Žádost o udělení povolení k uvádění geneticky modifikovaného lnu FAD2-i do životního prostředí Datum podání 21.12.2011 ČÁST A VŠEOBECNÉ NÁLEŽITOSTI ŽÁDOSTI 1. Název projektu Transformace lnu pro RNA inaktivaci FAD2 desaturázy 2. Žadatel (+) Výpis z obchodního rejstříku (ne starší než 3 měsíce), případně úředně ověřená kopie živnostenského listu nebo zakladatelského dokumentu 2. 1. Jméno, popřípadě jména, a příjmení (obchodní firma), je-li žadatelem fyzická osoba oprávněná k podnikání nevztahuje se 2. 2. Název (obchodní firma) a právní forma, je-li žadatelem právnická osoba AGRITEC, výzkum, šlechtění a služby s.r.o., společnost s ručením omezeným 2. 3. Státní občanství (u fyzických osob) nevztahuje se 2. 4. Sídlo (u právnických osob), nebo místo podnikání a adresa bydliště (u fyzických osob) Zemědělská 2520/16, Šumperk, PSČ 787 01 2. 5. IČO: 48392952 2. 6. DIČ: CZ48392952 2. 7. Předmět činnosti (podle zakladatelského dokumentu nebo zápisu v obchodním rejstříku) - výzkum a vývoj v oblasti přírodních a technických věd nebo společenských věd - testování, měření, analýzy - činnost technických poradců v oblasti chemie, potravinářství, zemědělství a lesnictví - pořádání odborných kurzů, školení a jiných vzdělávacích akcí včetně lektorské činnosti 2. 8. Jméno, popřípadě jména, a příjmení osob, které tvoří statutární orgán žadatele, s uvedením způsobu, jímž jménem žadatele jednají (u právnických osob). Ing. Miroslav Hochman jednatel, ředitel Ing. Zdeněk Muroň - jednatel Ing. Prokop Šmirous, CSc. - jednatel Jednatelé jsou oprávněni jednat jménem společnosti samostatně. 3. Odborný poradce (+) Výpis z evidence Rejstříku trestů, popřípadě jiný odpovídající doklad podle zvláštního právního předpisu. 7) Viz oprávnění udělené MŽP Jihočeské univerzitě, Biologické fakultě č.j. 60955/ENV/06 1
(+) Doklad o dosaženém vzdělání a délce odborné praxe (bylo- li odborné vzdělání nebo praxe získáno v jiném členském státě státním příslušníkem členského státu, rozumí se tímto dokladem rozhodnutí o uznání odborné kvalifikace podle zvláštního právního předpisu 7)) Viz oprávnění udělené MŽP Jihočeské univerzitě, Biologické fakultě č.j. 60955/ENV/06 3. 1. Jméno, popřípadě jména, příjmení, titul RNDr. Slavomír Rakouský, CSc. 3. 2. Povolání, případně zaměstnavatel a funkce Odborný asistent, Zdravotně sociální fakulta Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích 3. 3. Vzdělání Vysokoškolské absolvent Přírodovědecké fakulty UK, Praha 3. 4. Odborné kurzy Národní a mezinárodní projekty zaměřené na bezpečnost nakládání s GMO (UNEP GEF, SIGMEA, AIGM ESF) 3. 5. Dosavadní praxe 30 let vědecké práce, převážně na GM rostlinách, lektor řady odborných kurzů o GMO, tajemník České komise transgenoze rostlin, poté člen České komise pro nakládání s GMO, účastník mezinárodních programů GMO 3. 6. Adresa bydliště Vodňanská 9, 370 11 České Budějovice 3. 7. Kontaktní adresa Branišovská 31, 370 05 Č. Budějovice 3. 8. Telefon 387 775 537 3. 9. Fax 387 775 537 3. 10. E-mail srak@prf.jcu.cz 4. Charakteristika nakládání s geneticky modifikovaným organismem 4. 1. Účel uvádění do životního prostředí, popřípadě název a označení projektu, zadavatel (účel uvádění včetně všech potenciálních přínosů pro životní prostředí, které je možné očekávat) V rámci řešení projektu MŠMT 2B06087 (uzavřené nakládání - viz Oznámení č.j. 13527/ENV/10, Rozhodnutí č.j. 48336/ENV/10) byly získány regeneranty olejného lnu nesoucí úsek plasmidu ppcv812i/35s/fad2i/35s/gus (FAD2-i GUS), ve kterém je obsažen segment DNA FAD2-i, což je upravený segment genu FAD2 pro desaturázu mastných kyselin, jenž byl uzpůsoben tak, aby byla potlačena exprese původního FAD2 genu rostliny. Další materiály budou postupně vznikat opakováním transformačních pokusů za použití téhož plasmidu v rámci uzavřeného nakládání neboť se předpokládá vliv místa inzerce transgenu na jeho expresi. Předpokládá se, že v důsledku exprese tohoto segmentu genu dojde k posttranskripčnímu umlčování genu pro FAD2 desaturázu rostlinám lnu vlastní. Díky nepřítomnosti nebo silné redukci funkčních molekul FAD2 desaturázy bude snížena nebo zcela zastavena konverze kyseliny olejové v linolovou a tím dojde ke zvýšení obsahu kyseliny olejové v semenném oleji. Obsah mastných kyselin podléhá silně vlivům prostředí a výsledky získané ze skleníkových podmínek jsou zkreslené, proto je nutné k získání objektivních výsledků pěstovat rostliny v polních podmínkách. 2
4. 2. Předpokládaný výsledek uvádění do životního prostředí V polních pokusech bude prověřována hypotéza, že přítomnost konstruktu v buňkách vyvíjejících se embryí zvýší obsah kyseliny olejové v semenném oleji. Současně bude ověřen pravidelný přenos konstruktu do vyšších generací a stabilita exprese transgenu FAD2-i. 5. Doba uvádění do životního prostředí 5. 1. Celková doba uvádění geneticky modifikovaného organismu do životního prostředí a datum jeho předpokládaného zahájení Datum předpokládaného zahájení: 2. polovina dubna 2012 (po obdržení kladného rozhodnutí) Předpokládaná celková doba nakládání: 7 let (poslední monitoring do 30.06.2018). 5. 2. Závazný harmonogram (rozpis jednotlivých dílčích etap, datum jejich předpokládaného zahájení a doba jejich trvání) 2012-2014 namnožení semenného materiálu, sledování pravidelnosti přenosu transgenu do dalších generací, sledování exprese transgenu v následujících generacích. 2013-2018 sledování vlivu přítomnosti konstruktu na morfologické znaky a biologické charakteristiky u transformantů. Výhledově budou začleňována i potomstva rostlin získaných transformací nově vyvíjenými konstrukty na bázi FAD2-i, případně dalších FAD genů a jejich kombinací 6. Plánuje žadatel uvádění stejného geneticky modifikovaného organismu do životního prostředí v některém členském státě Evropských společenství nebo mimo jeho území? NE 7. Podal žadatel žádost pro uvádění stejného geneticky modifikovaného organismu do životního prostředí v některém členském státě Evropských společenství? NE 8. Podal žadatel žádost pro uvádění stejného geneticky modifikovaného organismu do životního prostředí nebo do oběhu mimo území Evropských společenství? NE 9. Hodnocení rizika uvádění geneticky modifikovaného organismu do životního prostředí (+) Hodnocení rizika podle 7 zákona včetně dokumentace výsledků předchozích uvádění do životního prostředí, především z hlediska různého rozsahu činnosti a různých přijímajících ekosystémů 9. 1. Shrnutí hodnocení rizika Uvádění výše popsaného geneticky modifikovaného lnu do životního prostředí odpovídá činnostem bez škodlivého působení na zdraví člověka a zvířat, na životní prostředí nebo biologickou rozmanitost (viz Hodnocení rizik v příloze 3). Pěstování geneticky modifikovaného lnu s upraveným genem pro FAD2 desaturázu je prakticky bez rizika, neboť použité konstrukty neobsahují geny, které by samy o sobě nebo zprostředkovaně mohly způsobit toxicitu rostlin nebo jejich částí, nezpůsobují zvýšenou vitalitu lnu v přírodním prostřední (ověřeno ve skleníkových pokusech firmy Agritec v rámci uzavřeného nakládání), nehrozí únik lnu do životního prostředí (při běžné agrotechnice není len schopen přežívat na poli v následujícím roce po výsevu, není schopen přežívat a množit se v přírodě bez pomoci člověka, nemá v přírodě ČR příbuzný druh, který by byl schopen přijmout jeho pyl - viz Tejklová a Seidenglanz (2004) a Hodnocení rizik (příloha 3). 3
