Ontogenetický původ chrupavčitých a kostěných elementů lebky obratlovců

UNI V E R Z I T A K A R L O V A V PR A Z E PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA K atedra zoologie Ontogenetický původ chrupavčitých a kostěných elementů lebky obratlovců BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Lenka Fialová Vedoucí práce: Mgr. Robert Černý, Ph.D. Praha 2009

Prohlášení Prohlašuji, že jsem balalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením Mgr. Roberta Černého, Ph.D. a s použitím citované literatury. V Praze dne 30.4.2009...

Poděkování Chtěla bych poděkovat mému školiteli, Mgr. Robertu Černému, Ph.D. za jeho čas věnovaný konzultacím ohledně mé bakalářské práce, hodnotné rady a připomínky a podporu při jejím zpracovávání. Dále chci vyjádřit velký dík svým rodičům a prarodičům za jejich podporu během mého studia.

Obsah Obsah Obsah... 1 Abstrakt... 2 1. Úvod... 3 2. Neurální lišta... 4 2.1. Embryonální vznik... 4 2.2. Migrace... 5 2.3. Deriváty...7 3. Metody studia osudu buněk... 10 4. Hlava obratlovce... 15 5. Dosavadní poznatky o embryonálním původu lebky obratlovců... 19 5.1. Ryby... 19 5.2. Plazi...20 5.3. Ptáci...20 5.4. Savci... 22 5.5. Obojživelníci... 23 6. Problém homologií... 24 7. Závěr... 25 8. Seznam citované literatury... 26 8.1. Přímé citace... 26 8.2. Nepřímé citace... 28 1

Abstrakt Abstrakt Přestože je ontogenetický původ hlavy obratlovců v mnoha aspektech již dobře znám, výsledky některých studií se stále liší. Během embryonálního vývoje vznikají kosti lebky obratlovců buď z mezodermu, nebo z buněk tzv. neurální lišty. Neurální lišta představuje klíčovou inovaci obratlovců, která poskytuje zdroj buněk pro celou oblast tzv. nové hlavy. Buňky neurální lišty vznikají v průběhu neurulace na dorzální straně nervové trubice a během dalšího vývoje hlavy migrují u všech skupin obratlovců ventrálním směrem jako tři buněčné proudy. Z neurální lišty vzniká celé viscerokranium, ale také přední část klenby a báze lebeční. Nejspornější je však embryonální vznik zadní části klenby lebeční (hlavně co se týče kostí frontale a parietale), kde se liší výsledky studií mezi modelovými skupinami obratlovců. Zásadní význam pro vyjasnění těchto problémů má správné určení homologií kostí. Osud buněk neurální lišty (tzv. fate mapping), můžeme dnes studovat pomocí několika alternativních metod, z nichž každá má své klady a zápory a hodí se na jiný typ pokusu. Jednou z nejlepších metod je tzv. orthotopická transplantace, kdy tkáň příjemce je nahrazena identickou tkání z dárcovského organismu. V mé diplomové práci budu provádět transplantace buněk neurální lišty z transgenního, GFP exprimujícího embrya axolotla (A. mexicanum) do embrya axolotla normálního, a GFP v dárcovských buňkách neurální lišty mi tudíž umožní sledovat osud těchto buněk v průběhu embryonálního i larválního vývoje. Abstract Despite the embryonic development of the vertebrate head is well known in many aspects, there are still some disagreements in the results of different studies. Skull bones can arise either from mesoderm or neural crest during the embryonic development. The neural crest represents a crucial novelty of vertebrates as it provides a source of cells for the new head. It originates within the neurulation on the dorsal site of the neural tube. During the ontogenesis of the head, the neural crest cells migrate ventrally forming three main streams, which represent a conservative feature of all vertebrates. Neural crest cells contribute into many tissues and organs in the vertebrate body. Regarding head, all the viscerocranium and the frontal part of skull vault as well as the skull base certainly originate in the neural crest. The most controversial issue is the embryonic origin of the posterior part of cranial skull vault (mainly regarding frontal and parietal bones), where the results of studies differ among model species and even among one species studied by different laboratories. Crucial importance for clarification of these problems is in correct assessment of bone homologies. Currently, there are many methods for studying the fate of cells (fate mapping approach), especially the neural crest cells, each one has its advantages and disadvantages and fits for different experiment. One of the best methods is the orthotopic transplantation of a fragment of tissue from donor to an acceptor organism. In my next study I will transplant neural crest cells from transgenic, GFP expressing axolotl embryo (Ambystoma mexicanum) into the wild one. Thanks to GFP in the donor neural crest cells I ll be able to trace the fate of these cells during embryonic and larval development of the embryo. Klíčová slova: Ambystoma mexicanum, klenba lebeční, mezoderm, neurální lišta, neurokranium, obratlovci, viscerokranium, 2

Úvod 1. Úvod Studium embryonálního původu hlavových elementů obratlovců má velký význam z mnoha různých důvodů. Jak bude vidět z dalších kapitol, porovnáváním původu kostí lebky různých obratlovců bychom se mohli dozvídat stále více informací o jejich evoluční historii. Během evoluce obratlovců se jejich lebka razantně měnila - z rybí lebky obsahující spoustu drobných kostí až k lebce ptačí, která vykazuje velice malý počet odlišitelných kostí. Změny lebky souvisely se způsobem pohybu, potravními strategiemi, expanzí mozku atd. Dalšími obory, pro které je studium hlavy obratlovců důležité, jsou vývojová biologie a její klinická aplikace. Pokud bychom mluvili o člověku, pak studium vývoje lebky savců (v dnešní době hlavně myši) můžeme v budoucnu využít v biologii člověka, např. v embryologii a teratologii. Dnes se již studují vlivy různých genů na vývoj a migraci neurální lišty, která je jedním z hlavních zdrojů materiálu pro lebku. Můžeme doufat, že díky tomu budeme jednou schopni předejít některým vrozeným vývojovým poruchám člověka nebo je alespoň částečně upravovat či kompenzovat již v embryonálním stavu. V této práci chci shrnout dosavadní poznatky o embryonálním původu hlavových elementů napříč obratlovci. Jak víme, lebka obratlovce může být rozdělena na několik částí podle ontogeneticého původu nebo způsobu osifikace kostí. Dnes již je známo, že celá obratlovčí lebka je tvořena buňkami pocházejícími ze tří zdrojů. Z mezodermu, který můžeme rozdělit na paraxiální hlavový a dále trupový, který tvoří somity. Tento poznatek je již dlouho znám a nejsou okolo něj větší rozpory. Nejzajímavějším poznatkem je však to, že velkou část lebky (rozsahem lišícím se mezi jednotlivými druhy obratlovců) tvoří buňky původem z neurální lišty. Neurální lišta je subpopulace vysoce migratorních mezenchymových buněk přispívající, kromě kostí lebky, do mnoha struktur v těle obratlovce. Díky neurální liště, klíčové inovaci obratlovců, která vytvořila novou hlavu (viz kapitola 4), mohl být tento taxon tolik úspěšný a vyvinulo se v jeho rámci tolik nových, naprosto mezi sebou odlišných forem. Proto se v této práci budu věnovat ve velkém rozsahu neurální liště. Má bakalářská práce slouží jako předstupeň ke zpracování diplomové práce, kde se zaměřím převážně na neurální lištu a její deriváty v rámci hlavy u axolotla Ambystoma mexicanum (Shaw, 1789). 3

