Nukleové kyseliny Replikace DNA 2013 Doc. MVDr. Eva Bártová, Ph.D.
Nukleové kyseliny 7% cytozin Monomer: NUKLEOTID, tvoří jej: uracil kyselina fosforečná pentóza (ribóza, deoxyribóza) tymin organická dusíkatá baze: puriny - adenin (A) (6-aminopurin) - quanin (G) (2-amino-6-oxopurin) pyrimidiny - cytozin (C) (6-amino-2-oxopyrimidin) - tymin (T) (2,6-dioxo-5-metylpyrimidin) - uracil (U) (2,6-dioxopyrimidin) adenin quanin Nukleosid = N base+cukr (adenosin, quanosin, cytidin, uridin, thymidin)
Komplementariata párování bazí T A C G Vždy se páruje: purin + pyrimidin U A
Polynukleotidový řetězec spojení nukleotidů kovalentní fosfodiesterovou vazbou (mezi fosfátovou skupinou jednoho nukleotidu vázanou na 3. uhlík pentózy a pátým uhlíkem pentózy druhého nukleotidu). V ose řetězce se střídá kyselina fosforečná a pentóza, baze vázané na cukr glykozidovou vazbou odstupují od osy. fosfát cukr Délka NK = počet bazí (1kb = 1000bp; 1Mb = 1 million bp) oligonukleotidy - krátké řetězce (< 50 bp) polynukleotidy - dlouhé řetězce - pentóza - fosfát Umět namalovat a popsat DNA
Typy NK Ribonukleová (RNA) zpravidla 1 polynukleotidový řetězec (jednovláknová). Je tvořena fosfátem, ribózou a bazemi A, G, C, U. transferová RNA (trna) ribosomální RNA (rrna) mediátorová RNA (mesenžerová, informační) (mrna) virová RNA (jednořetězcová nebo dvojřetězcová, lineární)
Typy NK Deoxyribonukleová (DNA) 2 řetězce (dvouvláknová) spojené H můstky mezi N bazemi Je tvořena fosfátem, deoxyribózou, bazemi A, G, C, T. lineární - s volnými konci u eukaryot cirkulární - kružnicová, př. u virů, plazmidů a chromosomů (u prokaryontních organismů, mitochondrií a chloroplastů).
Konformace primární struktura - zastoupení a pořadí (sekvence) nukleotidů v polynukleotidovém řetězci sekundární struktura - tvar polynukleotidového řetězce v prostoru RNA - šroubovice, dvojitá šroubovice (RNA viry) - jetelový list (trna) t-rna DNA (1953 J. Watson, F. Crick - popis DNA) (1962 J. Watson, F. Crick, M. Wilkins - nobelova cena ) - pravotočivá dvouřetězcová šroubovice - lineární nebo cirkulární (virová DNA - jednořetězcová/dvojřetězcová, lineární/cirkulární) terciární struktura uspořádání DNA v chromozomu Umět namalovat trna
Rosalind Franklin (1920-1958) Londýn, Cambridge university, chemie a biologie Maurice Wilkins (1916) New Zealand, King Edwards school v Birmingham, fyzika
James Watson a Francis Crick u modelu DNA
NK se liší počtem bazí a ze směsi je lze separovat na základě rozdílu v jejich sedimentačních rychlostech. Značení NK - podle sedimentačních konstant vyjadřovaných ve Svedbergových jednotkách (S) (př. 70S RNA - počet nukleotidů 6000)
Denaturace - změna sekundární konformace (oddělení obou řetězců) zvýšením teploty, zásaditým ph, působením močoviny atd. Denaturace reverzibilní = renaturace (hybridizace) Depolymerace (degradace) - přerušení obou vláken ve stejném místě vlivem přílivu energie, nebo působením spec.enzymů nukleáz (přerušují kovalentní vazby mezi nukleotidy v řetězci). depolymerace denaturace místo pro restrikční enzym
REPLIKACE GENETICKÉ INFORMACE
- život závisí na uchovávání a předávání genetické informace - v buňce jsou mechanismy pro: přesné kopírování genetické informace z mateřské buňky na 2 dceřiné buňky ochranu genetické informace před chybami (mutace) DNA animace DNA: http://www.pbs.org/wgbh/nova/geno me/dna.html# - dvouřetězcová DNA - v ose řětězce se střídá fosfát a cukr chemická polarita - vlákna jsou vůči sobě antiparalelní (opačná orientace: 5 3 a 3 5 ) - oba řetězce nesou stejnou informaci, každý může být matricí (templátem, předlohou) pro syntézu komplementár. vlákna REPLIKACE DNA = vznik 2 identických molekul DNA z 1 původní
Replikace (syntéza) DNA - probíhá v S fázi buněčného cyklu
