Obecná odpověď na stres Odpověď na stres Gram-pozitivních bakterií Bakteriální sporulace Odpověď na stres Gram-negativních bakterií Dlouhodobé přežívání Bakteriální kompetence Mezibuněčná komunikace
Typy stresů Zvýšená teplota Hsp Snížená teplota Cold shock proteins Oxidativní stres Hladovění stringentní odpověď Post diauxický stres Zvýšená acidita Poškození DNA
Mechanismus přežití u Gram-negativních mikroorganismů 1985 Xu et al. Escherichia coli, Vibrio cholerae živé ale nekultivovatelné v vodním prostředí (ústí řek, mořská voda). Odpověď na hladovění stav, kdy organismus není zjistitelný standardní kultivační technikou (cfu). jsou zjistitelné mikroskopicky mají zachovanou membránovou integritu schopnost průniku do eukaryotních buněk mají zvýšenou odolnost k environmentálním vlivům změněný profil bílkovin
Charakteristika VBNC Gram-negativní bakterie jsou známé schopností přežívat jako živé ale nekultivovatelné buňky (VBNC), kdy nerostou na konvenčních mediích,ale zůstávají neporušené se zachovalou životaschopností. Tento jev byl pozorován mnoha způsoby a zdá se být analogický sporulaci Gram-pozitivních bakterií. Přítomnost spoo-like genů u Vibrio cholerae a Escherichia coli byla zkoumaná pomocí polymerasové řetězové reakce za užití primerů odvozených z konservovaných oblastí spooa a spoof genů Bacillus subtilis.
Charakteristika VBNC Nebyly identifikovány oblasti u V. cholerae nebo E. coli které by vykazovaly komplexní homologii k spoo genům z B. subtilis a proto se soustředili na alternativní přístup mutagenese transposonu. Více než 2,500 transposonových mutant V. cholerae bylo testováno za nutričního limitu v umělé mořské vodě na VBNC odpověď, a porovnáno s divokým kmenem. Mutant JR09H1 vstupoval do VBNC rychleji než divoký kmen a to jak př 25 o C a 4 o C.
Cold shock response E. coli Změna z 37 na 10 o C zástava růstu a po 4 5 h snížení počtu syntetizovaných proteinů. Kromě toho se v tomto období tvoří nové cold shock response proteiny. Jsou to CS7.4, NusA, RecA, H-NS, polynukleotidfosforylasa, faktor iniciace translace 2β a 2α, pyruvát dehydrogenasa. Podjednotka A DNA gyrasy byla identifikovaná jako cold shock protein. Změna ve složení lipidů cytoplasmatické membrány.
Adaptační systémy bakterií Se vznikem kyslíkové atmosféry rozdělení organismů na anaeroby nemají mechanismy na likvidaci superoxid aniontů. Aerobní organismy získaly ochranné mechanismy: Superoxid dismutasa SOD Katalasa Alkyl hydroperoxid reduktasa
Oxidační stres nerovnováha mezi oxidačním a antioxidačním systémem vede k závažným poškození buněk tvorba volných radikálů- endogenní - exogenní
Oxidativní stres Za aerobních podmínek organismy čelí tvorbě různých typů ROS. Tvoří se metabolismem, respirací β-oxidací mastných kyselin, po účinku peroxidu, nebo těžkých kovů. 2 rozměrná ELFO - 167 proteinů exprese je ovlivněna H 2 O 2 nebo menadionem (u kvasinek).