ČÁST C DALŠÍ NÁLEŽITOSTI ŽÁDOSTI PRO GENETICKY MODIFIKOVANÉ VYŠŠÍ ROSTLINY 1. Údaje o příjemci, případně (kde je to aplikovatelné) rodičovském organismu 1. 1. České a latinské rodové a druhové jméno organismu, s přesným určením kultivaru (odrůdy, linie, hybridu) K transformaci byly použity linie olejného lnu (Linum usitatissimum L.) AGT 583/05 a AGT 952/04. První je klasického typu (s vysokým obsahem kyseliny alfa-linolenové), s vysokou odolností k houbovým chorobám, s nižším výnosem semene, druhá je nízkolinolenová s obsahem kyseliny alfa-linolenové kolem 5 %, s vyšším výnosem semene, středně odolná k houbovým chorobám. 1. 2. Původ (sbírka, sbírkové číslo, dodavatel) Jmenované linie použité k transformaci vznikly v rámci řešení projektu NAZV QE1123 a výzkumného záměru MŠMT MSM2678424601 ve firmách AGRITEC, výzkum, šlechtění a služby s.r.o. a Agritec Plant Research s.r.o. Transformace byly provedeny v rámci řešení projektu MŠMT 2B06087 ve firmě Agritec Plant Research s.r.o. v rámci uzavřeného nakládání. Body 1. 3. -1. 9. viz Žádost č.j. MŽP 20955/ENV/07 a rozhodnutí č.j. 20955/ENV/07. Pro úplnost a přehlednost uvedeny i zde: 1. 3. Rozmnožování 1. 3. 1. Způsob rozmnožování Len setý (n=15) se rozmnožuje výhradně semeny. Kulturní len má homostylické květy a je samosprašný. K opylení dochází v době otevírání květů. Pyl lnu je relativně těžký, proto je špatně přenosný větrem. Většina pylu se v kvetoucích porostech nachází do výše 50 cm. V přirozených podmínkách frekvence cizosprášení u přadného lnu představuje jen zlomek procenta, u olejného typu 1,38-0,16 % ve vzdálenosti 0-4,4 m (Tejklová, 2005). Cizosprášení lnu je zprostředkováno hmyzem (třásněnky, včely), ale zejména přímým kontaktem květů sousedních rostlin. Při sprášení cizím pylem u květů již opylených vlastním pylem vzniká od 2 do 55 % hybridů, v závislosti na době přenesení pylu. Plodem je pětipouzdrá tobolka, ve které může být až 10 semen. Zpravidla je však v tobolce 7 až 8 vyvinutých semen (Gill, 1987). U kulturního lnu zůstávají zralé tobolky uzavřené, takže nedochází k samovolnému výdrolu semen. Zralé semeno je 4-6 mm dlouhé a 2,4 až 3 mm široké. Hmotnost 1000 semen je podle genotypu 4-13 g (Muir a Westcott, 2003). Semeno nemá dormanci a klíčí při dostatku vláhy ihned po sklizni. 1. 3. 2. Specifické faktory, které ovlivňují rozmnožování (pokud existují) Teplota a vlhkost vzduchu výrazně ovlivňují násadu semen u lnu. Kvetení začíná na teplotě a vlhkosti vzduchu mezi 6.-7. hodinou ranní a ve slunečném počasí již kolem 10. - 11. hodiny opadají korunní plátky květů (Muir a Westcott, 2003). V deštivém počasí se květy rozvíjejí pomalu až do druhého dne. Neopylená blizna zasychá na přímém slunci během několika desítek minut. Pyl přenesený na bliznu klíčí a prorůstá relativně rychle. Již za 2,5-3 hodiny po opylení dosahuje pylová láčka semeníku (Jevminov, 1963) a za 4 hodiny proběhne oplození. Doba kvetení porostu lnu nepřesahuje 2 týdny. Při teplotě 23-26 0 C a slunečním svitu zůstává pyl životný po dobu 3 dnů, při 15-16 0 C ve stínu až 8 dní. 4
1. 3. 3. Generační doba Přadný len v závislosti na odrůdě má vegetační dobu 85-120 dnů. Vegetační doba olejných typů se pohybuje mezi 110 až 120 dny po vzejití (tj. celkově až 135 dnů od výsevu). V našich podmínkách vytváří len jedinou generaci do roka. 1. 3. 4. Sexuální kompatibilita s jinými pěstovanými nebo planými druhy a rozšíření těchto kompatibilních druhů v ČR V našich podmínkách se nevyskytuje žádný z pěstovaných či planě rostoucích druhů, se kterým by docházelo k samovolnému křížení s kulturním lnem L. usitatissimum L. Druh Linum angustifolium, ze kterého pravděpodobně L. usitatissimum pochází (Gill, 1987) a se kterým se kulturní len může úspěšně křížit, se ve volné přírodě na našem území nevyskytuje. 1. 4. Schopnost přežití 1. 4. 1. Schopnost vytvářet struktury, které umožňují přežití nebo dormanci, a délka možného přežívání nebo dormance, Len setý je jednoletou rostlinou bylinného typu. Nevytváří žádné vegetativní orgány umožňující jeho šíření v přírodě. Jedinými částmi rostliny, které umožňují jeho šíření a přežití, jsou semena. Semena lnu si zachovávají v příznivých podmínkách (sucho, teploty nepřekračující 20 o C) klíčivost i deset let, avšak již od třetího roku klíčivost klesá, takže v desátém roce po sklizni je již téměř nulová. Semena lnu nemají dormanci, příležitostně uvolněná dozrálá semena začínají klíčit po kontaktu s půdou při dostatku vláhy již po dvou dnech. Vzhledem ke klimatickým podmínkám v ČR vyklíčí semena z výdrolu během podzimu. Rostliny lnu nestačí před zimním obdobím dosáhnout zralosti a po nástupu mrazů hynou. V našich pěstebních podmínkách nebyly zaznamenány případy přežití nevyklíčených semen z výdrolu do jara následujícího roku. Experimenty firmy Agritec s kompostováním plev s klíčivými semeny lnu dokázaly, že v následujícím roce po založení kompostu se již neobjevily žádné klíční rostliny. Tzv. ozimé lny, seté v první polovině září, přežívají v závislosti na klimatických podmínkách v určitém procentu zimu ve fázi stromečku. Semena tohoto typu lnu rovněž nemají dormanci (jde zde o vyšší odolnost k nízkým teplotám) a semena z výdrolu klíčí ihned, jakmile získají dostatek vláhy. Vzhledem k ranější sklizni ozimého lnu (kolem poloviny července), oproti lnu setému na jaře, mají semena dostatek možností vzejít a většinou se před nástupem mrazů dostávají do fáze rychlého růstu. V této fázi zimu nepřežijí. Část semen může klíčit později (při pozdějším uvolnění z tobolek ze stonků po sklizni nebo při výjimečně dlouhém období bez srážek), potom mohou rostliny ve fázi stromečku přežít do nové vegetace. Při dodržení běžné agrotechniky (podzimní orba, jarní příprava půdy) však ani tyto rostliny nejsou schopny přežít. Při ponechání pozemku po sklizni ladem nejsou schopny rostliny ozimého lnu konkurovat plevelům a nejpozději během následujícího roku odumírají. Jen výjimečně méně oslabené rostliny dozrávají a poskytují klíčivá semena. Ta už však mají na pozemku zarostlém plevelem možnost klíčit velmi omezenou a možnost růstu prakticky žádnou. Pěstování tohoto typu lnu v ČR není zavedeno, neboť jeho odolnost ke chladu není ve většině let dostačující a vymrzáním dochází ke značým ztrátám. 1. 4. 2. Další specifické faktory umožňující přežití, pokud existují Neexistují. 1. 5. Šíření rostliny v prostředí 1. 5. 1. Způsob a rozsah šíření (pokles množství pylu a semen v závislosti na vzdálenosti od zdroje, síly a směru větru, toku vody a dalších faktorech) Pyl lnu je relativně těžký, a proto je špatně přenosný větrem. Cizosprášení u lnu je zprostředkováno hmyzem, hlavně včelami, čmeláky a třásněnkami, nebo přímým kontaktem 5
