 <0,9 2 Tolerant N-heterotrophic 2 mainly occurring in water bodies 3 brackish fresh 500-1000 0,9-1,8 3 Facultative N-heterotrophic 3 regularly on wet and moist places 4 brckish 1000-5000 1,8-9,0 4 Obligately N-heterotrophic 4 moist or temporarely y dry places Saprobity Oxyg. sat.(%) BOD 5 (mgl-1) 1 oligosaprobous >85 <2 2 ß-mésosaprobous 70-85 2-4 3 alpha-mésosaprobous 25-70 4-13 4 alpha-méso - polysaprobous 10-25 13-22 5 polysaprobous <10 >22 diatoms from the Netherlands. Netherl. J.Aquat. Ecol. Van DAM, H., A. MERTENS & J. SINKELDAM (1994 A coded checklist and ecological indicator values of freshwa 28(1):117-133
Index trofie ROTTův (st.0,3-3,9) oblast v grafu 2,8 3,3 eutrofie 3,4 Trofie ROTTtr. 3,3 3,2 Index trofie 3,1 3 2,9 2,8 2,7 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 směr hypertrofie vzorky
saprobní index Saprobní index - Sládečkův (0-4) a ROTTův (1-3,8) 3 2,8 2,6 2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Saprobita červená linie hranice α-meso-poly-saprobie (Van Dam) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 SLA - index ROTTsp - index vzorky
Index kyslíku a salinity Van Dam (1994) 5 Indexy kyslíku low 30% sat. index kyslíku 4 3 2 fairly hight 75%sat. moderate 50% sat. 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 vzorky Index salinity Salinity Cl- (mgl-1) Salinity( ) 1 fresh <100 <0,2 2 fresh brackish <500 <0,9 3 brackish fresh 500-1000 0,9-1,8 4 brckish 1000-5000 1,8-9,0
Podobnost druhového složení rozsivek -0.6 0.8 EDU 0CHV EDU 7CHV CPED MVAR RABB DVUL NCAP GAFF Hodonin CTUM FVIR NTRY FFAS NSIG AGRA GPAR DTEN NDIS HAMP CPLA ACOA NVEN NCON FARC NPSE ALIB NGRA NDIS NMUT NTRI APED NFON FULN CMIN TABE NAMP Detmarovice PGIB NCOM AAMB NCOM ALAN NSTR Tisova NPAL SBRE Prunerov II Temelin Melnik AVEN Pocerady Prunerov I Tusimice NGOE Chvaletice Porici Ledvice ELE Ledvice c. 4 Vítkovice -0.8 1.0
Ekotoxikologické biotesty Ekotoxikologie interdisciplinární vědní obor kombinující poznatky: ekosystémy a interakce chemických látek Ekologie Toxikologie Cíl: poznání interakcí mezi živými organismy a chemickými/toxickými látkami v prostředí na všech úrovních (molekula populace)
Koncept ekotoxikologie Interakce TOXICKÁ L./ŽIVÝ SYSTÉM - Vstupuje do prostředí - Specifická distribuce (voda x vzduch x půda x organismy) - Specifický osud (reaktivita x transformace x (bio)degrace vznik nových látek) INTERAKCE ŽIVÝ SYSTÉM - ne všechny l. jsou organismům dostupné vazby na složky v prostředí, nerozpustnost -některé l. se mohou v org. kumulovat Expozice = míra kontaktu LÁTKA/ŽIVÝ ORG. (dávka, délka, doba jednorázová, opakovaná, dlouhodobá)
Koncept ekotoxikologie Interakce TOXICKÁ L./ŽIVÝ SYSTÉM Chem.l. studium toxicity 1) In vitro biochemické studie, univerzální pro všechny organismy (př. mutagen) 2) Testy toxicity s jednotlivými organismy - poznání efektů na různých trofických úrovních - akutní toxicita - chronická toxicita: reprodukční toxicita, imunotoxicita 3) Ekotoxikologie Producenti populací, společenstev sinice, řasy, VR Konzumenti Destruenti
Producenti Toxicita na producenty má zásadní vliv na celý ekosystém Akutní efekty - inhibice fotosyntézy -letalita Výsledek - ztráta citlivých druhů - snížení diverzity - likvidace producentů kolaps ekosystému
Toxická látka Paracelsus (± 1500n.l.) All substanses are poisons, only the dose makes a distinction between one which is a poison and one which is a remedy Toxikant - není přírodního původu Toxin - látky přírodního původu Producenti používané v testech: Scenedesmus Raphidocelis Chlorella Microcystis
(no observed effect concentration) Křivka dávka - odpověď (lowest observed effect concentration) 100 Letální účinky 90 LOEC 80 NOEC 70 LC 60 50 40 30 Odhad 20 10 EC50 Ne 0 toxické 0,1 1 10 100 1000 10000 Logaritmické měřítko Křivka sigmoidní tvar EC50 - koncentrace, která způsobí úč (snížená reprodukce, růst atd.) u 50% testovacích organismů,
Vypočítané parametry EC 50 : účinná koncentrace způsobující 50% odpověď v testovací populaci. Účinná koncentrace, mg/l, ml/l LD50: dávka způsobující 50% letalitu v testovací populaci.
Determinační pomůcky a kurzy CCT www.sinice.cz 1) Pomůcky - Interaktivní klíč k určování vodních květů sinic (CD (Šejnohová et. al., 2005 - Atlas fytobentosu (CD 2008) 2) Kurzy & konference - Konference Cyanobakterie 2004, 2006, 2008 - Determinační semináře CCT pátky 1x měsíčně www.fytobentos.sinice.cz/schuzky_prihlaska.htm - Determinační kurzy fytobentos, fytoplankton ve spolupráci SZU Praha - Determinační kurz Fytobentos : 20.-22.4.2009 - www.fytobentos.sinice.cz
Kontakty lenka.sejnohova@ibot.cas.cz www.sinice.cz www.fytobentos.sinice.cz www.recetox.cz www.sejnohova.cz
Děkuji Vám za pozornost