Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biofyziky a fyzikální chemie Použití polarizovaného světla ke studiu interakcí látek v roztocích (rigorózní práce) Hradec Králové 2008 Hana Moţíšová
Čestné prohlášení Prohlašuji, ţe jsem rigorózní práci zpracovala samostatně a uvedla veškeré pouţité prameny a pouţitou literaturu. x. x. 2008 2
Poděkování 3
SOUHRN Tato rigorózní práce se zabývá aplikací polarizovaného světla při studiu interakce tenzidu (cetrimidu) a organického barviva fluoresceinu metodou fluorescenční spektofotomerie. V práci je uvedená metoda testována, neboť lze předpokládat její další vyuţití v gerontofarmacii. Na základě výsledků lze konstatovat, ţe mezi FLSS a CTAB dochází k významným interakcím, a dále je moţno o případných agregátech FLSS a CTAB ve zkoumaných roztocích říci, ţe nepatří k tzv. vysoce uspořádaným agregátům a mají relativně volnou strukturu. 4
OBSAH OBSAH... 5 1. ÚVOD... 7 2. TEORETICKÁ ČÁST... 9 2.1. LÁTKY POVRCHOVĚ AKTIVNÍ TENZIDY... 10 2.1.1. Rozdělení tenzidů dle schopnosti disociace... 10 2.1.2. Charakteristika tenzidů... 11 2.1.3. Interakce organických barviv s tenzidy... 11 2.1.4. Tvorba agregátů... 11 2.1.5. Premicelární agregáty H-typu a J-typu... 12 2.2. FLUORESCENČNÍ SPEKTROMETRIE LUMINISCENCE... 13 2.2.1. Struktura látek a fotoluminiscence... 13 2.2.2. Luminiscence... 13 2.2.3. Charakteristiky fluorescence... 15 2.2.4. Vliv prostředí na absorpční a emisní spektra... 15 2.2.5. Intenzita fluorescence... 16 2.2.6. Polarizovaná fluorescence... 17 2.2.7 Spektrofluorimetrie... 17 3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... 20 3.1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE... 21 3.2. POUŽITÉ PŘÍSTROJE... 22 3.3. PŘÍPRAVA ZÁSOBNÍCH ROZTOKŮ... 22 3.3.1. Příprava základních vodných roztoků fluoresceinu sodné soli... 22 3.3.2. Příprava základních vodných roztoků cetrimidu... 22 3.3.3. Příprava Britton Robinsonova (BR) pufru... 22 3.4. PRACOVNÍ POSTUP... 23 3.4.1. Příprava vzorků... 23 3.4.2. Spektrofluorimetrie měření emisních spekter... 24 3.4.2.1. Měření vzorků při spektrálních pološířkách 4 nm... 24 3.4.2.2. Měření slepých vzorků při spektrálních pološířkách 4 nm... 25 3.4.2.3. Měření vzorků při spektrálních pološířkách 2 nm a 4 nm... 25 3.4.2.4. Měření slepých vzorků při spektrálních pološířkách 2 nm a 4 nm... 25 4.VÝSLEDKY... 26 5
4.1. VÝSLEDKY MĚŘENÍ VZORKŮ PŘI SPEKTRÁLNÍCH POLOŠÍŘKÁCH 4 NM... 27 4.2. VÝSLEDKY MĚŘENÍ SLEPÝCH VZORKŮ PŘI SPEKTRÁLNÍCH POLOŠÍŘKÁCH 4 NM... 36 4.3. VÝSLEDKY MĚŘENÍ VZORKŮ PŘI SPEKTRÁLNÍCH POLOŠÍŘKÁCH 2 NM A 4 NM... 45 4.4. VÝSLEDKY MĚŘENÍ SLEPÝCH VZORKŮ PŘI SPEKTRÁLNÍCH POLOŠÍŘKÁCH 2 NM A 4 NM... 54 5. DISKUZE... 63 6. ZÁVĚR... 66 7. LITERATURA... 68 6
1. ÚVOD 7
Jedním z okruhu zájmů gerontofarmacie je vysvětlení otázek, proč a jak ţivé organismy stárnou. V současnosti se tento obor rozvíjí také na molekulární úrovni. Jsou sledovány změny nitrobuněčných iontů a ph, membránového potenciálu, polarity okolí, fluidity membrán, či přenosu energie mezi molekulami. Jednou z moţností, jak získat určité informace o relativních změnách dynamiky a uspořádání membránových sloţek, je vyuţití metody fluorescenční spektrofotometrie. Ke svým experimentům jsem zvolila následující látky, a to z těchto důvodů: Tenzidy obecně jsou povrchově aktivní látky vyuţívané v průmyslu i v teoretickém výzkumu, vykazují smáčecí, emulgační a čistící účinky.tyto sloučeniny jsou schopné ovlivňovat fotochemické reakce, jsou u nich pozorovány katalytické účinky, a co je zajímavé, mají vlastnosti analogické vlastnostem biologických membrán. Organické barvivo fluorescein, které je samo o sobě, či v různých sloučeninách pouţíváno jako chemická sonda, fluorescenční sonda nebo značka, při sledování nitrobuněčného prostředí a vlastností buněčných membrán, právě metodou spektrofluorimetrie. Vzhledem k velmi zajímavým vlastnostem obou skupin látek jsem se zaměřila na studium interakce tenzidu (cetrimidu) a organického barviva (fluoresceinu) v roztocích metodou fluorescenční spektrofotometrie. Uvedené roztoky představují modelové systémy, na nichţ byla pouţitá metoda testována pro případné vyuţití v gerontofarmacii.. 8
2. TEORETICKÁ ČÁST 9
2.1. LÁTKY POVRCHOVĚ AKTIVNÍ TENZIDY (1) Tenzidy (povrchově aktivní látky, surfaktanty) jsou látky, které ve své struktuře obsahují vţdy dvě části, hydrofobní a hydrofilní, s protikladnou afinitou k danému médiu. Látky s takovouto strukturou jsou nazývány amfipatické nebo také amfifilní. Hydrofobní je nepolární část nebo části molekuly tenzidu, odpuzující vodu. Hydrofobní sloţku tvoří obvykle uhlovodíkové řetězce alkanů, alkenů nebo struktury aromatických sloučenin. Hydrofilní jsou ty polární části molekuly tenzidu, jeţ mají afinitu k vodě a ve vodném médiu jsou v různém rozsahu hydratovány. Hydrofilní části molekuly tenzidu mohou ve vodném roztoku disociovat. Polárními skupinami schopnými disociace, které nalézáme v tenzidech nejčastěji, jsou -COOH, -O-SO 3 H, -SO 3 H, -NH 2 a kvarterní dusík. 2.1.1. Rozdělení tenzidů dle schopnosti disociace Podle schopnosti disociace ve vodě se rozlišují tenzidy: Iontové Neiontové Skupinu iontových tenzidů dále členíme na tenzidy: Anionaktivní Kationaktivní Amfoterní Aniontové tenzidy jsou látky, které ve vodném prostředí disociují na negativně nabitý, povrchově aktivní aniont a obvykle menší kationt. V kationtovém tenzidu povrchově aktivní část nese pozitivní náboj, proti ní stojí malý aniont. Amfoterní tenzidy obsahují aniontové i kationtové funkční skupiny. Jejich náboj závisí na koncentraci protonů, tj. na ph. Při vysokém ph se chovají jako aniontové, při nízkých hodnotách ph jako kationtové. V určité oblasti ph, v blízkosti neutrální oblasti, existují jako amfionty, coţ znamená, ţe se náboj vyrovná. Vykazují malou rozpustnost ve vodě, na stupnici ph se hovoří o isoelektrické oblasti. Neiontové tenzidy nemají schopnost ve vodě disociovat. 10
