MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ Fakulta přírodovědecká, Kotlářská 2a, Brno Výzkumné centrum pro chemii životního prostředí a ekotoxikologii Bakalářská práce Studium biodostupnosti perzistentních organických látek v akvatickém prostředí (voda, sediment) v návaznosti na pasivní vzorkování s využitím silikonové vrstvy jako média Vedoucí: RNDr. Jana Klánová, Ph.D. Zpracovala: Eva Valentová Brno 2006
Obsah 1. Úvod... 4 2. Seznam zkratek... 5 3. Zdroje a hladiny kontaminace akvatického prostředí perzistentními organickými polutanty... 7 4. Distribuce perzistentních organických polutantů mezi abiotické složky akvatického prostředí... 9 4.1 Povrchová voda... 10 4.2 Sedimenty... 11 4.3 Pórová voda... 12 4.4 Suspendovaná částicová složka... 13 5. Metody studia bioakumulace perzistentních organických polutantů na modelových organizmech... 14 6. Metody simulace bioakumulace perzistentních organických polutantů bez použití živých organizmů... 18 6.1 Srovnání konvenčních bodových odběrů a pasivního vzorkování... 18 6.2 Pasivní vzorkování... 20 6.2.1 Pasivní vzorkovače plněné rozpouštědlem... 22 6.2.2 Pasivní koncentračně extrakční vzorkovače in situ (PISCES)... 25 6.2.3 Zakotvená kapalinová membrána (SLM)... 26 6.2.4 Pasivní vzorkovače plněné sorbentem... 28 6.2.5 Popis systému semepermeabilních membrán (SPMD)... 29 7. Využití metod pasivního vzorkování pro studium kontaminace sedimentů a biodostupných frakcí... 33 7.1 Složení sedimentu a umístění hydrofobních organických látek... 33 2
7.2 Silikonová guma... 34 7.2.1 Volně rozpuštěná koncentrace... 35 7.2.2 Rovnovážná rozdělovací teorie... 36 7.2.3 Stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků pomocí silikonové gumy... 36 7.2.4 Experiment se silikonovou gumou... 37 7.2.5 Vliv vzorkovacích metod na výsledky analýzy... 46 7.2.6 Vlastnosti materiálů používaných v pasivním vzorkování... 50 8. Závěr... 58 9. Použitá literatura... 59 3
1. Úvod Cílem bakalářské práce bylo popsat studium biodostupnosti perzistentních organických látek v akvatickém prostředí (voda, sediment) v návaznosti na pasivní vzorkování s využitím silikonové vrstvy jako média. Získané poznatky a uvedená data pochází ze studia prací a výzkumu našich i zahraničních vědeckých týmů podle seznamu níže uvedené literatury. 4
2. Seznam zkratek BaP = benzo(a)pyren CB = chlorované bifenyly (chlorinated bifenyls) DBahH = dibenz(ah)anthracen DDT = 1,1,1-trichloro-2,2-bis(p-chlorofenyl)ethan DOC = rozpuštěný organický uhlík (dissolved organic carbon) DOM = rozpuštěná organická hmota (dissolved organic matter) EXACT = kopolymer ethylen + okten Flu = fluoranthen HOC = hydrofobní organické kontaminanty (hydrofobic organic compounds) K mw = rozdělovací koeficient materiál/voda (material-water partitioning coefficient) K oc = rozdělovací koeficient organický uhlík/voda (organic carbon-water partitioning coefficient) K ow = rozdělovací koeficient oktanol/voda (oktanol-water partitioning coefficient) K p = rozdělovací koeficient částice/voda (particulate-water partitioning coefficient) K sed = rozdělovací koeficient sediment/voda (sediment-water partitioning coefficient) K SS, w = rozdělovací koeficient silikon/voda (silicone sheet-water partitioning coefficient) K tw = rozdělovací koeficient triolein/voda (triolein-water partitioning coefficient) LDPE = polyethylen s nízkou hustotou (low density polyethylene) LL extrakce = extrakce kapalina-kapalina (liquid-liquid extraction) Naph = naftalen PAH = polycyklické aromatické uhlovodíky (polycyclic aromatic hydrocarbons) PCB = polychlorované bifenyly (polychlorinated bifenyls) PCDD/F = polychlorované dibenzo p-dioxiny a dibenzofurany PISCES = pasivní koncentračně extrakční vzorkovač in-situ (passive in situ concentration/extraction sampler) POM = polyoxymethylen POP = perzistentní organické polutanty PRC = standardy pro studium účinnosti (performance reference compounds) SLM = zakotvená kapalinová membrána (supported liquid membrane) 5
SPM = semipermeabilní membrána (semipermeable membrane) SPMD = vzorkovač na bázi semipermeabilní membrány (semipermeable membrane device) SS = silikonová guma (silicone sheet) 6
3. Zdroje a hladiny kontaminace akvatického prostředí perzistentními organickými polutanty Perzistentní organické polutanty (POP) jsou látky antropogenního původu vstupující do vodního prostředí. Skupina POP zahrnuje několik chemických skupin látek, které jsou všudypřítomné, hydrofobní a odolné vůči degradaci, s potenciálními škodlivými účinky. Nejvíce studované jsou polycyklické aromatické uhlovodíky (PAH), polychlorované bifenyly (PCB), polychlorované dibenzo-p-dioxiny a dibenzofurany (PCDD/F). Organické kontaminanty jsou přítomny ve směsích, vznikají podobnými cestami a mají podobné fyzikální a chemické vlastnosti. Vzhledem k vysoce komplexním směsím, které POP vytvářejí, bývá analýza reálných vzorků i odhad potenciálního rizika obtížný. Je nutné provádět integrované studie jejich environmentálního chování a distribuce spolu s vyhodnocením jejich toxikologického dopadu [1]. PAH vstupují do prostředí ve velkých množstvích převážně díky lidské činnosti. Mezi hlavní zdroje PAH v mořských vodách patří fosilní paliva, vypouštění domácích a průmyslových odpadů, spad a atmosférické vymývání, splach z půd. Vypouštění olejů je hlavním zdrojem PAH ve vodě [2]. Hydrofobní organické kontaminanty (HOC) vstupují do řek mnoha cestami včetně městských a průmyslových kanalizací, městských a zemědělských odtoků, mokré a suché atmosférické depozice. Významnější vstupy těchto látek do řek se objevují během jarních záplav. Mnoho hydrofobních polutantů, které se vyskytují ve vodě nebo v atmosféře má vysokou afinitu k částicím. Tyto typy látek obvykle mají vysoký rozdělovací koeficient oktanol/voda (log K ow >4) a jsou selektivně rozdělovány ve vodním sloupci do dnových a suspendovaných sedimentů a do tukových tkání vodních organizmů. Významná část persistentních organických polutantů se začlení do sedimentů. Vodní toky slouží jako transportní médium pro hydrofobní organické polutanty [2]. 7
Kontaminanty mohou být transportovány vodou třemi možnými způsoby: 1) rozpuštěné ve vodné fázi 2) se suspenzí nebo sorbovány na částicích 3) s dnovými sedimenty, které se pohybují podél říčního dna Částečky, které vážou POP, se obvykle usazují v nejbližším okolí zdroje, toto usazování závisí hlavně na velikosti částic, stejně jako na říčních charakteristickách (vodní tok, hloubka, tvar řečiště). Koncentrace se tak snižuje se vzdáleností od zdroje. V jezerech a rybnících převládá usazování, takže biodostupnost HOC je relativně nižší, ačkoli koncentrace v sedimentech může být vyšší. V říční vodě je usazování kompenzováno vyšším poměrem resuspendace sedimentu. Touto cestou jsou HOC přítomny ve vodě ve vyšší koncentraci a jejich biodostupnost je tak zvýšená [1]. HOC se vyznačují malými rychlostmi chemické a biologické degradace ve vodním prostředí. Jsou lipofilní, mají vysokou schopnost bioakumulace v organizmech, zvláště ve vyšších úrovních trofického řetězce [3]. 8
4. Distribuce perzistentních organických polutantů mezi abiotické složky akvatického prostředí Důkladně jsou prostudovány role rozdělování, stupeň distribuce a osudy kontaminantů ve vodním prostředí. Rozdělování organických kontaminantů mezi vodnou a partikulární fázi vodního sloupce je významný proces ovlivňující transport a biodostupnost. Osud hydrofobních organických kontaminantů v přírodních vodách je vysoce závislý na jejich sorpčních vlastnostech. Osud a distribuce HOC v říčním prostředí závisí na [3]: A) fyzikálně chemických a biologických vlastnostech sloučenin rozpustnost nestabilita lipofilita chemická stálost (trvalost) rezistence k biodegradaci B) parametry prostředí teplota ph obsah kyslíku obsah organického uhlíku charakter rozpuštěné organické složky velikost sedimentovaných částic vodní tok přítomné organizmy 9