Neurální lišta 2. Neurální lišta Neurální lišta je embryonální struktura, kterou představují extenzivně migrující mezenchymové buňky, které v sobě nesou veliký potenciál diferencovat se do obrovského množství buněčných derivátů (Hall, 1999). Neurální lišta byla nalezena výhradně u obratlovců a je proto považována za jejich evoluční novinku (jeden z jejich apomorfních znaků) (Roček, 2002; Hall, 2005). Migrující buňky podobné buňkám neurální lišty byly objeveny v raném ontogenetickém vývoji ještě u pláštěnců (Ecteinascidia turbinata a několik dalších), ale tyto struktury nelze označit za pravou neurální lištu (Jeffery, Strickler and Yamamoto, 2004). Jak velkou výhodu obratlovcům neurální lišta poskytuje je vidět například i na počtu buněčných typů. Ostatní organismy jich mají několik, nejvýš několik málo desítek, kdežto obratlovec má obrovské množství buněčncýh typů (Hall, 1999). Neurální lišta tedy zřejmě nabízí obrovský evoluční potenciál, což také dokazuje tvarová i funkční diverzita všech obratlovců. U obratlovců může být neurální lišta považována, kromě ektodermu, entodermu a mezodermu, za čtvrtý zárodečný list (Hall, 1999, 2000). Proto všichni čelistnatci (obratlovci s čelistmi) dále spolu s mihulemi a sliznatkami (tyto tři systematické skupiny tvoří dohromady skupinu Craniata) mohou být nazýváni kvadroblastickými živočichy (Hall, 2000). Tak jako ostatní zárodečné listy přispívá neurální lišta do celé škály adultních struktur v těle obratlovce (viz níže). Neurální lišta byla poprvé identifikována u kuřecího embrya Švýcarským embryologem W. Hisem v roce 1868. V roce 1874 ji stejný vědec označil jako zárodečný region, ze kterého vznikají orgány. Neurální lišta byla nejdříve považována za zdroj pouze pro hlavová a spinální ganglia a pro neurony. V 90. letech 19. století ji Julia Platt označila za zdroj materiálu pro chrupavky viscerokrania a dentin zubů u Nectura. Ačkoliv ji někteří vědci podpořili, tato teorie nebyla uznávána až do 50. let 19. století, kdy ji obnovili vědci Hörstadius, Sellman a de Beer. Poté již byly objevovány další a další její deriváty. (Hall, 1999) 2.1. Embryonální vznik Neurální lišta se zakládá na dorzální straně těla embrya ve velmi raném stadiu ontogenetického vývoje, nazývaném neurula. Proces, při kterém vzniká neurální trubice i neurální lišta, nazýváme neurulace (Obr. 1). Ta část embryonálního dorzálního ektodermu, která se podílí na neurulaci, se nazývá ektoderm neurální, všechen ostatní ektoderm pak 4

Neurální lišta můžeme označit za epiteliální (non-neurální). Neurální ektoderm během neurulace nejprve vytváří neurální ploténku, jejíž hranice se průběžně zvedají do takzvaných neurálních valů. Ty se k sobě postupně přibližují a uzavírají pod sebou nervovou trubici. Po uzavření tvoří dorzální stranu nervové trubice buňky, které dříve tvořily vrcholy neurálních valů. Poté již z dorzální a částečně i laterální části nervové trubice vznikají buňky neurální lišty (podstoupí změnu z epiteliálních na mezenchymové buňky), které později migrují ventrálně podle evolučně velmi stabilního vzoru. (Baker, 2008) Nejprve začnou migrovat buňky na přední, až poté na zadní straně embrya (tzv. rostrokaudální vlna). Obr. 1. Schéma neurulace, příčný řez dorzální stranou embrya (a) Diferenciace neurálního a epiteliálního ektodermu, tvorba neurální ploténky. (b) Postupné zvedání a přibliřování neurálních valů. (c) Uzavření neurální trubice a první migrace buněk neurální lišty. Struna hřbetní leží těsně pod neurální trubicí. Převzato a upraveno podle Baker (2008) 2.2. Migrace Buňky hlavové neurální lišty migrují ve třech základních proudech. Rostrální proud nazýváme trigeminální (čelistní), prostřední proud je hyoidní (jazylkový * ) a zadní proud je * Český ekvivalent slova hyoidní je odvozen od kosti jazylkové os hyoideum. Tu však mají pouze tetrapodi, kdežto hyoidní proud mají všichni obratlovci. Z toho důvodu je spojení jazylkový proud nevhodné. 5

Neurální lišta branchiální (žaberní). Buňky trigeminálního proudu migrují z oblasti zadní části embryonálního předního mozku (prosencephala), mozku středního (mesencephala) a prvních dvou rhombomer (r) mozku zadního (rhombencephala) (Černý et al., 2004; Lumsden et al., 1991). Buňky hyoidního proudu migrují z oblasti čtvrté, a buňky branchiálního proudu z oblasti šesté a sedmé rhombomery embryonálního zadního mozku (Lumsden et al., 1991). (Obr. 2) Populace buněk neurální lišty z různých částí mozku migrují odděleně a nemixují se mezi sebou (Epperlein et al., 2000). Obr. 2. Proudy raně migrující neurální lišty axolotla Ambystoma mexicanum. Obrázek ze skenovacího elektronového mikroskopu. Ektoderm byl odstraněn z povrchu embrya, neurální lišta byla na fotografii zeleně dobarvena. Embryo je orientoválno hlavou doleva. Oko značí optickou kapsuli. Převzato a upraveno z Černý et al. (2004) Z oblastí třetí a páté rhombomery přímo nemigrují žádné buňky (Lumsden et al., 1991) (Obr. 3). Buňky neurální lišty v těchto rhombomerách sice vznikají, většina z nich však podstupuje apoptózu (programovanou buněčnou smrt) (Lumsden et al., 1991) a ostatní jsou distribuovány do okolních rhombomer (Köntges and Lumsden, 1996). Mandibulární proud nejdříve pokryje celou přední část hlavy, ale později se rozdělí a buňky migrují kolem budoucího oka, takže tvoří preoptickou a postoptickou část (Černý et al., 2004). Buňky 6