2.1.2. Charakteristika tenzidů Jsou-li amfipatické látky přítomny v disperzním mediu v nízké koncentraci, existují odděleně a mají velikost částic pod hranicí koloidních dimenzí. Po dosaţení tzv. kritické micelární koncentrace (cmc) se molekuly nebo ionty tenzidu spontánně sdruţují do větších útvarů označovaných jako micely. Tyto soustavy jsou vratné, protoţe potřebným zředěním vznikne opět pravý roztok. V oblasti cmc se prudce mění fyzikální vlastnosti soustavy, jako hustota, povrchové napětí, vodivost, osmotický tlak a další, neboť v mikroměřítku se homogenní soustava mění na heterogenní. 2.1.3. Interakce organických barviv s tenzidy Barviva lze rovněţ povaţovat za amfifilní látky, neboť obsahují objemnou neiontovou část, připojenou k iontovým skupinám. Jelikoţ však postrádají dlouhé alkylové řetězce, jsou pouze slabě povrchově aktivní a netvoří micely ve vodném prostředí. Zvyšování koncentrace barviva můţe směřovat k postupné agregaci (vytváření dimerů, trimerů, polymerů a nakonec koloidů). V případě ţe je tenzid přidán do roztoku agregovaného barviva v koncentraci niţší neţ cmc, monomer tenzidu a agregáty barviva mohou interagovat za tvorby speciálního typu agregátu tzv. smíšeného agregátu. Přiblíţí-li se koncentrace tenzidu k cmc a nebo ji převýší, je barvivo nakonec inkorporováno do micel tenzidu (2). Interakce tenzidu a barviva závisí na různých faktorech (3), a to především na délce alkylového řetězce tenzidu, na typu a poloze substituentu v aromatickém řetězci barviva. Uvádí se také, ţe pro agregaci je nezbytný dialkyloamino substituent v molekule barviva. 2.1.4. Tvorba agregátů Tvorba agregátů je poměrně běţná pro barvivo a tenzid, jenţ nesou opačný náboj (2,4). R.K. Dutta a S.N. Bhat (4) ve své studii došli k závěru, ţe interakce mezi organickými barvivy a tenzidy jsou jak povahy elektrostatické, tak hydrofobní. Na důleţitost elektrostatických přitaţlivých sil poukazuje i skutečnost, ţe ţádné změny v absorpčních spektrech barviv nebyly pozorovány v přítomnosti souhlasně nabitých tenzidů (4,5,6). 11
Na tvorbu agregátu má také vliv poloha a typ iontové skupiny v molekule barviva. Významnější roli při interakci mezi azobarvivem a tenzidem hraje poloha tohoto iontu v molekule neţ jeho typ. Sledováním spektrálních posunů (7) u barviva, kde je iontová skupina v poloze para (methyloranţ), bylo zjištěno, ţe spektrální posuny jsou výraznější, neţ v případě, kdy se vyskytuje iontová skupina v poloze ortho (methylčerveň) nebo kde iontová skupina zcela chybí (methylţluť). Vliv iontové síly na absorpční spektrum barviva ve vodném roztoku tenzidu byl zkoumán (7) prostřednictvím měnících se koncentrací chloridu sodného, který byl přidáván do soustavy tenzidu (cetyltrimethylamoniumbromid) a azobarviva (MO) ve vodném prostředí a bylo zjištěno, ţe čím je vyšší koncentrace přidávaného chloridu (roste iontová síla v soustavě), tím se zmenšuje absorpční pás v oblasti vlnové délky 380 nm. Toto v podstatě odráţí důleţitost elektrostatických interakcí při tvorbě agregátů. 2.1.5. Premicelární agregáty H-typu a J-typu Indičtí autoři (6) popisují tvorbu premicelárních agregátů při koncentraci tenzidu pod cmc. Při těchto interakcích se mohou tvořit buď nespecifické agregáty, nebo vysoce uspořádané agregáty (H-typu, J-typu). V případě, ţe se koncentrace tenzidu přiblíţí cmc, dochází k rozpadu premicelárních agregátů a inkorporaci molekul barviva do micel tenzidu. V některých případech můţe tvorbě H-agregátu předcházet tvorba J-agregátu. Jednotlivé typy premicelárních agregátů (H-typu, J-typu) se tvoří při rozdílných koncentracích tenzidu. U porphyrinových barviv (6) přeměna monomeru barviva v J-agregát je dokončena, jakmile je koncentrace tenzidu asi dvojnásobná vůči koncentraci barviva. J-agregát obsahuje tudíţ barvivo a tenzid v poměru 1:2. Dalším zvyšováním koncentrace tenzidu se J-agregát stává nestabilním, jestliţe je koncentrace tenzidu oproti koncentraci porphyrinového barviva čtyřnásobná, J-agregát mizí. Vzniká nová forma, H-agregát. 12
2.2. FLUORESCENČNÍ SPEKTROMETRIE LUMINISCENCE(8) Molekuly absorbující energii mohou tuto energii předat jiným částicím při vzájemných kolizích nebo mohou emitovat luminiscenční záření. 2.2.1. Struktura látek a fotoluminiscence Podmínkou fotoluminiscence je absorpce záření v UV/VIS oblasti. Skupiny, kde dochází k absorpci a emisi záření, se nazývají fluorofory. Luminiscenci pozorujeme u látek s konjugovanými dvojnými vazbami, zejména u aromatických sloučenin s rigidní planární multicyklickou strukturou. Fluorescence bývá ovlivněna hodnotou ph roztoku. Látky obsahující heteroatomy vykazují výraznější fosforescenci neţ fluorescenci. 2.2.2. Luminiscence Definice luminiscence: 1. Luminiscence je přebytek záření nad tepelným vyzařováním tělesa v tom případě, máli toto přebytečné záření konečnou dobu trvání, jeţ podstatně převyšuje periodu světelných kmitů. 2. Luminiscence je emise světla z nějaké látky a nastává z elektronových excitovaných stavů. Luminiscence se dělí na: 1. fluorescenci 2. fosforescenci 3. zpoţděnou fluorescenci 13
Jev fluorescence(9) Jev fluorescence je zaloţen na tom, ţe fotony, které tvoří světlo, nesou určitou energii, kterou mohou předat elektronům v různých molekulách. Při tomto předání energie dochází k tzv. excitaci elektronů - tyto se přesouvají do vyšší energetické hladiny (do vyššího orbitalu). Tento stav ale není stabilní - elektron obsahuje nadbytek energie, která má tendenci se opětovně uvolnit, kdyţ je elektron "přitaţen" jádrem molekuly zpátky na niţší energetickou hladinu (do niţšího orbitalu). Tato energie se uvolní v podobě fotonu, který je vyzářen. Děj shrnuje níţe uvedené schéma. Protoţe při kaţdé přeměně energie dochází ke ztrátám - část energie se uvolní do prostředí v podobě tepla (konkrétně v podobě tepelných pohybů molekul), obsahuje vyzářený foton menší mnoţství energie. Protoţe světlo má vlnovou povahu, je vlnová délka vyzářeného (emitovaného) světla delší, neţ vlnová délka světla, které fluorescenci vybudilo (excitovalo). Obr. 1. Jev fluorescence Pohlcení a vyzáření jednoho fotonu ovšem není běţným okem ani mikroskopem pozorovatelné. Fluorescenční barviva jsou proto velké molekuly, obsahující velké mnoţství elektronů, které lze snadno a koordinovaně excitovat a které se také rychle vracejí zpět do niţší energetické hladiny. Jako fluorescenční barviva se proto nejčastěji pouţívají aromatické sloučeniny a heterocykly s konjugovanými elektrony, které lze relativně snadno excitovat. Typické fluorofory jsou např.: chinin (tonik) 14