květů sousedních rostlin. V rámci řešení projektů NAZV QC 1362 (2001-2004) a MŠMT 1M06030 bylo sledováno šíření pylu v porostu lnu. Cizosprášení bylo prokázáno do vzdálenosti 440 cm od zdroje pylu a to ve frekvenci 0,16% (Tejklová, 2005). Semena lnu se nešíří vzduchem ani vodou. Semeny lnu se živí některé druhy zpěvného ptactva: pěnkava obecná, pěnkava jikavec, zvonohlík zahradní, zvonek zelený, stehlík obecný, čížek lesní, konopka obecná, čečetka zimní, hýl rudý, hýl obecný, dlask tlustozobý, strnad obecný, strnad zahradní, strnad luční, vrabec domácí, vrabec polní, bělořit šedý, pěvuška modrá, červenka obecná, rehek domácí, rehek zahradní, bramborníček hnědý, bramborníček černohlavý, linduška luční, skřivan polní a chocholouš obecný (dle sdělení Moravského ornitologického spolku). Kromě zvonka zeleného však všechny ostatní druhy dávají přednost semenům jiných druhů rostlin, kterých nacházejí v době dozrávání lnu dostatek. Zvonci vyzobávají semena z tobolek lnu v období zelené až plné zralosti, což odpovídá konci července až polovině srpna. Mimo toto období nemají ptáci k semenům přístup. 1. 5. 2. Specifické faktory ovlivňující šíření (pokud existují) Šíření lnu je omezováno v důsledku působení těchto faktorů: teplota a vlhkost vyvolávající klíčení semen před příchodem zimy, vlhkost a houbové choroby ničící nevyklíčená nebo klíčící semena i rostliny, výskyt konkurenčních rostlin (plevelů). 1. 6. Zeměpisné rozšíření rostliny Ve světě se len pěstuje na ploše asi 2 mil. hektarů v oblastech mírného a subtropického pásma (především Čína, Indie, Rusko, Holandsko, Belgie, Francie, Kanada, USA). V našich podmínkách se pěstuje olejný len zejména v bramborářských, kukuřičných a řepařských oblastech. 1. 7. Pokud není rostlina v ČR pěstována, popis habitu včetně informace o přirozených konzumentech, patogenech, parazitech, konkurentech a symbiontech Nevztahuje se len je v ČR pěstován 1. 8. Další možné relevantní interakce rostliny s jinými organismy v ekosystému, ve kterém se rostlina obvykle pěstuje V našich podmínkách oblasti pěstování kulturního lnu nedosahují oblastí výskytu planých druhů lnu. Plané druhy lnu vyskytující se v ČR navíc mají (až na jednu výjimku) jiný počet chromozómů, takže nehrozí vznik mezidruhových hybridů. Len žlutý (Linum flavum L.), mající stejný počet chromozómů (n=15), se v pokusech provedených ve firmě Agritec se lnem setým nekřížil ani při umělém opylování (Tejklová a Seidenglanz, 2004). 1. 9. Účinky na zdraví lidí, zvířat a životní prostředí. - toxicita - alergennost - jiné (jednoznačně identifikujte) Len je v naší oblasti tradiční zemědělskou plodinou, Odedávna byl používán nejen k technickým účelům (především pro obsah vlákna ve stonku v textilní výrobě, pro obsah oleje v semeni k výrobě nátěrových hmot, apod.), ale také ke konzumaci (čerstvě vylisovaný olej, celé semeno) nebo jako součást krmiv pro domácí zvířata (celé semeno nebo pokrutiny) (Muir a Westcott, 2003). Nebyly u něho pozorovány toxické účinky na lidi nebo zvířata, i když v malé míře obsahuje některé antinutriční látky (kyanogenní glykosidy). Pro silný laxativní účinek slizů pokrývajících semeno nebyl len nikdy používán v množství, při kterém by se toxické účinky způsobené uvolňováním kyanovodíku z kyanogenních glykosidů mohly za určitých podmínek projevit. Semeno nebo pokrutiny z lněného semene nebyly bez tepelné 6
úpravy zkrmovány přežvýkavci, v jejichž bachoru jsou příhodné podmínky k uvolňování kyanovodíku při požití syrových semen. Z historie nejsou známy případy vyvolání alergických reakcí při kontaktu s rostlinami lnu nebo s produkty z lněného vlákna nebo semene ani při konzumaci produktů z lněného semene. Lněné semeno je dokonce využíváno k výrobě léčiv a kosmetických přípravků. 2. Údaje o genetické modifikaci a geneticky modifikované vyšší rostlině 2. 1. České a latinské rodové a druhové jméno geneticky modifikované vyšší rostliny, s přesným určením kultivaru (odrůdy, linie, hybridu) Len setý (Linum usitatissimum L.), semenná potomstva rostlin pěstovaných v GM skleníku (viz Oznámení č.j. 13527/ENV/10 a Rozhodnutí č.j. 48336/ENV/10) vzniklá samosprášením regenerantů po transformacích šlechtitelských linií AGT 583/05 a AGT 952/04. Předpokládá se, že v následujících letech budou do polních pokusů zařazována semenná potomstva dalších transformatů získaných výše uvedeným konstruktem po transformacích obou linií, jakož i dalších šlechtitelských linií a odrůd lnu. Výhledově budou začleňována i potomstva rostlin získaných transformací nově vyvíjenými konstrukty na bázi FAD2-i. O případném zařazení nových transgenních materiálů lnu bude vždy ministerstvo životního prostředí informováno s předstihem před jejich uvedením do životního prostředí. 2. 2. Popis a charakteristika dědičných vlastností, které byly vloženy nebo změněny, včetně signálních a selekčních genů a předchozích modifikací a popis jejich fenotypových projevů Obě šlechtitelské linie AGT 583/05 a AGT 952/04 byly transformovány bakteriemi kmene GV3101 Agrobacterium tumefaciens nesoucími plazmidový konstrukt ppcv812i/35s/fad2i/35s/gus (FAD2-i GUS). Transformované genotypy obsahují selekční gen hpt pro odolnost k hygromycinu, reportérový gen pro beta-glukuronidázu (GUS, uida) a expresní kazetu se segmentem genu lnu pro FAD2 desaturázu, spacerem a segmentem DNA komplementárním k segmentu daného genu. Transformace byla provedena k uplatnění systému RNA interference k blokaci translace mrna pro FAD2 desaturázu na základě posttranskripčního umlčování genu ( gene silencing ). Gen pro FAD2 desaturázu se exprimuje v buňkách vyvíjejícího se embrya lnu. Nejprve dochází k transkripci, kdy se DNA přepisuje se do mrna. V transformovaných buňkách se současně přepisuje upravený segment FAD2-i. Příslušná mrna pro FAD2-i vytvoří díky navržené sekvenci bází vlásenku, která je rozpoznána jako dvouřetězcová RNA a štěpena na fragmenty. Fragmenty se rozpadnou na jednotlivá vlákna a ta pak nasedají na komplementární úseky mrna pro FAD2. Tato nyní dvouvláknová místa jsou rovněž štěpena a mrna pro FAD2 je rozdělena na fragmenty, podle kterých nemůže dojít k translaci a proto ani nevzniká molekula bílkoviny enzymu FAD2 desaturázy. Enzym FAD2 desaturáza se normálně účastní konverze kyseliny olejové na kyselinu linolovou, ke které tedy v důsledku transformace nemůže dojít. Rostliny lnu nesoucí funkční konstrukt FAD2-i mají v závislosti ještě i na dalších faktorech zvýšený obsah kyseliny olejové, což je cílem transformace. Gen hpt ani gen pro GUS na vlastnosti lnu vliv nemají, jak bylo ověřeno v rámci uzavřeného nakládání firmy Agritec (č.j. 13527/ENV/10, rozhodnutí č.j. 48336/ENV/10) i polních pokusů s GM lnem Agritec (č.j. 1010/OER/GMO/01). 