Distribuce HOC mezi různými částmi vodního prostředí je ovlivněná několika procesy včetně sorpce/desorpce, advekce (přenos tepla prouděním), těkání, rozpouštění, biotické a abiotické transformace [1]. 4.1 Povrchová voda Hydrofobní nepolární organické sloučeniny mají velmi nízkou rozpustnost ve vodě. Rozpustnost přímo ovlivňuje distribuci (rozdělování) nenabitých organických sloučenin mezi vodu, sediment a biotu a míru mikrobiologické degradace. Rozpustnost HOC může být zvětšena vyšší teplotou nebo obsahem ostatních rozpuštěných sloučenin. Organické kontaminanty mohou být transportovány jako volně rozpuštěné nebo vázáné na malé neusazené částice a organickou hmotu. Je obecně uznáváno, že volně rozpuštěné hydrofobní polutanty jsou více biodostupné než ty, které jsou vázané na částice. Za účelem modelování rozdělování kontaminantů byl spojen parametr hydrofobicity K ow (rozdělovací koeficient oktanol/voda) různých kontaminujících látek s jejich rozdělovacími koeficienty mezi vodu a tuhé částice (K p ) [3]. Rozdělovací koeficient částice/voda je definován jako: K p = c s / c w, (1) kde c s je koncentrace látky na částicích a c w je koncentrace látky ve vodním sloupci. Rozpuštěný organický uhlík (DOC) může hrát roli v koloběhu organických polutantů ve sladkovodních systémech. Ukázalo se, že přítomnost DOC může zvětšit zdánlivou rozpustnost DDT, PCB a PAH a může snížit jejich sorpci a biokoncentraci vodními bezobratlými a rybami. Výsledky ale silně závisí na struktuře a složení molekul DOC [1]. 4.2 10
Sedimenty Sorpční vlastnosti ovlivňují rychlosti a mechanismus transportu organických sloučenin do a ze sedimentu. Distribuce hydrofobních organických sloučenin v sedimentu a pórové vodě je ovlivňovaná mnoha dalšími procesy, které zahrnují [3]: biologické a chemické transformační reakce difúzi advekci (přenos tepla prouděním) míchání a resuspendaci dnového sedimentu Relativní vliv každého z těchto procesů závisí na molekulární struktuře, biologické aktivitě a fyzikálně chemických vlastnostech jednotlivých sloučenin, stejně tak jako na vlastnostech sedimentu [2]. V laboratorních experimentech bylo dokázáno, že sorpce neutrálních, relativně nepolárních směsí je ve vzájemném vztahu k obsahu organického uhlíku v sorbentu. Ve vzorcích jsou přítomny dva typy organické hmoty. Zlomkovitý rostlinný materiál, který je pravděpodobně odpovědný za vysoké hodnoty organické hmoty v největších sedimentových částicích, zatímco stárnoucí a zhuštěná organická hmota je spojena s menší velikostí částic. Tyto typy organického materiálu mají různé afinity k organickým kontaminantům vzhledem ke stárnutí organické hmoty. Rozdělovací koeficient sediment/ voda, upravený pro obsah organického uhlíku K oc, se vypočítá z rovnice: K oc = c s / (c w f oc ) = K p / f oc, (2) kde c s je koncentrace látky (ng/kg) v sedimentech, c w je koncentrace látky (ng/l) v odstředěné vodě, a f oc je frakce organického uhlíku. Rozdělovací koeficient sediment/voda upravený pro obsah organického uhlíku je dobrý ukazatel rozdělování pro danou hydrofobní organickou látku. Log K oc je přímo úměrný log K ow látek rozpuštěných v roztoku. Rozdělování na částice je nepřímo úměrné logaritmu rozpustnosti HOC a logaritmu koncentrace částic a přímo úměrné obsahu organického uhlíku na částicích. Je 11
nutné důkladně prozkoumat významné rozpory mezi koncentracemi HOC navázaných na částice, které jsou předpovídány z rovnovážného částicového modelu, a skutečnými koncentracemi uvedenými v řadě studií. Použití modelových hodnot vede k podhodnocení nebo nadhodnocení rizika skutečného znečištění [3]. 4.3 Pórová voda Pórová voda je stále v přímém kontaktu se sedimenty, a proto sloučeniny přítomné v sedimentech se mohou zkoncentrovat do pórové vody mnohem více než do povrchové vody. Brannon a kol. popsali, že složení PCB v pórových vodách je podobné složením PCB v sedimentech. V pórové vodě jsou sloučeniny více biodostupné. Přítomnost organických koloidů v pórové vodě může zvyšovat koncentrace těchto sloučenin v pórové vodě. V rámci sedimentového prostředí, rozpuštěná organická hmota (DOM) pórové vody v sedimentu může ovlivňovat distribuci a biodostupnost hydrofobních organických kontaminantů. Interakce s DOM mohou ovlivnit vlastnosti HOC, jako je zvýšení rozpustnosti, pomalé těkání, změna reaktivity a biodostupnosti [3]. Distribuce HOC mezi sedimenty a pórovou vodou probíhá do dosažení rovnováhy, která může být narušena různými procesy přirozenými (bouřky, záplavy, eroze) nebo umělými (lodní doprava, bagrování, říční stavby). Rovnováha se rychleji ustavuje pro PCB oproti PAH z těchto důvodů [1]: rychlá biodegradace PAH v pórové vodě výměna mezi sloupcem pórové a povrchové vody jen zlomek celkové koncentrace PAH v sedimentech vstupuje do rovnováhy s okolní pórovou vodou Prostředí dnového sedimentu je bezkyslíkaté a chemie pórové vody se liší od chemie povrchové vody (prudké fyzikální, chemické a biologické gradienty na rozhraní sediment-voda). Fyzikální rozrušení sedimentu, jako je bagrování a velké proudy z prudkého deště, může míchat podložní bezkyslíkatou pórovou vodu ze sedimentu s 12
povrchovou okysličenou vodou. Není známo, jak provzdušňování bezkyslíkatých sedimentačních prostředí ovlivní distribuci a pohyblivost HOC [3]. 4.4 Suspendovaná částicová složka Velká část zatížení HOC vstupuje do řeky sorbována na částicích nebo se tato sorpce odehrává ve vodním sloupci. V řekách mohou být HOC transportovány sorbované na částicích. Tento transport závisí na velikosti částic a na říčním toku. Zdá se, že částice menší než 1 mikrometr vzniklé spalováním, mají rozhodující vliv pro transport hydrofobních organických sloučenin na velké vzdálenosti ve vzdálených vodních oblastech. Částice větší než 1 mikrometr se usazují v sedimentu a hrají důležitou roli v blízkosti emisního zdroje [3]. Ve vodě se HOC usadí v první řadě navázané na velké, rychle se usazující částice. Toto usazování částicové hmoty se často sestává z úhrnu menších částeček, které byly vytvořeny biotickými a abiotickými procesy, jako je srážení ve vločky a aglomerace. Vysoký obsah částicové hmoty má za následek vysokou adsorpční kapacitu pro rozpuštěné HOC díky vysokému K oc. Ukázalo se, že K p a také K oc se snižuje se stoupající koncentrací suspendovaných sedimentů. Rovnováha mezi vodou a rozptýlenými částicemi se ustálí za různě dlouhou dobu (hodiny až dny) [1]. 13
5. Metody studia bioakumulace perzistentních organických polutantů na modelových organizmech Odhad ohrožení organizmů žijících v půdě, sedimentu nebo vodě toxickými látkami vyžaduje informace o koncentraci POP, která je dostupná těmto druhům. V současnosti je odhad rizika POP založen na celkové koncentraci POP v půdě a sedimentu, tj. koncentraci pozorované po úplných extrakcích. Obecně jsou kontaminanty v rozpuštěné fázi považovány za biodostupné a to je velmi důležité pro výklad měření biologických účinků. Pro daný kontaminant je tato výměna řízena poměrem částic sedimentu a pórové vody [4]. PAH jsou polutanty, které byly zařazeny na seznam prioritních polutantů U.S. EPA (obrázek 1) kvůli jejich toxicitě a v některých případech i karcinogenitě. Dopad na vodní organizmy byl ukázán v několika směrech a široce se mění se strukturou sloučeniny, tj. počtem kruhů, stavem (volné nebo vázané na částicovou hmotu), hydrofobicitou a jejich koncentrací. Akutní toxicita PAH pro vodní organizmy roste s rostoucí molekulovou hmotností. PAH jsou vážně toxické pro vodní organizmy ve vodních koncentracích okolo 0.2-10 ppm [4]. 14