fluorescein, rhodamin B (nemrznoucí směsi, fluorescenční značení) POPOP (scintilátory) akridinová oranţ (DNA) umbeliferon (ELISA) antracén, perylén (znečištění ţivotního prostředí oleji) 2.2.3. Charakteristiky fluorescence(8) Hlavní charakteristiky fluorescence jsou: 1. intenzita počet fotonů procházejících v daném směru jednotkovou plochou za jednotku času 2. spektrální složení spektrální hustota fotonového toku na jednotkový interval vlnových délek nebo frekvencí 3. polarizace směr kmitání elektrického vektoru elektromagnetické vlny 4. doba dohasínání je dána vnitřní dobou ţivota excitovaného stavu, z něhoţ dochází k emisi; úzce souvisí s pochody vedoucími k nezářivé deaktivaci tohoto stavu 5. koherenční vlastnosti vztahy mezi fázemi světelných vln 2.2.4. Vliv prostředí na absorpční a emisní spektra V roztocích dochází vlivem elektrostatických interakcí dipól-dipól, nebo dipólindukovaný dipól mezi molekulami fluoroforu a rozpouštědla k solvataci fluoreskujících molekul (Obr. 1.). Protoţe molekuly mají v základním a v excitovaném stavu obecně různé dipólové momenty i polarizovatelnosti, dochází při měření fluorescence v roztocích ke změnám v optických spektrech vlivem různé solvatace molekul. Doba potřebná pro molekulární relaxace je mnohem delší, neţ je rychlost elektronového přechodu, ale obvykle kratší, neţ doba ţivota excitovaného stavu. K emisi proto dochází ze stavu, kdy jiţ bylo dosaţeno rovnováţné konfigurace. Protoţe část absorbované energie se spotřebuje na relaxaci molekul rozpouštědla kolem molekuly fluoroforu v excitovaném i základním stavu, je energie emitovaného fluorescenčního záření menší, neţ by odpovídalo čistě elektronovému přechodu. 15
Obr. 2. Solvatace fluoroforu při absorpci a emisi v roztocích. absorpce fluorescence 1 rovnovážná konfigurace v základním stavu 2 nerovnovážná konfigurace v excitovaném stavu (Franckův-Condonův stav) 3 rovnovážná konfigurace v excitovaném stavu 4 nerovnovážná konfigurace v základním stavu (Franckův-Condonův stav) 2.2.5. Intenzita fluorescence Intenzita fluorescence je úměrná intenzitě absorpce násobené kvantovým výtěţkem fluorescence. Jestliţe fluorescenci měříme pod magickými úhly 54 44 8 nebo 125 15 51 ke směru excitačního paprsku, potom není její intenzita ovlivněna případnou anizotropií emise systému. Při pouţití citlivých fotonásobičů pro detekci fluorescenčního záření a při buzení intenzivním světlem lze detekovat koncentrace rozpuštěných látek aţ 10-12 mol/l, coţ je alespoň o 4 řády vyšší citlivost, neţ pro absorpční měření. Protoţe kvantový výtěţek fluorescence roztoků sloţitých molekul je obvykle nezávislý na vlnové délce budícího záření, je excitační spektrum fluorescence zředěných roztoků přesnou replikou jejich absorpčního spektra a lze tak spektrofluorimetricky získat absorpční spektrum fluoreskující látky při daleko niţších koncentracích, neţ při přímém měření absorpce na spektrofotometru. 16
2.2.6. Polarizovaná fluorescence Je-li roztok fluoroforů excitován lineárně polarizovaným zářením, potom budou excitovány pouze ty molekuly, které mají nenulový průmět svého absorpčního přechodového momentu do směru polarizace (fotoselekce). Je-li průměrná rotační relaxační doba (charakterizující rotační difúzi v roztocích) mnohem delší neţ doba dohasínání fluorescence, potom také výsledná fluorescence bude polarizována. Bude-li naopak průměrná rotační relaxační doba mnohem kratší neţ doba dohasínání fluorescence, potom anizotropie systému klesne ještě před emisí na limitní hodnotu (v izotropním systému o malé viskozitě aţ na nulu). Pokud jsou doba dohasínání fluorescence a rychlost molekulární reorientace srovnatelné, potom bude polarizace fluorescence modulována molekulárním pohybem a analýza časové závislosti emisní anizotropie bude poskytovat informaci o anizotropii systému, v němţ se fluorofor nachází. Měření polarizace fluorescence poskytuje informace o molekulární orientaci a pohyblivosti a procesech, které je modulují, např.: fluidita membrán interakce ligand-receptor proteolýza interakce protein-dna kontrakce svalů aktivita proteinkináz 2.2.7 Spektrofluorimetrie Spektrofluorimetry mají zdroj budícího záření v ultrafialové a viditelné oblasti spektra. Pro měření ustálené fluorescence se běţně pouţívají vysokotlaké výbojky, přístroje pro měření časově rozlišené fluorescence vyuţívají jako zdroj budícího záření obvykle pulzní laser. Budící záření prochází excitačním monochromátorem a dopadá na vzorek (obvykle temperovaná kyveta s roztokem). Nejčastěji ve směru kolmém k budícímu paprsku se měří emitované fluorescenční záření, které nejprve prochází emisním monochromátorem a je detekováno pomocí fotonásobiče. Pouţívá se uspořádání s jedním emisním monochromátorem (uspořádání L ) nebo se dvěma protilehlými emisními monochromátory (uspořádání T ). Při měření polarizované fluorescence jsou za excitační monochromátor a 17
před emisní monochromátor zařazeny polarizátory, které jsou otočné kolem osy paprsku jimi procházejícího. Při měření emisních spekter fluorescence je excitační monochromátor nastaven na pevnou vlnovou délku budícího záření. Při měření excitačních spekter je pevně nastavena vlnová délka na emisním monochromátoru. Kromě vlnových délek excitace a emise se běţně nastavují ještě šířky štěrbin obou monochromátorů, které ovlivňují citlivost a spektrální rozlišení daného měření. Polarizovaná fluorescence roztoků se měří ve směru kolmém ke směru budícího paprsku, který je polarizován ve svislém směru. Je přitom nutno provádět korekci na vliv emisního monochromátoru spektrofluorimetru na polarizaci jím procházejícího záření. Anizotropie fluorescence se určuje ze vztahu (1. 1) r = (I V II - G I V )/(I V II + 2 G I V ) kde I V II a I V jsou sloţky světelné intenzity rovnoběţné nebo kolmé k směru (vertikálnímu) polarizace budícího záření a G je korekční faktor, který lze změřit při excitačním záření polarizovaném vodorovně jako poměr I H /I H II. U fluoroforů s dlouhou dobou ţivota v roztocích o malé viskozitě je faktor G při měření excitačního spektra konstantní. 18
Obr. 3. Uspořádání při měření polarizované fluorescence. Kyveta se vzorkem Štěrbina Monochromátor Štěrbina Fotonásobič Monochromátor Zdroj světla Bude-li analyzátor otočen o magický úhel 54,74 (=54 44 8 ), potom je (1.2) I 54,7 (t) = I II (t) + 2 I (t) V roztocích, kde je doba dohasínání fluorescence srovnatelná s rotační relaxační dobou je nutno měřit celkovou intenzitu fluorescence pomocí analyzátoru otočeného o 54,7, čímţ se získají hodnoty dohasínání fluorescence neovlivněné molekulárními rotacemi. 19
3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 20