Oxidativní stres u mikroorganismů Obecná odpověď na stres systém regulující koordinovanou indukci více stresových genů pomocí společného cis elementu součást jejich promotorů Stress response element - STRE camp protein kinasa A - PKA STRE sekvence AGGGG celkem 186 genů STRE je funkční v obou orientacích CCCCT nebo AGGGG
Volné radikály nestabilní částice jeden nebo více nepárových elektronů krátký poločas rozpadu řetězová reakce- iniciace - propagace - terminace
Aktivní formy kyslíku ( ROS = reactive oxygen species) hlavní sloučenina - molekulární kyslík O 2 konečný akceptor elektronů v KDŘ přeměna O 2 na H 2 O- cytochromoxidasa čtyřkroková přeměna Singletový Superoxid Hydroxidový kyslík anion 1 O 2 1 O 2 - O 2 OH -............................ O:O O:O: :O:O :O:H pka = 4,8................ H.... + H.... + H...... +.. O:O H:O:O H:O:O:H e - O 2 HO 2 O:H H:O:H e - e - e - H 2 O 2 HO H 2 O Základní stav Hydrogen- Peroxid Hydroxylový Voda kyslíku hyperoxidový vodíku radikál radikál
Půbení antioxidantů na ROS
Typy stresů
Escherichia coli První sensor pro peroxid OxyR regulon Obsahuje geny pro metabolismus peroxidu: katg, ahpc, ahpf, dps, dále pro redox rovnováhu: gor, grxa, trxc a malou RNA oxys.
Oxidativní stres aktivuje OxyR tvorbou disulfidických vazeb.oxyr spouští expresi enzymů s redukčním účinkem na disulfidické vazby.
Antioxidační systém organismu enzymový systém: superoxiddismutasa ( SOD) katalasa ( CAT) glutathionperoxidasa ( GSHPx) neenzymový systém ( zhášeče): kys. askorbová (vit. C) - tokoferol ( vit. E) - karoten ( vit. A) glutathion...
Hlavní signální dráhy aktivované oxidativním stresem
Další složky antioxidační obrany Glutathion Gsh1p hypersensitivita k H2O2 Thioredoxin Trx1p/Trx2p totéž + defekt v buň.c. Glutaredoxin Glx1p Superoxide dismutasa Sod1p
Post Diauxic Shift Podobný cis regulující prvek identifikován v promotoru SSA3 genu. Tento úsek, jehož sekvence se podobají STRE (T/AAGGGA) je také regulován camp PKA drahou byl označen jako post-diauxic shift PDS. Oba elementy jsou však regulovány rozdílně, neboť PDS působí pouze malé zvýšení exprese jako odpověď na heat-shock, je necitlivý k osmotickému stresu a není ovlivněn mutacemi.
Pathogenní odpověď na stres Nutriční stres limitace Fe Exprese bakteriálních proteinů jako odpověď na tkáň hostitele Environmentální kontrola exprese genů pro bičíky (pilus gene) Teplotní regulace bakteriální virulence
δ E Uplatňuje se při expresi syntézy alginátu u Pseudomonas aeruginosa, u pacientů s cystickou fibrozou.
δ E závislá extracytoplasmatická odpověď na stres δ E je vázán antisigma faktorem RseA. RseB se váže na periplasmatickou doménu RseA a ochraňuje před proteolýzou.
δ E odpověď na stres Nesložené OMP aktivují proteasu DegS, která štěpí periplasmatické domény RseA. Částečně degradovaný RseA je substrátem pro RseP. RseP dále štěpí RseA a uvoňuje cytoplasmatické domény RseA navázané na δ E. Zbývající domény RseA jsou pak degradovány ClpXP a tak uvolní δ E ta pak interaguje s RNA polymerasou a řídí transkripci do regulonu. Hlavní skupiny známých genů δ E regulonu jsou ukázány. Alarmon ppgpp a protein DksA může aktivovat δe dependentní transkripci.