Obr.1 PAH zařazené na seznam U.S. EPA Různé studie ukázaly, že organické kontaminanty s vysokým log K ow přítomné ve vodě, se budou biokoncentrovat do tukové tkáně říční bioty. Organizmy přednostně hromadí hydrofobní organochlorované látky v tukové tkáni vzhledem k ostatním orgánům. Volně rozpuštěné sloučeniny jsou snadno dostupné pro absorpci organizmem. HOC přímo spojené se sedimenty mají nízkou biodostupnost, přestože sedimenty mohou také sloužit jako zdroj HOC. Ačkoli je absorpce z usazenin daleko méně účinná než absorpce z vody, vysoká koncentrace v sedimentu může udělat z absorpce z usazeného kalu významnou cestu příjmu HOC. Biodostupnost je tak nejen založena na fyzikálně chemických vlastnostech látky, ale také závisí na chování a stravovací strategii 15
studovaných organizmů. Desorpce v sedimentech vázaných HOC do pórové a sedimentové povrchové vody je druhý potenciální zdroj biologicky dostupných HOC pro příjem rybami. Absorpce ve vodě rozpustných HOC je u ryb rychlá, hlavní cesta vstupu je přes žábry a doba expozice nemusí být dlouhá [3]. Akumulace organických kontaminantů v tkáních vodních organizmů je komplexní funkcí fyzikálně chemických vlastností kontaminující látky, jejich distribuce ve vodním systému, a stravovacích návyků a výměny látek vodního organizmu (obrázek 2). Výsledky z laboratoře a také terénní studie ukazují, že ryby mohou nahromadit zvláště chlórované perzistentní látky z kontaminovaných vodních systémů. Každá ryba absorbuje HOC různou rychlostí, což je dáno výměnou látek, rozdíly v růstu, váze, pohlaví a také genetické proměnlivosti v biotransformačních rychlostech [3]. V aktivním biologickém monitoringu jsou mušle exponovány v mořské vodě a postupně analyzovány pro odhad dostupné koncentrace. Měření v mušlích ukazuje velké sezónní výkyvy a díky degradaci (metabolizmu), koncentrace v nich přesně neodráží expozici kontaminanty. Je velmi časově náročné a drahé sbírat a analyzovat organizmy ze všech sedimentů, pro které je potřebný odhad rizika, proto jsou vyvíjeny modely k předpovězení biodostupnosti [3]. 16
Obr.2 Biokoncentrace, sorpce na částice a vypařování jsou transportními a distribučními procesy 17
6. Metody simulace bioakumulace perzistentních organických polutantů bez použití živých organizmů 6.1 Srovnání konvenčních bodových odběrů a pasivního vzorkování Bodovým odběrem vzorku rozumíme klasický způsob vzorkování, kdy je vzorek, kupříkladu z vodárenské nádrže či toku odebrán v určitém okamžiku a na konkrétním místě či místech. Problematická zůstává interpretace bodových odběrů, kdy jsou pro charakterizaci stavu lokality používána data ze vzorků odebraných v jednom místě a v jednom okamžiku. Je zřejmé, že interpretace takových výsledků může být často zavádějící. Je to způsobeno nepravidelností v přísunu sledovaných látek, které někdy přicházejí do recipientů nárazově či periodicky. Bodové odběry pak nejsou schopny zachytit opravdový stav kvality surové a upravené vody [5]. Komplikované je rovněž stanovení účinků polutantů v nízkých koncentracích biotesty. Akutní testy toxicity zpravidla nezaznamenají odezvu nízkých koncentrací a chronické testy jsou náročnější, tudíž i dražší. Užitím chronických testů toxicity lze sledovat dlouhodobé účinky i nízkých koncentrací. Takový test sice dobře popíše, jak na testovací organizmus působí dlouhodobá expozice testovaným vzorkem, ale opět se jedná pouze o vzorek odebraný v jednom konkrétním okamžiku o bodový odběr [5]. V případě sledování kvantitativní úrovně organické kontaminace je situace jiná a řešení jsou daleko složitější. Je totiž známo, že řada organických kontaminantů je ve vodě velmi málo rozpustná. Velké množství těchto látek, což zvláště platí o persistentních organických polutantech, se kumuluje na pevné fázi (sedimenty, popílek), jsou lipofilní (rozpustnost a kumulace v tucích). Pokud se u těchto vzorků provede bodový odběr, pro následnou analýzu vyvstává zásadní otázka, jak se bude zpracovávat vzorek, který obsahuje nějaký podíl pevné fáze. Oddělením pevné fáze filtrací dochází u organických látek k velkým chybám a výsledky bývají často složitě reprodukovatelné. Monitorování látek, jako jsou PCDD/F nebo toxické kongenery PCB, které se vyskytují ve velmi nízkých koncentracích, je pak analyticky velmi složité až nemožné [5]. 18
Velmi důležitou informací je (v případě POP) také kvalitativní profil sloučenin (PAH) nebo kongenerů (PCDD/F, PCB). Tyto profily mohou vést k identifikaci zdroje kontaminace. V případě bodových vzorků může docházet (také vlivem složité předběžné úpravy) ke změnám těchto kvalitativních profilů [5]. Nevýhody konvenčních bodových odběrů: Analýzy vzorků získaných z bodových odběrů reprezentují pouze zbytkové složení v okamžiku odběru a nemusí zachytit periodickou kontaminaci. Nastávají problémy při kontrole kvality a manipulaci s velkými objemy vody potřebnými k analýze stopových koncentrací. Běžnými analytickými postupy není stanovována koncentrace doopravdy rozpuštěných a biodostupných polutantů. Toxikologická data a chemická kritéria kvality vody jsou založena pouze na koncentraci rozpuštěných látek, ne na celkovém množství polutantů ve vodě. Běžné postupy často zklamou při stanovení stopových množství bioakumulujících se kontaminantů. Objemy vzorků pro biotesty jsou zřídka dostačující [5]. 6.2 19
Pasivní vzorkování Výše zmíněným nedostatkům bodových odběrů se dá předejít používáním pasivního vzorkování. Jedná se o odebírání vzorků z média takovým způsobem, kdy jsou pokusná zařízení či testovací organizmy exponovány v médiu po dlouhou dobu, kontinuálně. Takové přístupy vzorkování byly vypracovány zejména pro biologické metody. Jednalo se například o růstové testy toxicity, expozice testovacích organizmů v tocích, rozbory sedimentů apod. Doba expozice u takovýchto testů může být až několik týdnů [5]. Pro pasivní vzorkování chemických ukazatelů bylo již v minulosti použito tukové tkáně vodních živočichů (k monitorování POP v životním prostředí). Tento přístup se používá k rutinnímu monitoringu dodnes, ale jen v případě vod, kde jsou tito živočichové schopni existence. Má však řadu nevýhod, jelikož jeho použití je spojeno s proměnlivostí řady faktorů: míra akumulace a druh látky je závislý na sledovaném druhu, pohlaví, stáří, druhu potravy, migrace organizmů. Významné omezení spočívá v metabolizaci některých látek, resp. kongenerů (např. PCB). Perspektivní alternativou, založenou na chemickofyzikálních principech s analytickou či toxikologickou koncovkou je použití semipermeabilních membrán SPMD [5]. Pasivní metody mohou být zpravidla klasifikovány bud jako adsorpce nebo absorpce. Adsorpční metody využívají fyzikální nebo chemické retence povrchem. Absorpční metody se netýkají pouze povrchového fenoménu, ale také analytické permeability v intervenovaném materiálu. Toto novější pojetí poskytuje možnost rozdělení sloučenin díky fyzikálně-chemickým vlastnostem membrán [6]. Membrána je nejdůležitějším prvkem permeability pasivních vzorkovačů. Materiál, z něhož jsou membrány vyrobeny, by měl být odolný vůči specifickým podmínkám, například vysokému koeficientu permeability, který se přímo týká druhu materiálu membrány, hustoty membrány a homogenity tak, že nejsou rozdíly mezi vzorkovači použitými během paralelní expozice [6]. 20
Permeabilita není ale určena jen difúzí, ale také rozpustností v membráně. Proto je transport polutantů přes membránu především ovlivněn charakterem materiálu membrány [6]. Proces pronikání se může rozdělit do tří fází: 1. adsorpce analytu na vnějším povrchu membrány 2. rozpouštění a difúze analytu přes membránu, kde je rozpouštění řízeno rozdělovacím koeficientem analytu mezi membránou a substrátem 3. desorpce analytu z vnitřního povrchu membrány Difúze analytu, rozpuštěného v membráně, je nejpomalejším krokem a určuje tedy rychlost vzorkování analytu z vodního prostředí [6]. Řada parametrů může ovlivnit pasivní vzorkování analytu ( např.: teplota vody, změna koncentrace analytu), proto je vhodné stanovit na počátku studie parametry odpovědné za absorpci [6]. Schéma vzorkovačů Membránové pasivní vzorkovače jsou založeny na procesu pasivního rozdělování sloučenin mezi vodou a lipofilním materiálem uzavřeným v semipermeabilní polymerní membráně. Bylo navrženo několik schémat membránových vzorkovačů. Zahrnují [6]: zařízení plněné rozpouštědlem pasivní koncentračně extrakční vzorkovač in-situ (PISCES) technika zakotvené kapalinové membrány (SLM) zařízení plněné sorbentem semipermeabilní membrány (SPMD) 21