3.1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE Během svých experimentů jsem pouţila níţe uvedené chemikálie: - Cetrimid cetyltrimethylamoniumbromid (viz vzorec č. 1), MERCK (for cosmetics), pouţitá zkratka CTAB - Hydroxid sodný, Lachema s. p. Brno, o. z. Neratovice - Lihomethanol, FaF UK - Destilovaná voda, FaF UK - Fluorescein sodná sůl (viz vzorec č. 2), Spolek pro chemickou a hutní výrobu, n. p. Praha, pouţitá zkratka FLSS - Kyselina octová, Lachema a. s., Neratovice - Kyselina fosforečná, Lachema s. p. Brno, o. z. Neratovice - Kyselina boritá, Lachema s. p. Brno Vzorec č. 1: Cetrimid (Mr = 364,46) N Br Vzorec č. 2: Fluorescein sodná sůl (Mr = 376,28) 21
3.2. POUŽITÉ PŘÍSTROJE V průběhu své práce jsem uţívala tyto přístroje: - digitální analytické váhy Sartorius - fluorimetr AMINCO- Bowman Series 2 - ph-metr PerpHect 350 - ORION 3.3. PŘÍPRAVA ZÁSOBNÍCH ROZTOKŮ 3.3.1. Příprava základních vodných roztoků fluoresceinu sodné soli Na analytických váhách jsem naváţila 0,09407 g barviva FLSS, toto mnoţství jsem kvantitativně přenesla do odměrné baňky, rozpustila a doplnila na 50 ml destilovanou vodou. Získala jsem tak základní roztok FLSS o koncentraci 5.10-3 mol.l -1. Potřebné roztoky niţších koncentrací jsem připravila příslušným ředěním roztoku základního. 3.3.2. Příprava základních vodných roztoků cetrimidu Základní roztok tenzidu o koncentraci 5.10-3 mol.l -1 jsem připravila naváţením 0,091115 g cetrimidu na analytických vahách, rozpuštěním a následným doplněním destilovanou vodou na objem 50 ml v odměrné baňce. Potřebné roztoky niţších koncentrací jsem připravila příslušným ředěním roztoku základního. 3.3.3. Příprava Britton Robinsonova (BR) pufru Při svých experimentech jsem potřebovala BR pufr o hodnotě ph 7,96, který jsem připravila takto. Ke 100 ml základního roztoku kyselin o koncentraci 0,04 mol.l -1, který jsem připravila dle publikace (1), jsem přidala 60ml 0,2 mol.l -1 hydroxidu sodného. 22
3.4. PRACOVNÍ POSTUP 3.4.1. Příprava vzorků K přípravě roztoků barviva FLSS jsem pouţila třináct kádinek, do kterých jsem odpipetovala 0,8 ml roztoku cetrimidu o koncentraci 1.10-4 mol.l -1, potřebné mnoţství roztoku FLSS o koncentraci dle rozpisu tabulky ( viz tabulka č. 1). Objem jsem doplnila BR pufrem o ph 7,96 na 4 ml. Potom jsem vzorky promíchala a ponechala 10 minut stát. Dále jsem připravila slepé vzorky, které odpovídaly roztokům FLSS o různé koncentraci. Tyto slepé vzorky jsem připravila odpipetováním potřebného mnoţství zásobního roztoku FLSS o koncentracích odpovídajících rozpisu tabulky č. 1. Roztok tenzidu byl ve slepých vzorcích nahrazen vodou a vzorky byly doplněny BR pufem o ph 7,96 na objem 4 ml. Tabulka č. 1: Koncentrační řada barviva FLSS Vzorek Slepý roztok Koncentrace zás. roztoku FLSS Objem zás. roztoku FLSS Objem BR pufru [ml] Koncentrace barviva ve vzorku Objem zás. roztoku barviva Objem BR pufru [ml] [ mol.l -1 ] [ml] [mol.l -1 l] [ml] 2,5. 10-4 0,32 2,88 2,00. 10-5 0,00 3,20 2,5. 10-4 0,35 2,85 2,19. 10-5 0,03 3,17 2,5. 10-4 0,38 2,82 2,38. 10-5 0,06 3,14 2,5. 10-4 0,41 2,79 2,56. 10-5 0.09 3,11 2,5. 10-4 0,45 2,75 2,81. 10-5 0,13 3,07 2,5. 10-4 0,48 2,72 3,00. 10-5 0,16 3,04 2,5. 10-4 0,64 2,56 4,00. 10-5 0,32 2,88 2,5. 10-4 0,80 2,40 5,00. 10-5 0,48 2,72 2,5. 10-4 0,96 2,24 6,00. 10-5 0,64 1,60 2,5. 10-4 1,12 2,08 7,00. 10-5 0,80 2,40 2,5. 10-4 1,28 1,92 8,00. 10-5 0,96 2,24 5,00. 10-4 0,80 2,40 1,00. 10-4 0,64 2,56 5,00. 10-4 0,96 2,24 1,20. 10-4 0,80 2,40 23
3.4.2. Spektrofluorimetrie měření emisních spekter U vzorků, které jsem připravila postupem uvedeným v kapitole 3.4.1., jsem proměřila emisní spektra. U kaţdého z proměřených emisních spekter byly zároveň odečteny hodnoty emisních maxim (EM) a hodnoty intenzit fluorescence (IF), které jsem pouţila pro výpočet hodnot r (Anizotropie) (viz 1.1), G (korekční faktor) a hodnot I 54,7 (viz 1.2). 3.4.2.1. Měření vzorků při spektrálních pološířkách 4 nm Nejprve jsem měřila emisní spektra vzorků při nastavení spektrálních pološířek na hodnoty 4 nm (spektrální pološířka před polarizátorem) a 4 nm (spektrální pološířka za analyzátorem). Citlivost přístroje jsem nastavila u vzorků 1-6 na slepý vzorek č. 6 a pro vzorky 7-13 na slepý vzorek č. 13. V první sérii měření byl polarizátor za emisním monochromátorem nastaven do polohy open (nepolarizovaný paprsek) a polarizátor před analyzátorem na tzv. magický úhel 54,7, dále na úhel 0 (vertikální polarizace) a 90 (horizontální polarizace). U dalších měření zůstalo nastavení analyzátoru stejné jako v předchozím případě, polarizátor emisního monochromátoru pak byl nastaven tak, ţe jím procházel vertikálně polarizovaný excitační paprsek (0 ). Poslední sérii měření jsem provedla při excitaci horizontálně polarizovaným paprskem (90 ) a při emisi vertikálně (0 ) a horizontálně polarizovaným paprskem (90 ). V tomto případě bylo nutné nastavit citlivost přístroje pro všechny vzorky na slepý vzorek číslo 13. Pro výpočet hledaných hodnot (r, G, I 54,7 ) bylo potřebné odečíst hodnoty IF maxim emisních spekter, která byla naměřena při excitaci nepolarizovaným (open), vertikálně polarizovaným (0 ) a horizontálně polarizovaným paprskem (90 ) a emisi horizontálně polarizovaným paprskem (90 ), při takových EM, které odpovídaly EM při emisi vertikálně polarizovaným paprskem (0 ). 24
3.4.2.2. Měření slepých vzorků při spektrálních pološířkách 4 nm Emisní spektra slepých vzorků připravených dle tabulky č. 1 jsem proměřila postupem popsaným v kapitole 3.4.2.1. Z měření byl vyjmut slepý vzorek číslo 1, neboť neobsahuje barvivo FLSS. I při těchto měřeních byly zároveň odečteny hodnoty emisních maxim (EM) a hodnoty intenzit fluorescence (IF). 3.4.2.3. Měření vzorků při spektrálních pološířkách 2 nm a 4 nm Identický postup proměřování popsaný v kapitole 3.4.2.1., jsem aplikovala znovu na stejných 13 vzorků s tím rozdílem, ţe spektrální pološířka před polarizátorem byla nastavena na hodnotu 2 nm a spektrální pološířka za analyzátorem na hodnotu 4 nm. 3.4.2.4. Měření slepých vzorků při spektrálních pološířkách 2 nm a 4 nm Slepé vzorky č. 2-13 jsem proměřila postupem opsaným v kapitole 3.4.2.2. Slepý vzorek č. 1 byl z měření z výše uvedených důvodů vyjmut. 25
4.VÝSLEDKY 26