Vliv δe na buněčné obaly
Defekty buněčných obalů Kultury SEA007 SEA008 byly obdobně kultivovány. Vzorky se odebíraly po 2.5 h po indukci overexprese rsea a rseb ( A D). Zobrazení živých buněk za různých typů mikroskopie: DIC diferenciální interferenční mikroskopii, sloupec 1, fluorescenční mikroskopie, sloupec 2, - vizualizace membrán; barvení DAPI, sloupec 3 vizualizace DNA, exprese YFP vizualizace cytoplasmy( zeleně) slouipec 4. A kontrolní kmen δe není inhibovaná B a C δe je inhibovaná, bleby buněk
Definice acidického stresu Kombinovaný biologický účinek nízkého ph a slabých (organických) kyselin v prostředí Slabé kyseliny: těkavé mastné kyseliny jako butyrát, propionát a acetát Nenabité, protonované slabé kyseliny difundují přes membránu a disociují až v cytoplasmě, kde snižují ph Čím nižší je vnější ph, tím více slabých kyselin bude protonováno ( podle pka hodnot) atím více jich bude procházet membránou K usmrcení buněk při ph 3,5 je potřeba méně slabých org. kyselin, než při ph 4,5
Acid Tolerance Response
Obecná odpověď na stres u E. coli Spouští se mnoha typy stresů: hladovění, vysoký osmotický tlak, vysoká nebo nízká teplota, nízké ph Odpověď ve stavu nouze (emergency) a dlouhodobý program adaptace na hladovění Brání buňku před zánikem, menší vliv na opravy Akumulace δ S (RpoS): hlavní regulátor této odpovědi Více než 50 genů je indukováno tvoří δ S regulon
Listeria monocytogenes Jako odpověď na zvýšenou teplotu hsp, Geny: groesl, dnak, clpb, clpc, clpe, htra posilují virulenci Acid stres geny: gadd1t1, gadd2t2, gadd3, arcb,lmo0038, arca, atpi - posilují virulenci Osmotický stres geny: htra, kdpe, lisrk, prob, btla - posilují virulenci Bet, gbu - neovlivňují virulenci
SOS odpověď na poškození DNA Mikroby jsou pravidelně vystavovány působení celé řady faktorů prostředí, které poškozují jejich DNA. Toto poškození vede k reca lexa závislé indukci celé řady genů. Poškození DNA vyvolá expresi minimálně 20 genů, které nejsou spolu ve vazbě. Několik typů posttranslačních mechanismů se také účastní koordinace odpovědi na stres. LexA protein má funkci represoru genů náležejících do SOS regulonu. Signálem poškození DNA je utvoření nukleoproteinového vlákna RecA/ssDNA. Geny podléhající SOS kontrole byly identifikovány pomocí nahodile generovaných transkripčních fuzí.
SOS odpověď První experimentální podpora existence induktivního systému oprav DNA u Escherichia coli byla nalezena před 30 lety Miroslavem Radmanem, který zavedl termín SOS response pro popis celého řetězce událostí. Dva proteiny hrají klíčové role v regulaci SOS odpovědi: represor nazývaný LexA a induktor, RecA vlákno. Během normálního růstu LexA represor se váže na specifické sekvence SOS boxu, přítomného v promotorové oblasti SOS genů a tak zabraňuje jejich expresi. Za normálních růstových podmínek jsou SOS geny diferenciálně reprimované. Stupeň represe závisí na přesné sekvenci jejich SOS boxů (oblast promotoru, která je rozpoznávaná LexA), na jejich pozici v promotorové oblasti, a na síle promoteru.
Mechanismy, které má buňka k dispozici pro opravu poškozené DNA Excisní mechanismy opravy chybných nukleotidů:uvra, UvrB, UvrC, UvrD, DNA polyme- rasa I, DNA ligasa Kontrola dělení buňky po poškození DNA: SulA in- hibuje buněčné dělení vazbou na FtsZ. Přídavné mechanismy pro kontrolu replikační vidličky: u E.coli změna DNA polymerasy III na UmuD DNA polymerasu.
Aktivace SOS genů Poškození DNA vyvolává akumulaci jednovláknové DNA ssdna (single strand) RecA protein tvoří vlákno kolem ssdna, je závislý na ATP a tak se aktivuje. Aktivovaná forma RecA působí jako ko-proteasa při autokatalytickém štěpení LexA proteinu (represor)
Jakmile je pool LexA snížen, represe SOS genů ustává v závislosti na afinitě jejich SOS boxů k LexA. Tímto způsobem se postupně aktivují různé geny. Geny jejichž operátor má velmi slabou afinitu k LexA jsou plně exprimovány jako první. Geny se slabým SOS boxem jako jsou lexa, reca, uvra, uvrb, uvrd jsou plně indukovány i po slabém ošetření vyvolávajícím SOS odpověď. Dále jsou na řadě geny se silnějším SOS boxem: sula, umud,umuc. SulA zastavuje buněčné dělení - vznik vláken.