Stanovení sinic (revize ČSN ) a chlorofylu

Transkript

1 Stanovení sinic (revize ČSN ) a chlorofylu Seminář Laboratorní metody, vzorkování a způsoby hodnocení povrchových vod ke koupání Výzkumný vodohospodářský T.G.M., v.v.i., Petr Pumann Seminář je výstupem projektu Technologické agentury ČR Nové metodické přístupy pro kontrolu a hodnocení povrchových vod ke koupání ; evidenční č. TA

2 ČSN kokální sinice?

3 ČSN vláknité sinice

4 Dezintegrace některých taxonů

5 Dezintegrace ČSN z roku 2008 obsahovala 4 způsoby dezintegrace: 1) automatickou pipetou, 2) injekční stříkačkou s tupou jehlou 3) homogenizátorem Potter-Evehjem, 4) ultrazvukovým homogenizátorem

6 Dezintegrace MPZ pomůcky k dezintegraci rok počet účastníků bez dezintegrace stříkačka (obvykle s KOH) ultrazvuk jen KOH automatická pipeta

7 Dezintegrace Revize ČSN z roku 2013 obsahuje již jen 2 způsoby dezintegrace: 1) injekční stříkačkou s tupou jehlou 2) ultrazvukovým homogenizátorem

8

9

10 volné buňky / ml volné buňky / ml Dezintegrace po přidání zásaditého skleněná stříkačka s tupou jehlou Lugolova roztoku Funguje na obtížně dezintegrovatelné taxony (počítání až druhý den po přidání zásaditého Lugolova roztoku). M. viridis: počet nátahů do stříkačky ultrazvukový homogenizátor čas dezintegrace (min) kyselý lugol zásaditý lugol kyselý lugol zásaditý lugol

11 Zahušťování zahustit odstředěním každý vzorek z 10 na 0,2 ml v praxi zažitý postup alternativně filtrace (aparatura Petra Marvana) významné ztráty (i vzorků fixovaných Lugolem) výtěžnost SZÚ obvykle mezi %

12 buňky/ml buňky/ml buňky/ml buňky/ml Zahušťování vzorku s Microcystis během mezilaboratorních zkoušek SZÚ v letech (modré jednotliví účastníci, růžová medián) ano ne 0 ano ne ano ne 0 ano ne

13 Změna v revizi ČSN odstraněno Limni jako výrobce aparatury odstřeďování prodloužen čas z 10 na 15 minut a zvýšena odstředivá síla ze 700 na g pečlivě vyvažovat! přednostně nezahušťovat

14 Neukázněné chování Planktothrix v komůrce

15 Neukázněné chování Planktothrix v komůrce pásy s výrazně vyšší hustotou vláken než na zbytku komůrky A B

16 Planktothrix v revizi 2013 POZNÁMKA Při dominanci vláknitých sinic (především Planktothrix agardhii) se poměrně často stává, že jsou vlákna na mřížce komůrky rozmístěna velmi nerovnoměrně. V těchto případech se vyskytují oblasti (pásy) s výrazně větší hustotou vláken než v ostatních částech komůrky. V takovém případě je nutné komůrku naplnit znovu. Tento jev se vyskytuje častěji, pokud je kapka vzorku na mřížce komůrky přikryta krycím sklem s časovým odstupem (deset sekund a déle). Proto je vhodné přikrýt kapku krycím sklem co nejrychleji (během několika sekund).

17 Objemová biomasa podle vyhlášky č. 238/2011 Sb. je nutno stanovit objemovou biomasu v případech kdy dominují tenké vláknité sinice do přílohy A.3 revidované normy vložena tabulka se šířkou vláken (na horní hranici uváděné velikosti) pro případ, že není dostatek času proměřovat nebo laboratoř není technicky vybavena na ke stažení soubor ve formátu MS Excel na přepočet objemové biomasy sinic

18 Taxonomická revize rodů Anabaena a Aphanizomenon

19 Informativní příloha F Původní jméno Anabaena mendotae Anabaena affinis Anabaena bergii Anabaena circinalis Anabaena compacta Anabaena crassa Anabaena curva Anabaena danica Anabaena flos-aquae Anabaena lemmermannii Anabaena mucosa Anabaena planctonica Anabaena reniformis Anabaena sigmoidea Anabaena smithii Anabaena spiroides Nové jméno Dolichospermum mendotae Dolichospermum affine Chrysosporum bergii Dolichospermum circinale Dolichospermum compactum Dolichospermum crassum Dolichospermum curvum Dolichospermum danicum Dolichospermum flos-aquae Dolichospermum lemmermannii Dolichospermum mucosum Dolichospermum planctonicum Sphaerospermopsis reniformis Dolichospermum sigmoideum Dolichospermum smithii Dolichospermum spiroides