4.1. Výsledky měření vzorků při spektrálních pološířkách 4 nm 1. série měření polarizátor v poloze open Nejprve bylo provedeno měření vzorků připravených postupem uvedeným v kapitole 3.4.1., kde byl polarizátor nastaven do polohy open (nepolarizovaný paprsek) a analyzátor na tzv. magický úhel 54,7, dále na úhel 0 (vertikální polarizace) a 90 (horizontální polarizace). Tabulka č. 2.: Naměřené EM a IF při nastavení open-0, 90 a 54,7 Vzorek 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Emisní open maximum [nm], intenzita fluorescence 54,7 0 90 EM 517 517 517 IF 4,30359 5,41595 3,49976 EM 517 517 517 IF 4,96185 6,34735 4,13574 EM 517 517 517 IF 5,36774 6,7727 4,4458 EM 517 519 517 IF 5,61096 7,07886 4,5813 EM 518 519 517 IF 6,02661 7,60406 4,93988 EM 518 518 517 IF 6,40015 8,10394 5,26672 EM 519 519 518 IF 0,889577 1,12885 0,725708 EM 519 521 519 IF 1,0849 1,39191 0,892029 EM 521 521 521 IF 1,25336 1,58813 1,01929 EM 521 521 520 IF 1,40015 1,79474 1,14838 EM 521 522 521 IF 1,49139 1,90277 1,21979 EM 523 523 523 IF 1,8396 2,37701 1,49933 EM 524 525 523 IF 2,12769 2,74323 1,17615 27
Pro další výpočty jsem potřebovala hodnoty IF stejných vlnových délek. Srovnávací hodnotou pro hledaný odečet byla vlnová délka emisního maxima při nastavení polarizátorů open-0. Tabulka č. 3.: Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet I 54,7 při nepolarizovaném excitačním světle Vzorek 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Vlnová délka open [nm], intenzita fluorescence 0 90 λ 517 517 IF 5,41595 3,49976 λ 517 517 IF 6,34735 4,13574 λ 517 517 IF 6,7727 4,4458 λ 519 519 IF 7,07886 4,53461 λ 519 519 IF 7,60406 4,92554 λ 518 518 IF 8,10394 5,24109 λ 519 519 IF 1,12885 0,725098 λ 521 521 IF 1,39191 0,883484 λ 521 521 IF 1,58813 1,01929 λ 521 521 IF 1,79474 1,14777 λ 522 522 IF 1,90277 1,21307 λ 523 523 IF 2,37701 1,49933 λ 525 525 IF 2,74323 1,72028 Z hodnot uvedených v tabulce č. 3 jsem vypočetla pro kaţdý vzorek hodnotu I 54,7 podle vztahu (1.2). Vypočítané hodnoty uvádím v tabulce č. 4. 28
Tabulka č. 4.: Vypočtené hodnoty I 54,7 Vzorek I54,7 I 0 2 I90 1 12,41547 2 14,61883 3 15,6643 4 16,14808 5 17,45514 6 18,58612 7 2,579046 8 3,158878 9 3,62671 10 4,09028 11 4,32891 12 5,37567 13 6,18379 Obrázek č. 4.: Graf k tabulce č. 4. 25 20 15 I(54,7) 10 5 Závislost intenzity fluoreccence (I 54,7) na koncentraci vodného roztoku FLSS 0 2,00 2,19 2,38 2,56 2,81 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 1,00 E-04 1,20 E-04 c [ mol.l-1 ] 29
2. série měření polarizátor v poloze 0 Měření proběhlo při nastavené vertikální polarizaci excitačního paprsku. Analyzátor byl postupně nastaven stejně jako v 1.sérii experimentů. Tabulka č. 5.: Naměřené EM a IF při nastavení 0-0, 90 a 54,7 Vzorek 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Emisní 0 maximum [nm], intenzita fluorescence 54,7 0 90 EM 517 517 517 IF 1,28387 1,64642 1,06628 EM 517 518 517 IF 1,51947 1,93268 1,25702 EM 517 517 517 IF 1,62872 2,06146 1,38519 EM 517 519 518 IF 1,69617 2,15271 1,38794 EM 518 519 517 IF 1,83594 2,35016 1,50208 EM 519 519 519 IF 1,94 2,48871 1,59515 EM 520 519 519 IF 0,267334 0,345459 0,220032 EM 520 521 520 IF 0,328979 0,421448 0,269165 EM 521 521 521 IF 0,376892 0,488892 0,309143 EM 521 521 521 IF 0,422668 0,548401 0,348816 EM 523 522 522 IF 0,447998 0,58197 0,367126 EM 523 523 522 IF 0,555725 0,722961 0,451965 EM 524 525 524 IF 0,647583 0,84198 0,524902 Pro další výpočty jsem potřebovala hodnoty IF stejných vlnových délek. Srovnávací hodnotou pro hledaný odečet byla vlnová délka emisního maxima při nastavení polarizátoru i analyzátoru do polohy 0. 30
Tabulka č 6.: Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet I 54,7 a r při vertikálně polarizovaném excitačním světle Vzorek 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Vlnová délka 0 [nm], intenzita fluorescence 0 90 λ 517 517 IF 1,64642 1,06628 λ 518 518 IF 1,93268 1,25553 λ 517 517 IF 2,06146 1,38519 λ 519 519 IF 2,15271 1,37238 λ 519 519 IF 2,35016 1,48865 λ 519 519 IF 2,48871 1,59515 λ 519 519 IF 0,345459 0,220032 λ 521 521 IF 0,421448 0,265808 λ 521 521 IF 0,488892 0,309143 λ 521 521 IF 0,548401 0,348816 λ 522 522 IF 0,58197 0,367126 λ 523 523 IF 0,722961 0,451965 λ 525 525 IF 0,84198 0,523682 Podle vztahu (1.2) jsem z naměřených hodnot vypočetla hodnotu I 54,. 31
Tabulka č. 7.: Vypočtené hodnoty I 54,7 Vzorek I54,7 I 0 2 I90 1 3,77898 2 4,44374 3 4,83184 4 4,89747 5 5,32746 6 5,67901 7 0,785523 8 0,953064 9 1,107178 10 1,246033 11 1,316222 12 1,626891 13 1,889344 Obrázek č. 5.: Graf k tabulce č. 7 7 6 5 4 I(54,7) 3 2 1 Závislost intenzity fluoreccence (I 54,7) na koncentraci vodného roztoku FLSS 0 2,00E- 2,19E- 2,38E- 2,56E- 2,81E- 3,00E- 4,00E- 5,00E- c [ mol.l-1 ] 6,00E- 7,00E- 8,00E- 1,00E- 04 1,20E- 04 32
3.série měření polarizátor v poloze 90 Polarizátor jsem nastavila tak, ţe jím procházel horizontálně polarizovaný paprsek. Analyzátor byl postupně nastaven stejně jako v 1.sérii experimentů. Tabulka č. 8.: Naměřené EM a IF při nastavení 90-0, 90 Vzorek 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Emisní 90 maximum [nm], intenzita fluorescence 0 90 EM 518 517 IF 2,22961 1,48041 EM 518 517 IF 2,51312 1,6748 EM 518 518 IF 2,75665 1,81885 EM 517 518 IF 2,82562 1,86707 EM 518 518 IF 3,04779 2,01538 EM 519 519 IF 3,34381 2,1817 EM 519 519 IF 4,28162 2,793 EM 520 519 IF 5,798 3,334 EM 521 521 IF 6,09558 3,95569 EM 521 521 IF 6,92352 4,48608 EM 523 522 IF 7,4707 4,84039 EM 523 523 IF 9,73267 6,28479 EM 523 522 IF 6,48865 4,15436 Pro další výpočty jsem potřebovala hodnoty IF stejných vlnových délek. Srovnávací hodnotou pro hledaný odečet byla vlnová délka emisního maxima při nastavení polarizátoru na 90 a analyzátoru na 0. 33
Tabulka č. 9.: Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet G při horizontálně polarizovaném excitačním světle Vzorek 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Vlnová délka 90 [nm], intenzita fluorescence 0 90 λ 518 518 IF 2,22961 1,46179 λ 518 518 IF 2,51312 1,64308 λ 518 518 IF 2,75665 1,81885 λ 517 517 IF 2,82562 1,86127 λ 518 518 IF 3,04779 2,01538 λ 519 519 IF 3,34381 2,1817 λ 519 519 IF 4,28162 2,793 λ 520 520 IF 5,798 3,32764 λ 521 521 IF 6,09558 3,95569 λ 521 521 IF 6,92352 4,48608 λ 523 523 IF 7,4707 4,7995 λ 523 523 IF 9,73267 6,28479 λ 523 523 IF 6,48865 4,1539 Pro výpočet hodnot korekčního faktoru G jsem pouţila hodnoty uvedené v tabulce č. 9, a následně pro hodnoty anizotropie r ( viz. vztah 1.1) výsledky z tabulky č.6. Vypočtené hodnoty uvádím v tabulce č. 10. 34
Tabulka č. 10.: Hodnoty korekčního faktoru G a anizotropie r I Vzorek G I H 90 H 0 r I V I 0 V 0 G I 2 G I 1 0,655626 0,311156 2 0,653801 0,311048 3 0,659804 0,295037 4 0,658712 0,315273 5 0,661259 0,316231 6 0,652459 0,316819 7 0,651746 0,31957 8 0,657899 0,319728 9 0,648944 0,32386 10 0,647948 0,322248 11 0,642443 0,328478 12 0,645742 0,32993 13 0,640179 0,335032 V 90 V 90 Obrázek č. 6.: Graf k tabulce č. 10 Závislost hodnot anizotropie na koncentraci vodného roztoku FLSS 0,4 0,38 0,36 0,34 0,32 r 0,3 0,28 0,26 0,24 0,22 0,2 2,00 2,19 2,38 2,56 2,81 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 1,00 E-04 1,20 E-04 c [ mol.l-1 ] 35
