Test akutní toxicity na roupicích Enchytraeus crypticus ve vodním prostředí 1. Účel testu Tento test slouží k rychlému a jednoduchému testování toxicity chemických látek použitím roupic ve vodním prostředí. Využívá se skutečnosti, že roupice přežívají ve vodném roztoku, ale nedochází zde k reprodukci. 2. Charakteristika testu Testovací podmínky jsou shodné s podmínkami zkoušky inhibice pohyblivosti Daphnia magna [1]. Test je založen na sledování hodnoty procentuelní úmrtnosti roupic v různých koncentracích testované látky ve srovnání s kontrolou po 72 hodinách. Roupice budou klasifikovány jako mrtvé v případě, že nebudou reagovat na mechanický stimul. 3. Testovaný organismus Čeleď roupice (Enchytraeidae) patří do třídy máloštětinatci (Oligochaeta) do které se dále zahrnují žížaly, žížalice a nítěnkovci. Roupice obývají suchozemské, mořské i sladkovodní prostředí. Je známo asi 28 rodů se 600 druhy z různých částí světa. Ve střední Evropě lze nalézt asi 200 300 druhů z 20 rodů. Na některých lokalitách mohou tvořit průměrně až 75 % celkové biomasy půdní mikrofauny [3]. V laboratorních podmínkách se testované kultury roupic chovají v inertních plastových boxech naplněných sterilizovanou přírodní půdou nebo zahradním substrátem v různém poměru ve vrstvě 3 4 cm nebo větší. Vysušená půda pro chov je před použitím přesyta přes síto o velikosti ok 2 mm. Odstranění fauny a flóry se provádí několikanásobným zmražením a následným rozmražením při pokojové teplotě. Poté se půda uchovává v mrazáku. Před použitím je ph půdy upraveno uhličitanem vápenatým na 5,5 6,5. Vlhkost artificiální i přírodní půdy by se měla pohybovat mezi 40 60 % její WHC. Chovné nádoby je nutné uchovávat v termostatu nebo v klimatizované inkubační místnosti při cca (20 ± 2) C. Roupice je nezbytné jednou za týden vlhčit, krmit nadrcenými sterilizovanými ovesnými vločkami a větrat. V testu se požívají dospělí jedinci přibližně stejné velikosti (jedinci s viditelným opaskem s vajíčky). 1
Obr. 1: Na obrázku jsou dobře patrní dospělí jedinci Enchytraeus crypticus v porovnání s měřítkem, kteří se vyznačují opaskem. 4. Materiál Rekonstituovaná voda připravená dle Roembke at. al. [2] Tabulka 1. Složení rekonstituované vody pro vodní test na roupicích. Chemikálie Koncentrace [mg/l] CaCl 2 222 MgSO 4.7H 2 O 123 NaHCO 3 65 KCl 5,8 K přípravě rekonstituované vody se používá deionizavaná voda s konduktivitou menší než 10 µs/l. Hodnota ph rekonstituované vody by se měla pohybovat v rozmezí 6,5 ± 0,5 [2]. Případná úprava ph se provádí 1M roztokem NaOH, případně HCl. Dostatečné množství rozpuštěného kyslíku (minimálně 90 %) je třeba zajistit aerací. Zřeďovací vodu je vhodné připravovat alespoň den před jejím použitím a aerací přes noc zajistit nejen nasycení kyslíkem, ale zároveň dokonalé rozpuštění solí a homogenizaci. 2
5. Pracovní postup Nejprve připravíme ředící médium, tj. rekonstituovanou vodu, kterou dáme temperovat na (20 ± 0,5) C do termoluminostatu. Poté si dle pokynů asistenta připravíme roztoky testovaných látek v koncentrační řadě do 250ml odměrných baněk. Pozor při přípravě koncentrační řady místo destilované vody používáme rekonstituovanou vodu. Po přípravě roztoků koncentrační řady odměrným válcem odměříme 50 ml roztoku do 100ml kádinky, překryjeme parafilmem a vložíme opět do termoluminostatu. Pro každou koncentraci provádíme 2 paralelní opakování včetně kontroly (pouze rekonstituovaná voda). Následně do větší Petriho misky rozplavíme část roupic, které nabereme