Bakteriální bioluminiscenční test. Stanovení účinnosti čištění odpadních vod pomocí bakteriálního bioluminiscenčního testu

Transkript

1 Bakteriální bioluminiscenční test Stanovení účinnosti čištění odpadních vod pomocí bakteriálního bioluminiscenčního testu

2 BBTT Cíl: Stanovit účinek odpadních vod na bakterie Vibrio fischeri.

3 Principem testu je změna luminiscence mořských světélkujících bakterií Vibrio fischeri (syn. Photobacterium phosphoreum) vyvolaná negativním působením toxického vzorku (odpadní vody).

4 Množství emitovaného světla se měří luminometrem LUMIStox 300 před a po přidání testované látky a ze změny intenzity světla se počítá toxický účinek.

5

6 Měření se provádí v sérii zkušebních kyvet obsahujících různá ředění testované látky. Jednotlivá ředění se proměřují zpravidla po 15 a 30 minutách.

7 Termoblok s řízenou teplotou k temperování zkoušených vzorků na 15 C ± 1 C

8 Jako referenční roztok (blank) se používá 2% NaCl. Roztok chloridu sodného se používá k rozpuštění pevných vzorků či k naředění toxikantu. Kapalné vzorky musí být obohaceny chloridem sodným na výslednou koncentraci 2% NaCl.

9 EC Hodnota EC je efektivní koncentrace, která způsobí 20% (EC20) nebo 50% (EC50) inhibici emise světla (luminiscence) ve srovnání s kontrolou. LUMIStox 300 může vypočítat hodnotu EC, pokud zvolené koncentrace testované látky vyvolaly inhibici emise světla v rozmezí 10 až 90 %. Tyto hodnoty EC stanovujeme pro inkubační časy 15 a 30 minut.

10 Zkušební bakterie Klon luminiscenčních bakterií patří k druhu Vibrio fischeri NRRL B Bakteriální suspenze, používané pro stanovení toxicity, se připravují z komerčně dostupných lyofilizovaných bakterií, které musí být uchovávány v mrazničce při teplotě -18 o C až -20 o C.

11 Bakterie se začnou rozmnožovat ihned po rozmrazení a rehydrataci a jsou připraveny pro použití ke zkoušce

12 Voda Jako ředicí voda se používá roztok chloridu sodného (NaCl). Ředicí vodu připravíme rozpuštěním 20 g chloridu sodného v destilované vodě a doplníme na objem ml.

13 Pracovní postup

14 Nastavení luminometru vložení systémové diskety, zapnutí přístroje LUMIStox 300, spuštění termobloku tlačítko ON, počká se, až je dosaženo teploty 15 C ± 1 C (rozsvítí se zelené světlo)

15 Rehydratace bakterií rozmražený reaktivační roztok dáme na 15 minut temperovat do termobloku. Stejným způsobem necháme temperovat 2% roztok NaCl (ředicí voda). zkumavku s luminiscenčními bakteriemi vyndáme z mrazničky a na cca 2 minuty ji ponoříme do vodní lázně (kádinky s vodou o pokojové teplotě).

16 do zkumavky s bioluminiscenčními bakteriemi napipetujeme 0,5 ml rozmraženého, vytemperovaného reaktivačního roztoku. Zkumavku s bakteriemi a reaktivačním roztokem (zásobní suspenze) umístíme do termobloku a necháme 15 minut při teplotě 15 C temperovat.

17 do zkumavky se zbývajícím reaktivačním roztokem přelijeme suspenzi bakterií a jemným třepáním zkumavky zásobní suspenzi homogenizujeme

18 Příprava ředění pro stanovení toxicity odpadní vody Ve vzorku odpadní vody změříme hodnotu ph. Je-li ph mezi 6 až 8,5 není potřebná úprava. Je-li to nutné, upraví se hodnota ph na 7 ± 0,2 přídavkem kyseliny chlorovodíkové (1M-HCl) nebo roztoku hydroxidu sodného (1M-NaOH). Na 1 litr odpadní vody se přidá 20 g chloridu sodného.

19 Postup Do kyvet A1 až A9 dáme 1,5 ml ředicí vody. Do kyvety A10 dáme 3 ml odpadní vody. Pomocí automatické pipety přeneseme 1,5 ml odpadní vody z kyvety A10 do kyvety A9. Obsah kyvety několikrát nasajeme pipetou, aby došlo k důkladnému promíchání.

20 Příprava ředicí řady několikanásobným ředěním odpadní vody (faktorem 2) ředící řada: 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,13; 1,56; 0,78; 0,39 %. každá koncentrace je připravena zředěním předchozí na polovinu; kontrola - koncentrace 0 je referenční roztok (blank) 2% NaCl. Ten se používá i jako ředicí voda.

21 Tuto proceduru zopakujeme s dalšími koncentracemi: 1,5 ml z kyvety A9 do A8, 1,5 ml z A8 do A7 Kyveta A1 je kontrolní s 1,5 ml ředicí vody bez přídavku testovaného výluhu odpadu.

22

23 Kyvety s koncentrační řadou odpadní vody se umístí do řady A přístroje. kontrola je umístěna vlevo (pozice A1), následují jednotlivé dílčí koncentrace, neředěný vzorek je umístěn nejvíce vpravo (pozice A10).

24 do zkušebních kyvet v pozicích B1 až B10 a C1 až C10 napipetujeme 500 l zásobní suspenze bakterií (počet pozic záleží na rozsahu testování, pro každé ředění se nasazují duplikáty - kyvety B/C). Takto připravené zkušební kyvety se zkušební suspenzí bakterií se nechají opět 15 minut při 15 C v termobloku temperovat.

25

26

27 Vlastní měření bioluminiscence na luminometru zvolíme vyhodnocovací režim LU (stanovení relativní luminiscence), po 15 minutovém temperování suspenze bakterií (kyvety v pozici B a C) se změří počáteční luminiscence bakterií. Kyveta se umístí do měřící komůrky v luminometru, stiskne se tlačítko measure a vyčká se na zobrazení hodnoty relativní luminiscence.

28 luminiscenci je nutno měřit ve stejných časových intervalech, doporučuje se interval 15 až 20 sekund po každém změření napipetujeme 0,5 ml ředicí vody pro kontroly (kyvety B1 a C1) z kyvety A1 nebo ředění vzorku z odpovídající pozice v řadě A2 až A10 do řady B nebo C,

29 hodnoty luminiscence v kontrolních i zkušebních kyvetách zaznamenáme do protokolu, po uplynutí prvního inkubačního času (15 minut) se opět změří luminiscence u všech vzorků z pozic B a C,

30 po změření luminiscence v poslední kyvetě se na displeji luminometru ukáží hodnoty EC20, EC50 a fk, měření je ukončeno, zpětnými šipkami se vrátíme do hlavního menu přístroje na END. Po vypnutí luminometru vyjmeme systémovou disketu a vypneme termoblok

31 Platnost testu (validace) Výsledky testu se považují za platné, jestliže hodnota korekčního faktoru (fk) pro 30 minutovou expozici je v rozsahu hodnot 0,6 až 1,8.