4.2. Výsledky měření slepých vzorků při spektrálních pološířkách 4 nm 1. série měření polarizátor v poloze open Byla provedena série měření vzorků připravených postupem uvedeným v kapitole 3.4.1., kde byl polarizátor nastaven do polohy open (nepolarizovaný paprsek) a analyzátor na tzv. magický úhel 54,7, dále na úhel 0 (vertikální polarizace) a 90 (horizontální polarizace). Z měření byl vyjmut slepý vzorek č. 1, neboť neobsahuje barvivo FLSS. Tabulka č. 11.: Naměřené EM a IF při nastavení open-0, 90 a 54,7 Vzorek Emisní maximum [nm], intenzita fluorescence 1-2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 open 54,7 0 90 EM 514 513 513 IF 0,466309 0,5915 0,392456 EM 514 513 513 IF 0,880127 1,11115 0,741577 EM 515 515 513 IF 1,32446 1,6745 1,11267 EM 515 515 515 IF 1,84143 2,33429 1,55121 EM 514 515 515 IF 2,22626 2,83112 1,87073 EM 517 519 517 IF 0,486145 0,621338 0,40802 EM 519 519 517 IF 0,650024 0,824585 0,535583 EM 521 521 521 IF 1,0144 0,843506 0,834656 EM 521 521 521 IF 0,993652 1,27228 0,817566 EM 521 521 521 IF 1,11725 1,42487 0,924683 EM 521 523 521 IF 1,4212 1,83472 1,17645 EM 523 525 523 IF 1,79962 2,33978 1,50177 Pro další výpočty jsem potřebovala hodnoty IF stejných vlnových délek. Srovnávací hodnotou pro hledaný odečet byla vlnová délka emisního maxima při nastavení polarizátorů open-0. 36
Tabulka č. 12.: Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet I 54,7 při nepolarizovaném excitačním světle Vzorek Emisní maximum[nm], intenzita fluorescence 1-2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 open 0 90 EM 513 513 IF 0,5915 0,392456 EM 513 513 IF 1,11115 0,741577 EM 515 515 IF 1,6745 1,10901 EM 515 515 IF 2,33429 1,55121 EM 515 515 IF 2,83112 1,87073 EM 519 519 IF 0,621338 0,406189 EM 519 519 IF 0,824585 0,535278 EM 521 521 IF 0,843506 0,834656 EM 521 521 IF 1,27228 0,817566 EM 521 521 IF 1,42487 0,924683 EM 523 523 IF 1,83472 1,16913 EM 525 525 IF 2,33978 1,48621 Z hodnot uvedených v tabulce č. 12 jsem vypočetla pro kaţdý vzorek hodnotu I 54,7 podle vztahu (1.2). Vypočítané hodnoty uvádím v tabulce č. 13. 37
Tabulka č. 13.: Vypočtené hodnoty I 54,7 Vzorek I54,7 I 0 2 I90 1-2 1,375427 3 2,594304 4 3,89252 5 5,43671 6 6,57258 7 1,433716 8 1,895141 9 2,512818 10 2,907412 11 3,274236 12 4,17298 13 5,3122 Obrázek č. 7.: Graf k tabulce č. 13 Závislost intenzity fluoreccence (I 54,7) na koncentraci vodného roztoku FLSS 7 6 5 4 I (54,7) 3 2 1 0 2,19 2,38 2,56 2,81 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 1,00 E-04 1,20 E-04 c [ mol.l-1 ] 38
2. série měření polarizátor v poloze 0 Provedla jsem měření vzorků, kde byl polarizátor nastaven do polohy 0 (nepolarizovaný paprsek) a analyzátor na tzv. magický úhel 54,7, dále na úhel 0 (vertikální polarizace) a 90 (horizontální polarizace). Z měření byl vyjmut slepý vzorek č 1. Tabulka č. 14.: Naměřené EM a IF při nastavení 0-0, 90 a 54,7 Vzorek Emisní maximum [nm], intenzita fluorescence 1-2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0 54,7 0 90 EM 514 513 513 IF 0,140381 0,180359 0,117493 EM 514 513 513 IF 0,267029 0,342407 0,223389 EM 515 515 515 IF 0,398254 0,512085 0,336914 EM 515 515 515 IF 0,560608 0,723572 0,4776 EM 515 517 515 IF 0,678406 0,871887 0,569763 EM 517 517 517 IF 0,146484 0,189514 0,122207 EM 519 519 519 IF 0,192875 0,251465 0,160828 EM 521 521 521 IF 0,30426 0,396118 0,25177 EM 521 521 521 IF 0,298767 0,390625 0,248718 EM 521 521 521 IF 0,332031 0,435181 0,432434 EM 523 523 521 IF 0,427246 0,559082 0,354309 EM 524 524 523 IF 0,551453 0,72113 0,457153 Pro další výpočty jsem potřebovala hodnoty IF stejných vlnových délek. Srovnávací hodnotou pro hledaný odečet byla vlnová délka emisního maxima při nastavení polarizátoru i analyzátoru do polohy 0. 39
Tabulka č. 15.: polarizovaném excitačním světle Vzorek Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet I 54,7 a r při vertikálně Emisní maximum [nm], intenzita fluorescence 1-2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0 0 90 λ 513 513 IF 0,180359 0,117493 λ 513 513 IF 0,342407 0,223389 λ 515 515 IF 0,512085 0,336914 λ 515 515 IF 0,723572 0,4776 λ 517 517 IF 0,871887 0,561523 λ 517 517 IF 0,189514 0,122207 λ 519 519 IF 0,251465 0,160828 λ 521 521 IF 0,396118 0,25177 λ 521 521 IF 0,390625 0,248718 λ 521 521 IF 0,435181 0,432434 λ 523 523 IF 0,559082 0,352173 λ 524 524 IF 0,72113 0,457153 Podle vztahu (1.2) jsem z naměřených hodnot vypočetla hodnotu I 54,. 40
Tabulka č. 16.: Vypočtené hodnoty I 54,7 Vzorek I54,7 I 0 2 I90 1-2 0,415345 3 0,789185 4 1,185913 5 1,678772 6 1,994933 7 0,433928 8 0,573121 9 0,899658 10 0,888061 11 1,300049 12 1,263428 13 1,635436 Obrázek č. 8.: Graf k tabulce č. 16 7 6 5 4 I (54,7) 3 2 1 0 2,19E- Závislost intenzity fluoreccence (I 54,7) na koncentraci vodného roztoku FLSS 2,38E- 2,56E- 2,81E- 3,00E- 4,00E- 5,00E- c [mol.l-1] 6,00E- 7,00E- 8,00E- 1,00E- 04 1,20E- 04 41
3.série měření polarizátor v poloze 90 Polarizátor jsem nastavila tak, ţe jím procházel horizontálně polarizovaný paprsek. Analyzátor byl postupně nastaven stejně jako v 1.sérii experimentů. Nebyl měřen slepý vzorek č. 1. Tabulka č.17.: Naměřené EM a IF při nastavení 90-0, 90 Vzorek Emisní maximum [nm], intenzita fluorescence 1-2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 90 0 90 EM 511 511 IF 0,0119019 0,00701904 EM 513 513 IF 0,0283813 0,01804 EM 513 513 IF 0,0454712 0,0289917 EM 515 515 IF 0,0662231 0,0436401 EM 517 516 IF 0,0778198 0,09644 EM 517 517 IF 0,155945 0,102539 EM 519 519 IF 0,193787 0,126953 EM 521 521 IF 0,318909 0,206604 EM 521 521 IF 0,315857 0,2383 EM 521 521 IF 0,358887 0,232544 EM 523 521 IF 0,449829 0,293274 EM 523 523 IF 0,615234 0,396729 Pro další výpočty jsem potřebovala hodnoty IF stejných vlnových délek. Srovnávací hodnotou pro hledaný odečet byla vlnová délka emisního maxima při nastavení polarizátoru na 90 a analyzátoru na 0. 42
