Experimentální modely ekotoxicity pro bezobratlé živočichy Klára Hilscherová RECETOX- Přírodovědecká fakulta MU Brno Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky
Bezobratlí živočichové Přítomnost a aktivita bezobratlých je naprosto rozhodující pro stav ekosystému. Bezobratlé najdeme ve všech ekosystémech. Bezobratlí tvoří významnou část celkové biomasy v terestrických i akvatických ekosystémech, mají nepoměrně vyšší druhovou bohatost oproti obratlovcům. Hrají významnou roli v potravním řetězci jako destruenti, ale i konzumenti prvního a druhého řádu, s čímž je spojená možná bioakumulace. Díky změnám habitatu při metamorfóze mohou zasahovat do více ekosystémů i během jednoho životního cyklu, díky čemuž mohou přijímat široké spektrum polutantů a přenášet je mezi jednotlivými ekosystémy.
Testy ekotoxicity v půdě hlístice Půdní testy s bezobratlými Uspořádání : umělý substrát, vlhčená petriho miska, standardní nebo přírodní půda různé nádoby... - zpravidla 14 dní (letalita), 56 dní reprodukce... Organismy Kroužkovci žížaly, háďátka, roupice Hmyz - Chvostoskoci (Collembola) roupice žížaly chvostoskoci
TERESTRICKÉ PROSTŘEDÍ konzumenti - bezobratlí Zejména pro testování biocidů VČELY - testování insekticidů - dávkování v potravě Moucha domácí Drosophila (hodnocení genotoxicity)
Testy s vodními bezobratlými Stanovení akutní či prolongované toxicity: chemických látek, výluhů z pevných matric průmyslových či komunálních odpadních vod povrchových nebo podzemních vod
Testy toxicity na vodních bezobratlích Normy testů na bezoobratlých: ČSN EN ISO, OECD, ASTM, US EPA, TNV, EEC, AFNOR Testy na korýších (Crustacea) - planktonní - nejčastější Daphnia magna, D. pulex, Ceriodaphnia dubia, Artemia salina (mořská), Thamnocephalus platyurus Testy na vířnících (Rotifera) - Brachionus calyciflorus Testy na kroužkovcích (Annelida) - Tubifex tubifex Testy na hmyzu (Insecta) - Chironomus tentans Testy na měkkýších (Mollusca) Potamopyrgus antipodarum Testy na bentických korýších (Crustacea) Gammarus, Hyallela azteca
Daphnia magna Artemia salina Ceriodaphnia dubia Gammarus Chironomus riparius
Hrotnatka velká (Daphnia magna) Říše Animalia (živočichové) kmen Arthropoda (členovci) podkmen Crustacea (korýši) - třída Branchiopoda (lupenonožci) řád Cladocera (perloočky) čeleď Daphniidae (hrotnatkovití) rod Daphnia (hrotnatka) Daphnia pulex (hrotnatka obecná), D. magna (h. velká) zástupce zooplanktonu akutní i chronické testy běžně používaný modelový organismus (OECD 1984) - citlivost k toxikantům - rychlá reprodukce - determinované toxikologické parametry - rychlý životní cyklus - snadná kultivace - biochemické markery
Normy testů s Daphnia magna ČSN ISO 6341 (75 7751) Jakost vod Zkouška inhibice pohyblivosti Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) Zkouška akutní toxicity ČSN ISO 10706 (75 7752) Jakost vod Stanovení chronické toxicity látek pro daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) ISO 6341/1996 Water quality - Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) - Acute toxicity test ISO 1070/2000 Water quality - Determination of long term toxicity of substances to Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) OECD 202 Daphnia sp. Acute Immobilisation Test (Updated Guideline, adopted 4th April 1984) OECD 211 Daphnia magna Reproduction Test (Original Guideline, adopted 21st September 1998)
Permanentní laboratorní chov Daphnia magna kultivační místnost stálá teplota 20 2 C stálá fotoperioda 16h světla / 8h tmy stálé ph kultivační médium M4 pravidelné krmení směsí řas 3 5 mm dlouhý, převážně planktonický sladkovodní živočich dospívají během 6-10 dní, množí se partenogeneticky, životnost až 56 dní při 20 C
Akutní test na Daphnia magna Cíl: určení počáteční koncentrace, která v testu imobilizuje 50% jedinců Daphnia magna Podmínky akutního testu: jedinci mladší 24 hodin, získaní partenogenezí expozice 24/48 h, bez aerace, bez krmení, bez úpravy ph standardní médium (CaCO 3, MgSO 4, NaHCO 3, KCl) bez osvětlení nebo 16 h světla / 8 h tmy, teplota 20 C 2 C ph 6-9 (změna během testu max. 1,5) během testu měříme ph, teplotu, O 2 rozpuštěný kyslík 2mg/l / 3 mg/l referenční látka:dichroman draselný Zpracování a příprava vzorků vody Láhve se naplní vzorkem, aby se zamezilo přístupu vzduchu. Zkouška toxicity se provede co nejdříve po odběru, nejpozději do 6 hod. Pokud není možné tento interval dodržet, vzorek se na místě odběru zchladí na +4 C [nebo zmrazí na 20 C]. V tomto případě musí být vzorek zpracován do 48 hod.