Neurální lišta branchiálního proudu se na své cestě také dělí, tentokrát podle žaberních oblouků, takže tvoří čtyři oddělené žaberní proudy. Je nutno zmínit, že popsaný vzor migrace buněk neurální lišty byl nalezen u všech doposud studovaných obratlovců a proto můžeme říci, že je evolučně velmi konzervativní. Co se týče buněk trupové neurální lišty, ty migrují z dorzální strany trupové nervové trubice, ale netvoří sepjaté proudy tak, jako je tomu u buněk neurální lišty hlavové. Zde buňky migrují samostatně (Epperlein et al., 2000), zato ale homogenně z celé délky nervové trubice, na rozdíl od hlavové neurální lišty (3. a 5. rhombomera, viz výše). Pokud bychom se zaměřili na předurčení osudu buněk neurální lišty, je v hlavové a trupové části také rozdíl. Zatímco v trupové části se tyto buňky diferencují až pod vlivem somitů mezodermu, v hlavě jsou buňky neurální lišty částečně naprogramovány pro svůj osud ještě před začátkem migrace. Avšak i okolní prostředí má na jejich konečný osud vliv. (Epperlein et al., 2000) Obr. 3. Pozdější migrace neurální lišty embrya axolotla Ambystoma mexicanum. Embryo i fotografie je upravena stejně jako předchozí. r3 a r5 značí rhombomery 3 a 5, je vidět, že zde buňky neurální lišty v menčí míře vznikají, ale nemigrují odsud. Před migrací se přemístí do sousedních rhombomer. Převzato a upraveno z Černý et al. (2004) 2.3. Deriváty Neurální lišta, stejně jako ostatní zárodečné listy, přispívá do velkého množství tkání a orgánů v těle obratlovce, a to buď přímo, poskytnutím buněk, nebo nepřímo, poskytováním potřebného vlivu na ostatní buňky (Hall, 1999). Její deriváty můžeme rozdělit na neurální a tzv. non-neurální a dále na hlavové a trupové. Mezi neurální deriváty řadíme hlavně hlavová a spinální ganglia a další, pomocné buňky nervové tkáně. Non-neurálními deriváty jsou chrupavky, kosti, škára, pojiva svalové hmoty, a dále je neurální lišta výhradním zdrojem pigmentových buněk (právě pigmentové buňky diferencované z buněk podobných buňkám neurální lišty byly nalezeny u pláštěnců (Jeffery, Strickler and Yamamoto, 2004)). Dále 7

Neurální lišta buňky neurální lišty přispívají do zubů, srdeční a endokrinní tkáně (Hall, 2000; Le Liévre and Le Douarin, 1975; Santagati and Rijli, 2003). Kromě odlišného způsobu migrace, zmíněného v předchozí kapitole, můžeme pozorovat velký rozdíl mezi hlavovou a trupovou neurální lištou i co se týče jejich derivátů. V hlavě tvoří tyto buňky všechny deriváty zmíněné výše, kdežto v trupu z nich vznikají jen buňky pigmentové, spinální ganglia, část srdeční tkáně a některé endokrinní buňky. (podrobněji Tab. 1) Hlavová neurální lišta Trupová neurální lišta Senzorický nervový systém Ganglia kraniálních nervů Spinální ganglia Nervový systém střev Nervový systém střev Autonomní nervový systém Některá parasympaticá ganglia Některá parasympaticá a sympatická ganglia Satelitní buňky ganglií, Satelitní buňky ganglií, Pomocné neuronální buňky Schwannovy buňky hlavových Schwannovy buňky periferních Nervů Nervů Pigmentové buňky Melanocyty Melanocyty Endokrinní buňky Kalcitonin produkující buňky Dřeň nadledvin a další Kostra Kosti lebky a chrupavky Viscerokrania Škára, tuk a hladké svalstvo kůže, ciliární svaly, rohovka, Pojivová tkáň stroma hlavových a krčních žláz, papily zubů, stěny některých tepen, meningy předního a části středního mozku Tab. 1. Podrobně rozepsané a rozdělené deriváty neurální lišty. Přeloženo a upraveno podle Santagati a Rijli (2003). Jak již bylo uvedeno, neurální lišta je výhradním znakem obratlovců (Hall, 2005). Souvisí to s jejich obrovským rozvojem mozku a přední části hlavy, do které již nezasahuje původní struna hřbetní (chorda dorsalis neboli notochord, což je anglický výraz používaný i v češtině). Proto největší význam má neurální lišta právě v této evolučně nové části hlavy. Je výhradním zdrojem stavebního materiálu pro viscerokranium neboli (přeneseno na člověka) obličejovou část lebky, která vznikla posunem a přestavbou původních žaberních oblouků (viz níže). Přispívá také do neurokrania, a to konkrétně do lebeční báze a klenby. Právě lebeční klenba je největším otazníkem co se týče jejího embryonálního původu. Studiem u různých obratlovců se došlo k odlišným závěrům a je potřeba se tomuto problému dále věnovat (viz kapitola 5). 8

Neurální lišta Jelikož jsem zmínila, že neurální lišta je jediným zdrojem stavebního materiálu pro viscerokranium, je nutno ještě dodat, že toto platí za normálních podmínek. Byla však studována zástupnost neurální lišty a mezodermu v hlavě ptáků a bylo zjištěno, že pokud se transplantuje neurální lišta mezi mesenchymální buňky hlavového mezodermu, je schopna tvořit struktury, které jsou za normálních podmínek tvořeny mezodermem (Schneider, 1999). Pokud bychom se zabývali tím, která část hlavové neurální lišty přispívá do jakých kostí, obecně platí, že anteriorní neurální lišta přispívá do anteriorních struktur a vice versa. Tak například nejproximálnější část spodní čelisti u ptáků je tvořena buňkami původem z hyoidního proudu (r4), střední část je tvořena buňkami původem z posteriorního trigeminálního proudu (r1 a r2) a nejdistálnější část tvoří buňky původem z anteriorního trigeminálního proudu (mesencephalon). V kostech jsou dokonce ostré kryptické hranice mezi těmito populacemi buněk, neodrážejí se však v žádných anatomických znacích. (Köntges and Lumsden, 1996) Kosti původem z neurální lišty mohou osifikovat oběma způsoby- endochondrálně přes chrupavku nebo endesmálně ve škáře (dermis), bez chrupavčitého stadia. Endesmálně osifikují většinou ploché, krycí kosti lebky tvořící lebeční klenbu. 9

Metody studia osudu buněk 3. Metody studia osudu buněk Studium buněčných osudů a linií (fate mapping) má rozhodující význam pro pochopení embryogeneze a tím i pro vývojovou biologii. Buněčnou linií se rozumí buňka nebo skupina buněk a všechny jejich buňky dceřinné. Pokud chceme pozorovat určitou buněčnou linii, resp. zjistit, do jakých struktur v těle přispívá, musíme jasně rozpoznat tyto buňky od buněk ostatních. První metodou sledování buněčných linií bylo přirozeně prosté pozorování pod mikroskopem. Tato metoda se osvědčila při pozorování embryí bezobratlých živočichů, která bývají často průhledná a tak přímé pozorování bylo možné. Zmíněnou metodu zdokonalilo přidání kamery k mikroskopu, díky němuž byla určena celá buněčná linie Caenorhabditis elegans (Stern and Fraser, 2001). Pokud se týká obratlovců a buněk neurální lišty, první, dá se říct primitivní experimentální metodou byly tzv. extirpace, které se používaly k jejímu studování a určení jejích derivátů u obratlovčích embryí. Znamenalo to vyjmutí části neurální lišty z embrya a následné zjišťování, která pokročilejší struktura se nevyvinula nebo vyvinula porušená. Nevýhodou této techniky byla vysoká úmrtnost embryí z důvodu odstranění příliš velkých částí těla. Naopak při vyjmutí malých segmentů neurální lišty byly výsledky ovlivněny schopností okolních buněk alespoň částečně regenerovat poškozenou část (Sadaghiani and Thiébaud, 1987; Wahl and Noden, 2001). Další, velmi zásadní nevýhodou je také to, že neurální lišta má také indukční vliv na ostatní buňky a proto po jejím vyjmutí nemůžeme jednoznačně určit, že postižená struktura má původ přímo v ní. Nemůžeme totiž vyloučit, že nevyvinutá nebo poškozená část nemá původ v jiné embryonální buněčné linii, kterou neurální lišta pouze indukuje (Hall, 1999). Pro zdokonalení sledování následných generací buněk a lepší rozpoznání jejich derivátů se postupně objevovaly různé metody barvení a značení buněk tak, aby tato značka byla přenášena z mateřských na dceřinné buňky co nejdéle. Každá z těchto metod má své výhody a nevýhody a proto se každá hodí na jiný typ pokusu. První barviva, která byla použita na rozeznávání pozorovaných buněk, byla takzvaná vitální barviva. Vitální proto, že se dala použít na živé buňky. Těchto barviv je několik druhů. Některá vitální barviva jsou rozpustná ve vodě, což má nevýhodu v tom, že se mohou poměrně lehce dostat do sousedících buněk. Při vyhodnocování studie potom nemůžeme jistě 10