6.2.1 Pasivní vzorkovače plněné rozpouštědlem Södergren (1990) první použil hydrofilní dialýzní vak vyrobený z regenerované celulózy, naplněný hexanem pro enviromentální monitoring nepolárních vodních reziduí. Při dialýze rozpuštěná látka difunduje od donorní části (vodní prostředí) do akceptorní části membrány (v pasivním vzorkovači) vlivem koncentračního spádu. Dialýza přes pórovitý materiál je separačním procesem, pro který existuje matematický vztah mezi difúzním tokem a jeho řídící silou, koncentračním spádem, uvedeným v roce 1955 Fickem. Nejčastěji se používají symetrické hydrofilní polymery jako membrány pro dialýzu, zvláště regenerovaná celulóza a acetát celulózy, které jsou snadno vyrobitelné a odolné vůči řadě organickým modifikátorům a mohou se použít při ph 2-8. Bohužel tyto materiály nejsou chemicky ani termicky stálé a jsou předmětem biologického rozkladu. Navíc se prokázaly reakce s několika druhy organických rozpouštědel. Södergren dokázal, že rovnováha v dialyzačním vaku byla dosažena již za 48 hodin, kdy došlo k odstranění nežádoucích látek. Neporézní vak naplněný několika typy rozpouštědel se používá pro koncentrování rozpuštěných organických kontaminantů ve vodním prostředí. Rozpouštědlem naplněná dialýzní membrána váže perzistentní lipofilní polutanty podobně jako vodní organizmy [6]. Použití neporézních filmů z polyethylenu a polypropylenu je výhodné proti tradičním membránovým dialýzám, protože jsou hydrofilní a odolnější vůči rozpouštění a biodegradaci. Neporézní polymery s nízkou hustotou (polyethylen) mají ve své struktuře dočasné dutiny a proto pouze rozpuštěné organické látky s nízkou molekulovou hmotností mohou difundovat do rozpouštědla. [6]. Peterson a kol. použil pasivní vzorkovače obsahující polyethylenovou trubičku naplněnou isooktanem, kterou umístil na tři týdny do ústí řeky v drátěném koši. Během expozice se oddělily hydrofobní sloučeniny (chlorované pesticidy) z vody do trubiček s rozpouštědly. Vzorkovače jsou součástí systému popsaného na obrázku 3. Systém obsahuje obdélníkovou skleněnou nádržku se čtyřmi úseky schopnými pojmout asi 2 litry [6]. 22
Obr.3 Pasivní vzorkovač podle Petersona a kol. Pro nízké meze detekce analytické metody je nutné odebrat větší objem vzorků. S rostoucím objemem vzorku se musí odstraňovat větší množství lipidů, které může ovlivnit množství extraktů při čištění. Polopropustná membrána (SPM) je vlastně polyethylenová trubička, která je na konci zatavena, popis je uveden na obrázku 4. Před použitím se trubička ponoří na 24 hodin do kádinky s cyklopentanem a pak se promyje. Tato zatavená trubička se umístí do skleněné nálevky s teflonovým ventilem, který je ve spodní části. Extrakt se převede do trubičky pomocí Pasteurovy pipety. V závislosti na požadovaném objemu vzorku má skleněná nálevka výšku 200 až 500 mm a vnitřní průměr je 40 mm. Baňka je umístěna pod nálevkou a cyklopentan se přidává do stejné hladiny rozpouštědla, jako je ve vnitřní trubičce, která má průměrný objem asi 150 ml. Rozpouštědlo se mění otevíracím ventilem 2 až 3 dny po 16 hodinách. Po 4 dnech se frakce odpaří na 3 ml. Dialýza zredukuje obsah lipidu na 1-5% v závislosti na čase dialýzy, druhu lipidu a rozpouštědla [6]. Tyto techniky se také mohou použít pro čištění jiných typů vzorků obsahujících sloučeniny s vysokou relativní molekulovou hmotností, např. z extraktů dužiny, dehtových produktů, tkání a sedimentů [6]. 23
Obr.4 Vzorkovací zařízení: A) podle Leba a kol., B) podle Ellise a kol. Jiným typem pasivního vzorkovače, který je plněný organickými rozpouštědly a opatřen membránou, je systém vyvinutý Kotem a Wasikem (obrázek 5). Kontaminanty migrují přes membrány a jsou absorbovány v organickém rozpouštědle (většinou isooktan, cyklohexan). Pasivní vzorkovač je po určitý čas exponovaný (30 až 60 dnů) a pak se rozpuštěný obsah analyzuje bez předchozí úpravy. Pro terénní studie by měl být pasivní vzorkovač opatřen ochranným víkem a polystyrénovým plovákem, který je upevněn pomocí drátku. Celé zařízení pak plave pod hladinou vody. Tyto vzorkovače 24
jsou levné a relativně jednoduché na výrobu. Mohou se tudíž použít v libovolných přírodních vodních rezervoárech [6]. Obr.5 Pasivní vzorkovač plněný organickým rozpouštědlem podle Kota a kol. 6.2.2 Pasivní koncentračně extrakční vzorkovače in situ (PISCES) V roce 1993 byla prezentována vzorkovací metoda PISCES (pasivní koncentračně extrakční vzorkovač in-situ) navržená Listenem a kol. PISCES (obrázek 6) je po naplnění 200 ml hexanu hermeticky uzavřen a pak několik dní exponován. Vzorkovače jsou upevněny ve vodním sloupci s membránami otočenými směrem dolů. Ke vzorkování dojde molekulární difúzí organických sloučenin z vody přes membránu do sběrného rozpouštědla. Rozpouštědlo pomalu difunduje ze vzorkovače přes membránu, čímž účinně zabraňuje biologickému růstu (sinic, řas, atd.) a znečišťování povrchů membrán. Tento proces neovlivňuje adsorpci analytu z vody, protože difúzní proces je řízen aktivitním koeficientem mezi rozpouštěným analytem ve vodě a v rozpouštědle [6]. Rychlost vzorkování je ovlivněna jen, když se rozdělování rozpouštědlo-voda blíží rovnováze. Uváděné rychlosti vzorkování se pohybují v rozmezí od 0.4 litru denně při 10 C do 0.92 litru denně při 20 C a objem odebrané vody se pohybuje mezi 5 až 16 litry, což záleží na místě vzorkování [6]. 25
PISCES vzorkovače se ukázaly být vhodnou terénní metodou, která může být úspěšně využita pro vzorkování nízkých koncentrací organických chemikálií ve vodě (např. PCB). Další výhodou je transport vzorku přímo do rozpouštědla, což eliminuje problémy související s přepravou velkých objemů vody [6]. Obr.6 Schématické znázornění vzorkovače PISCES podle Littena a kol. 6.2.3 Zakotvená kapalinová membrána (SLM) Zakotvená kapalinová membrána (SLM) může velmi selektivně transportovat ionty ze zásobního roztoku (donor) do povrchového roztoku (akceptor) pomocí transportního mechanizmu, kterým je difúze přes membránu [6]. SLM techniky vyžadují použití porézních teflonových membrán oddělujících dva vodné roztoky. Membrána je naimpregnována organickým rozpouštědlem a umístěna mezi dva teflonové bloky. V těchto blocích jsou spirálovité žlábky tvarované do průtokových kanálků na každé straně membrány. Tyto kanálky umožňují roztokům nezávislé čerpání vodného roztoku přes každý z kanálků. Sloučeniny mohou být také selektivně extrahovány z jednoho roztoku (donoru) do organické kapalinové membrány a 26
pak postupně do ostatních roztoků (akceptorů). Takovouto alternativní metodu vyvinul Audunsson v polovině 80. let [6]. Kapalinová membránová technika je v několika směrech podobná dialýze. Ale na rozdíl od dialýzy, kde jsou analyty prvně zředěny v čistém rozpouštědle, které je později odpařeno, techniky kapalinových membrán přinášejí zkoncentrování analytů. Selektivita těchto technik, na rozdíl od dialýzy, je jiná v principu separace malých molekul analytu od makromolekul. Několik litrů vzorku může být zakoncentrováno do malého objemu roztoku akceptoru (méně než 1 ml). Objem použitých organických rozpouštědel je minimální, což je velkou výhodou SLM technik. SLM navíc může být automatizován a kombinován např. s čistícími a frakcionačními kroky (např. kolonová adsorpce). Teoretickým popisem principů SLM extrakce, funkčními charakteristikami a srovnáním s existujícími vzorkovacími technikami se podrobně zabýval Jönsson a kol. [6]. Kapalinová membránová extrakce se používá na různé typy vodních prostředí. V současnosti se používají SLM hlavně jako selektivní a účinné metody předběžného zpracování určitých druhů analytů před konečnou chromatografickou analýzou nebo jinou metodou: čištění a obohacování analytů ze složitých matricí, jako například krevní plazma, moč a hnůj; například při využití kapalinových membrán obsahujících undekan byly stanoveny alifatické a aromatické aminy v moči ve velmi malých koncentracích (ppb) nebo alifatické aminy v krevní plazmě obohacováním stopových množství polutantů ze vzorků prostředí byly stanoveny alifatické aminy ve venkovském i městském vzduchu ve Švédsku bylo provedeno terénní vzorkování stopových množství herbicidů ve vodách (průtok vody: 0.8 ml/min během 24 hodin, nebo 7.0 ml/min za 70 minut) a herbicidy byly detekovány v koncentracích ppt [6] 27