2. 3. Typ genetické modifikace 2. 3. 1. Vnesení cizorodého dědičného materiálu ANO v obou případech 2. 3. 2. Vynětí části dědičného materiálu NE v obou případech 7
2. 3. 3. Kombinace vynětí a vnesení dědičného materiálu NE v obou případech 2. 3. 4. Buněčná fúze NE v obou případech 2. 3. 5. Jiné (jednoznačně identifikujte) NE v obou případech 2. 4. Vlastnosti a původ použitého vektoru (pokud byl vektor při genetické modifikaci použit) (+ mapa vektoru) K transformaci lnu byl použit konstrukt připravený ve firmě Agritec s.r.o. Šumperk ve spolupráci s Ústavem Biochemie a Mikrobiologie, VŠCHT v Praze v r. 2009. Příprava konstruktu: 1) vektor: plasmid ppcv812i (Koncz et al. 1994). Tento plasmid nese gen pro ß- glukuronidasu s intronem a byl použit jako výchozí vektor. 2) příprava plasmidu ppcv812i/35s: do plasmidu ppcv812i byl vnesen CaMV 35S promotor o velikosti 810 bp a to do míst EcoRI/BamHI. (Surá et al. 2004). 3) příprava plasmidu ppcv812i/35s/fad2i/35s/gus: Do ppcv812i/35s byla do místa EcoRI vnesena (Ústav Biochemie a Mikrobiologie, VŠCHT v Praze, 2009) kazeta 35S/FAD2i o velikosti 1600 bp (Agritec s.r.o. Šumperk). Genetická mapa plasmidu 2PCV812i/35S/FAD2i/35/GUS (FAD2-i GUS): Hind III HindIII Eco RI 35S FAD2 FAD2 Sma I Eco RI kazeta 35S FAD2-i 8
Plasmidový konstrukt obsahuje expresní kazetu FAD2-i (promotor CaMV 35S, segment DNA pro FAD2 desaturázu, spacer, invertovaný segment DNA), promotor CaMV 35S z plazmidu pan4, hpt gen z E. coli, gen pro -glukuronidázu s intronem z E. coli (K12). K přenosu plasmidového konstruktu byl použit kmen GV3101 Agrobacterium tumefaciens, který neobsahuje gen pro rezistenci k hygromycinu, což umožnilo použít gen hpt přítomný v konstruktu k selekci transformantů. Vektorové bakterie A. tumefaciens i transformované rostliny je možné identifikovat na základě průkazu přítomnosti transgenu hpt nebo gus v jejich DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) a jejich modifikací. Pozn. FAD2 gen je lnu vlastní, a proto sekvenci FAD2-i nelze použít pro detekci inzertu běžnou PCR. Detekce PCR GUS ppcv812i/35s/fad2i/35s/gus: Pár primerů produkující část genu pro ß-glukuronidasu s intronem: primer 1 (5-3 ) ACGTCCTGTAGAAACCCCAA primer 2 (5-3 ) CCCGCTTCGAAACCAATGCC produkt: 544 bp Alternativně: jiný pár primerů (mimo intron, Horáček, Agritec, leden 2011): primer 1 (5-3 ) GGC ACA GCA CAT CAA AGA GA primer 2 (5-3 ) CTG ATA GCG CGT GAC AAA AA produkt: 211 bp Detekce nested-pcr transgenu hpt: pica1: 5 -ATGCGCARGAGGCTCGTCTTCGAG pica2: 5 -GACGCAACGCATCCTCGATCAGCT specificky amplifikují oblast 568 bp (Kononov et al. 1997), pro druhý běh nested-pcr pica3: 5 -GAGGATGGTTGTGTCTATCGCG pica4: 5 -CTTCTTGTGCCAATAATTGCCG velikost produktu: 283 bp 2. 5. Údaje o každé části úseku DNA, který byl vnesen do organismu příjemce (pokud genetická modifikace zahrnuje vnesení dědičného materiálu) 2. 5. 1. Původ (české a latinské rodové a druhové jméno dárcovského organismu přesným určením kultivaru -odrůdy, rasy, plemene, linie, formy, hybridu, kmene, patovaru) Název plasmidu ppcv812i/35 S/FAD2i/35S /GUS = FAD2-i GUS Inserty Zdroj Funkce Reference hpt E. coli rezistence rostlin k hygromycinu uida= GUS FAD2i E. coli (K12) signální gen pro GUS = betaglukuronidázu Linum usitatissimum L. gene silencing mrna pro FAD2 desaturázu CaMV 35S virus žilkové mozaiky květáku konstitutivní promotor Amp R E. coli selektovatelný gen pro rezistenci vektorových bakterií k ampicilinu KONCZ et al. (1994) VANCANNEYT et al. (1990) Genbank acc No. DQ222824, nepublikováno KONCZ et al. (1994) KONCZ et al. (1994) 9
Údaje o dárcovských organizmech pro jednotlivé dílčí konstrukty jsou uvedeny v bodě 2.4. Segment genu pro FAD2 byl uměle syntetizován. 2. 5. 2. Funkční charakteristika viz bod 2.5 2. 5. 3. Velikost Nebyla dosud zjišťována, bude předmětem analýz linií GM lnu, jež budou vybírány na základě výsledků polních testů 2. 5. 4. Poloha - pokud byl integrován Poloha vneseného inzertu nebyla zatím pro jednotlivé linie transformantů zjišťována viz bod 2.5.3. 2. 5. 5. Sekvence Nebyly dosud pro jednotlivé linie transformantů zjišťovány viz bod 2.5.3. 2. 6. Pokud se jedná o vynětí části dědičného materiálu (deleci), velikost a funkce vyňatého úseku Nejedná se o delece dědičného materiálu 2. 7. Popis metody použité pro genetickou modifikaci Transformace byly provedeny pomocí vektorových bakterií Agrobacterium tumefaciens modifikovanou kokultivační technikou dle Donga a McHughena (1993). 2. 8. Jestliže je příjemce nebo rodičovský organismus lesní dřevina, popište způsoby šíření a specifické faktory ovlivňující šíření Není 2. 9. Umístění vloženého dědičného materiálu v rostlinné buňce (vložen do chromozómů, chloroplastů nebo v neintegrované formě) Podle stávajících výsledků genetických a molekulárních analýz se předpokládá vložení DNA do chromozómů. 2. 10. Počet kopií vloženého dědičného materiálu Nebyl dosud studován. Bude předmětem analýz u jedinců vybraných na základě jejich úspěšnosti v polních testech. 2. 11. Stabilita vloženého dědičného materiálu a stabilita jeho umístění Byla prokázána přítomnost genu uida pro GUS v explantátech v in vitro kultuře, v regenerovaných rostlinách ve fázi stromečku a v regenerovaných rostlinách ve fázi kvetení jednak barevnou reakcí se substrátem, jednak metodou PCR. Dále byl prokázán přenos po autogamii rostlin do generace T2, v níž byla pomocí RT-PCR prokázána cdna pro FAD2 u kontrolní varianty, zatímco v regenerantech vykazujících barevnou reakci GUS se substrátem (transformovaných regenerantech) nebyla cdna pro FAD2 prokázána, což svědčí o RNA umlčování genu pro FAD2 díky vnesenému konstruktu. 2. 12. Metody stanovení uvedených údajů K důkazu přenosu plasmidu do lnu je používan test na GUS (na aktivitu beta-glukuronidázy), metoda PCR ke stanovení genů hpt a uida a metoda RT PCR ke stanovení RNA-i blokace exprese FAD2. 10