Tabulka č. 18.: Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet G při horizontálně polarizovaném excitačním světle Vzorek Emisní maximum [nm], intenzita fluorescence 1-2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 90 0 90 λ 511 511 IF 0,0119019 0,00701904 λ 513 513 IF 0,0283813 0,01804 λ 513 513 IF 0,0454712 0,0289917 λ 515 515 IF 0,0662231 0,0436401 λ 517 517 IF 0,0778198 0,06592 λ 517 517 IF 0,155945 0,102539 λ 519 519 IF 0,193787 0,126953 λ 521 521 IF 0,318909 0,206604 λ 521 521 IF 0,315857 0,2383 λ 521 521 IF 0,358887 0,232544 λ 523 523 IF 0,449829 0,2927 λ 523 523 IF 0,615234 0,396729 Pro výpočet hodnot korekčního faktoru G jsem pouţila hodnoty uvedené v tabulce č. 18, a následně pro hodnoty anizotropie r ( viz. vztah 1.1) výsledky z tabulky č. 15. Vypočtené hodnoty uvádím v tabulce č. 19. 43
Tabulka č. 19.: Hodnoty korekčního faktoru G a anizotropie r I Vzorek G I H 90 H 0 r I V I 0 V 0 1 - - G I 2 G I 2 0,589741 0,348243 3 0,634411 0,320663 4 0,637584 0,315676 5 0,658986 0,302165 6 0,650981 0,31588 7 0,657533 0,311683 8 0,655116 0,316114 9 0,647846 0,322579 10 0,65024 0,3251 11 0,647959 0,32567 12 0,645861 0,3271 13 0,644842 0,325272 V 90 V 90 Obrázek č. 9.: Graf k tabulce č. 19 0,4 0,38 0,36 0,34 0,32 r 0,3 0,28 0,26 0,24 0,22 0,2 Závislost hodnot anizotropie na koncentraci vodného roztoku FLSS 2,19 2,38 2,56 2,81 3,00 4,00 5,00 c [mol.l-1] 6,00 7,00 8,00 1,00 E-04 1,20 E-04 44
4.3. Výsledky měření vzorků při spektrálních pološířkách 2 nm a 4 nm 1. série měření polarizátor v poloze open Provedla jsem měření vzorků připravených postupem uvedeným v kapitole 3.4.1., kde byl polarizátor nastaven do polohy open (nepolarizovaný paprsek) a analyzátor na tzv. magický úhel 54,7, dále na úhel 0 (vertikální polarizace) a 90 (horizontální polarizace). Tabulka č. 20.: Naměřené EM a IF při nastavení open-0, 90 a 54,7 Vzorek 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Emisní open maximum [nm], intenzita fluorescence 54,7 0 90 EM 517 516 516 IF 1,40991 1,77246 1,16974 EM 517 517 517 IF 1,69586 2,15637 1,39252 EM 517 518 517 IF 1,80481 2,28912 1,48315 EM 517 518 517 IF 1,93695 2,453 1,60431 EM 518 519 517 IF 2,06879 2,62421 1,70135 EM 518 519 517 IF 2,24609 2,74821 1,853603 EM 519 520 520 IF 3,04535 3,88397 2,50458 EM 520 521 520 IF 3,63617 4,59381 2,96692 EM 521 521 521 IF 4,45404 5,64667 3,61481 EM 522 523 521 IF 4,8589 6,18436 3,95264 EM 521 523 523 IF 5,379 6,73279 4,27948 EM 523 523 523 IF 6,34491 8,110 5,16876 EM 525 525 524 IF 7,69165 9,84802 6,25671 Pro další výpočty jsem potřebovala hodnoty IF stejných vlnových délek. Srovnávací hodnotou pro hledaný odečet byla vlnová délka emisního maxima při nastavení polarizátorů open-0. 45
Tabulka č. 21.: Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet I 54,7 při nepolarizovaném excitačním světle Vzorek 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Emisní open maximum [nm], intenzita fluorescence 0 90 λ 516 516 IF 1,77246 1,16974 λ 517 517 IF 2,15637 1,39252 λ 518 518 IF 2,28912 1,47369 λ 518 518 IF 2,453 1,59271 λ 519 519 IF 2,62421 1,67847 λ 519 519 IF 2,74821 1,84326 λ 520 520 IF 3,88397 2,50458 λ 521 521 IF 4,59381 2,95197 λ 521 521 IF 5,64667 3,61481 λ 523 523 IF 6,18436 3,9328 λ 523 523 IF 6,73279 4,27948 λ 523 523 IF 8,110 5,16876 λ 525 525 IF 9,84802 6,24573 Z hodnot uvedených v tabulce č. 21 jsem vypočetla pro kaţdý vzorek hodnotu I 54,7 podle vztahu (1.2). Vypočítané hodnoty uvádím v tabulce č. 22. 46
Tabulka č. 22.: Vypočtené hodnoty I 54,7 Vzorek I54,7 I 0 2 I90 1 4,11194 2 4,94141 3 5,2365 4 5,63842 5 5,98115 6 6,43473 7 8,89313 8 10,49775 9 12,87629 10 14,04996 11 15,29175 12 18,44757 13 22,33948 Obrázek č. 10.: Graf k tabulce č. 22 25 Závislost intenzity fluoreccence (I 54,7) na koncentraci vodného roztoku FLSS 20 15 I(54,7) 10 5 0 2,00 2,19 2,38 2,56 2,81 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 1,00 E-04 1,20 E-04 c [ mol.l-1 ] 47
2. série měření polarizátor v poloze 0 Měření jsem provedla při nastavené vertikální polarizaci excitačního paprsku. Analyzátor byl postupně nastaven stejně jako v 1.sérii experimentů. Tabulka č. 23.: Naměřené EM a IF při nastavení 0-0, 90 a 54,7 Vzorek 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Emisní 0 maximum [nm], intenzita fluorescence 54,7 0 90 EM 516 517 517 IF 0,4245 0,545654 0,352173 EM 517 519 517 IF 0,5159 0,653076 0,4228 EM 518 518 517 IF 0,544739 0,700684 0,451965 EM 518 519 517 IF 0,585022 0,748291 0,482788 EM 519 518 517 IF 0,620728 0,799255 0,519104 EM 519 519 518 IF 0,678101 0,874634 0,56366 EM 519 520 518 IF 0,92926 1,19629 0,762939 EM 521 521 520 IF 1,09497 1,41479 0,906372 EM 521 521 521 IF 1,3327 1,71967 1,09528 EM 521 522 521 IF 1,46942 1,89819 1,21155 EM 523 523 522 IF 1,58875 2,994 1,3089 EM 523 523 523 IF 1,921 2,48993 1,57135 EM 524 525 524 IF 2,2998 3,03131 1,89545 Pro další výpočty jsem potřebovala hodnoty IF stejných vlnových délek. Srovnávací hodnotou pro hledaný odečet byla vlnová délka emisního maxima při nastavení polarizátoru i analyzátoru do polohy 0. 48
Tabulka č. 23.: Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet I 54,7 a r při vertikálně polarizovaném excitačním světle Vzorek 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Emisní 0 maximum [nm], intenzita fluorescence 0 90 λ 517 517 IF 0,545654 0,352173 λ 519 51 IF 0,653076 0,415955 λ 518 518 IF 0,700684 0,447998 λ 519 519 IF 0,748291 0,480347 λ 518 518 IF 0,799255 0,515137 λ 519 519 IF 0,874634 0,561829 λ 520 520 IF 1,19629 0,76803 λ 521 521 IF 1,41479 0,91489 λ 521 521 IF 1,71967 1,09528 λ 522 522 IF 1,89819 1,21033 λ 523 523 IF 2,994 1,29333 λ 523 523 IF 2,48993 1,57135 λ 525 524 IF 3,03131 1,87836 Podle vztahu (1.2) jsem z naměřených hodnot vypočetla hodnotu I 54,. 49
Tabulka č. 25.: Vypočtené hodnoty I 54,7 Vzorek I54,7 I 0 2 I90 1 1,25 2 1,484986 3 1,59668 4 1,708985 5 1,829529 6 1,998292 7 2,73235 8 3,24457 9 3,91023 10 4,31885 11 4,6466 12 5,63263 13 6,78803 Obrázek č. 11.: Graf k tabulce č. 25 7 6 5 4 I(54,7) 3 2 1 Závislost intenzity fluoreccence (I 54,7) na koncentraci vodného roztoku FLSS 0 2,00 2,19 2,38 2,56 2,81 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 1,00 E-04 1,20 E-04 c [ mol.l-1 ] 50
3.série měření polarizátor v poloze 90 Polarizátor byl nastaven tak, ţe jím procházel horizontálně polarizovaný paprsek. Analyzátor byl postupně nastaven stejně jako v 1.sérii experimentů. Tabulka č. 26.: Naměřené EM a IF při nastavení 90-0, 90 Vzorek 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Emisní 90 maximum [nm], intenzita fluorescence 0 90 EM 517 516 IF 0,127869 0,0830078 EM 517 515 IF 0,142517 0,0930786 EM 518 516 IF 0,156555 0,103149 EM 519 517 IF 0,161438 0,106506 EM 517 517 IF 0,176392 0,115967 EM 518 517 IF 0,184937 0,21155 EM 518 519 IF 0,238647 0,159302 EM 520 521 IF 0,279541 0,180969 EM 521 520 IF 0,32959 0,213318 EM 523 522 IF 0,361633 0,232544 EM 522 521 IF 0,401306 0,26062 EM 523 523 IF 0,527039 0,341187 EM 524 523 IF 0,597534 0,383911 Pro další výpočty jsem potřebovala hodnoty IF stejných vlnových délek. Srovnávací hodnotou pro hledaný odečet byla vlnová délka emisního maxima při nastavení polarizátoru na 90 a analyzátoru na 0. 51