6.2.4 Pasivní vzorkovače plněné sorbentem Stopy organických kontaminantů ve vodě mohou být úspěšně stanoveny pomocí vzorkování využívající pasivní vzorkovače plněné vhodným sorbentem. Di Giano a kol. navrhl vzorkovač vyrobený ze dvou plastových disků o průměru 5 cm, které jsou sešroubované a uzavřené těsnícím kroužkem. Na obrázku 7 je horní disk, který se skládá ze 72 dírek (průměr 1 mm, délka 1 cm). Dolní disk tvoří pojistná část, která obsahuje aktivovaná zrnka uhlíku. Filtr je umístěn mezi disky tak, aby zadržel uhlík padající ven z difúzních dírek. Hlavním transportním mechanismem analytů je difúze. Vzorkovače jsou většinou exponovány 5 až 50 dní. Vzorkovač je exponován, sorbent (uhlík) je extrahován sirouhlíkem pro extrakci xylenů a chlormethanem pro extrakci atrazinu 30 až 60 minut, pak sušen síranem sodným a analyzován. Limit detekce po desetidenní expozici je 1 ppb. Navržený vzorkovač může být použit pro vzorkování vod i ovzduší [6]. V roce 1997 Grathwohl a Sciedek popsali časově integrované vzorkovače pro organické polutanty, které vzorkovaly sloučeniny akumulací kontaminantů v sorbentu pokrytém pevnou fází C 18, XAD-amberlit. Ve skutečnosti byly představeny dva typy difúzních systémů: 1. akumulace pomocí stálé difúze přes membránu do absorpčního činidla (1. Fickův zákon) 2. akumulace pomocí nestálé difúze ve vodou nasycené a zhuštěné vrstvě absorpčního činidla (2. Fickův zákon) V prvním případě se analyt hromadí lineárně s časem, ve druhém případě se množství kontaminantů zvyšovalo s druhou odmocninou času. V obou případech se předpokládalo, že nebyla dosažena rovnováha mezi vodou a vrstvou absorpčního činidla. Testovaná absorpční činidla prokázala vysokou polaritu, vynikající obnovovací rychlosti, dobré smáčecí vlastnosti a rozdílné sorpční kapacity. Tyto pasivní vzorkovače byly testovány pro stanovení PAH ve vodě [6]. 28
Obr.7 Pasivní vzorkovač plněný sorbetem podle Di Giana a kol. 6.2.5 Popis systému semipermeabilních membrán (SPMD) Systém semipermeabilních membrán (SPMD) se skládá z polopropustné membrány (tloušťky 75-95 µm), rozměrů 94 x 2.5 cm (exponovaná plocha je cca 420 cm 2 ), s póry specifického rozměru do 1 10-9 m, což je rozměr odpovídající biologickým membránám rybích buněk. Uvnitř membrány je uzavřen syntetický lipid triolein vysoké čistoty 95%. Jedná se o neutrální triglycerid 1,2,3-tri(cis-9-oktadecenoyl)glycerol. Volba trioleinu je dána blízkou korelací mezi rozdělovacím koeficientem oktanol/voda (K ow ) a triolein/voda (K tw ) [7]. SPMD membrány jsou základem pro vzorkování vod i ovzduší. Přepočet na koncentrační jednotky (např. ng/l, pg/l, ) z jednotek na vzorek - membránu (např. ng/vzorek, pg/vzorek) je možné jen na základě kalibračních dat, která se vztahují ke standardně připraveným membránám. Pořízení kalibračních dat je experimentálně velmi náročné. Použití jiných membrán, než standardně připravených je možno doporučit jen pro určení relativní kvantitativní, případně kvalitativní odezvy [6]. 29
6.2.5.1 Postup vzorkování Membrány (naplněné trioleinem) jsou předčištěny dialýzou v hexanu. Poté jsou napnuty do vhodného vzorkovacího držáku (patra). Patro je vloženo do ochranné ocelové klece. Tento systém je umístěn do vzorkovaného prostředí. Expozice probíhá zpravidla (pro PAH, PCB, PCDD/F) 28-30 dnů. Při expozici dochází k akumulaci všech lipofilních kontaminantů do trioleinu (sequestrantu), nezanedbatelná část zůstává rozpuštěná v membráně. Po dané době jsou membrány z prostředí vyjmuty, extrahovány a výsledné dialyzáty jsou použity k chemické analýze či zkouškám toxicity [7]. Pro vzorkování se používá vzorkovací koš rozdělený do pater. Membrány jsou do pater umístěny pomocí háčků a pružin (obrázek 8). Mechanickému poškození membrány zabraňuje ochranný plechový obal s otvory, kterými kapalina volně proudí. Ochranné koše jsou vybaveny digitálními teplotními senzory s pamětí [8]. Vzorky SPMD po expozici jsou zpracovány standardními metodami. Přepočet koncentrací stanovených v membráně na koncentraci ve vodě je prováděn podle dostupných kalibračních dat [8]. Obr. 8 Uspořádání SPMD aparatury pro vzorkování vod 30
6.2.5.2 Matematický model Matematický model popsal Huckins, J.N. (1990). Expozice trioleinu v membránách je řízena difůzí, jejíž základní odvození vychází z Fickova zákona. Jelikož matematický model je poměrně složitý, uvádím zde jen konečnou formu, která se vztahuje na přepočet výsledků po expozici. Koncentrace analytu ve vodě (c w ) je dána vztahem koncentrace analytu v SPMD (c SPMD ), efektivní rychlostí vzorkování (R S ) a času vzorkování (t): c c = SPMD W RSt (3) Uvedený vztah platí pro případy lineární oblasti křivky expozice [5]. Vzorkování pomocí SPMD je zejména závislé na těchto parametrech: rychlost vzorkování (R s ) - je teplotně závislá, hodnoty jsou stanoveny experimentálně a jsou k dispozici v různých publikacích. Obecně platí, že čím je větší teplota, tím je větší rychlost vzorkování doba vzorkování (obvykle 28-30 dnů) povrch (plocha) membrány vzorkované prostředí ( vznik biologického filmu na membráně), rozdělovací koeficient oktanol/voda (K ow ) [5] 6.2.5.3 Souhrn vlastností SPMD Funkční vlastnosti: odráží přítomnost biotických kontaminantů možnost dosažení velké přesnosti vzorkování při velmi nízké úrovně kontaminace systém eliminuje epizodické výkyvy kontaminace - integrální vzorkování má velmi dobré výsledky pro bioakumulaci látek, které obvykle podléhají metabolizaci silný potenciál pro monitorování rozpuštěných organických látek velmi významnou vlastností uvedené techniky je možnost aplikace pro testy toxicity a mutagenity Microtox, Mutatox, EROD případně další, právě díky 31
vlastnosti akumulace toxických látek, vyskytujících se ve velmi nízkých koncentračních úrovních [5] Praktické vlastnosti: cenová dostupnost velmi jednoduchá manipulace odráží biotickou expozici zpracování exponovaných SPMD je méně náročné než zpracování sedimentů popř. biotických vzorků v porovnání s biotickými organizmy nalezená kontaminace odráží vztah ke sledovanému místu (není nutno zvažovat migraci) [5] 32
7. Využití metod pasivního vzorkování pro studium kontaminace sedimentů a biodostupných frakcí Půdy, řeky, jezera a sedimenty byly celosvětově znečištěny hydrofobními organickými kontaminanty. Je to hlavně díky emisím v šedesátých a sedmdesátých letech, dnes je produkce těchto sloučenin značně omezena. Hydrofobní organické kontaminanty jsou polutanty, které jsou málo rozpustné ve vodě. Díky tomuto chování a jejich odolnosti se HOC silně kumulují v sedimentech. Staré sedimenty vykazují emise HOC z minulosti. Nejvíce znečištěné jsou sedimenty v přístavech a v těžce znečištěných řekách. V minulosti se hledělo na sedimenty jako na skladiště odpadu, ve kterém byly polutanty bezpečně uzamčeny. Dnes se znečištění polutantů pokládá za potenciální riziko v ekosystémech a je důležité odhadnout osud těchto chemikálií sorbovaných v sedimentech. Společnost využívá široký okruh chemikálií, které jsou zčásti emitovány do životního prostředí, což představuje vzhledem k jejich toxicitě potenciální riziko pro populaci a životní prostředí. Organizmy žijící v sedimentech nebo na nich závislé mohou akumulovat HOC. V součtu HOC mohou procházet do potravního řetězce. Odhad takových rizik vyžaduje znalost transportu v životním prostředí a vlastnosti distribuce emitovaných chemikálií. Vodní fáze je důležitou součástí v modelování osudu organických kontaminantů ve vodním prostředí [4]. 7.1 Složení sedimentu a umístění hydrofobních organických látek Pro dobré porozumění sorpce je nezbytné znát složení sedimentů, zvláště částic sedimentu. Není možné zavést jednu strukturu sedimentu, protože sedimenty jsou velmi různorodé, jsou složeny z částic. Částice sedimentů se mohou chovat jako agregáty mnoha malých částic, které jsou jednotné v pórovité struktuře. Stojatá vodní vrstva odděluje množství vodní fáze z povrchu částic [4]. Organická fáze je adsorbována nebo vázána na tyto částice a je naměřena v těchto sedimentech jako obsah organického uhlíku. Sediment z organické fáze je hydrofobní sediment a proto je obsah organického uhlíku pravděpodobně nejdůležitějším faktorem ukazujícím sorpci hydrofobních organických látek. Sorbované HOC jsou pak podobné 33