2. 13. Údaje o expresi vloženého dědičného materiálu 2. 13. 1. Místo, kde dochází v rostlině k expresi vložených genů (např. kořeny, lodyha, listy, pyl apod.) Exprese genu uida pro GUS byla zatím prokázána v listech a stoncích. RNA-i blokace byla prokázána v embryích v kotyledonárním stádiu. 2. 13. 2. Změny exprese v závislosti na životním cyklu rostliny Nebyly zatím sledovány viz bod 4.2. Část A 2. 13. 3. Stabilita exprese Nebyla zatím sledována viz bod 4.2. Část A 2. 13. 4. Metody použité pro charakterizaci exprese RT PCR 2. 14. Údaje umožňující jednoznačnou identifikaci geneticky modifikované vyšší rostliny 2. 14. 1. Popis části změněné DNA Viz body 2.4 a 2.5 2. 14. 2. Metody detekce a identifikace geneticky modifikované vyšší rostliny a jejich ověřená metodika Detekce PCR plasmidu ppcv812i/35s/fad2i/35s/gus: Pár primerů produkující část genu pro GUS (uida) s intronem: primer 1 (5-3 ) ACGTCCTGTAGAAACCCCAA primer 2 (5-3 ) CCCGCTTCGAAACCAATGCC velikost produktu: 544 bp Jiný pár primerů (mimo intron, Horáček, Agritec, leden 2011): primer 1 (5-3 ) GGCACAGCACATCAAAGAGA primer 2 (5-3 ) CTGATAGCGCGTGACAAAAA velikost produktu: 211 bp 2. 15. Chování vložených genů 2. 15. 1. Při hybridizaci se stejným druhem Na základě literárních údajů i výsledků předchozích polních studií firmy Agritec s GM lnem prováděných podle rozhodnutí MŽP (č.j. 1010/OER/GMO/01, č.j. 20955/ENV/07) se vložené transgeny chovají jako dominantní geny a jsou přenášeny mendelististicky na potomstvo. Přestože nejsou očekávány odchylky od tohoto pravidla, bude v pokusech chování vložených cílových genů studováno. Len je samosprašnou rostlinou s velmi nízkým podílem cizosprášení (0-1,38 % podle vzdálenosti). Předpokládá se, že při případné hybridizaci GM linie s jedinci jiné odrůdy budou transgeny přenášeny a exprimovány stejným způsobem jako při samosprášení. 2. 15. 2. Při hybridizaci se vzdálenými druhy Hybridizace s Linum flavum, jediným druhem z rodu Linum vyskytujícím se přirozeně v ČR se stejným počtem chromozómů jako u L. usitatissimum byla neúspěšná. 11
2. 16. Jednoznačné údaje o tom, v čem se geneticky modifikované vyšší rostliny liší od příjemce nebo rodičovského organismu - způsob a rychlost rozmnožování: Některé z regenerantů byly částečně sterilní, jiné se od netransformované kontroly ve skleníkových podmínkách nelišily. - šíření v prostředí: nepředpokládá se odlišnost - schopnost přežití: nepředpokládá se odlišnost - účinky na zdraví lidí, zvířat a životní prostředí: nepředpokládá se odlišnost - jiné (upřesněte) 2. 17. Fenotypová stabilita geneticky modifikované vyšší rostliny Bude studována v rámci uvádění transformovaného lnu do životního prostředí. 2. 18. Jakákoliv změna schopnosti geneticky modifikované vyšší rostliny přenášet genetický materiál na jiné organismy v důsledku genetické modifikace Nepředpokládá se. 2. 19. Informace o každém možném škodlivém účinku geneticky modifikované vyšší rostliny na zdraví lidí způsobeném genetickou modifikací Nepředpokládají se žádné škodlivé účinky GM lnu v důsledku genetické modifikace. Při transformaci FAD2-i je do lnu vnášen segment vlastního genu, jedná se zde o umlčení genu rostlině vlastního. Použitý selekční gen hpt pro odolnost k hygromycinu nemá na zdraví lidí žádné nepříznivé účinky. Gen hpt byl zařazen vědeckým výborem Evropského úřadu pro bezpečnost potravin (EFSA) do nejnižší kategorie selektovatelných genů kódujících odolnost k antibiotikům s žádnými či velmi nízkými potenciálními riziky na zdraví člověka a zvířat (EFSA 2004). 2. 20. Údaje o bezpečnosti geneticky modifikované vyšší rostliny pro zdraví zvířat, zejména s ohledem na jakékoliv škodlivé účinky způsobené genetickou modifikací, pokud má být geneticky modifikované vyšší rostliny použito jako krmivo Předmětem plánovaných polních pokusů s GM liniemi lnu není jeho potravinářské či krmivářské užití. Po vyhodnocení pokusů a sklizni budou zbytky rostlin zničeny. Odpad po odsemeňování bude spálen na vyhrazeném místě nebo zkompostován na kompostu pro tento účel zřízeném (viz žádost č.j. MŽP 20955/ENV/07, rozhodnutí č.j. 20955/ENV/07). 2. 21. Mechanismus interakce mezi geneticky modifikovanou vyšší rostlinou a cílovým organismem, pokud cílový organismus existuje Cílový organismus neexistuje. 2. 22. Možné změny v interakcích geneticky modifikované vyšší rostliny s necílovými organismy plynoucí z genetické modifikace Nepředpokládají se. 2. 23. Možné interakce geneticky modifikované vyšší rostliny s neživými složkami životního prostředí Nepředpokládají se. 3. Údaje o množství geneticky modifikovaných vyšších rostlin, které má být použito, a o celkové rozloze pozemků 3. 1. Přibližné množství geneticky modifikovaných vyšších rostlin, které má být uváděno do životního prostředí 12
V polních podmínkách bude hodnocen materiál T2 generace získaný z transformačních pokusů v rámci uzavřeného nakládání. V jednotlivých letech se bude počet rostlin uváděných do životního prostředí lišit v závislosti na výsledcích skleníkových pokusů. Průměrně se bude jednat řádově o tisíce až desítky tisíc rostlin lnu pěstovaných v polních pokusech ročně. V r. 2012 bude vyseto cca 30 linií odvozených ze tří původních regenerantů (počet záleží na dozrání semen regenerantů ve skleníku). Materiál bude v tomto roce v polních podmínkách především namnožen pro další analýzy. V dalších letech bude hodnocen vybraný materiál v T3 a vyšších generací a půjde o desítky tisíc rostlin. 3. 2. Celková rozloha plochy, na které mají být geneticky modifikované vyšší rostliny pěstovány V polních podmínkách bude hodnocen materiál jednak nově získaný z pokusů v rámci uzavřeného nakládání, v dalších letech také z předchozích polních pokusů pro opakované pozorování. V jednotlivých letech se bude plocha, na které bude GM len uváděn do životního prostředí, lišit v závislosti na výsledcích skleníkových a polních pokusů. Průměrně se bude jednat o plochu kolem 100 m 2 (včetně cestiček mezi parcelkami). Tyto pokusy budou přiřazeny ke stávajícím polním pokusům s GM lnem uváděným do životního prostředí na základě Žádosti č.j. MŽP 20955/ENV/07 a Rozhodnutí č.j. 20955/ENV/07. 