Metody studia osudu buněk určit, že označené buňky jsou opravdu odvozeny pouze z původně označené populace buněk. Dnes se používají spíš vitální barviva rozpustná v tucích (lipofilní), která se zakomponují do buněčné membrány a tím pádem buňky tuto značku předají jen svým potomkům. Příkladem je červené barvivo DiI (1,1-dioktadecyl-3,3,3,3 tetramethylin-dokarbocyanin perchlorát) a zelené barvivo DiO (3,3'-dilinoleyloxacarbocyanin perchlorát). Výhoda barvení vitálními barvivy je v jeho jednoduchosti. Buňky si barvivo samy vyzvednou ze svého okolí po přiložení malého kousku agaru s barvivem na povrch embrya. Dnes se barviva DiI a DiO používají jako fokální injekce přímo do místa, kde chceme buňky označit (Obr. 4). (Epperlein et al., 2000; Cerny et al., 2004). Obr. 4. Embryo axolotla 1,5 dne po vpravení 3 fokálních injekcí s DiI do neurálních valů. Buňky neurální lišty (červeně) již migrují ventrálně. Přavzato z Epperlein et al. (2000) Zásadní techniku pro pozorování osudu buněk neurální lišty vyvinula Le Douarin. Tato technika spočívá ve vytvoření mezidruhové chiméry pomocí transplantace malé části donorového embrya na odpovídající místo na embryu hostitelském, kde byla stejná část předem vyjmuta. Tato metoda využívá druhově specifických buněčných znaků, podle kterých mohou být buňky různých živočišných druhů rozlišeny (Le Liévre and Le Douarin, 1975; Le Douarin and Kalcheim, 1999). Le Douarin zavedla techniku, kde hostitelem bylo kuře a donorem křepelka. Tato metoda byla však dříve i později použita také ke tvoření interspecifických chimér obojživelníků a ptáků. Například transplantace neurální lišty embryí Xenopus borealis do embryí Xenopus laevis (Sadaghiani and Thiébaud, 1987), dále mezidruhové chiméry ocasatých obojživelníků (Ambystoma mexicanum a Triturus, různé druhy Ambystom mezi sebou), ale také chiméry mezi ocasatým obojživelníkem a žábou (Bombina variegata a Triturus alpestris) (Wagner, 1949 ex Hall, 1999). Dále můžeme uvést obousměrné transplantace mezi kachnou a křepelkou (Schneider and Helms, 2003). Bylo zjištěno, že všechny buňky, které jsou při transplantaci přímo kontaktovány mikrochirurgickými nástroji, záhy poté zemřou (Wahl and Noden, 2001). To může být velkou nevýhodou při transplanaci velmi malých částí tkáně. Modifikací metody mezidruhových chimér jsou transplantace částí embryí stejného druhu, kde všechny buňky donorového embrya jsou označeny tak, aby se daly po transplantaci jednoduše odlišit od buněk embrya hostitelského. Jedním ze způsobů označení donorového embrya je použití fluorescenčních dextranů. Ty jsou komerčně dostupné a jsou to fluorofory navázané na dextran, který je netoxický a ve vodě rozpustný. Fluorescenční 11

Metody studia osudu buněk dextran se injekcí vpraví do jednobuněčného embrya a to se nechá vyvíjet do stadia vhodného k transplantaci tkáně do embrya neoznačeného. Tato metoda má velikou výhodu v tom, že takto označené buňky můžeme díky fluorescenci pozorovat v žijícím i fixovaném embryu. Navíc tento marker je dlouhotrvající (až několik měsíců), což je nepostradatelné v případech, kdy se snažíme vystopovat embryonální původ tkání, které se vyvíjejí v pozdních stadiích ontogenetického vývoje (například kost). (Gross and Hanken, 2004, 2005) Ještě důmyslnější metodou jsou transplantace, kdy transgenní donorové embryo ve všech svých buňkách (nebo v jejich polovině - viz níže) exprimuje zelený fluorescenční protein - GFP (Borchers, Epperlein and Wedlich, 2000). Tato embrya jsou chována komerčně. Obr. 5. Do embrya Xenopa na obrázku byla transplantována část neurálního valu ebmrya exprimujícího GFP ve všech buňkách. 30 hodin po transplantaci jsou zřetelné všechny tři hlavové proudy neurální lišty. Anteriorní část embrya je vpravo. Převzato z Borchers, Epperlein, Wedlich (1999) Mohou být tvořena injekcí GFP RNA do jedné z blastomer dvoubuněčného embrya. Tak vznikají embrya exprimující GFP jen v jedné polovině těla (pravé nebo levé), která jsou používána k jednostranným transplantacím (Borchers, Epperlein and Wedlich, 2000). Dalším způsobem je křížení normálního jedince s jedincem majícím GFP v celém těle, a tudíž i v pohlavních buňkách (Sobkow et al., 2006). Takto vzniklá embrya pak exprimují GFP ve všech buňkách a mohou být použita i pro oboustranné transplantace. Zřetelná výhoda používání GFP spočívá v tom, že pro transplantace je jako hostitel i donor použit stejný živočišný druh a tím se vyhneme případnému negativnímu vlivu nezvyklých podmínek nového prostředí na implantát (stejně jako u použití fluorescenčního dextranu). (Obr. 5) Metoda využívající GFP se dnes dá považovat za jednu z vrcholových metod studia embryonálního původu různých struktur, protože zároveň poskytuje vynikající výsledky a je relativně velmi jednoduchá na aplikaci. Tuto metodu budu používat ve své budoucí diplomové práci, kde se budu zabývat embryonálním původem hlavových kostí v mexickém axolotlovi (Ambystoma mexicanum), a proto se zmíním o GFP podrobněji. Zelený fluorescenční protein byl izolován z medúzy Aequorea victoria, která zeleně fluoreskuje po osvícení modrým světlem. Je hojně využíván v buněčné a molekulární biologii jako genový marker a byl použit jako důkaz, že gen může být exprimován organismem, ve kterém není původní. Objevení a rozvoj GFP byl v minulém roce oceněn Nobelovou cenou. Dnes existuje 12