polymerní struktuře organických látek, jakou má např.humusový materiál. Pro HOC sorbované v sedimentech obsahujících organickou fázi často platí, že sorpce HOC koreluje s obsahem organické fáze v sedimentu [4]. 7.2 Silikonová guma Obecná chemie vychází z vazby Si-O jako páteře polymeru, která je odpovědná za její mimořádnou odolnost k oxidaci a degradaci ozonem. Tento základní rozdíl mezi silikonovými polymery (jako známé polysiloxany) a organickými polymery je následně ilustrován na obrázku 9: Obr.9 Struktura organického a silikonového polymeru Tato Si-O vazba je identická s chemickou vazbou nalezenou ve vysoce stabilních materiálech jako je křemen, sklo a písek a je odpovědná za vynikající stabilitu silikonů při vysokých teplotách a jejich obecnou odolnost k rozkladným faktorům jako je ozon, koroze, zvětrávání a radiace. Mnoho organických polymerů obsahuje nenasycené dvojné vazby v jejich primární struktuře, které jsou částečně náchylné k oxidaci a ozonizaci. Absence nenasycených vazeb ve struktuře silikonu vede k extrémní odolnosti vůči těmto reakcím [9]. Molekuly silikonu mohou být modifikovány navázáním vedlejších skupin (methyl, vinyl, fenyl a trifluorpropyl) pro zlepšení vlastností požadovaných v různých aplikacích. Obsah vinylových skupin (obecně méně než 1%) významně zvyšuje schopnost zesíťování s organickými peroxidy [9]. 34
Silikonová guma byla zavedena pro vzorkování koncentrace rozpustné frakce HOC v systému sediment-voda (podobně jako SPMD). Byly testovány vhodné podmínky úpravy silikonové gumy a podmínky expozice. Metodika byla rozvinuta za použití znalostí rozdělovacích koeficientů hydrofobních organických látek. Systém sedimentvoda byl obohacen PAH a po dosažení rovnováhy PAH v systému byla přidána silikonová guma. Koncentrace PAH v silikonu byla měřena pomocí HPLC. Pro urychlení dosažení rovnováhy v systému sediment-voda je důležitým faktorem množství sedimentu. Přenos koncentrací PAH silikonovou vrstvou do vodné fáze popisuje rozdělovací koeficient sediment/voda. Metoda umožnila odhad koncentrací rozpuštěných PAH ve vodné fázi a vyměnitelných koncentrací PAH v sedimentech [4]. 7.2.1 Volně rozpuštěná koncentrace Jen velmi malá část HOC v sedimentech je přítomná v rozpuštěné formě. Toxicita sedimentu může být spojena se skutečně rozpuštěným obsahem kontaminantů získaných z rozdělení mezi sedimentem a vodou. Tato skutečně rozpuštěná koncentrace je považována za část, která je dostupná biotě, a ovlivňuje difúzní přenosy masy jako vypařování, sorpce a absorpce do makro- a mikroorganizmů. Stanovení rozpuštěných koncentrací HOC je proto rozhodující pro porozumění a správnou modelaci distribuce, přenosu, toxicity a biodegradace těchto látek v sedimentu. Měření volně rozpuštěných koncentrací představuje analytický problém díky extrémně nízkým koncentracím. Výpočet je často ovlivněn frakcí kontaminantů asociovaných s koloidy zahrnující rozpuštěnou organickou hmotu. Mnoho různých metod se používá k určení frakce ve vodě rozpuštěných kontaminantů [4]. 35
7.2.2 Rovnovážná rozdělovací teorie Podstatou v rovnovážné rozdělovací teorii je přepočet testů toxicity vody na příbuzné koncentrace v sedimentu za použití rozdělovacího koeficientu. V současnosti je zde mnoho názorů, zda tento přístup je vhodnou předpovědí skutečnosti. V rovnováze je vztah mezi adsorbovanými a rozpuštěnými koncentracemi vysvětlen pomocí rozdělovacího koeficientu sediment/voda (K sed ): K sed =C sed /C w, (4) kde C sed je koncentrace HOC (µg/kg) a C w je koncentrace ve vodě (µg/l) [3]. Sorpce HOC je většinou spojena s obsahem organického uhlíku v sedimentu, může být normalizován rozdělovací koeficient na sorbovanou frakci organického uhlíku f OC : K oc =K sed /f oc =C sed /(C w f oc ), (5) kde K oc je rozdělovací koeficient organického uhlíku, f oc je sorbovaná frakce organického uhlíku, C sed je koncentrace HOC (µg/kg) a C w je koncentrace ve vodě (µg/l) [4]. 7.2.3 Stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků pomocí silikonové gumy Polycyklické aromatické uhlovodíky jsou třídou hydrofobních organických polutantů. Jsou složeny z uhlíku a vodíku, uspořádaných do 2 a více spojených kruhů. Rozpustnost klesá s rostoucím počtem kruhů. Většina PAH je v mořské vodě adsorbovaná na suspendované částice. Ty se usadí a kumulují na dně sedimentu. PAH jsou mnohem méně degradovatelné, když jsou ve vodním sloupci. Koncentrace všech PAH v sedimentech se velice mění. PAH mají rozdílné sorpční a desorpční vlastnosti. Rovnovážná situace se mezi silikonem a vodou pozoruje v různých expozičních časech. Menší PAH jsou rychleji v rovnováze než větší molekuly PAH, expoziční čas k pozorování rovnováhy může být velmi krátký pro menší PAH (hodiny) a velmi dlouhý pro větší PAH (měsíce) [4]. 36
7.2.4 Experiment se silikonovou gumou Studie A. Luszezaneca zavádí přístup, který je založen na principu vzorkovacích technik jako SPMD, které zavedl Huckins a kol. Silikonové guma (SS) (Rubber BV- Hilversum, Nizozemí) o tloušťce 0.05 a 0.2 cm nařezána na proužky o rozměrech 4 3.15 cm, 4 6.25 cm a 4 12.5 cm byla vložena do prostředí sediment-voda. V sadě několika expozičních testů bylo testováno rozdělování PAH mezi sediment a silikonovou gumu. Absorpce PAH silikonovou gumou je dvoufázový proces, který probíhá přes fázi lineární absorpce do rovnováhy [4]. 7.2.4.1 Fáze lineární absorpce Když jsou SPMD nebo silikonové proužky vystaveny systému sediment-voda, organické kontaminanty jsou z počátku absorbovány konstantní rychlostí, pak se v závislosti na K ow ustanovuje rovnováha (obrázek 10). Q SS = C w A SS t k, (6) kde Q SS je absorpce PAH silikonem, C w je koncentrace ve vodě, A SS je plocha silikonového proužku, t je expoziční čas a k je rychlostní konstanta [4]. 37
Obr.10 Absorpční křivky pro tři látky, které se liší hydrofobicitou: nízký K ow (nízká hydrofobicita), střední K ow, vysoký K ow (vysoká hydrofobicita). V čase 1 mají všechny látky lineární fázi absorpce. V čase 2 látka s nízkým K ow dosáhla rovnováhy, látka s vysokým K ow má stále lineární fázi absorpce. Absorpce Q SS silikonových proužků je závislá na expozičním čase, expozičním povrchu a volně rozpuštěné koncentraci s podmínkou, že teplotní a průtokový režim jsou konstantní. Pomocí silikonových proužků v systému sediment-voda při konstantní teplotě a hybnosti lze stanovit míru koncentrace HOC ve vodě. Mělo by se dbát na to, že rychlost desorpce sloučenin ze sedimentu není určující pro rychlost absorpce do silikonových proužků, čehož se může dosáhnout přídavkem sedimentové fáze. Práce Booij a kol. ukazuje, že expozice silikonové gumy mořskou vodou zůstala ve fázi lineární absorpce více než 6 týdnů [4,10]. 38