4. Pracoviště a pozemky, na kterých bude uvádění do životního prostředí probíhat (+) Havarijní plán podle 20 zákona příloha č. 1 (+) Provozní řád pracoviště podle přílohy č. 4 zákona příloha č. 2 (+) Kopie katastrálních map s vyznačením pozemku a přehledná mapka s vyznačením plodin, pěstovaných na okolních pozemcích příloha č. 2 Havarijního plánu (přílohy č. 1); přehledná mapka s vyznačením místa pěstování GM lnu a plodin pěstovaných na okolních pozemcích bude MŽP poskytována vždy v předstihu před výsevem. 4. 1. Účel uvádění do životního prostředí (včetně všech relevantních informací dostupných v této fázi), jako například agronomické účely, zkoušky hybridizace, změna schopností přežití nebo šíření, zjišťování účinků na cílové nebo necílové organismy V potomstvech regenerantů budou v polních podmínkách vyhledávány odchylné typy (díky somaklonální variabilitě nebo vlivem místa inzerce konstruktu do chromozómu) od výchozího materiálu použitého pro transformace zejména s ohledem na jejich možné šlechtitelské využití. Ve sklizených semenech bude sledován obsah mastných kyselin v semenném oleji. Bude také sledován přenos transgenu do dalších generací a exprese transgenu v polních podmínkách. Dále bude sledován případný vliv transgenu na morfologické znaky a biologické charakteristiky. 4. 2. Umístění pozemku 4. 2. 1. Kraj Olomoucký 4. 2. 2. Obec Vikýřovice 4. 2. 3. Název katastrálního území a parcelní číslo V katastrálním území Vikýřovice bude v jednotlivých letech vyséván GM len v osevním sledu na parcelách č. 1670/1-9, 1712/1-24 a 1715/1-15 (viz příloha č. 2a-2c Havarijního plánu přílohy č. 1 Žádosti). Firma AGRITEC s.r.o. si tento pozemek pronajímá od uživatele pozemku - Výzkumného ústavu pro chov skotu (VÚCHS) Rapotín. Parcelky s GMO jsou 13
umisťovány podle osevního plánu, a proto se v jednotlivých letech budou nacházet na různých místech pozemku, vždy v bloku ostatních pokusných parcel firmy AGRITEC s.r.o. Pro každý rok bude vytvořen plánek umístění polního pokusu (kopie katastrální mapy, do které bude zakresleno umístění parcely s GMO) pro rok 2012 viz příloha 3 Havarijního plánu. 4. 2. 4. Identifikační číslo půdního bloku a případně dílu půdního bloku, je-li pozemek předmětem evidence využití zemědělské půdy podle zvláštního právního předpisu 10) Nevztahuje se. 4. 3. Velikost pozemku 4. 3. 1. Poloha pěstování geneticky modifikované vyšší rostliny na pozemku a její velikost (m 2 ) (plánek ve vhodném měřítku) Plocha osetá GM lnem bude v jednotlivých letech přibližně 10-100 m 2 (v závislosti na množství vyprodukovaného osiva). Plánek pro r. 2012 je přikládán formou přílohy č. 3 k Havarijnímu plánu (příloha č. 1 Žádosti), v dalších letech bude každoročně zasílán na MŽP. VÚCHS bez problémů umožňuje vstup na pozemky odpovědným pracovníkům firmy Agritec, kteří provádějí kontroly pozemků v následujících letech po pěstování transgenního materiálu. 4. 3. 2. Velikost (m 2 ) a způsob využití izolačního pásma kolem plochy pěstování geneticky modifikované vyšší rostliny (vyznačit v plánku) Kolem plochy pěstování GM lnu bude cesta nejméně 3 m široká, na které budou likvidovány veškeré rostliny lnu vzešlé z případně vytroušených semen při setí. 4. 4. Využití okolních pozemků Pozemek, který je firmou Agritec využíván k polním pokusům, je rozdělen do pěti honů. Jeden hon je vždy obsazen pokusy firmy Agritec (hrách, peluška, vikve, lupina, bob koňský, netransgenní a transgenní len), ostatní čtyři pak slouží VÚCHS Rapotín k pěstování polních plodin (obiloviny, ozimá řepka, svazenka atd., nikdy len). Blok pokusů se každoročně posouvá v souladu s osevním plánem, takže se na stejný hon dostává až po pěti letech. Uvedené parcely se nacházejí mezi poměrně málo frekventovanou silnicí 3. třídy a železniční tratí vedoucí na zvýšeném náspu. Pozemky za železniční tratí jsou využívány jako pastviny. K pěstování GM rostlin lnu budou vybírány plochy u železniční trati ve vzdálenosti min. 300 m od ostatních porostů lnu (izolační vzdálenost je větší než vzdálenost daná směrnicemi ÚKZÚZ pro len, přitom naše normy jsou v tomto ohledu jedny z nejpřísnějších). Body 4.5.1. 4.5.5. viz Žádost č.j. MŽP 20955/ENV/07 a Rozhodnutí č.j. 20955/ENV/07. Pro úplnost a přehlednost uvedeny i zde: 4. 5. Vzdálenost pozemku od specifických území (v metrech nebo kilometrech) 4. 5. 1. Zvláště chráněná území 11) Pozemek je vzdálen 2 km vzdušnou čarou od okraje Chráněné krajinné oblasti Jeseníky a 8 km vzdušnou čarou od nejbližší národní přírodní rezervace Rašeliniště na Skřítku. 4. 5. 2. Ochranná pásma vodních zdrojů V blízkosti pěstební lokality se nenachází. 14
4. 5. 3. Vodní toky, vodní nádrže Nejbližší vodní tok je vzdálen cca. 500 metrů od lokality. Kontaminace vodních ploch GM rostlinami lnu ani jejich částmi není aktuální. 4. 5. 4. Území obhospodařovaná v ekologickém zemědělství 12) V blízkém okolí se nenachází žádná plocha obhospodařovaná v režimu ekologického zemědělství. 4. 5. 5. Jiné Nevztahuje se 4. 6. Způsob zabezpečení pozemku 4. 6. 1. Zabezpečení pozemku proti neoprávněným osobám Pokusné plochy firmy AGRITEC s.r.o. jsou označeny tabulemi a je do nich přístup nepovolaných osob zakázán. Vlastní parcelka pro pěstování GM rostlin lnu bude dále označena tabulemi Pokusný pozemek firmy Agritec s.r.o. Vstup zakázán! Geneticky modifikovaný len a výstražnou značkou Biohazard. Body 4.6.2. 4.8. viz Žádost č.j. MŽP 20955/ENV/07 a Rozhodnutí č.j. 20955/ENV/07. Pro úplnost a přehlednost uvedeny i zde: 4. 6. 2. Zabezpečení pozemku proti zvěři Na pozemek občas vstupují zajíci, srnci a divoká prasata. Vzhledem k tomu, že v blízkém okolí se vyskytují pokusy a ochranné pásy oseté hrachem, nevěnují zvířata lnu pozornost. V nutných případech jsou zvířata z pozemku odháněna. 4. 6. 3. Zabezpečení pozemku proti splachu Pozemek se nachází na rovině, kde prakticky nehrozí nebezpečí splachu. 4. 7. Popis ekosystému v místě pozemku Typ pěstební oblasti: bramborářská, subtyp bramborářsko-pšeničný 4. 7. 1. Typ půdy hnědá půda, ilimerizovaná, oglejená, středně těžká zásoba živin P, K, Mg: střední 4. 7. 2. Vodní režim včetně zavlažování Pozemek není zavlažován. 4. 7. 3. Klimatické podmínky nadmořská výška: 315 m roční teplotní normál: 7,45 o C roční srážkový normál: 693 mm 4. 7. 4. Flóra včetně zemědělských plodin V nejbližším okolí lokality se vyskytuje flóra a fauna typická pro zemědělskou oblast bramborářského typu, bramborářsko-pšeničného subtypu. Běžně jsou zastoupeny zejména plevele jako pýr plazivý, ježatka kuří noha, rozrazil rolní, zemědým lékařský, penízek rolní, violka trojbarevná rolní, hluchavka nachová, konopice rolní, heřmánkovec přímořský, svízel přítula, pcháč rolní, přeslička rolní. V blízkosti pokusů firmy Agritec není zásadně vyséván len (dohoda s VÚCHS). 15