Metody studia osudu buněk několik mutací genu GFP, které jednak zlepšily jeho fluorescenční vlastnosti a jednak změnily jeho barvu, takže dnes můžeme použít například modrou, červenou nebo žlutou variantu. Můžeme si pak představit elegantní pokus, kdy bychom zkombinovali transplantace různých částí embryí exprimujících různé fluorescenční barvy a tak dosáhli například zelené neurální lišty a modrého mezodermu (včetně jejich derivátů) v albinotickém embryu axolotla (viz níže). Ve své diplomové práci budu používat metodu transplantací mezi GFP pozitivním (GFP+) axolotlem a jeho albinotickou formou, kde je zamezena migrace těch buněk neurální lišty, které se později diferencují do buněk pigmentových. Sobkow et al. (2005) zjednodušila získávání GFP+ embryí zavedením a křížením zárodečné linie axolotlů exprimujících GFP v celém těle. První takový samec axolotla byl získán injekcí plazmidu, který obsahoval jednak gen pro GFP a jednak rozeznávací místa pro ISceI meganukleázu, spolu s touto nukleázou do jednobuněčného embrya axolotla. ISceI meganukleáza zvyšuje procento buněk exprimujících GFP v F0 generaci. Po zkřížení tohoto samce s albinotickou samicí bylo 50% embryí GFP+, vykazujíce expresi GFP jednotně v celém těle. Tato metoda je výhodná v tom, že GFP je dlouhodobý marker, který se dokonce přenáší z generace na generaci. Použitím jakéhokoliv z uvedených způsobů se jen velmi těžko dosáhne značení jediné buňky, avšak naštěstí se podařilo nalézt nový způsob, jak toho dosáhnout. Vědci mohou použít retrovirální vektor, který do DNA hostitelské buňky zavede nukleovou kyselinu kódující marker (např. β-galactosidasu). Roztok obsahující virové částice je tak naředěn, že je nepravděpodobné, aby se infikovala více než jedna buňka. Navíc ve virové částici je zamezena replikace vyjmutím sekvence kódující plášťové proteiny. Tak můžeme konstatovat, že všechny označené buňky jsou jedné, klonální linie. (Evans and Noden, 2006; Stern and Fraser, 2001) Do dnešní doby bylo vyvinuto mnoho dalších způsobů, jak označit pozorované buňky. Jedním z nich jsou monoklonální protilátky proti konkrétnímu molekulárnímu markeru. Protilátka se naváže na povrch buňky, která tento marker exprimuje, a tím ji označí. Na protilátky je navázáno koloidní zlato, které se přenáší i do dalších buněčných generací, a díky kterému můžeme označené buňky vizualizovat. (Stern and Fraser, 2001) Poslední metodou, kterou zmíním, je využívání transgenních linií modelových organismů. Jsou vytvořeny dvě rozdílné transgenní linie, po jejichž zkřížení dojde kaskádou dějů v jádře některých buněk k expresi markeru. Tak se označí buňky, ve kterých je aktivní právě ten gen, který nás zajímal a díky jehož promotoru je spuštěna zmíněná kaskáda. Takových trasgenních systémů (tzv. permanentních molekulárních markerů) je již vyvinuto 13

Metody studia osudu buněk několik. Například u myší byla vyvinuta jedna metoda pro označení neurální lišty (Wnt1- cre/r26r) a jiná pro označení mezodermu (Mesp1-cre/R26R) (Yoshida et al., 2008). Pokud se zaměřím na neurální lištu, pak tam, kde byl nebo je exprimován gen Wnt1 (tzn. ve všech buňkách neurální lišty), je také díky jeho promotoru aktivní Cre-rekombináza. Tato rekombináza vystřihne inhibiční sekvenci z markerového genu R26R a díky tomu je exprimována beta-galactosidáza, která vizuálně označí buňky neurální lišty (Jiang et al., 2002). Obdobně lze situaci popsat u permanentního molekulárního markeru mezodermu. (Obr. 6) Obr. 6. Dorzální pohled na celou lebku myši (Mus musculus). Na obrázcích je vidět reciproční vzor Mesp1- cre/r26r a Wnt1-cre/R26R trangenních linií myší. A: Kosti temenní (p) a laterální část interparietale (*) jsou původem z mezodermu, lehké zbarvení i v mediální části interparietale je způsobeno mezodermálním původem meningů ležících těsně pod kostmi. B: Kost čelní (f) a mediální část interparietale (*) jsou původem z neurální lišty. Lehké zbarvení kostí temenních je způsobeno pod nimi ležícími meningy původem z neurální lišty. Převzato z Yoshida et al. (2008) Je nutno zmínit, že pokud chceme sledovat deriváty buněk jakéhokoliv obratlovce kteroukoliv ze zmíněných metod, nestačí nám pouze označit mateřskou buňku nebo skupinu buněk. Po jejich označení musíme určitou dobu (podle struktury, kterou chceme později pozorovat) embryo nechat vyvíjet v optimálních podmínkách podle různých protokolů (odlišných pro různé živočichy). Pokud embryo doroste do požadovaného stadia, musíme ho často usmrtit, zafixovat a vhodnou metodou nařezat tak, abychom mohli pozorovat, kde se v jeho těle označené buňky nacházejí, popřípadě do kterých struktur přispívají. Tomu všemu se lze vyhnout například použitím metod využívajících fluorescenci nebo s pomocí nukleární magnetické rezonance, díky které můžeme sledovat označené buňky hluboko uvnitř vyvíjejících se embryí (Stern and Fraser, 2001). 14

Hlava obratlovce 4. Hlava obratlovce Jak již je zmíněno výše, vznik obratlovců doprovázela velká expanze mozku směrem dopředu a s tím spojené prodlužování hlavy. Bylo potřeba zvětšující se mozek chránit pevnou schránkou, proto se vyvinuly nové struktury pro obratlovce typické. Morris-Kay (2001) dělí obratlovčí lebku na chrupavčité viscerokranium, chrupavčité neurokranium, dermální klenbu lebeční a týlní oblast. Já zde uvádím trochu jiné dělení, spíš podle funkčnosti než podle emryonálního původu, ale všechny jím uvedené části zde také představuji. Neurokranium Neurokranium je ta část lebky, která chrání mozek. Skládá se z báze lebeční, postranních stěn a lebeční klenby. Zahrnuje také senzorické kapsule: čichovou, zrakovou a sluchově-rovnovážnou, a patří sem výše zmíněná týlní oblast. Má původ jednak mezodermální a jednak z neurální lišty. (Obr. 6) Báze lebeční má dvojí původ. U savců má sphenoidní kompex, který se skládá z kostí ethmoidale, presphenoidu a basisphenoidu, původ převážně v neurální liště. Avšak laterální část presphenoidu má mezodermální původ a v posteriorní části basisphenoidu můžeme také mezodermální buňky pozorovat (McBratney-Owen et al., 2008). Couly, Coltey and Le Douarin (1993) u ptáků naopak zjistili původ báze lebeční převážně v mezodermu (pleurosphenoid, basi-postsphenoid), ale i neurální lišta sem přispívá (basi-presphneoid, přední část parasphenoidu, pterygoid). Celá týlní kost (occipitale), kterou částečně můžeme také zahrnout do lebeční báze, je tvořena mezodermem, ať již hlavovým nebo trupovým (somity, viz níže) (pták: Couly, Coltey and Le Douarin, 1993). Dosud není zcela dořešen ontogenetický původ klenby lebeční, kde se výsledky liší nejen mezi živočišnými třídami, ale dokonce i v rámci ptáků (viz níže). Otázka lebeční klenby je dnes jedna z nejčastěji řešených mezi vývojovými embryology. Co se týče způsobu osifikace, kosti neurokrania vznikají oběma cestami, tedy endesmální i endochondrální. Všechny kosti lebeční báze podstupují endochondrální osifikaci (Owen et al., 2008), tzn. nejprve je vytvořena chrupavka, která později inkrustuje anorganickými solemi a osifikuje. Naproti tomu kosti klenby lebeční, tj. frontale (kost čelní), parietale (kost temenní), popř. frontoparietale, interparietale nebo postparietale, vznikají endesmální osifikací (osifikací přímo z mezenchymu v hlubších vrstvách dermis (Morris-Kay, 15