kopistem ze zásobní kultury (z chovu). Pro snadnější získání většího množství roupic z chovu je dobré odebírat je z místa, kde bylo dávkováno krmení, zde jsou roupice více kumulovány. Rozplavené dospělé jedince vybíráme z Petriho misky pomocí háčku a umisťujeme je do příslušných kádinek s testovanou látkou. Umisťování roupic začínáme od kontroly a postupujeme dále od nejnižší koncentrace. Do každé kádinky se nasazuje 10 dospělých jedinců. Kádinky s roupicemi překryjeme parafilmem a vložíme do termoluminostatu vytemperovaného na (20 ± 2) C. Každých (24 ± 0,5) h počítáme a zapisujeme počty mrtvých jedinců, které odstraňujeme pomocí pipetky s balonkem. Po 72hodinové expozici test ukončujeme. Mortalita u kontroly nesmí přesáhnout 20 %. Tabulka 2: Podmínky pro vodní test akutní toxicity na organismu Enchytraeus crypticus. Testovací organismus: stáří Sledovaná odezva: Podmínky testu: teplota objem testovaného média doba expozice/frekvence kontrol počet paralelních nasazení počet jedinců v testované koncentraci osvětlení jiné Chemikálie: Pomůcky a zařízení: Enchytraeus crypticus dospělí jedinci s opaskem úmrtnost (roupice bez reakce na mechanický stimul považujeme za mrtvé) (20 ± 2) C 50 ml testovaného roztoku ve 100ml skleněné kádince 72 h/každých (24 ± 0,5) h 2 5 10 ks/kádinka bez osvětlení (ve tmě) bez aerace a bez krmení testovaná látka, rekonstituovaná voda kádinky 100ml, pipety, Pasteurovy pipetky nebo pipetky s balónkem, odměrný válec, lžička, háček, Petriho miska, střička, odměrné baňky, parafilm, termoluminostat, kopista 3
6. Vyhodnocení výsledků Vyhodnocení výsledků dle ČSN EN ISO 6341 (1997): Jakost vod Zkouška inhibice pohyblivosti Daphnia magna [1]. Z hodnot počtu imobilizovaných jedinců v jednotlivých koncentracích spočítejte procentuální imobilizaci podle následujícího vzorce: Im ct N = Im 100 N Kde: Im ct je imobilizace jedinců v čase t [%] N Im je průměrný počet imobilizovaných jedinců [ks] je počet živých jedinců vložených do každé koncentrace [ks] N 0 Hodnoty EC 10, EC 50, EC 90 zjistěte nelineární regresí, kdy se imobilizace dá do závislosti na dekadickém logaritmu koncentrace. Jednotlivé hodnoty EC se vyhodnocují pro každé paralelní stanovení zvlášť a z nich se vypočítá průměrná hodnota. Hodnoty EC 50 se nesmí lišit o více než 30 %. 0 Vyhodnocení výsledků vodního testu akutní toxicity na roupicích dle Roembke et. al. [2] Ze zaznamenané mortality Enchytraeus crypticus ve vodním prostředí sestrojte do jednoho obrázku graf pro každou testovanou koncentraci, kde bude na ose y vynesena mortalita v % a na ose x čas v hodinách s hlavní jednotkou 24 hodin. Výpočet mortality roupic je analogický k předchozímu výpočtu imobilizace Daphnia magna dle ČSN EN ISO 6341 (1997) [1]. M ct = N N M 0 100 Kde: M ct je mortalita jedinců v čase [%] N M je průměrná úmrtnost jedinců [ks] je počet živých jedinců vložených do každé koncentrace [ks] N 0 Hodnota LC 50 (koncentrace, při které dochází k 50% mortalitě), se určuje pomocí programu GraphPad Prism 5. Práce s tímto programem bude vysvětlena přímo během laboratorního cvičení. 4
7. Literatura [1] ČSN EN ISO 6341 (1997): Jakost vod Zkouška inhibice pohyblivosti Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) Zkouška akutní toxicity. [2] Roembke, J., & Knacker, Th. (1989): Aquatic toxicity test for enchytraeids. Hydrobiologia, 180, 235-242 [3] Šuteková, E. (2006): Zavedení a optimalizace metod pro vybrané biomarkery půdních bezobratlých, Diplomová práce, laboratoře RECETOX Brno. 5