4. 7. 5. Fauna včetně hospodářských a migrujících zvířat Z hmyzu jsou zastoupeny zejména slunéčko sedmitečné, dřepčík, včela medonosná, střevlíci. Lokalitu navštěvují běžní obratlovci jako hraboši, myši, zajíci, srnci, prase divoké, bažanti, koroptve, křepelky a drobné ptactvo. Porosty lnu bývají navštěvovány zejména zvonkem zeleným. Jde o druh obecně rozšířený, v posledních letech přemnožený a působící značné škody na porostech lnu, řepky a dalších zemědělských plodin. Ze savců připadá jako konzument lněného semene v úvahu hraboš polní. Na pozemek nevstupují žádná hospodářská zvířata. 4. 8. Přítomnost planých nebo pěstovaných sexuálně kompatibilních rostlin na pozemku a v jeho okolí Na pozemku ani v jeho okolí nejsou přítomny žádné sexuálně kompatibilní rostliny. 4. 9. Relevantní údaje týkající se předchozích případů uvádění do životního prostředí stejné geneticky modifikované vyšší rostliny, pokud existují, zejména ve vztahu k možným vlivům na zdraví lidí a zvířat, životní prostředí a biologickou rozmanitost V letech 1999-2011 byly na stejném pozemku stejnou firmou uváděny do životního prostředí lny po inzerční mutagenezi, po transformaci genem bar (nefunkčním, jak se později ukázalo), lny po transformaci s cílem zvýšení schopnosti odčerpávat těžké kovy z půdy a lny s konstruktem s předpokládaným pozitivním účinkem na odolnost lnu ke škůdcům a chorobám. Žádný vliv na zdraví lidí ani zvířat, na životní prostředí nebo biologickou rozmanitost nebyl zjištěn. 5. Popis nakládání s geneticky modifikovanými vyššími rostlinami 5. 1. Nakládání s geneticky modifikovanými vyššími rostlinami před jejich uváděním do životního prostředí (uzavřené nakládání, přeprava) Materiál uváděný do životního prostředí byl ve firmě Agritec Plant Research s.r.o. získán transformací výše zmíněných linií lnu uvedeným konstruktem (oznámení č.j. 13527/ENV/10 a rozhodnutí č.j. 48336/ENV/10 o uzavřeném nakládání). Explantáty jsou udržovány ve sterilních in vitro podmínkách (v uzavřených kultivačních baňkách), manipulace s explantáty probíhá v laminárním boxu typu Biohazard, zakořeněné prýty (rostliny T1 generace) jsou dopěstovány do semen (T2 generace) v kontejnerech ve fytotronu nebo ve skleníku určených pro práci s GMO. Získaná semena jsou uložena do sáčků a do uzavíratelných boxů (plastové truhlíky RM Plastig s.r.o., kat č. 074 nebo 075 - bez otvorů, opatřené víky z dřevotřísky). Je-li z regenerantů sklizeno příliš malé množství semen pro následný výsev na pole, je osivo v následujícím roce přemnoženo opět ve skleníku (sklizena semena T3 generace). 5. 2. Postup, kterým budou geneticky modifikované vyšší rostliny uváděny do životního prostředí Výsev, ošetřování během vegetace a sklizeň GM lnu bude prováděna stejným způsobem jako u netransformovaného lnu. Výsev potomstev jednotlivých rostlin bude prováděn ručně, výsev většího množství osiv (do řádků dlouhých 1m) bude prováděn bezezbytkovým secím strojem Hege. Během vegetace budou jednotlivé testované linie odvozené z regenerantů sledovány a porovnávány s výchozími odrůdami, které budou současně vysety jako kontroly. Budou vyhledávány a označovány genotypy s morfologickými a dalšími odchylkami od výchozích materiálů. 16
Z potomstev jednotlivých regenerovaných rostlin budou odebrány vzorky k analýzám. Bude v nich prokazována přítomnost vneseného konstruktu. Ve zralých semenech bude stanovován obsah mastných kyselin. O průběhu pozorování a provádění pokusu budou vedeny záznamy. Rovněž bude provedena fotodokumentace pokusu. Sklizeň bude prováděna ručně vytrháním rostlin, jen v případě zkoušek výnosu na parcelách velkých 10m 2 bude sklizeň prováděna maloparcelkovým kombajnem. Body 5.3. 5.4. a 5.6., 5.8., 5.10. - viz Žádost č.j. MŽP 20955/ENV/07 a Rozhodnutí č.j. 20955/ENV/07. Pro úplnost a přehlednost uvedeny i zde: 5. 3. Přibližný počet geneticky modifikovaných vyšších rostlin na m 2 Na 1 m 2 se vysévá kolem 1000 semen, do zralosti dorůstá zpravidla kolem 700 rostlin. 5. 4. Příprava a způsob úpravy pozemku před pěstováním geneticky modifikovaných vyšších rostlin Běžný postup jako pro geneticky nemodifikovaný len. Podle aktuálního stavu půdy na pozemcích budou použity: podmítka, středně hluboká orba, smykování, vláčení, kypření kombinátorem, základní hnojení NPK. 5. 5. Způsob dopravy geneticky modifikovaných vyšších rostlin Osiva i sklizené rostliny a semena budou převážena vlastními vozidly firmy Agritec v uzavřeném prostoru. Na pole budou semena určená k výsevu přepravována v sáčcích nebo ve skleničkách používaných k setí strojem Hege, uložených v umělohmotných přepravkách bez otvorů (např. Manutan CL605005) s víkem. Přepravky budou v úložném prostoru vozidla zabaleny do plachet z hustě tkané látky nebo husté síťoviny, která zabrání případnému vysypání semen do přepravního prostoru vozu. Sklizené rostliny a sklizená semena (po kombajnové sklizni) budou uloženy do pytlů z husté síťoviny a převezeny v uzavřeném voze zabalené v plachtě z hustě tkané látky nebo husté síťoviny, která zabrání případnému vysypání semen uvolněných z rostlin do přepravního prostoru vozu, do areálu firmy k dalšímu zpracování. 5. 6. Způsob ochrany zdraví pracovníků v průběhu nakládání s geneticky modifikovanými vyššími rostlinami v souladu se zvláštními právními předpisy 9) Materiál, se kterým bude nakládáno, nepodléhá žádným zvláštním právním předpisům. Proto při nakládání budou používány běžné ochranné pomůcky odpovídající charakteru dané činnosti. 5. 7. Způsob kultivace geneticky modifikovaných vyšších rostlin na pozemku Přibližně v polovině dubna každého roku (podle klimatických podmínek) budou vyseta semena genotypů vybraných pro hodnocení v polních podmínkách. V souladu s agrotechnikou běžně používanou ve lnu budou porosty ošetřovány proti škůdcům (dřepčíkům) a proti plevelům (jednoděložným, dvouděložným). Výsev semen sklizených z regenerantů T1 bude proveden ručně, v případě většího množství osiva v T2 a vyšších generacích bude k výsevu využito bezezbytkových secích strojů typu Hege. Výsev bude prováděn proškolenými pracovníky za přítomnosti zodpovědné osoby dr. E. Tejklové. Po výsevu bude technika zkontrolována, případné zbytky semen budou odstraněny, obaly použité pro převoz a výsev osiva budou vyčištěny, zbytky semen budou převezeny na pracoviště k likvidaci zkompostováním na kompostu pro GMO, viz Oznámení č.j. 5603/ENV/06 a Rozhodnutí č.j. 5603/ENV/06 o uzavřeném nakládání a Žádost č.j. MŽP 20955/ENV/07 a Rozhodnutí č.j. 20955/ENV/07 o uvádění GM lnu do životního prostředí. 17