7.2.4.2 Rovnovážná fáze Jinou metodou, jak dosáhnout při expozici rovnováhy, je zavedení rovnovážné fáze. Získání rovnováhy hydrofobních sloučenin ale může trvat delší dobu. V dalších experimentech byly studovány cesty urychlující rovnováhu a výběr vhodného množství sedimentu. V tomto přístupu byla ovlivněna koncentrace HOC v sedimentu (C sed ) a ve vodné fázi (C w ) během expozice, ale při extrapolaci lze odhadnout koncentrace ve vodné fázi neovlivněné HOC [4]. Hydrofobní organické látky difundují do silikonové gumy, kde jsou absorbovány. Rovnováha je popsána rozdělovacím koeficientem silikon/voda K SS,w. Po expozici silikonových proužků v systému silikon-voda, koncentrace HOC ve vodné fázi (C w ) může být odvozena od koncentrace HOC naměřené v silikonových proužcích (C SS ) a aproximována na rozdělovací koeficient K SS,w [4]. C w = C SS /K SS,w, (7) kde C w je koncentrace HOC ve vodné fázi, C SS je koncentrace HOC v silikonových proužcích a K SS, w je rozdělovací koeficient silikon/voda. Protože přítomnost vlivu silikonu na koncentrace C sed a C w klesá s absorpcí HOC silikonem, původní koncentrace HOC ve vodné fázi C 0 w nemůže být přímo odvozená ze vztahu (7). C w není původní koncentrace před expozicí, ale během expozice. Rozdílný podíl mezi silikonem a sedimentem musí být prostudován k vyhodnocení všech podílů koncentrace rozpuštěných látek C w. Případ nekonečně malých podílů fází vyžadoval, že pro odhad původní koncentrace HOC ve vodné fázi C 0 w může být nalezena extrapolací, jak je ukázáno následovně podle hmotnosti zbytku: C 0 sed m sed = C sed m sed + C SS m SS, (8) kde C 0 sed je původní koncentrace HOC v sedimentu, m sed je hmotnost sedimentu, C sed je koncentrace HOC v sedimentu po expozici, C SS je koncentrace HOC v silikonovém proužku a m SS je hmotnost silikonového proužku [4]. 39
absorpce proužkem je: C SS m SS = C 0 sed m sed C sed m sed, (9) kde C SS je koncentrace HOC v silikonovém proužku, C 0 sed je původní koncentrace HOC v sedimentu, C sed je koncentrace HOC v sedimentu po expozici. C 0 sed = C sed + (m SS /m sed ) C SS (10) Rozdělovací koeficient sediment/voda je K sed,w = C sed /C w, takže C sed = K sed,w C w Rozdělovací koeficient silikon/voda je K SS,w = C SS /C w a následně C SS = K SS,w C w C sed může být nahrazena C w K sed,w a C SS za C w K SS,w, dostaneme vztah: 1/C w = 1/C 0 w + m SS/ m sed 1/C 0 w K SS,w /K sed,w (11) Tato rovnice (11) může být vyřešena následující regresí: y= b+ax. Po vyhodnocení 1/C w versus podíl fází (m SS /m sed ), je úsek (1/C 0 w) inverzní hodnotou skutečné koncentrace rozpuštěných látek v systému sediment-voda bez silikonu, tj. sediment a koncentrace rozpuštěných látek nejsou ovlivněné. Původní koncentrace C 0 sed může být kvantifikována následovně: v rovnováze je C w stejná jako pro sediment a silikonový proužek,odtud: C sed = (K sed,w /K SS,w ) C SS a C SS m SS = C 0 sed m sed (K sed,w /K SS,w ) C SS m sed Podělením C SS m sed dostáváme: m SS /m sed = C 0 sed 1/C SS K sed,w /K SS,w (12) 40
Tato rovnice může být snadno vyřešena následující regresí: y = ax + b, ve které je y poměr rozdělení mezi proužek a sediment a x je inverzní hodnotou ke koncentraci v proužku. Tak se analyzují data z různých podílů fází, a je C 0 sed a b je K sed,w /K SS,w. Rozdělovací koeficient sediment-voda K sed,w se může tak odhadnut ze sklonu křivky [4]. Druhým krokem, po prvním experimentu a výsledcích, v tomto projektu bylo nalezení nejkratší cesty k dosažení rovnováhy. Tím byl testován vliv množství sedimentu při několika expozičních časech na ustálení rovnováhy [4]. 7.2.4.3 Úprava silikonových proužků před aplikací Syntetické polymery obvykle obsahují velké množství aditiv a polymery s nízkou molekulovou hmotností mohou způsobit značné problémy během čištění vzorku a analýzy. K odstranění těchto aditiv a nízkomolekulárních polymerů se provádí řada čistících kroků. Prováděla se extrakce silikonových proužků o velikosti 4 6.25 0.05 cm a 4 12.5 0.05 cm se směsí rozpouštědel hexan/aceton (3:1) přes noc v Soxhletově extraktoru. Bylo pozorováno velké zvětšení povrchu silikonových proužků, ačkoli se proužky vrátily do jejich původního tvaru, když se vysušily. Byla nalezena přibližně stejná extrahovatelná hmota (23 mg/g). Vyextrahované množství bylo olejovité, což mohlo způsobit velké problémy během HPLC analýzy. Extrahovaná rezidua ze silikonového proužku byla testována pomocí kolony naplněné oxidem hlinitým (10% voda). Kolona byla promývána 40 ml hexanu. Téměř 100% reziduí se zadrželo v koloně při promývání hexanem. Předběžně extrahované silikonové proužky byly extrahovány podruhé se směsí rozpouštědel hexan/aceton (3:1) v Soxhletově extraktoru. Nebyla nalezena žádná rezidua [4]. Lze usuzovat, že jedna extrakce přes noc byla dostatečná k předběžné přípravě silikonového proužku. To vylučuje zbylé vedlejší produkty, které by mohly být nebezpečné pro HPLC analýzu. Čištění oxidem hlinitým probíhalo během preparace pomocí HPLC analýzy k ujištění, že ve vzorcích nebudou přítomny žádné vedlejší produkty [4]. 41
7.2.4.4 Standardy pro studium účinnosti Standardy pro studium účinnosti (PRC) jsou deuterované látky (v případě studia PAH) nebo látky, které se nevyskytují v životním prostředí. Využívají se ke stanovení rychlosti vzorkování. Dříve než se silikonová guma vystavila expozici v systému sediment-voda, se silikonové proužky obohatily řadou PRC: deuterovanými PAH (anthracen-d10, chrysen- D12, perlen-d12). PRC byly přidány do roztoku methanol:voda (1:1), ve kterém byly ponořeny silikonové proužky. Absorpce PRC silikonem byla urychlena přídavkem methanolu k vodě [4]. Po vyčištění a obohacení silikonových proužků PRC nemohla být stanovena hmotnost každého proužku, aby se zabránilo kontaminaci. Hmotnost proužku byla stanovena po expozici a následující extrakci. Tato hmotnost byla použita k převedení výsledků získaných softwarem Turbochrom (ng/silikonový proužek) na výsledky v ng/g silikonového proužku. Byl vytvořen číslovací systém, aby byl rozlišen každý proužek; byl to druh binárního kódu vyrobeného děrovačkou [4]. 7.2.4.5 Vzorkování Silikonové proužky byly vystaveny množství vlhkého nebo suchého sedimentu a deionizované vodě ve skleněných lahvích, které byly umístěny do třepačky na různě dlouhé časové úseky. Experimenty byly prováděny v klimatizované laboratoři ( při 20.0 + 0.1 C, ve tmě) pro zachování konstantních podmínek [4]. 7.2.4.6 Extrakce silikonových proužků Po expozici byl každý silikonový proužek vyjmut z lahve a promyt deionizovanou vodou a otřen tkaninou. Proužek byl srolován a vložen do patrony Soxhletova extraktoru. Vzorek byl extrahován přes noc s 50 ml směsi rozpouštědel hexan/aceton (3:1). Extrakt byl zakoncentrován na Kuderna-Danishově koncentrátoru a převeden do kolony 42
s oxidem hlinitým (10% vody). Vzorek byl promyt 25 ml hexanu. Získaný eluát byl odpařen stejným koncentrátorem. Poté se k zahuštěnému extraktu přidalo 100 µl vnitřního standardu 2-methyl chrysenu a 5 ml acetonitrilu a extrakt byl zahuštěn na objem 1 ml [4]. 7.2.4.7 Chromatografická analýza Koncentrace PAH a PRC se stanovila kapalinovou chromatografií, která byla vybavena dvěma fluorescenčními detektory (HPLC HP1100 LC 2, xenonový zdroj fluorescenčního detektoru). Byla použita kolona se sorbentem C18 a mobilní fází methanol/voda. Fluorescence látek byla následně měřena dvěma detektory, používající různé excitační a emisní vlnové délky. Fluorescenční detektor detekuje světlo emitované molekulou (emise vlnových délek Em), poté co absorbovalo energii z excitačního paprsku (excitace vlnových délek Ex). Signál je přímo úměrný koncentraci PAH, které mohou absorbovat v tomto rozsahu vlnové délky. Na konci každé analýzy byla kolona promyta 100% acetonem k vyčištění a připravena směsí voda/methanol na další analýzy. Čtyři koncentrace PAH byly použity pro kalibraci [4]. PAH použité v této práci byly (v retenčním pořadí): fenanthren (Fen), anthracen (Ant), fluoranthen (Flu), pyren (Pyr), benzo[a]anthracen (BaA), chrysen (Chr), benzo[e]pyren (BeP), benzo[b]fluoranthen (BbF), benzo[k]fluoranthen (BkF), benzo[a]pyren (BaP), benzo[g,h,i]perlen (bghipe), dibenzo[a,h]anthracen(dbaha), a indeno[1.2.3-c,d]pyren (InP). Retenční časy PAH se pohybovaly od 13.1 min pro fenanthren do 54.1 min pro indeno[1.2.3-c,d]pyren [4]. 7.2.4.8 Kontrola kvality Kvalita analytické práce byla kontrolována několika způsoby, které zahrnovaly rozsáhlé čištění skla a silikonové gumy, použití tmavého skleněného nádobí k minimalizaci fotolýzy PAH. Byla kontrolována účinnost extrakce a byly analyzovány blanky [4]. 43