PRŮBĚH REPLIKACE DNA 1. uvolnění nadšroubovicového vinutí DNA - topoizomeráza 2. vazba iniciačních proteinů na replikační počátky DNA-helikáza - rozvíjí dvoušroubovici DNA prokaryota - 1 replikační počátek eukaryota - mnoho replikačních počátků (DNA je větší)
3. vznik replikační vidličky - po rozvolnění DNA vznikají 2 replikační vidličky ( Y ), na které se váží proteiny replikačního aparátu: primáza (specifická RNA polymeráza) - katalyzuje vznik a připojení primeru na začátek jednovlákové DNA vzniká krátké dvouvlákno, které je prodlužováno DNApolymerázou DNA-polymeráza - katalyzuje připojování nukleotidů na 3 konci DNA (prodlužuje dvouvlákno), má polymerační funkci ve směru 5 3 nového řetězce (ve směru 3 5 má nukleázovou aktivitu, tj. štěpení DNA, význam pro opravu chyb) primer - krátky asi 10 bp oligonukleotid RNA, syntetizován na principu komplementarity podle templátové DNA - na vedoucím řetězci je 1 primer, na váznoucím řetězci jich je mnoho) Umět namalovat a popsat replikační vidličku a replikační bublinu
Proteiny v replikační vidličce
4. růst nového dvouvlákna DNA - nové vlákno DNA je syntetizována pouze ve směru 5 3 vedoucí řetězec - růst kontinuálně 5 3 váznoucí řetězec (opožďující se) - růst diskontinuálně, vznikají Okazakiho fragmenty 3 5 - syntéza nového vlákna připojováním nukleotidů DNApolymerázou - odstaranění primerů (RNA nukleotidy) RNA-nukleázou - dosyntetizování volných úseků opravnou DNA-polymerázou - spojení Okazakiho fragmentů DNA-ligázou (ligate=spojit) Animace replikace DNA: http://bcs.whfreeman.com/thelifewire/content/chp11/1102003.html http://www.stolaf.edu/people/giannini/flashanimat/molgenetics/dna-rna2.swf
Asymetričnost replikační vidličky (bublina) 5 3 3 5 5 3 3 5
5. ukončení replikace DNA, syntéza DNA v telomerách - po odstranění primeru na 3 konci DNA, nemůže být vlákno dosyntetizováno (zkracuje se) = zkracují se telomery Telomery - opakující se (repetitivní) sekvence (úsek) nukleotidů na koncích eukaryontních chromozomů (negenová DNA) - jejich zkracováním se nezredukuje počet strukturálních genů BUNĚČNÉ STÁRNUTÍ - vlivem zkracování telomer dochází po určitém počtu dělení ke ztrátě schopnosti se dělit a tím ke stárnutí buňky př. fibroblasty (buňky pojivové tkáně) lidského embrya se dělí 80x, fibroblasty 40-letého člověka se dělí 40x mitotický chromozom telomera
- příležitostně se telomerické sekvence dosyntetizují a připojí k templátovému vláknu chromozomu enzymem telomerázou Telomeráza (enzym) aktivní telomeráza - v buňkách prokaryot - v zárodečných buňkách eukaryot inaktivní telomeráza - v somatických buňkách eukaryot (souvisí se stárnutím a smrtí buněk) telomery buňka embrya chromozom dlouhá telomera aktivní telomeráza dospělá buňka krátká telomera inaktivní telomeráza telomera (opakující se sekvence
OPRAVA CHYB NA DNA Zdroje chyb: chybné párování bazí DNA-polymerázou DNA-polymeráza - dělá 1 chybu na cca 10 7 replikovaných párů bazí - kontroluje, zda se předcházející pár bazí spároval správně - opravná funkce (chybně spárované úseky DNA štěpí ve směru 3 5 )
náhodné chemické změny DNA - vlivem chem. látek,uv: - depurinace - deaminace cytosinu - spojení 2 pyrimidinů vlivem UV záření (př. vznik thyminového dimeru, který způsobuje zastavení replikace) DNA mismatch repair system: - rozpozná chybně nasyntetizovaný nový řetězec DNA (častější mezery - zlomů v novém řetězci, které jsou brzy spojovány) DNA-nukleáza - odstraní chybně nasyntetizovanou část nového řetězce opravná DNA polymeráza - dosyntetizuje odstraněný úsek DNA-ligázou - zacelí mezery
trvalá změna DNA MUTACE v gametách - promítne se do všech buněk nového organismu v somatických buňkách - častá příčina nekontrolovaného množení buněk (až rakovina) podmínka evoluce díky opravným mechanismům se změny v DNA hromadí během evoluce jen velmi pomalu (př.: člověk a šimpanz se oddělili od společného předka před 5 mil. let, mají ale z 98 % shodné sekvence DNA.