Ošetřování rostlin během vegetace bude stejné jako u netransgenního lnu: ošetření proti dřepčíkům (Vaztak aj.) v době vzcházení, postemergentní ošetření proti plevelům jednoděložným (Pantera aj.) a dvouděložným (Glean 75 WG, Basagran aj.). 5. 8. Způsob sklizně geneticky modifikovaných vyšších rostlin Po dozrání budou rostliny sklizeny ručně vytrháním nebo v případě hodnocení ve zkouškách výkonu budou sklizeny maloparcelkovým kombajnem. 5. 9. Popis dalšího nakládání s geneticky modifikovanými vyššími rostlinami GM len bude zpracováván odděleně od ostatního, netransgenního materiálu. Sklizené rostliny a semena budou uloženy na půdě snopkárny, resp. ve stodole na sušce, které jsou uzamčeny a kam mají přístup pouze oprávněné osoby proškolené v nakládání s GMO, k dosušení. Vybrané rostliny (s detekovanými odchylkami) budou rozborovány a jednotlivě ručně odsemeněny. Ostatní rostliny budou odsemeněny po svazcích na drhlíku. Semena budou uložena na určeném místě na půdě technohaly do doby, než budou podrobena dalším analýzám, případně připravena pro výsev. Pracoviště bude vždy dokonale uklizeno od zbytků rostlin a semen smetením a vysátím. Odpad bude na vyhrazeném místě zkompostován viz Oznámení č.j. 5603/ENV/06 a Rozhodnutí č.j. 5603/ENV/06 o uzavřeném nakládání. Semena budou dále hodnocena a použita k testům v rámci uzavřeného nakládání: Hodnocení barvy, velikosti, zdravotního stavu, semen, stanovení obsahu oleje, obsahu mastných kyselin, výsev na plata ve skleníku pro nakládání s GMO pro získání vzorků na PCR analýzy apod. 5. 10. Termín a způsob vyhodnocení uvádění geneticky modifikovaných vyšších rostlin do životního prostředí Každoročně budou semena vysévána ve druhé polovině dubna (v závislosti na klimatických podmínkách), rostliny budou sklízeny během srpna (v závislosti na klimatických podmínkách), sklizené rostliny a semena zpracována během října až prosince, případně během prvních měsíců následujícícho roku. Každoročně bude v lednu na MŽP ČR podáváno hlášení v souladu se zákonem č. 78/2004 Sb. o nakládání s GMO. Body 6.1. 6.5.4. a 6.5.6. 6.7. viz Žádost č.j. MŽP 20955/ENV/07 a Rozhodnutí č.j. 20955/ENV/07. Pro úplnost a přehlednost uvedeny i zde: 6. Opatření na ochranu zdraví lidí, zvířat, životního prostředí a biologické rozmanitosti a nakládání s odpadem 6. 1. Vzdálenost plochy pěstování geneticky modifikovaných vyšších rostlin od planých nebo pěstovaných sexuálně kompatibilních druhů rostlin Bude dodržována minimální vzdálenost 300 m od ploch osetých netransgenním lnem. 6. 2. Opatření pro snížení nebo zabránění úletu pylu nebo semen, jsou-li použita Mimo výše uvedených, nejsou potřebná žádná další opatření. 6. 3. Popis metod pro úpravu pozemku po skončení pokusu Po sklizni je pozemek ponechán do vzejití semen z výdrolu bez ošetření, vzešlé rostliny jsou ošetřeny totálním herbicidem (Roundup), další postup podle běžné agrotechniky. 6. 4. Popis metod pro dopravu a zpracování geneticky modifikovaných vyšších rostlin Celé sklizené rostliny budou uloženy do pytlů z husté síťoviny a převezeny v uzavřeném voze zabalené v plachtě z hustě tkané látky nebo husté síťoviny, která zabrání případnému vysypání semen uvolněných z rostlin do přepravního prostoru vozu, do areálu firmy, kde 18
budou uloženy na dosušení v určených půdních prostorách. Sklizená semena (po kombajnové sklizni) budou přepravována v pytlích z husté síťoviny uložených v umělohmotných přepravkách s víkem (bez otvorů např. Manutan CL605005). Rostliny a semena budou dále využity k účelům uvedeným v bodě 5.9. 6. 5. Kontroly a monitorování výskytu a účinků geneticky modifikovaných vyšších rostlin 6. 5. 1. Metody zjišťování přítomnosti geneticky modifikovaných vyšších rostlin a monitorování jejich účinků na ekosystém Monitoring v průběhu vegetačního období: Plán monitoringu je založen na závěrech hodnocení rizika GM lnu vůči životnímu prostředí a má za cíl včasné zjištění a identifikaci jevů, které by měly očekávaný i neočekávaný vliv v důsledku uvedení GM rostlin lnu do životního prostředí. Bylo prokázáno, že při dodržení minimální vzdálenosti pěstování GM lnu od ostatních ploch lnu nehrozí žádné riziko jeho úniku do životního prostředí. Přesto však byla přijata opatření k omezení potenciálních rizik nakládání na nejmenší možnou míru. Vlastní pozemek a jeho nebližší okolí budou v průběhu vegetační doby pravidelně kontrolovány min. 1 x za 2 týdny zodpovědným pracovníkem, případně doprovázeným vedoucím oddělení či osobou odborného poradce. O výsledku provedené kontroly budou prováděny písemné záznamy. Zaznamenávány budou veškeré skutečnosti týkající se nejen samotného porostu GM lnu, ale i možných vlivů na okolí a na sousední plochy s dalšími plodinami. Na základě běžné zemědělské praxe budou zaznamenávány obecné charakteristiky plodiny (UPOV), vztahující se k agronomickým vlastnostem GM linií lnu, jako odolnost k patogenům, napadení škůdci atd. Záznamníky budou doplňovány o nové údaje během celého období uvádění GM lnu do životního prostředí. Chování geneticky modifikovaných linií lnu bude porovnáváno s chováním odrůd příjemce, které budou pěstovány paralelně na stejném pokusném místě jako srovnávací kontrola. Posklizňový monitoring pokusných ploch: Po sklizni bude ve dvoutýdenních intervalech monitorován výskyt rostlin lnu vzešlých z výdrolu. Vzešlé rostliny budou zlikvidovány ošetřením totálním herbicidem Roundup. V průběhu následující sezóny bude monitorován výskyt rostlin lnu v následné plodině pěstované na pokusné ploše a v jejím nejbližším okolí. V případě výskytu budou rostliny lnu vytrhány, při masovějším výskytu budou zlikvidovány aplikací selektivního herbicidu dle typu následné plodiny. Dosud ale takové případy nejsou známy ani ze zemědělské praxe v ČR, ani z pokusů s transgenním lnem dosud prováděných v rámci uvádění do životního prostředí firmou Agritec s.r.o. Při běžné agrotechnice nepřežívá len přes zimu ani ve vegetativním stadiu, ani ve formě semen. Očekává se, že pěstování GM lnu za účelem realizace polních pokusů nebude mít žádný jiný vliv na ekosystém, než jaký má netransgenní len. Konstrukty, respektive transgeny vnesené do rostlin jsou detekovatelné PCR metodou za použití příslušných primerů (viz bod 2.4. této žádosti). 6. 5. 2. Specificita metod identifikace geneticky modifikovaných vyšších rostlin a odlišení geneticky modifikovaných rostlin od dárcovského organismu, příjemce, případně rodičovského organismu, citlivost a spolehlivost těchto metod Konstrukt, respektive transgen GUS nebo hpt vnesený do rostlin je detekovatelný PCR metodou za použití příslušných primerů (viz bod 2.4. této žádosti). Tato metoda je dostatečně citlivá a spolehlivá k odlišení GM linií od konvenčních materiálů lnu. 19