20 Stanovení chlorofylu-a

21 Chlorofyl-a ve vodním prostředí přítomen v řasách, sinicích, ale i v makrofytech údaj o jeho koncentraci se využívá jako míra pro množství přítomného fytoplanktonu různé metody stanovení spektrofotometricky po extrakci (různými činidly - etanol, aceton, metanol) spektrofotometricky in vivo in-situ fluorescenční sondy HPLC v provozní praxi především ČSN ISO Jakost vod Měření biochemických ukazatelů Spektrofotometrické stanovení koncentrace chlorofylu-a rutinně v několika desítkách laboratoří (podniky povodí, y, některé vodárny a jiné provozní laboratoře)

22 Postup filtrace (obvykle 0,1-2 litry vzorku) skleněná vlákna, záchyt nad 1µm extrakce v 90% etanolu filtr roztřepat vodní lázeň při 75 C po dobu 5 min (varianta B) vyčištění extraktu centrifugace nebo filtrace měření při 665 a 750 nm měření při 665 a 750 nm po okyselení HCl (korekce na feopigmenty) výpočet (výsledky v µg/l) dle známých vlastností chlorofylu-a Vhodnou volbou objemu vzorku, etanolu a optické dráhy kyvety lze měřit chl-a v různých koncentračních úrovních

23 Výsledky MPZ

24 Voda ve filtrech norma uvádí, že se filtr vysuší sáním, ale to si každý může představovat jinak typ filtru WHATMAN GF/B průměr 47mm WHATMAN GF/C průměr 47mm hmotnost vody ve filtru 1,33 g 0,56 g procento zbytkové vody na celkovém objemu extraktu při 10 ml extraktu při 20 ml extraktu při 25 ml extraktu 11,8 % 5,3 % 6,2 % 2,7 % 5,1 % 2,2 % zbytková voda ve filtru znamená podhodnocení výsledku (netýká se extrakční varianty A) podhodnocují všichni (vždy nějaká voda zůstane) nižší koncentrace etanolu v extr. činidle než 90%

25 A665 na 1 cm dráhy kyvety Nedokonalá extrakce (nezamýšlený experiment při zácviku nové pracovnice) 0,2 1. měření 0,15 0,1 0,05 0

26 A665 na 1 cm dráhy kyvety Nedokonalá extrakce (nezamýšlený experiment při zácviku nové pracovnice) 0,2 0,15 1. měření opakování 0,1 0,05 0

27 chl-a (feopigmenty) µg/l chl-a (feop chl-a (f 20 Doba extrakce v plastových 10 6, ,9 falkonkách (příklad zelené řasy) min 15 min 5 min 5 min 47,7 49,0 15 min délka extrakce 5 v min; lázni druhý den 50 48,2 délka extrakce v lázni chlorofyl-a feopigmenty chlorofyl-a feopigmenty 40 8,4 8,4 7, ,9 8,4 7,8 0 5 min 15 min 5 min; druhý den délka extrakce v lázni chlorofyl-a feopigmenty Budou se stejně chovat i jiné organismy (např. velké kolonie sinic)?

28 teplota extraktu ( C) Extrakce vliv extrakční nádoby plast čas (minuty)

29 teplota extraktu ( C) Extrakce vliv extrakční nádoby čas (minuty) plast sklo

30 přepočítaní absorbance při 665 nm přepočítaní absorbance při 665 nm přepočítaní absorbance při 665 nm přepočítaní absorbance při 665 nm MPZ chlorofyl-a (čas extrakce) - vzorek 3A 10 9,8 9,6 9,4 9,2 9 8,8 8,6 8,4 8, čas extrakce v hodinách 2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 MPZ chlorofyl-a (čas extrakce) - vzorek 3B čas extrakce v hodinách MPZ chlorofyl-a (čas extrakce) - vzorek 3A MPZ chlorofyl-a (čas extrakce) - vzorek 3B 1,7 8 1,6 7,8 7,6 1,5 7,4 7,2 1,4 7 1,3 6,8 6,6 1,2 6,4 6,2 1, čas extrakce v hodinách čas extrakce v hodinách doba extrakce v MPZ 2012 a 2013

31 přepočítaní absorbance při 665 nm MPZ chlorofyl-a (čas extrakce) - vzorek 3A 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1, čas extrakce v hodinách doba extrakce v MPZ 2013

32 Skladování extraktu

33 Okyselování extraktu Zkoušeno na extraktu s absorbancí při 665 nm 0,125 / 1 cm optické dráhy kyvety

34 Stanovení sinic a chlorofylu-a pomocí alternativních metod Fluorometrie, HPLC Srovnání klasického stanovení chl-a (SZU) a pomocí Fluoroprobe (CCT) Microcystis vláknité sinice Aphanizomenon flos-aquae