Tabulka č. 27.: Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet korekčního faktoru G při horizontálně polarizovaném excitačním světle Vzorek 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Emisní 90 maximum [nm], intenzita fluorescence 0 90 EM 517 517 IF 0,127869 0,0830078 EM 517 517 IF 0,142517 0,0927734 EM 518 518 IF 0,156555 0,11929 EM 519 519 IF 0,161438 0,103149 EM 517 517 IF 0,176392 0,115967 EM 518 518 IF 0,184937 0,12085 EM 518 518 IF 0,238647 0,158691 EM 520 520 IF 0,279541 0,180359 EM 521 521 IF 0,32959 0,213013 EM 523 523 IF 0,361633 0,2271 EM 522 522 IF 0,401306 0,26001 EM 523 523 IF 0,527039 0,341187 EM 524 524 IF 0,597534 0,38208 Pro výpočet hodnot korekčního faktoru G jsem pouţila hodnoty uvedené v tabulce č. 27, a následně pro hodnoty anizotropie r ( viz. vztah 1.1) výsledky z tabulky č.23. Vypočtené hodnoty uvádím v tabulce č. 28. 52
Tabulka č. 28.: Hodnoty korekčního faktoru G a anizotropie r pro nastavení 90 0, 90 I Vzorek G I H 90 H 0 r I V I 0 V 0 G I 2 G I 1 0,649163 0,316123 2 0,650964 0,320022 3 0,761969 0,259738 4 0,638939 0,324039 5 0,657439 0,311922 6 0,653466 0,31543 7 0,664961 0,309139 8 0,645197 0,317685 9 0,646297 0,322698 10 0,627849 0,333027 11 0,64791 0,327094 12 0,647366 0,325499 13 0,639428 0,336845 V 90 V 90 Obrázek č. 12.: Graf k tabulce č. 28 Závislost hodnot anizotropie na koncentraci vodného roztoku FLSS 0,4 0,35 0,3 0,25 r 0,2 0,15 0,1 0, 0 2,00 2,19 2,38 2,56 2,81 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 1,00 E-04 1,20 E-04 c [ mol.l-1 ] 53
4.4. Výsledky měření slepých vzorků při spektrálních pološířkách 2 nm a 4 nm 1. série měření polarizátor v poloze open Provedla jsem měření vzorků připravených postupem uvedeným v kapitole 3.4.1., kde byl polarizátor nastaven do polohy open (nepolarizovaný paprsek) a analyzátor na tzv. magický úhel 54,7, dále na úhel 0 (vertikální polarizace) a 90 (horizontální polarizace). Z výše uvedených důvodů nebyl měřen slepý vzorek č. 1.. Tabulka č. 29.: Naměřené EM a IF při nastavení open-0, 90 a 54,7 Vzorek Emisní maximum [nm], intenzita fluorescence 1-2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 open 54,7 0 90 EM 513 514 511 IF 0,0436401 0,58472 0,0354004 EM 513 513 513 IF 0,104065 0,1337 0,0881958 EM 515 515 514 IF 0,161743 0,2078 0,0135803 EM 515 516 515 IF 0,174255 0,220642 0,1474 EM 515 515 515 IF 0,25177 0,32074 0,212708 EM 517 517 516 IF 0,436096 0,55542 0,366821 EM 519 519 519 IF 0,616455 0,78125 0,5162 EM 521 521 521 IF 0,9555 1,2326 0,797729 EM 521 521 520 IF 0,91156 1,17096 0,769348 EM 521 521 521 IF 1,0733 1,37451 0,899353 EM 523 523 523 IF 1,53809 1,97906 1,28998 EM 523 523 523 IF 1,87042 2,41516 1,56799 54
Pro další výpočty jsem potřebovala hodnoty IF stejných vlnových délek. Srovnávací hodnotou pro hledaný odečet byla vlnová délka emisního maxima při nastavení polarizátorů open-0. Tabulka č. 30.: excitačním světle Vzorek Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet I 54,7 při nepolarizovaném Emisní maximum [nm], intenzita fluorescence 1-2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 open 0 90 λ 514 514 IF 0,58472 0,0354004 λ 513 513 IF 0,1337 0,0881958 λ 515 515 IF 0,2078 0,0134888 λ 516 516 IF 0,220642 0,145569 λ 515 515 IF 0,32074 0,212708 λ 517 517 IF 0,55542 0,365295 λ 519 519 IF 0,78125 0,5162 λ 521 521 IF 1,2326 0,797729 λ 521 521 IF 1,17096 0,766602 λ 521 521 IF 1,37451 0,899353 λ 523 523 IF 1,97906 1,28998 λ 523 523 IF 2,41516 1,56799 Z hodnot uvedených v tabulce č. 30 jsem vypočetla pro kaţdý vzorek hodnotu I 54,7 podle vztahu (1.2). Vypočítané hodnoty uvádím v tabulce č. 31. 55
Tabulka č. 31.: Vypočtené hodnoty I 54,7 Vzorek I54,7 I 0 2 I90 1-2 0,126648 3 0,309449 4 0,2326 5 0,51178 6 0,746156 7 1,28601 8 1,813354 9 2,8288 10 2,704164 11 3,173216 12 4,55902 13 5,55114 Obrázek č. 13.: Graf k tabulce č. 31 7 6 5 4 I (54,7) 3 2 1 0 Závislost intenzity fluoreccence (I 54,7) na koncentraci vodného roztoku FLSS 2,19E- 2,38E- 2,56E- 2,81E- 3,00E- 4,00E- 5,00E- c [mol.l-1] 6,00E- 7,00E- 8,00E- 1,00E- 04 1,20E- 04 56
2. série měření - polarizátor v poloze 0 Provedla jsem měření vzorků, kde byl polarizátor za emisním monochromátorem nastaven do polohy 0 (nepolarizovaný paprsek) a analyzátor na tzv. magický úhel 54,7, dále na úhel 0 (vertikální polarizace) a 90 (horizontální polarizace). Nebyl měřen slepý vzorek č. 1. Tabulka č. 32.: Naměřené EM a IF při nastavení 0-0, 90 a 54,7 Vzorek Emisní maximum [nm], intenzita fluorescence 1-2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0 54,7 0 90 EM 514 511 511 IF 0,00946045 0,0131226 0,00762939 EM 516 514 512 IF 0,0280762 0,0369263 0,0228882 EM 514 515 514 IF 0,0460815 0,95093 0,0396729 EM 514 516 513 IF 0,00488 0,0650024 0,0411987 EM 516 517 515 IF 0,0735474 0,09552 0,0619507 EM 517 519 516 IF 0,129089 0,167847 0,108337 EM 517 519 517 IF 0,181274 0,236816 0,154114 EM 520 521 521 IF 0,285034 0,37262 0,239563 EM 521 521 521 IF 0,275554 0,359497 0,231934 EM 521 521 520 IF 0,321655 0,418396 0,270386 EM 522 523 523 IF 0,4602 0,603333 0,386353 EM 523 525 523 IF 0,563965 0,7373 0,472412 Pro další výpočty jsem potřebovala hodnoty IF stejných vlnových délek. Srovnávací hodnotou pro hledaný odečet byla vlnová délka emisního maxima při nastavení polarizátoru i analyzátoru do polohy 0. 57
Tabulka č. 33.: polarizovaném excitačním světle Vzorek Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet I 54,7 a r při vertikálně Emisní maximum [nm], intenzita fluorescence 1-2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0 0 90 λ 511 511 IF 0,0131226 0,00762939 λ 514 514 IF 0,0369263 0,0228882 λ 515 515 IF 0,95093 0,0396729 λ 516 516 IF 0,0650024 0,04884 λ 517 517 IF 0,09552 0,06073 λ 519 519 IF 0,167847 0,106506 λ 519 519 IF 0,236816 0,153503 λ 521 521 IF 0,37262 0,239563 λ 521 521 IF 0,359497 0,231934 λ 521 521 IF 0,418396 0,269165 λ 523 523 IF 0,603333 0,386353 λ 525 525 IF 0,7373 0,467224 Podle vztahu (1.2) jsem z naměřených hodnot vypočetla hodnotu I 54,. 58