Vlastní zkouška: Nejméně: 20 jedinců na koncentraci (4x5ml/5ks), 5 organismů na jamku či nádobku nádobka 5-10ml/ks (30 jamková destička (10 ml)) - 2 ml testovaného roztoku na jedince po 5 jedincích do každé jamky nejméně 20 jedinců Zkoušené roztoky: min. 5 koncentrací + kontrola (testovaná látka + ředící médium) ředící jamka testovací jamky
Sledovaný parametr: imobilizace po 24, 48 hodinách - počítáme mobilní jedince - kriterium imobilizace: jedince, kteří nejsou schopni se rozplavat ani po 15s mírném zamíchání považujeme za imobilizované, i kdyby ještě pohybovali tykadly Platnost výsledků = validita testu Koncentrace rozpuštěného kyslíku na konci zkoušky je větší anebo se rovná 2 mg.l -1 Procento imobilizace kontrolních vzorků je menší než nebo se rovná 10% 24h-EC50i pro dichroman draselný je v rozsahu od 0,6 do 1,7 mg.l-1 Vyjadřování výsledků Hodnocení: Počet imobilních jedinců počáteční inhibiční koncentrace - hodnoty EC50 (pro 24h a 48h) popř. nejnižší c pro 100% imobilizaci a nejvyšší c pro 0% imobilizaci Hodnoty 24h-EC50i, 48h-EC50i a limity odpovídající 0% a 100% imobilizace se vyjadřují: U odpadních vod v procentech ředění U chemických látek v miligramech na litr
ALTERNATIVNÍ MIKROBIOTESTY ("toxkity") s bezobratlými www.microbiotests.be
MIKROBIOTESTY http://www.microbiotests.be/ Výhody: miniaturizace, zkrácení doby inkubace a tím i zjednodušení Možnost dlouhodobého uchovávání testovacích organizmů ve formě kryptobiotických klidových stádií, v lyofilizovaném nebo imobilizovaném stavu. Organizmy se před použitím v testech uvedou do aktivního stavu. Synchronně vylíhlí jedinci jsou uniformní a pocházejí z geneticky přesně definovaných zásobních kultur. V současnosti jsou mikrobiotesty komerčně dostupné v podobě tzv. toxkitů
Mikrobiotesty DAPHTOXKIT FTM magna, DAPHTOXKIT FTM pulex: 24-48h test akutní toxicity pro korýše Daphnia magna a Daphnia pulex (odpovídá OECD a ISO normám) CERIODAPHTOXKIT FTM: 24 h test akutní toxicity pro korýše Ceriodaphnia dubia (odpovídá USEPA normě) THAMNOTOXKIT FTM: 24 h test akutní toxicity pro korýše Thamnocephalus platyurus (Test s Thamnocephalem u nás normován TNO) OSTRACODTOXKIT FTM: 6 denní chronický test toxicity (mortalita/inhibice růstu) s korýšem Heterocypris incongruens. První kontaktní mikrobiotest pro kontaminované sedimenty nebo půdy ROTOXKIT FTM: 24 h test akutní toxicity pro vířníka Brachionus calyciflorus (odpovídá standardní normě ASTM E1440-91). ROTOXKIT FTMshort chronic: 48h krátký-chronický (reprodukční) test s vířníkem Brachionus calyciflorus (odpovídá francouzské normě AFNOR) PROTOXKIT FTM: 24h chronický (inhibice růstu) test toxicity pro prvoka Tetrahymena thermophila. Metodika pro odpovídající test je vyvíjena v OECD. RAPIDTOXKIT (tm): Hodinový test toxicity s larvami korýše Thamnocephalus platyurus pro rychlou detekci kontaminace vody.