7.2.4.9 Výsledky 1) test fáze lineární adsorpce Sediment z Rotterdamského přístavu byl použit ke studiu absorpce silikonovými proužky ve vztahu k expozičnímu času. Část s nejkratšími expozičními časy (dva až tři dny) ukazuje, že absorpce byla klesající s časem [4]. Pokles absorpce je úměrný klesajícím koncentracím ve vodné fázi a v sedimentu. Část kontaminantů byla absorbována silikonem. Výsledky neukazují fázi lineární absorpce, hlavně z toho důvodu, že absorpce silikonovými proužky významně ovlivnila množství kontaminantů v sedimentu. Jinými slovy, první silikonové proužky extrahovaly významné procento všech kontaminantů [4]. Experiment byl ověřením použitelnosti rovnice (6). Pro sloučeniny s nízkým K ow (sloučeniny s nízkou hydrofobicitou) byla absorpce v systému silikon-voda v rovnováze. Rovnovážné situace bylo velmi rychle dosaženo pro lehčí PAH [4]. 2) rovnovážný čas a hustota suspenze Tyto výsledky ukázaly, že doba expozice pro méně hydrofobní sloučeniny je úměrná času potřebnému k dosažení rovnováhy, více hydrofobní PAH by vyžadovaly delší doby expozice. Tento experiment potvrdil vliv obsahu sedimentu na sorpci PAH do silikonových proužků. Sorpce PAH silikonovým proužkem prudce stoupala, když byl vyšší obsah sedimentu od 0.005 do 0.3 g/ml po stejný expoziční čas. Systém silikonových proužků těžko dosahoval rovnováhy pro větší sloučeniny i po šestidenní expozici. Bylo to zřejmě kvůli pomalé transportní rychlosti těchto velkých PAH přes film silikonové gumy, který může napodobit ochranný účinek biomembrán [4]. 3) rozdělovací koeficienty silikon-voda Rozdělovací koeficienty silikon/voda byly stanoveny ze studií silikonových proužků, ve kterých byly silikonová i vodná fáze analyzovány odděleně. Tyto rozdělovací koeficienty silikon/voda mohou být určeny z této rovnice K SS,w = C SS /C w, když známe 44
obě, koncentraci HOC ve vodě i koncentraci HOC absorbovanou na gram silikonového proužku [4]. Silikonová guma může simulovat živé tělo a být považována za prostředek k napodobení akumulace v membránách. Rozdělovací koeficienty membrána/voda rostou s rostoucí hydrofobicitou [4]. 4) poměr fází S klesajícím poměrem mezi silikonem a sedimentem stoupá množství absorbované silikonovým proužkem [4]. Absorpce silikonovými proužky v systémech sediment-voda byly mnohem rychlejší než se očekávalo. Protože obsah sedimentu byl po krátké expoziční době ovlivněn, nebylo možné udržovat fázi lineární absorpce [4]. Absorpční rychlost systémů silikon-voda byla úměrná hustotě suspenze, což umožnilo dosáhnout rovnováhy v rozumném čase [4]. Rozdělovací koeficienty silikon/voda byly přímo úměrné hydrofobicitě (K ow ) [4]. Mohla být kvantifikována frakce kontaminantů, která je vyměnitelná s vodnou fází [4]. Výsledky odhalily, že 70-90% PAH vázaných v sedimentu se nepodílí na výměně s vodnou fází [4]. 45
7.2.5 Vliv vzorkovacích metod na výsledky analýzy Tato studie byla popsána Hermansem a kol. v roce 1992. Analýza PCB ve vodné fázi je obtížná, protože koncentrace jsou extrémně nízké díky hydrofobní povaze těchto sloučenin. Koncentrace v mořské vodě pro kongenery PCB byla v rozsahu pg/l [11]. Deset litrů vody ze Severního moře bylo navzorkováno použitím filtračních metod s filtrem se skleněnými vlákny a pak centifugováno pomocí kontinuální průtokové centrifugace. Po oddělení z pentanové vrstvy byla voda obohacena různými kongenery PCB rozpuštěnými v methanolu. Vzorek se míchal 1 hodinu a pak byl extrahován 7 hodin. Obsah PCB se stanovoval v každém dílčím extraktu [11]. Výsledky K prostudování možných rozdílů v chování mezi obohacenými a neobohacenými polychlorovanými bifenyly se ke vzorkům přidal PCB155 (sloučenina, která se nevyskytuje v prostředí) a nechala se ustavit rovnováha 1 den. Poté se provedla extrakce. Obrázek 11 ukazuje rostoucí extrakční křivky pro některé vzorky vody neobohacené PCB a PCB155 ve filtrovaných a centrifugovaných vzorcích. Když se extrakční křivky přibližovaly k téměř konstantně rostoucímu obsahu, předpokládalo se, že návratnost bude až 100%, což se také potvrdilo vysokou návratností kongeneru PCB155 (95%). Pro obohacené vzorky vody byla návratnost přidaných PCB >90%. Pro neobohacené vzorky byly nutné delší časy extrakce. Pro více chlorované kongenery byla nutná doba extrakce 10-45 hodin, což ukazuje silnější afinitu více chlorovaných PCB k rozpuštěné organické hmotě. Krátké časy extrakce u obohacených vzorků mohou být vysvětleny krátkou dobou pro ustanovení rovnováhy po obohacení (jen 1h). Pro obohacené vzorky se časy potřebné k dosažení rovnováhy téměř rovnaly extrakčním časům [11]. 46
Uchovávání vzorku Bylo pozorováno, že vzorky, které byly původně vizuálně čisté, po uskladnění ukázaly zákal, pravděpodobně díky biologické aktivitě. Tento jev se vyskytoval zejména v centrifugovaných vzorcích. Okyselené vzorky se zdály být bez emulze a bez zákalu po delší době skladování. Po jednom měsíci skladování byla extrakce PCB z kyselých vzorků o mnoho rychlejší než z neupravených vzorků. Neupravený vzorek nebyl plně extrahován ani po nejdelším čase extrakce (80h). Účinek okyselení na extrakční rychlost byl významnější pro více chlorované PCB než pro méně chlorované PCB [11]. Adsorpce na filtry Uvolňování PCB klesalo s rostoucím stupněm chlorace v souladu s jejich rozpustností ve vodě. Ukázalo se, že filtry se skleněnými vlákny zadržují až 35% DOM [11]. Filtrace versus centrifugace Doby extrakce 10-20 hodin se zdály být dostatečné pro filtráty, zatímco centrifugáty potřebovaly dobu extrakce alespoň 30-60 hodin. Vyšší obsah PCB a pomalejší extrakce pro centrifugovanou vodu je přisouzen přítomnosti organické hmoty. V závislosti na afinitě k DOM, jsou PCB extrahovány pomaleji díky kineticky omezené desorpci nebo vyšším distribučním koeficientům. Podle této hypotézy se očekávalo, že více rozpustné PCB (méně chlorované) se budou extrahovat rychleji než méně rozpustné PCB (více chlorované), což je v souladu s obrázkem 11. Na obrázku 12 jsou uvedeny sloupcové diagramy proměnných poměrů pro obsahy PCB pozorované při různých extrakčních technikách a při centrifugaci. Obsah PCB v centrifugátech je zřetelně odlišný od filtrátů se skleněnými vlákny, kde se ukazují zvýšené koncentrace méně chlorovaných PCB. Zjevně jsou méně chlorované PCB přítomny více ve vodě filtrované skleněnými vlákny než více chlorované PCB, jak může být očekáváno na základě jejich příslušných rozpustností ve vodě. Více chlorované PCB jsou převážně vázané na DOM [11]. 47
Obr.11 Extrakční křivky pro vzorky vody neobohacené PCB, HCB a obohacené PCB (PCB155) a) filtrované vody a b) centrifugované vody Membránové filtry absorbovaly všechny volně rozpuštěné PCB, zatímco filtry se skleněnými vlákny prokázaly jen omezenou adsorpci. Frakce PCB vzorkované kontinuální průtokovou centrifugací nemohou být považovány za volně rozpuštěné frakce, protože se vzorkuje také částicová hmota s adsorbovanými PCB. Centrifugace mohla být použita pro transportní studie. Použití kontinuální průtokové centrifugace také dovoluje neomezený sběr částicové hmoty, čímž se získává celkový obrázek o kontaminaci PCB ve vodní fázi [11]. 48
Obr.12 Srovnání modelů PCB mezi suspendovanou hmotou (SPM), centrifugátem, filtrátem se skleněnými vlákny a filtrátem z membránového filtru (PCB18 a 44 nebyly stanoveny v SPM ani membránovém filtrátu) 49