Hlava obratlovce 2001)), stejně jako squamosum (kost šupinová), která tvoří postranní stěnu neurokrania. Tyto kosti se nazývají dermálními. Obr. 7. Schématické nákresy jednotlivých komponent lebky ukazující jejich vzájemné vztahy a evoluční změny. A: báze lebeční u ryb; B: vztah báze lebeční a viscerokrania ryb, posteriorní elementy viscerokrania podporují žábry; C: změněné viscerokranium tetrapodů; D: dermální kosti savců pokrýbají velkou část lebky, articulare, quadratum a collumela jsou změněny ve sluchové kůstky. Převzato a přeloženo z Morriss-Kay (2001) Viscerokranium Viscerokranium je ta část lebky, která vznikla přeměnou, příp. přesunem původních chrupavčitých elementů (žaberních oblouků), které podpíraly žábry (Obr. 7). Přeneseno na člověka je to obličejová část hlavy, ta se poprvé objevila spolu s obratlovci. U těch obratlovců, kde jsou přítomny žábry, však elementy viscerokrania stále plní funkci jejich opory. Kosti viscerokrania poté vznikají buď osifikací chrupavek žaberních oblouků nebo jejich překrytím dermálními kostmi. Důležité je, že téměř celé viscerokranium má embryonální původ v neurální liště (Černý et al., 2006). Jediný element viscerokrania, totiž posteriorní basibranchiale (nejventrálnější část žaberních oblouků, která je v mediální linii spojuje dohromady), má původ mezodermální (Sadaghiani and Thiébaud, 1987; Le Douarin and Kalcheim, 1999). Velmi podstatnou součástí viscerokrania je čelistní aparát (Obr. 7). Čelisti umožnily obratlovcům stát se úspěšnými predátory, díky nim dosáhnou lepší manipulace s potravou a poskytují jim účinný obranný systém. Původní chrupavčitý element spodní čelisti, Meckelova 16

Hlava obratlovce chrupavka, je u obratlovců v různé míře nahrazena dermální kostí zubní, os dentale. Z Meckelovy chrupavky u savců, nejodvozenějších obratlovců, pak zůstává jen zosifikovaná os articulare, kterou se spodní čelist kloubí k horní. Klasicky se uvádí, že horní čelist je tvořena chrupavčitým palatoquadratem. Pravdou je, že palatoquadratum je v jeho chrupavčité podobě vždy přítomno, ale u mnoha obratlovců horní čelist netvoří. Tuto funkci pak zastává například báze lebeční a palatoquadratum tudíž tvoří jen spojnici mezi spodní a horní čelistí. Kostěné horní patro pak představují dermální kosti premaxila (kost předčelistní), maxila (kost čelistní) a palatinum (kost patrová), u ptáků sem můžeme zahrnout i nasale (kost nosní), které se podílí na tvorbě horní části zobáku. Palatoquadratum je u dospělých tetrapodů redukováno na quadratum a alisphenoid. Quadratum tvoří s os articulare primární čelistní kloub, alisphnenoid je zakomponován do neurocrania a stává se součástí báze lebeční. (Roček, 2002) U nejvíce odvozených skupin plazů a všech savců je primární čelistní kloub uvolněn a articulare i quadratum se posouvají spolu s columellou do středního ucha. (Morris-Kay, 2001, Obr. 7) Articulare pak tvoří malleus neboli kladívko, z quadrata se stává incus neboli kovadlinka a collumela je homologická se stapes, česky třmínkem. Collumela tvoří také střední ucho plazů, obojživelníků a ptáků. (Geisler a Zima, 2007) Sekundární čelistní kloub savců je pak tvořen mezi dentale a maxilou. Dalším velmi důležitým elementem viscerokrania je jazylka, os hyoideum. Představuje podporu pro svaly jazyka, který je samozřejmě pro obratlovce velmi důležitý z hlediska zpracování potravy. Neméně důležitý je pak pro nás co se týče artikulované řeči. Chondrokranium Chondrokranium je, jak již napovídá název, lebka tvořená chrupavkami a endochondrálními kostmi (Liem et al., 2001). Zahrnuje chrupavčité neurokranium bez klenby lebeční, která je dermálního původu, a dále chrupavčité viscerokranium. U obratlovců majících kost většina chrupavek chondrokrania později endochondrálně osifikuje, ale některé jsou potlačeny, případně nahrazeny dermálními kostmi (viz např. Meckelova chrupavka, výše). Chondrokranium se nachází také u chrupavčitých ryb a paryb, kde samozřejmě neosifikuje. Podle Liema et al. (2001) se název chondrokranium dá zaměnit s neurokraniem Dermatokranium Dermatokranium je ta část lebky, která vzniká přímou osifikací mezenchymových buněk neurální lišty nebo dermatomu somitů (Liem et al., 2001). Tvoří ho krycí kosti klenby lebeční (např. frontale, parietale, příp. frontoparietale, dále postparietale, interparietale a squamosum) a krycí kosti viscerokrania (kupříkladu dentale, premaxila, maxila, palatinum, 17

Hlava obratlovce nasale). Právě dermální kosti čelistí jsou ty kosti, které nesou zuby (mimo jiné premaxila, maxila a dentale). V roce 1983 přišli vědci Gans a Northcutt s teorií nové hlavy, která, stručně řečeno, popisuje klíčový význam neurální lišty ve vývoji obratlovců. Uvádí, že ta část lebky, která je souběžná s původní chordou dorsalis a kam chorda až zasahuje, je embryonálně tvořena buňkami mezodermu. Naopak kosti lebky před touto hranicí jsou tvořeny buňkami neurální lišty. Co se týče viscerokrania, výsledky studií tuto teorii podporují. U lebeční báze je tato teorie více méně potvrzena též, až na malé výjimky zmíněné výše. Lebeční klenba je i v tomto případě více kontroverzní. Tuto teorii potvrzují studie na savcích a studie ptačí lebky publikované Le Liévre (1978) a Nodenem (1978), ale neshodují se s ní výsledky Coulyho et al. (1993). Výsledky těchto studií uvádím v Kapitole 4. Bohužel u dospělých živočichů nemůžeme žádnou doposud objevenou metodou rozlišit kosti tvořené buňkami neurální lišty od těch tvořených buňkami mezodermu. Pokud tedy chceme zjistit jejich embryonální původ, musíme je studovat již během jejich embryonálního nebo larválního vývoje pomocí fate mappingu popisovaného v předchozí kapitole. 18

Dosavadní poznatky o embryonálním původu lebky obratlovců 5. Dosavadní poznatky o embryonálním původu lebky obratlovců Získáváním poznatků o ontogenetickém vývoji lebky a embryonálním původu hlavových elementů (ať už chrupavčitých nebo kostěných) u různých obratlovců nás může dovést k hodnotným závěrům o příbuzenských vztazích a fylogenezi jednotlivých skupin. Jak již jsem zmínila, vznikem neurální lišty dostali obratlovci obrovské možnosti v rozvoji velmi rozrůzněných forem lišících se jednak tvarem a velikostí a jednak funkcí nových elementů. Týká se to hlavně hlavy, kde měla neurální lišta největší prostor ke změnám z důvodu zvětšujícího se mozku. Díky tomu, že expandující částí mozku byl koncový mozek (telencephalon), působila neurální lišta hlavně v přední části hlavy. Proto můžeme obecně říct, že přední část lebky je původem z neurální lišty, kdežto zadní část je z paraxiálního mezodermu, ať již z hlavového nebo tělního (který odpovídá somitům). (podrobněji níže) Ze sklerotomu somitů vznikají tělní obratle. Avšak nejkraniálnější somity nepřispívají do stavby páteře, nýbrž do stavby kaudální části lebky. Couly, Coltey and Le Douarin (1993) tento aspekt studovali na ptačím modelu metodou mezidruhových chimér kuřete a křepelky. Zjistili, že prvních pět somitů přispívá do týlní části lebky. První somit tvoří exo-occipitale (a také přispívá do stavby otické kapsule), druhý, třetí, čtvrtý a přední polovina pátého somitu se podílí na basi-occipitale. Počínajíc zadní polovinou pátého somitu již tyto do lebky nepřispívají a tvoří obratle. Dá se říci, že těchto prvních pět somitů tvoří jeden velký obratel, který je zakomponován do lebky a jehož neurální kanál tvoří supraoccipitale, které jsou původem z hlavového mezodermu. Ostatní obratlovci mají také týlní část lebky tvořenou somitickým mezodermem, i když počet somitů a rozdělení kostí se může poněkud lišit. 5.1. Ryby Dodnes nejsou bohužel publikovány žádné články, které by přímo popisovaly embryonální původ jednotlivých částí lebky u ryb (Gross and Hanken, 2008). Modelová ryba, Danio rerio (Hamilton-Buchanan, 1822), tzv. zebrafish, je používána především na studium genetických aspektů různých embryonálních pochodů včetně genetického pozadí migrace neurální lišty. Studium embryonálního původu hlavy kostnatých ryb by nám přineslo velmi důležité informace o starobylém schématu příspěvku neurální lišty a mezodermu do 19

Dosavadní poznatky o embryonálním původu lebky obratlovců jednotlivých kostí lebky. Tyto informace bychom mohli dále srovnávat s více pokročilými rybami i ostatními obratlovci, abychom zjistili míru konzervovanosti zmíněného schématu. 5.2. Plazi Ani u plazů zatím neexistuje žádná osudová mapa (fate map), která by přesně určila příspěvky zárodečných listů do jejich lebky (Gross and Hanken, 2008). Je zde však jeden zajímavý aspekt, kdy u želv byly zjištěny buňky původem z neurální lišty tvořící přinejmenším některé dermální kosti jejich krunýře, a to jak karapaxu (dorzálního), tak plastronu (ventrálního krunýře) (Gilbert et al., 2001, 2007 ex Gross and Hanken, 2008). Je to zatím jediná zmínka o tom, že by postkraniální nebo trupová neurální lišta mohla tvořit kost. Je pravda, že želví krunýř je unikátní struktura mezi obratlovci a proto se můžeme domnívat, že právě u želv by trupová neurální lišta tvořící kost mohla být evoluční novinkou, která umožnila stavbu kostěného krunýře. 5.3. Ptáci Ptáci jsou skupinou obratlovců, kde můžeme pozorovat v dospělosti nejrozsáhlejší srůstání kostí lebky. Avšak v dřívějších vývojových stádiích lze jednotlivé kosti od sebe dobře odlišit. Nejznámějšími vědci a vědeckými skupinami, které se zabývaly a zabývají studiem embryonálního původu kostí ptačí lebky jsou Le Liévre, Noden a jeho kolegové a Couly a Le Douarin a jejich kolegové. Velký rozvoj studování lebky ptáků se objevil v 60. letech 20. století po zavedení techniky interspecifikých chimér, u ptáků zastoupených chimérou mezi kuřetem (Gallus gallus (Linnaeus, 1758)) a křepelkou (Coturnix coturnix (Linnaeus, 1758)) (viz kapitola 3). Co se týče výsledků studií, jsou ptáci dosud nejkontroverznější skupinou obratlovců co do příspěvku neurální lišty do kostí klenby lebeční. Klenba lebeční se u ptáků skládá stejně jako u ostatních obratlovců z kosti čelní (frontale) a temenních (parietale). U ostatních obratlovců kost čelní končí přibližně u posteriorního konce optické kapsule, zde expandovala a překrývá celý koncový mozek. Temenní kosti jsou zde malé, kdežto u ostatních obratlovců bývají mnohem větší než kost čelní. Le Liévre (1978) studovala neurální lištu a její přispění do kostí ptačí lebky s ohledem na oblast embryonálního mozku (prosencephalon, mesencephalon, rhombencephalon), ze které neurální lišta migrovala. Tak určila, že všechny kosti viscerokrania mají původ v neurální liště stejně jako pouze malá část kosti čelní. Z toho 20

Dosavadní poznatky o embryonálním původu lebky obratlovců usoudila, že zbytek frontale je původem z mezodermu. Ve svých studiích jako první definovala fenomén, kdy jeden kostěný element může vznikat za přispění buněk neurální lišty z více oblastí mozku, kdy však buňky z různých oblastí zachovávají diskrétní populace a mezi sebou se nemísí (Gross and Hanken, 2008). Obr. 8. Lebka kuřete. A: Výsledek Nodenových (1982 a 1984) sudií; B: výsledek studií Coulyho et al. (1993) shodující se s výsledky Le Douarin and Kalcheim (1999); C: popsány a zeleně označeny jsou kosti, na kterých se A a B neshodují. Červeně: kosti z neurální lišty, šedě: kosti jiného (mezodermálního) původu. Převzato a upraveno z Gross and Hanken (2008) Nodenovy studie (1978) (ex Gross and Hanken, 2008) se z velké části shodují s Le Liévre, kdy určují původ celého viscerokrania v neurální liště. Avšak vzniká zde rozpor ohledně embryonálního původu lebeční kostí klenby. Co se týče kosti čelní, zde Noden určil pouze její nejpřednější část jako odvozenou z neurální lišty. Na základě této neshody pokusy později zopakoval s použitím odlišné techniky (Evans and Noden, 2006) a výsledky byly stejné jako u jeho studií s chimérami. (Obr. 8) Ve studii z roku 1993 se Couly, Coltey a Le Douarin znovu zabývali embryonálním původem celé ptačí lebky. Brali v úvahu 3 zdroje buněk- neurální lištu, trupový mezoderm (somity) a hlavový paraxiální mezoderm. Publikovali výsledky, kde neurální lišta přispívala dosud do nejrozsáhlejší části lebky. S ostatními autory se shodli na tom, že neurální lišta tvoří bez výjimky celé viscerokranium. Co se však týče lebeční klenby, jejich výsledky se od ostatních 21

Dosavadní poznatky o embryonálním původu lebky obratlovců autorů velmi liší. Určili celou lebeční klenbu jako odvozenou z neurální lišty, zatímco mezoderm se na stavbě frontale ani parietale vůbec nepodílí. (Obr. 8) Z výše napsaných poznatků si nemůžeme jednoduše vybrat který je správně a který ne. K definitivnímu určení embryonálního původu ptačí klenby lebeční by bylo zapotřebí několika dalších studií nezávislých laboratoří, které by však používaly stejné a přesně dané postupy a metody. Rozdílnost výsledků jednotlivých autorů může být, a pravděpodobně také je způsobena odlišnými postupy práce. Například Le Liévre (1978) použila pro transplantace ve svých experimentech starší embrya než Couly, Coltey a Le Douarin (1993), a naopak konečné výsledky určovala z mladších embryí, kde ještě nejsou kosti klenby lebeční jasně patrné (Couly, Coltey a Le Douarin, 1993). Dále se Le Liévre od ostatních lišila mnohem delšími transplantovanými úseky. Noden a Trainor (2005) a Evans a Noden (2006) použili úplně odlišné techniky, a to barvení buněk neurální lišty i mezodermu s použitím retrovirálního vektoru nebo barvení pomocí fokálních injekcí. (Gross and Hanken, 2008) 5.4. Savci Obr. 9. Embryonální původ kostí savčí lebky podle tří uvedených autorských kolektivů. Nevybarvené kosti jsou kosti viscerokrania a proto je můžeme určit původem z neurální lišty. Převzato a upraveno z Gross and Hanken (2008) Studium embryonálního původu savčích hlavových elementů je velmi ztíženo jejich nitroděložním vývojem. Avšak byly nalezeny metody genetických modifikací umožňujících značení buněk jednotlivých linií, ať už neurální lišty (Wnt1-cre/R26R) nebo mezodermu (Mesp1-cre/R26R). Díky těmto metodám je již dnes znám embryonální původ jednotlivých hlavových elementů myši, Mus musculus (Linnaeus, 1758). Bylo zjištěno, že viscerokranium je jako u ostatních obratlovců tvořeno buňkami neurální lišty. Co se týče klenby lebeční, kost čelní zde vzniká výhradně z neurální lišty, kdežto temenní kosti z mezodermu (Jiang et al., 2002; Morris-Kay, 2001) (Obr. 9). Tento 22

Dosavadní poznatky o embryonálním původu lebky obratlovců výsledek se neshoduje ani s jednou interpretací embryonálního původu kostí klenby lebeční u ptáků. Zde u savců je navíc přítomna ještě jedna kost, interparietale, jejíž mediální část vzniká z neurální lišty, kdežto laterální části z mezodermu (Yoshida et al., 2008). (viz kapitola 6) 5.5. Obojživelníci Protože embryonální původ hlavových struktur obojživelníků budu studovat ve své diplomové práci, uvádím je v tomto výčtu jako poslední a zmíním se o nich podrobněji. Vzhledem k jejich typickému embryonálnímu vývoji zahrnujícím metamorfózu bylo dřív velmi náročné, ne-li nemožné pozorovat osud buněk až do dospělosti zvířat. Nebyly vhodné techniky, díky kterým by pozorované buňky byly rozlišitelné od ostatních i na konci larválního vývoje obojživelníka, kdy se objevuje osifikace (buď těsně před nebo během metamorfózy) (Gross and Hanken, 2008). Takové techniky byly vyvinuty až v posledních letech (například využití GFP a fluorescentních dextranů) a zmiňuji se o nich v kapitole 3. Do té doby byly však studie omezeny na zjištění příspěvku buněk neurální lišty pouze do nedospělé chrupavčité lebky. Staršími metodami byl zjištěn původ v neurální liště u některých elementů viscerokrania pozdní larvy. V blízké minulosti pak bylo u druhu Xenopus laevis určeno, že kosti frontoparietale, nasale, parasphenoid, squamosum a dentale mají původ v neurální liště (Gross and Hanken, 2004, 2005). Dále byl zjištěn příspěvek neurální lišty do quadrata (Sadaghiani and Thiébaud, 1987). Nebyl však současně určen příspěvek mezodermu a tak nemůžeme jednoznačně říct, že tyto kosti jsou tvořeny výhradně buňkami neurální lišty. V rámci třídy obojživelníků je velmi důležité rozeznávat ocasaté obojživelníky a žáby, kdy každá z těchto skupin má velmi odlišnou lebku. Největší význam v tomto směru má klenba lebeční, kdy u žab nacházíme frontoparietale, kdežto ocasatí obojživelníci mají normální frontale a parietale (Liem et al., 2001). Ve své diplomové práci se budu zabývat embryonálním původem kostí viscerokrania a klenby lebeční u ocasatých obojživelníků na modelovém oragnismu Ambystoma mexicanum. 23

Problém homologií 6. Problém homologií Považuji za velmi důležité zde zmínit to, že ačkoliv se podle studií liší embryonální původ jednotlivých kostí lebeční klenby u jednotlivých skupin obratlovců, nemůžeme z toho jednoduše usoudit, že se v evoluci staly takové události, které změnily zdroje buněk pro stejné kosti různých obratlovců. Avšak s ohledem na to, že dnes již víme, že homologické kosti různých živočichů nemusí vždy vznikat ze stejné embryonální oblasti nebo dokonce stejným vývojovým procesem (Hall, 1999), výše zmíněný sénář je možný. Tak například frontale ptáků je natolik prodloužené dozadu, že by nebylo tak těžké uvěřit tomu, že je to vlastně frontale a parietale s nerozeznatelným švem mezi nimi. A pokud se na tento problém zaměříme, zjistíme, že ptačí frontale vzniká ze dvou párů osifikačních center. Přední osifikační centra dávají vznik té části ptačího frontale, kterou všechny studie určují původem z neurální lišty. Ze zadních osifikačních center vzniká větší, zadní část frontale, které většina studií (kromě Coulyho et al.) určuje původ v mezodermu. (Gross and Hanken, 2008) Zdá se proto pravděpodobné, že původní parietale a frontale mohly srůst dohromady za vzniku ptačího frontoparietale. Kosti označované jako parietale by tak byly vlastně postparietale, které mají jak staří plazi, tak i savci, kde se vyskytují jako jedna kost - interparietale. Naopak u žab se jediná kost tvořící klenbu lebeční nazývá frontoparietale. Ta vzniká (u většiny žab) také ze dvou párů osifikačních center. Avšak studie této kosti (Gross and Hanken, 2005) dokazují, že neurální lišta přispívá do této kosti v celé její délce (i když není vyloučeno současné přispění mezodermu). Takže buď se můžeme domnívat, že jde opravdu o srostlé kosti čelní a temenní, a že se tento vzor shoduje s Coulyho et al. (1993) lebeční klenbou u kuřete, celou odvozenou z neurální lišty. Odporovalo by to naopak výsledkům Morris-Kaye (2001) a Jianga et al. (2001) u myší, kde z neurální lišty vzniká pouze kost čelní. Druhá alternativa je určit žabí frontoparietale jako homolog kosti čelní ostatních obratlovců, což by pak odpovídalo myšímu vzoru, ale neshodovalo se s dvěma ze tří výsledků studií u ptáků. (Gross and Hanken, 2008) Proto se zatím můžeme pouze dohadovat o tom, jestli se v evoluci posunula hranice mezi oblastmi, kam ještě přispívá mezoderm a kam už neurální lišta, dozadu a jestli je tato hranice evolučně stabilní nebo labilní. Bylo by potřeba znovu přezkoumat homologie jednotlivých kostí na pozadí dnes dostupných fylogenetických dat. 24