Mikrobiotesty Testovací organismus Thamnocephalus platyurus Uchovávání: klidová stádia Doba líhnutí: 20 hod., 4000 lx, 20 C Inkubace: 24 hod., 4000 lx, 20 C Vyhodnocení: mortalita, 24 LC 50 Výhody: 20 h líhnutí, větší, citlivý organismus, expozice 24-48 h, srovnatelné výsledky s dafnií (+ citlivější) i zakalené/zabarvené vzorky, je v TNV Obdobně CERIODAPHTOX Ceriodaphnia dubia Thamnotoxkit
ODVĚTVOVÁ TECHNICKÁ NORMA VODNÍHO HOSPODÁŘSTVÍ MZe ČR MIKROMETODA STANOVENÍ AKUTNÍ TOXICITY NA KORÝŠI THAMNOCEPHALUS PLATYURUS TNV 75 7754 Obsah Strana 1. Předmluva.......... 1 2. Předmět normy...:... 2 3. Termíny. definice a zkratky... 2 4. Podstata zkoušky...:... 3 5. Materiály a chemikálie... 3 6. Přístroje a pomůcky...:... 4 7. Příprava vzorků zkoušené vody... 4 8. Postup zkoušky... 5 9. Vyjadřování výsledků... 7 10. Protokol o zkoušce...... 7 11. Příloha A (informativní) - Korýš Thamnocephalus platyurus... 8 12. Přílohy B (informativní) - Limitní hodnoty pro Thamnocephalus platyurus... 9 13. Příloha C (informativní) - Literatura... 10
Rotoxkit F Testovací organismus: Brachionus calycifloris (vodní vířník) Uchování: klidová stádia, cysty Doba líhnutí: 18 hod., 20 C, 4000lx Design: 6 opakování, 6 koncentrací v jedné destičce, jamka á 0,3 ml Inkubace: 24 hod., 20 C, 4000lx Vyhodnocení: mortalita, 24 LC 50 Výhody: Domácí běžný druh, přídavná informace Nevýhody: Malý, většinou méně citlivý Závěr: zajímavý doplněk testů toxicity, není nutný, je-li v baterii korýš Obdobně Protoxkit s prvokem Tetrahymena thermophila
Líhnutí cyst vířníků
Plnění testovací destičky
Přenos vířníků do testovacích jamek
Daphtoxkit pulex Výhody Jako ISO, OECD Z klidových stádií Nevýhody 3 dny líhnutí Nevyrovnané líhnutí Problémy se skladováním Povrchové tenze - neplavou Závěr: zatím není zcela vyladěný
RAPIDTOXKIT Test s nejrychlejší odpovědí jídelní test sledováno ovlivnění příjmu potravy stresem (toxickou látkou) Testovací organismus: Thamnocephalus platyurus Uchování: klidová stádia, cysty Doba líhnutí: 30-45 hod., 25 C, 4000lx Inkubace: 15-60min, 25 C, 4000lx Pak přidány červeně obarvené mikrospory (potrava), inkubace 15-30 min Vyhodnocení: pod mikroskopem zhodnocen příjem potravy v jednotlivých expozičních variantách hodnocena inhibice příjmu mikrospor v porovnání s kontrolou
Testy toxicity na korýších/vířnících VALIDITA: Výsledky testu jsou považovány za platné, když Koncentrace rozp. kyslíku neklesla pod 60% nasycení Koncentrace testované látky neklesla pod 80% Mortalita kontrolního vzorku nepřesáhla 10% Zjištěná koncentrace LC 50 je v souladu se standardy
PŮDA + SEDIMENTY Mikrobiotest - OSTRACODTOXKIT FTM: 6 denní chronický test toxicity (mortalita/inhibice růstu) s korýšem Heterocypris incongruens. Kontaktní test v mikrodeskách 3x2 jamky (objem 1 ml). 10 jedinců na jamku, Uchování: klidová stádia, cysty Doba líhnutí: 52 hod., 25 C, 4000lx Inkubace: 6 dní, 25 C, 4000lx Vyhodnocení: mortalita, 24 LC50, růst
Testy toxicity s bezobratlými Ekonomické hodnocení (orientační ceny bez cla a dopravy) Rotoxkit, Thamnoto... 1000Kč Daphtoxkit...... 1300Kč Algaltoxkit.........4300Kč ECHA Biocide monitor... 200Kč MetPad. 500Kč Toxichromotest (SedimentChromoPad), Toxichromotest 1000Kč
Chronické testy s vodními bezobratlými živočichy Akvatické testy Reprodukční test s hrotnatkou Daphnia spp. (ISO 1070/2000) Test přežívání a reprodukce s břichatkou Ceriodaphnia dubia (USEPA, 1989) Chronické biotesty s vidlonožci (Mysidacea řád korýšů z podtřídy rakovců) mořští, pronikají i do brakických a sladkých vod Sedimentové testy 10-denní test přežívání a růstu s různonožcem Hyalella azteca (USEPA, 2000) 42-denní test přežívání, růstu a reprodukce s různonožcem Hyalella azteca (USEPA, 2000) 10-denní test přežívání a růstu s pakomárem Chironomus tentans (USEPA, 2000) Celoživotní (Life-cycle) test pro hodnocení účiků kontaminace sedimentů s pakomárem Chironomus tentans (USEPA, 2000)
Chronický test na Daphnia magna ČSN ISO 10706 Jakost vod - Stanovení chronické toxicity látek pro Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) organismy mladší 24h 10 organismů na koncentraci individuálně v 50ml media M4/kádinku médium výměna 3x týdně expozice 21 dní teplota 20 2 C ph 6-9 ( 1,5) rozpuštěný O2 > 3mg/l fotoperioda 16 h světla / 8 h tmy krmení směs řas Jednou týdně: O2, teplota, tvrdost a ph v médiu, kontrolních nádobách a u nejvyšší zkušební koncentrace.
Příprava média Elendt M4 Zásobní roztoky SrCl 2.6H 2 O H 3 BO 3 MnCl 2.4H 2 O LiCl ZnCl 2 RbCl CoCl 2.6H 2 O NaBr Na 2 SeO3 KI CuCl 2.2H 2 O NH 4 VO 3 CaCl 2.2H 2 O, NaHCO 3, NaNO 3 MgSO 4.7H 2 O, KH 2 PO 4, KCl, K 2 HPO 4, Na 2 SiO 3.9H 2 O Roztok I (stopové prvky) Roztok II. (makroživiny vitamíny) Thiamin hydrochlorid, Biotin, Cyanocobalamin
Zkušební roztok a zkušební koncentrace Zkušební koncentrace se připravuje alespoň v pěti variantách s faktorem <3,2 (geometr. řada) c n = c 0 * q n n = 1,2,3, Rozptyl koncentrací se nastavuje podle cíle testu: LOEC/NOEC EC x Nepoužívá se koncentrace se statisticky významným účinkem na přežití dospělců -> toxicita pro reprodukci a mortalitu Rozpouštědla a dispersanty do 0,1ml/l, lépe je nepoužívat
Sledované parametry Mortalita, přežívání koncentrace 135 mg/l Reprodukce 100 Počet narozených juvenilů 80 Den první reprodukce Chování - způsob pohybu koncentrace 15 mg/l 240 220 přežívání (%) 60 40 20 0 contorl BIOMASS AQ.EXTRACT C18 PERMEATE C18 ELUATE počet narozených jedinců 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 control BIOMASS AQ.EXTRACT C18 PERMEATE C18 ELUATE SPINACH 10 12 14 16 18 20 22 čas (dny) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 čas (dny) další parametry (zbarvení, tukové kapénky, velikost gonád) - měření délky matečných organismů na konci zk. - velikost a počet potomků jednoho organismu - počet potracených plůdků,
Testy toxicity s bezobratlými Závěr pro konkrétní případ, vzorek a problém může zkušený ekotoxikolog vybrat vhodnou kompozici detekčního systému akutní testy toxicity jsou jednou z několika součástí systému hodnocení - chemické analýzy - struktura zoocenoz a fytocenoz - biokumulace a biokoncentrace - QSAR - biomarkery - atd...
Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky