MASARYKOVA UNIVERZITA LÉKAŘSKÁ FAKULTA DISERTAČNÍ PRÁCE

MASARYKOVA UNIVERZITA LÉKAŘSKÁ FAKULTA DISERTAČNÍ PRÁCE Brno 2016 Mgr. Petra Amchová

MASARYKOVA UNIVERZITA LÉKAŘSKÁ FAKULTA FARMAKOLOGICKÝ ÚSTAV Behaviorální a neurochemické změny v animálních modelech deprese a závislosti Disertační práce v oboru Lékařská farmakologie Školitelka: PharmDr. Jana Rudá, Ph.D. Autorka: Mgr. Petra Amchová Brno, 2016

Abstrakt Úvod: Drogová závislost se klinicky často vyskytuje současně s jiným psychiatrickým onemocněním, včetně deprese. Cílem práce bylo prozkoumat komorbiditu závislosti a deprese z preklinického pohledu na behaviorální i neurochemické úrovni. V problematice drogové závislosti hraje dále významnou roli pohlavní diferenciace, proto bylo dalším cílem porovnání mezipohlavních rozdílů v animálním modelu látkové závislosti. Metody: Pro preklinické modelování komorbidity deprese a drogové závislosti byl použit model olfaktorické bulbektomie (OBX) a model intravenózní operantní autoaplikace látky (IVSA) s cílem ověřit, zda má depresivní fenotyp vliv na příjem agonisty CB1 receptoru WIN55,212-2. K ovlivnění vzniklého adiktivního chování u potkanů byl aplikován agonista 5-HT1B receptoru, CGS-12066B (CGS). Pro sledování pohlavních rozdílů ve vulnerabilitě k relapsu byl použit model IVSA MET po periodě nucené abstinence. Za účelem získání dat o hladinách neurotransmiterů v nucleus accumbens shell byla provedena in vivo mikrodialýza, a to za bazálních podmínek a po aplikaci jedné dávky MET/WIN s následnou analýzou pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Výsledky: OBX zvířata vykazovala vyšší příjem WIN ve srovnání s kontrolní skupinou. Po akutní aplikaci CGS nedošlo ke změně v příjmu WIN ani u jedné ze skupin. U OBX byly naměřeny snížené bazální hladiny dopaminu, serotoninu a jejich metabolitů a zvýšené hladiny glutamátu a gama-aminomáselné kyseliny (GABA) ve srovnání s kontrolní skupinou. Po akutním podání MET bylo zaznamenáno významně vyšší uvolňování dopaminu, serotoninu a jejich metabolitů u OBX, naopak hladiny glutamátu byly nižší a hladiny GABA se nelišily od kontroly. V reakci na akutní podání WIN došlo k signifikantnímu zvýšení hladiny dopaminu u skupiny SHAM, avšak u skupiny OBX neměla aplikace WIN na hladiny limbického dopaminu žádný vliv. V modelu IVSA MET byl potvrzen mezipohlavní rozdíl v příjmu MET, kdy samice potkana prokázaly nižší konzumatorní příjem a naopak vyšší vulnerabilitu k relapsu. Závěr: Tato práce poskytuje důkazy o mezolimbických změnách v potkaním modelu deprese, které by mohly objasnit základní mechanismy v modelu IVSA, kde OBX potkani vykazují vyšší příjem drogy ve srovnání s kontrolní skupinou. Pohlavní rozdíly v problematice drogové závislosti prokázané v této práci vyzývají ke specifické strategii léčby závislostí a rozdílnému přístupu v prevenci relapsů. 1

Klíčová slova deprese dopamin metamfetamin in vivo mikrodialýza operantní autoaplikace potkan serotonin závislost 2

Abstract Background: Drug abuse is clinically a frequent comorbidity of other psychiatric disorders including depression. The aim of this thesis was to investigate the comorbidity of addiction and depression at behavioural and neurochemical level in rat model. There is also an evidence suggesting differential characteristics of the disorder of drug addiction in male and female; therefore another aim of this study was to assess gender differences in animal drug seeking behaviour. Methods: To model the comorbidity of depression and drug addiction pre-clinically we used the olfactory bulbectomy (OBX) model of depression and intravenous self-administration (IVSA) procedure in rats to verify whether depressive-like rats displayed altered voluntary intake of the CB1 receptor agonist WIN55,212-2 (WIN). Serotonin 5-HT1B receptor agonist, CGS-12066B (CGS) was administered to influence the addictive behaviour. Gender differences in the relapse-like behaviour were observed in methamphetamine (MET) IVSA after a period of forced abstinence. In vivo microdialysis was performed to elucidate neurotransmitter changes in the nucleus accumbens shell, starting from baseline and following after a single dose of MET (WIN). The determination of neutrotransmitters and their metabolites was performed by high performance liquid chromatography. Results: OBX animals exhibited a higher intake WIN compared to the control group. Acute pre-treatment with CGS did not significantly modify WIN intake in OBX and SHAM. OBX animals had lower basal levels of dopamine and serotonin and their metabolites. However, gamma-amino-butyric acid (GABA) and glutamate levels were increased. The MET injection induced stronger dopamine and serotonin release in the OBX rats and lower release of glutamate in comparison with SHAM operated rats; GABA levels did not differ significantly. In response to a WIN challenge the dopamine levels in the NAc of OBX rats did not increase, as in SHAM rats. Gender difference was confirmed in IVSA METH protocol, female rats were found to self-administer significantly lower dose of METH, and on the other hand they demonstrated higher vulnerability to relapse of drug seeking behavior. Conclusions: This study provides an evidence of mesolimbic neurotransmitter changes in the rat model of depression which may elucidate mechanisms underlying intravenous selfadministration studies in which OBX rats were demonstrated to have higher drug intake in comparison to intact controls. The gender differences in the issue of drug addiction, which 3

were demonstrated in this thesis, encourage to a specific addiction treatment strategy and different approach in preventing relapses. Keywords depression dopamine methamphetamine in vivo microdialysis self-administration rats serotonin addiction 4

Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto disertační práci vypracovala samostatně pod vedením PharmDr. Jany Rudé, Ph.D. s využitím zdrojů uvedených v seznamu použité literatury. Prohlašuji, že v této disertační práci jsou použity originální výsledky z výzkumu provedeného v rámci mého postgraduálního studia na Farmakologickém ústavu LF MU. Mgr. Petra Amchová 5

Poděkování Ráda bych zde poděkovala především své školitelce PharmDr. Janě Rudé, Ph.D., jak za pomoc při experimentech, interpretaci získaných dat a psaní všech našich publikací, tak za obrovskou motivaci do další práce a plánování nových experimentů a také za neuvěřitelně vstřícný osobní přístup a bezkonkurenční přátelství. Dále bych chtěla poděkovat prof. MUDr. Alexandře Šulcové, CSc., která mě podporovala ve snaze účastnit se vědeckých konferencí, odborných seminářů, workshopů a zahraničních stáží a velkým dílem přispěla k publikaci našich výsledků. Moje díky patří rovněž mým kolegům, MUDr. Janě Pistovčákové, Ph.D., která mne uvedla do problematiky modelování deprese, předala mi metodické rady týkající se olfaktorické bulbektomie a pomáhala při mých prvních setkáních s animálními experimenty; dále PharmDr. Magdaleně Šustkové, CSc., která mi umožnila seznámit se s metodou in vivo mikrodialýza v prostorách laboratoře 3LF Univerzity Karlovy a za spolupráci na publikaci výsledků z tohoto experimentu; dále pak Dr. Lianě Fattore, se kterou jsem měla tu čest provést řadu experimentů na Univerzitě v Cagliari a tato spolupráce vedla nejen k finální publikaci získaných dat, ale také k přátelství. Zásadním způsobem přispěly k realizaci experimentů popsaných v této práci i laborantky Zdeňka Oplatková, Marcela Kučírková a Petra Vrátná, bez jejichž trpělivé a obětavé práce bych nebyla schopná časově ani organizačně experimenty zvládnout. Také bych ráda poděkovala sekretářce Farmakologického ústavu Renatě Bláblové za pomoc s administrativní činností týkající se grantů a účastí na konferencích a zahraničních stážích. Velké díky patří mé rodině, Haně Amchové, Karlu Amchovi a Karlu Kubzovi, kteří mě ohromně podporovali a umožnili mi odpoutat se od mateřských povinností a dovést tuto práci do finále. Chtěla bych poděkovat také svému synu Vilémovi, protože i on mi umožnil tuto práci dokončit. 6

Obsah 1. ÚVOD... 9 2. LÁTKOVÁ ZÁVISLOST... 10 2.1. Závislost na amfetaminových stimulanciích... 13 2.2. Farmakodynamika metamfetaminu... 14 2.2.1. Vliv amfetaminových stimulancií na hladiny neurotransmiterů v mozku... 16 2.3. Závislost na obsahových látkách Cannabis sp.... 19 2.3.1. Farmakodynamika kanabinoidů... 20 2.3.2. Vliv kanabimimetik na hladiny neurotransmiterů v mozku... 22 3. KOMORBIDITA DEPRESE A ZÁVISLOSTI... 23 3.1. Deprese a její neurobiologický podklad... 25 3.2. Preklinické modelování komorbidity deprese a drogové závislosti... 27 3.2.1. Preklinické modelování látkové závislosti... 28 3.2.2. Preklinické modelování deprese u laboratorních zvířat... 31 3.2.3. Vliv modelu olfaktorické bulbektomie na hladiny neurotransmiterů v mozku. 34 3.2.4. Komorbidita deprese a závislosti v preklinických studiích... 39 4. MEZIPOHLAVNÍ ROZDÍLY V CHARAKTERISTICE LÁTKOVÉ ZÁVISLOSTI... 42 5. CÍLE PRÁCE... 43 6. MATERIÁL A METODY... 52 6.1. Model deprese navozený olfaktorickou bulbektomií (OBX)... 52 6.1.1. Chirurgická příprava pro model OBX u potkana... 52 6.2. Model látkové závislosti navozený operantní autoaplikací... 53 6.2.1. Chirurgická příprava pro model IVSA u potkana... 53 6.2.2. Protokol experimentu IVSA WIN55,212-2 (WIN)... 54 6.2.3. Protokol experimentu IVSA MET... 55 6.2.4. Protokol experimentu autoaplikace sladkých pelet... 55 6.3. Metoda in vivo mikrodialýzy... 56 6.3.1. Chirurgická příprava pro metodu in vivo mikrodialýzy... 56 6.3.2. Protokol experimentu in vivo mikrodialýzy... 57 6.4. Behaviorální testy... 58 7

6.4.1. Test preference sacharózy... 58 6.4.2. Test pohybové aktivity... 58 6.4.3. Test behaviorálních projevů v průběhu in vivo mikrodialýzy... 59 7. VÝSLEDKY A DISKUSE... 60 7.1. Studie 1: Operantní autoaplikace WIN55-212,2 v modelu deprese navozené olfaktorickou bulbektomií a in vivo mikrodialýza po akutní dávce WIN55-212,2... 60 7.2. Studie 2: In vivo mikrodialýza po akutní dávce metamfetaminu v modelu olfaktorické bulbektomie: stanovení hladin DA a metabolitů, 5-HT a metabolitů, GLU a GABA v NAc shell... 78 7.3. Studie 3: Operantní autoaplikace metamfetaminu a modelování relapsu po období nucené abstinence u potkaních samců a samic... 95 8. ZÁVĚR... 95 9. POUŽITÁ LITERATURA... 109 10. SEZNAM ZKRATEK... 130 11. SEZNAM OBRÁZKŮ... 132 12. SEZNAM ODBORNÝCH PUBLIKACÍ AUTORKY... 133 12.1. Publikace in extenso v časopisech s IF... 133 12.2. Publikace in extenso v časopisech bez IF... 134 12.3. Prezentace na konferencích (prvoautorská abstrakta s IF)... 134 12.4. Prezentace na konferencích (prvoautorská abstrakta bez IF)... 135 12.5. Účast na zahraničních stážích... 136 13. SOUHRN POZNATKŮ DISERTAČNÍ PRÁCE... 137 8

1. Úvod Fenomén komorbidity deprese a užívání návykových látek je v klinických studiích dobře zdokumentován, avšak pokud mají být vyvinuty nové léčebné postupy, je nutno tento vztah experimentálně modelovat. Zvířecí modely umožňují používání metod, které z etických důvodů nemohou být použity u lidí a umožňují prověřit hypotézy o vývoji těchto nemocí v přesně definovaném a kontrolovaném prostředí, které není možné nastolit v humánních studiích. Při interpretaci animálních dat je samozřejmě třeba počítat s jejich limity. Vzhledem ke komplexnosti psychopatologie psychiatrických onemocnění u člověka, není možné modelovat onemocnění u zvířete v celém svém rozsahu se splněním všech validit. Ale i přes svá omezení mohou animální modely přinášet informace o vzniku, rozvoji a hlavně o možnostech ovlivnění depresivní poruchy i drogové závislosti. Experimenty v této práci byly navrženy tak, aby alespoň částečně objasnily vztah mezi depresí a užíváním drog z hlediska behaviorálního i neurochemického a také nastínily problém mezipohlavních rozdílů v této oblasti. 9

2. Látková závislost Závislost na návykových látkách je chronické psychiatrické onemocnění charakterizované cyklickými recidivujícími fázemi, přičemž projev závislosti se u každého jednotlivce liší (DMS-V). Drogová závislost je závažný zdravotní i psychosociální problém, který kromě organického poškození organizmu může vést až k neschopnosti plnit normální sociální funkce a role ve společnosti a rodině. Užívání drog však není kauzálně spojeno se závislostí na látce. Většina příležitostných nebo pravidelných uživatelů tedy neztrácí kontrolu nad svým chováním a jen malá část se stává skutečně závislá. V průběhu posledních desetiletí bylo vynaloženo velké úsilí především pochopit jednotlivé fáze cyklu závislosti z různých úhlů pohledu, tedy z psychologického, genetického i neurobiologického. 1-3 Návykové látky mají tzv. pozitivní posilovací vliv, tedy společnou vlastnost zpočátku vyvolat radost, dobrý pocit, anebo uvolnění ( high ). Tento efekt vnímaný jako odměna však bývá také motivačním stimulem pro opakování zážitku, což vede u některých jedinců k eskalaci užívání drogy. Zatímco některé psychické a fyzické příznaky jsou specifické pro každou jednotlivou drogu, obecný pocit nepohody, stresu a zvýšené úzkosti jsou společným projevem abstinenčních příznaků po vysazení většiny návykových látek. Fáze abstinenčního syndromu vede k dalším procesům, jako je toužení po droze (tzv. craving) a její nutkavé vyhledávání. Další charakteristikou závislosti je relaps, tedy opětovné užití látky v období abstinence, který vede k rychlému obnovení cyklu od prvního příjmu látky k abstinenčním příznakům a dalšímu vyhledávání drogy. 4 Opakované podávání návykové látky vede k rozvoji adaptačních mechanismů v mozku, což bylo prokázáno jak u lidí, tak u zvířat. 5,6 S užitím drogy souvisejí změny na molekulární úrovni, které se projeví změnou neuronální aktivity od genové exprese přes metabolické dráhy až k synaptické plasticitě, a to má za následek změny v emocionálním stavu a v chování. Nicméně stále existuje otázka, zda jsou vrozené molekulární rozdíly mezi jednotlivci predisponujícím prvkem vedoucím od expozice látky k závislosti. Pokud tomu tak je, mohly by dědičné faktory hrát roli rizika nebo ochrany ve vzniku závislosti. 7 Odměna, jako akutní hédonický efekt po užití drogy a stimul pro motivaci k dalšímu užití, je obvykle považována za výchozí bod při rozvoji závislosti. 2,5,8 Tento efekt spočívá ve stimulaci mezokortikolimbických dopaminergních drah označovaných jako okruh odměny. Ve středním mozku se nachází ventrální tegmentální oblast (VTA), což je heterogenní 10

struktura obsahující dopaminergní, glutamátergní a GABA-ergní neurony. Dopaminergní neurony vedoucí z VTA do limbického systému (nucleus accumbens, ventrální striatum, amygdala), tvoří tzv. mezolimbickou dopaminergní dráhu a neurony vedoucí z VTA do prefrontálního kortexu, tzv. mezokortikální dráhu (Obr. 1). Mezolimbická dráha se uplatňuje především v regulaci příjemných podnětů, vnímání odměny a motivace, mezokortikální dráha reguluje stav nálady a má významné uplatnění v patofyziologii depresivních poruch. 9 Po užití návykové látky dochází k aktivaci dopaminergních neuronů ústících z VTA do nucleus accumbens (NAc), následkem čehož je zvýšené vyplavení dopaminu, což se promítne v psychice jedince jako pocit odměny. 5 Zvýšené hladiny DA v NAc navíc vedou k upevňování vzpomínek na pozitivní události. 10 Chronické užívání návykových látek vede k mnohočetným plastickým modifikacím dopaminergního systému zahrnující nejen receptorový systém, ale i morfologické změny neuronů. 4 Preklinické studie dokonce ukázaly, že nejen chronické, ale i akutní užití návykové látky významně ovlivňuje vznik glutamátergních synapsí na dopaminergních neuronech ve VTA. 11,12 Zmnožení těchto synapsí je dlouhodobé a nemění se ani ve fázi abstinence či v relapsu. 13 K těmto dlouhodobým změnám v synaptické plasticitě dochází také v NAc, avšak na rozdíl od VTA až po opakované expozici návykové látky. 14 Všechny tyto změny v reaktivitě neuronálních drah přetrvávají dlouhou dobu a jsou pravděpodobně zodpovědné za relapsy vyvolané podnětem, který nějakým způsobem jedinci připomíná drogu, např. interiér baru, injekční stříkačka, apod. 4 Cílem současného výzkumu je objasnění neurobiologických mechanismů závislosti s individuálními rozdíly, na jejichž základě by mohly být vypracovány nové diagnostické postupy a terapeutické přístupy specifické pro každého pacienta. 7,15 Existuje široká škála faktorů, které mají vliv na průběh závislosti. Mezi faktory s přímým vztahem k pacientovi patří predispozice k vyhledávání nových věcí či rizik, individuální reakce na užití drogy, stres, nenadálé životní události či komorbidita s dalšími psychickými poruchami. 16 Významnou roli zde hrají i faktory vnějšího prostředí, jako např. dostupnost látky, která může mít vliv na přechod od příležitostného k chronickému užívání drogy. 17 Důkazy individuálních rozdílů mezi pacienty týkajících se závažnosti intoxikace, abstinenčních příznaků a rizika relapsu se objevují čím dál častěji a zdají se být přítomny i ve zvířecích modelech. 18,19 Vzhledem k tomu, že závislost je duševní porucha, individuální 11

rozdíly se objevují na různých úrovních, od psychických vlastností 17 přes genetické a epigenetické vlivy 15 až k neuroadaptačním mechanizmům. 7 Obrázek 1: Dopaminergní dráhy v CNS 12

2.1. Závislost na amfetaminových stimulanciích Psychostimulancia na bázi amfetaminu, z nichž nejčastěji užívanou látkou je metamfetamin (MET), se vyskytují na druhém místě (po kanabinoidech) v žebříčku nejčastěji užívaných nelegálních drog na světě. 20 Jedná se o psychoaktivní látky se stimulačními, euforizačními, anorektickými a v případě chronického užívání i halucinogenními účinky. MET je centrální nepřímé sympatomimetikum, akutní periferní účinky tedy odpovídají obecným projevům aktivace sympatiku (zvýšená srdeční a dechová frekvence, zvýšený krevní tlak a teplota, vazokonstrikce, bronchodilatace, hyperglykemie a mydriáza). Centrální stimulace se projevuje euforií, zvýšenou bdělostí, zintenzivněním emocí, snížením pocitu úzkosti a posílení sebevědomí. 21,22 Užitím MET se také zvyšuje pozornost a soustředěnost, avšak na úkor schopnosti efektivně selektovat vhodné podněty. 23 Z nežádoucích účinků po akutním podání bývá zaznamenávána bolest na hrudi, křeče, bezvědomí, ztráta vědomí, nevolnost, pocení, zvracení, dýchací potíže, třes, tetanie, tachykardie, bledost, psychózy a cyanóza. 24 Abstinenční příznaky se projevují apatií, depresí, podrážděností či anhedonií. Tyto příznaky přispívají k opakovanému zneužívání drogy a rozvoji závislosti. 25 Chronické užívání MET může vést až k psychózám podobným schizofrenii, projevujícím se agresivitou, sluchovými halucinacemi, bludy a pocity perzekuce. 26 U hlodavců jsou po dávce MET pozorovatelné podobné projevy psychostimulace jako u člověka, které se projevují především zvýšením lokomoce a při aplikaci vyšších dávek MET i rozvojem stereotypního chování (opakující se pohyby hlavy, čichání, žvýkání, apod.). Chronická aplikace pak vede k rozvoji závislosti, příznakům podobným psychóze i kognitivním deficitům, dále dochází k abnormálnímu zvýšení hladin dopaminu, rozvoji behaviorální senzitizace (zvyšující se behaviorální reakce na opakované intermitentní podání stejné dávky) 27 a k dysfunkci glutamátergního systému, což se projeví jako stav podobný schizofrenii 28. Chronické podávání MET je dokonce jedním ze zvířecích modelů pozitivních symptomů schizofrenie, neimituje však její negativní či kognitivní symptomy. 28 U hlodavců lze poměrně jednoduše vyvolat i drogovou závislost, jejíž projevy jsou velmi blízké humánním, jak po stránce behaviorální, jako je nutkání vyhledávat drogu, abstinenční syndrom nebo relapsu podobný behaviorální projev, tak po stránce neurochemické, např. akutní změny v hladinách neurotransmiterů (NT) či neuroadaptaci po chronickém užívání. 6 Tato práce se zabývá animálními modely látkové závislosti podrobněji dále. 13

2.2. Farmakodynamika metamfetaminu Všechna amfetaminová stimulancia vedou ke zvýšení hladin biogenních aminů v centrálních synapsích především inhibicí zpětného vychytávání NT a sníženou degradací prostřednictvím inhibice monoaminooxidázy (MAO). Tento mechanismus má za následek neenzymatickou degradaci uvolněných katecholaminů za vzniku neurotoxinů a volných radikálů, což může vyústit v oxidační stres a vznik amfetaminové neurotoxicity. 29-31 MET tedy ovlivňuje několika nepřímými mechanizmy více neurotransmiterových systémů, v první řadě je to dopaminergní, dále pak serotonergní, noradrenergní a glutamátergní. MET prochází snadno hematoencefalickou bariérou a díky své lipofilní povaze dokonce lépe než amfetamin. Po průchodu do centrálního nervového systému (CNS) se MET naváže na fyziologické transportéry, a to dopaminergní - DAT, serotonergní SERT a noradrenergní NET, jejichž blokováním dojde k inhibici zpětného vychytávání příslušných monoaminů (dopaminu - DA, serotoninu - 5-HT, noradrenalinu - NA) do synaptických vezikul a naopak zvýšení jejich koncentrace v cytosolu. Tyto mechanizmy jsou znázorněny na Obrázku 2. Narušení tohoto monoaminového gradientu vede přirozeně k vyplavení dalších monoaminů do synaptické štěrbiny. 31 Toto rychlé nefyziologické zvýšení extracelulární koncentrace monoaminů se projeví u člověka především jako euforie (pocit odměny). Po jejím odeznění dochází k následné depleci monoaminů. Při chronickém užívání MET dochází ke změnám v denzitě monoaminových membránových transportérů. Zatímco hustota DAT se v závislosti na množství substrátu snižuje, počet serotoninových transportérů SERT se zvyšuje, přičemž oba mechanismy mají za následek zvýšenou syntézu dopaminu (DA). 32 V rámci udržení homeostázy v CNS může dojít k patofyziologickým a anatomickým neuroadaptačním změnám, např. snížení počtu postsynaptických D2 receptorů nebo poškození nervových zakončení pro DA/5-HT či dokonce k apoptóze poškozeného neuronu. Tyto změny mohou být přechodné nebo trvalé. Doba užívání ani množství drogy potřebné k vyvolání těchto změn nejsou zcela objasněny, pravděpodobně závisí na více faktorech, jako genetika, pohlaví nebo věk zahájení užívání návykové látky. 33 14

Obrázek 2: Mechanismus působení amfetaminů na nervových zakončeních v CNS Legenda: Amfetaminy v CNS působí ve třech hlavních směrech: 1) usnadňují uvolňování DA, 5-HT a NA z presynaptických vezikul, 2) vážou se na MAO a tím brání degradaci těchto NT, 3) blokují transportéry pro zpětné vychytávání těchto NT (Zdroj: https://drugtoxicology.wikispaces.com/methamphetamine+-+how+meth+acts+within+the+body) 15

2.2.1. Vliv amfetaminových stimulancií na hladiny neurotransmiterů v mozku Většina návykových látek funguje na stejném principu jako přirozené druhy odměny (např. potrava, sexuální aktivita, sport, apod.), tedy jako příjemné stimuly, které aktivují mezokortikální dopaminergní dráhy, kde stimulují vyplavení DA. 34,35 Vzhledem k tomu, že MET je nepřímo působící centrální sympatomimetikum, hraje DA ve zprostředkování jeho účinku nejvýznamnější roli. Dostupnost DA v mozku je řízena dopaminergním transportérem (DAT), což je membránový protein, který aktivně přemisťuje uvolněný DA z extracelulárního prostoru do presynaptického neuronu. DAT je cílem působení mnoha návykových látek včetně kokainu, amfetaminu a MET. Tyto látky ovlivňují DAT dvěma způsoby, např. kokain se naváže na DAT a inhibuje transport DA, zatímco amfetamin a MET se pomocí DAT přemisťují spolu s DA a stimulují jeho eflux. Nicméně oba tyto procesy vedou k masivnímu vyplavení DA. 36 Dopamin uplatňuje svou fyziologickou funkci prostřednictvím vazby na dopaminergních receptorech. Existují dvě hlavní podskupiny (D1 a D2) a 5 subtypů dopaminergních receptorů (D1-5), přičemž stimulace D1 podskupiny (tedy subtypů D1 a D5) vede přes aktivaci adenylylcyklázy ke zmnožení camp (což má excitační vliv na neuron) a stimulace D2 podskupiny (subtypy D2, D3, D4) vede přes aktivaci fosfodiesterázy k odbourávání camp (inhibiční vliv na neuron). 37 Receptory D1, D2, a D3 jsou zahrnuty především v procesu odměny a motivace, zatímco D4 a D5 způsobují behaviorální útlum. 38,39 Antagonizací D1 receptoru se docílí jeho zvýšené senzitivity, což vede k zesílení posilujících účinků drogy. Tento efekt byl prokázán u kokainu a předpokládá se, že stejný efekt bude dosažen i u ostatních stimulancií. 40 Snížená denzita D1 receptorů byla prokázána u pacientů závislých na heroinu, kokainu, etanolu a MET. 41 Redukce počtu těchto receptorů pravděpodobně predisponuje jedince k vyhledávání psychoaktivní látky jako kompenzace snížené funkce dopaminergní dráhy odměny. 42 Důsledkem chronického příjmu MET dochází ke zvýšení hladin DA a 5-HT a jejich metabolitů v NAc a naopak, jeho vysazení vede k razantnímu snížení nabídky DA a negativním emočním stavům, včetně deprese. 43 Post-mortem analýza mozků chronických uživatelů MET odhalila snížené hladiny ukazatelů dopaminergní aktivity (hladiny DA, tyrosinhydroxylázy a exprese DAT) ve striatu 44-46 a snížení hladiny serotoninového transportéru v orbitofrontálním a okcipitálním kortexu. 47 16

Nejenom dlouhodobé užívání, ale i akutní toxická dávka může způsobit perzistující monoaminergní deficit a vést k vyvolání depresivního stavu, což bylo prokázáno v experimentu na myších, kde se zkoumalo depresi podobné chování po jediné dávce MET (30 mg/kg, i.p.) a to z krátkodobého (3 dny po podání) i dlouhodobého (49 dní po podání MET) hlediska. V testu visu za ocas měly myši výrazně delší čas imobility (fenotyp deprese), což bylo doprovázeno výrazným snížením neurotransmise DA a 5-HT a tudíž i snížením hladin DA a jeho metabolitů (DOPAC, HVA) a tyrosinhydroxylázy, a to v obou časových horizontech. Toto zjištění dokazuje, že i jedna vysoká dávka MET může vyvolat dlouhotrvající depresivní stav způsobený trvalým narušením frontostriatální dopaminergní a serotonergní homeostázy. 48 Základní dopaminergní mechanizmus působení MET je modulován dalšími neurotransmiterovými systémy, jako je serotonergní, GABA-ergní či glutamátergní. Serotonergní neurony jsou rozptýleny po celém mozku a regulují rozmanité funkce včetně dýchání, vnímání bolesti, sexuálního apetitu, spánkových cyklů či vnímání odměny. 49,50 Zasažením tohoto systému účinkem amfetaminových stimulancií dochází k silnému ovlivnění všech těchto funkcí. 51 Velmi významně se v procesu odměny a motivace uplatňují serotonergní receptory. Celkem je známo 7 podtypů 5-HT receptorů, tzv. 5-HT1-7 (5-HT1 se dále dělí ještě na A, B, D, E, F, 5-HT2 na A, B, C). V poslední době si získal pozornost podtyp 5-HT1B pro svou potenciální roli v modulaci adiktivního chování. 52,53 Řada klinických i preklinických studií prokázala příčinnou souvislost mezi změněnou aktivitou tohoto receptoru a rozvojem neuropsychiatrických onemocnění, včetně drogové závislosti. 54 V animálních modelech závislosti bylo zaznamenáno, že stimulace 5-HT1B receptoru může vést ke snížení vyhledávání další dávky drogy, např. d-amfetaminu 55 nebo kokainu 56 či ke snížení intrakraniální autostimulace. 57 Také neurotransmiter GABA hraje podstatnou roli v souvislosti s metamfetaminovou závislostí. Látky s GABA-agonistickým účinkem vpravené injekčně do NAc potlačily v potkaním modelu nutkavé vyhledávání další dávky MET. 58 Inhibicí GABA-transaminázy lze docílit rychlého zvýšení extracelulární koncentrace GABA, což se u zvířat projeví snížením autoaplikace kokainu. 59 Ke stejnému výsledku vedla také antagonizace GABA-A receptorů. 60 Souvislost mezi GABA receptory a vznikem závislosti se vysvětluje pomocí desinhibice mezolimbických dopaminergních neuronů (tudíž zvýšení hladin DA), způsobenou zvýšenou senzitivitou GABA-A či GABA-B receptorů, což má za následek intenzivnější 17

vnímání odměny po podání látek s návykovým potenciálem. 59 Stejným mechanismem účinku, přes GABA-ergní a DA-ergní systém, lze vysvětlit i vliv výše zmíněného 5-HT1B receptoru na regulaci příjmu drogy. Aktivací 5-HT1B receptoru se redukuje uvolňování GABA, což má za následek zvýšení hladin DA ve VTA a NAc a zvýšené vnímání odměny. 61 Up-regulace či down-regulace 5-HT1B na terminálních axonech GABA-ergních neuronů v oblasti dráhy odměny (v NAc shell) může přispívat k vulnerabilitě jedince k závislosti na návykové látce. 62 Amfetaminová psychostimulancia dále ovlivňují hladiny glutamátu v mozku, což má za následek typické psychostimulační účinky. 63 Bylo prokázáno, že MET zvyšuje hladiny glutamátu v prefrontálním kortexu (PFC), hipokampu a VTA nikoliv však v NAc. 64 Opačný efekt má amfetamin, který ovlivňuje glutamát v NAc, ne však v PFC. 65 Ve striatu se hladina glutamátu zvýší až po aplikaci poměrně vysoké dávky MET (7,5 mg/kg), jak bylo prokázáno v preklinické studii na potkanech, a je možné, že právě toto vychýlení z fyziologických hladin je základní příčinou metamfetaminové neurotoxicity. 66 Ohmori a kol. provedli v experimentu na potkanech pokus o replikaci tohoto zjištění při opakovaném podávání MET v dávce 5,0 mg/kg, avšak nezaznamenali žádné toxické účinky na dopaminergní nervová zakončení v NAc zprostředkované vysokými hladinami glutamátu. 67 Existují ještě další dvě hypotézy objasňující mechanismus, kterým MET indukuje neurotoxicitu, jedna se opírá o nefyziologické zvýšení hladin DA v cytosolu, což má za následek oxidační stres 68,69 ; zatímco druhá o MET způsobenou hypertermii. 70,71 Neuroprotektivní léčba zahrnující aplikaci reserpinu či α-methyl-p-tyrosinu ovlivňuje oba tyto fenomény, tedy snižuje hladiny DA 72 a současně působí hypotermicky. 71,73 18

2.3. Závislost na obsahových látkách Cannabis sp. Kanabinoidy jsou dle World Drug Report stále nejrozšířenější ilegální drogou na světě. 20 Uvádí se, že závislost na konopí se rozvine u 1 z 9 příležitostných uživatelů této drogy. 74 Kanabinoidy (fytokanabinoidy) se vyskytují v přírodě v rostlinách Cannabis sativa a mezi dva nejznámější patří Δ-9-tetrahydrokanabinol (THC) a cannabidiol (CBD). Konopí se v různých formách nejčastěji kouří, méně často se pak konzumuje orálně z důvodu pomalejšího nástupu psychoaktivního účinku. Akutní efekt se projevuje euforií, kontinuáním smíchem, mnohomluvností, ale také sedací, letargií, zintenzivněním obyčejných smyslových zážitků, z fyzických znaků pak spojivkovou hyperémií, zvýšenou chutí k jídlu, suchostí v ústech, zvýšeným krevním tlakem a tachykardií. 75 THC a CBD mají odlišné účinky na chování a také rozdílné účinky na funkci jednotlivých mozkových regionů. 76,77 Psychoaktivní THC je primárně zodpovědný za výsledné kognitivní účinky, psychotické symptomy, úzkost a návykový potenciál 78, naopak CBD, který nemá psychoaktivní účinky, může zabránit akutním psychotickým příznakům vyvolaným THC a má anxiolytické vlastnosti. 79 Opakovaná expozice fytokanabinoidům způsobuje v mozku neuroadaptační změny, které přetrvávají ještě dlouho po odeznění účinku látek a mohou být příčinou negativních afektivních stavů. Změny jsou specifické pro jednotlivé oblasti v mozku a závisí také na pohlaví a věku. Krátkodobé užívání způsobuje jemné abnormality v morfologii amygdaly 80 a PFC 81 především u dospívajících uživatelů, zatímco dlouhodobé užívání ve velkých dávkách způsobuje změny v mikrostruktuře vláken axonů a jejich konektivity v hipokampu, corpus callosum a komisurálních vláknech. 82 Po chronickém užívání THC byl popsán i abstinenční syndrom, který se vyznačuje zlostí, agresivitou, podrážděností, úzkostí, anorexií, neklidem, poruchami spánku a nepříjemnými sny. 75,83,84 Riziko vzniku psychózy a rozvoj schizofrenie u náchylných jedinců se týká nejen THC, tedy parciálního agonisty CB1 receptoru, ale i syntetických ligandů CB1 receptorů s vyšší afinitou k tomuto receptoru. Díky tomu mají tyto látky mnohem vyšší potenciál k vyvolání psychózy než přírodní látky. 85 Fytokanabinoidy i syntetické kanabinoidy, podobně jako další návykové látky, vytváří psychickou závislost nutící k vyhledávání a opakovanému užívání drogy. Kromě toho bylo prokázáno, že jejich užívání vede k rozvoji závislostí na dalších drogách, jako je alkohol 86, nikotin, MET, extáze a opioidy. 87 19

2.3.1. Farmakodynamika kanabinoidů Během posledních dvou desetiletí učinil výzkum na kanabinoidech obrovský pokrok. Hlavním průlomem se stal objev endogenního kanabinoidního systému, což umožnilo lépe objasnit mechanismus účinku fytokanabinoidů. 75 Endokanabinoidní systém je tvořen kanabinoidními receptory a endogenními ligandy pro tyto receptory (endokanabinoidy). V roce 1984 byla poprvé popsána existence kanabinoidních receptorů. 88 Jedná se zejména o CB1 a CB2 receptor, oba jsou spřaženy s G-proteiny a jsou přítomny na supraspinální, spinální i periferní úrovni. CB1 receptory jsou lokalizovány především na presynaptických neuronech CNS a jsou zodpovědné za akutní psychické a kardiovaskulární účinky konopí, CB2 receptory jsou ve značné míře lokalizovány na periferii a modulují imunitní funkce a zánětlivé odpovědi. 89-91 Objev receptorů byl následován objevem endokanabinoidů, což jsou látky přirozeně přítomné v lidském i zvířecím organismu. Jako první byl objeven N-arachidonylethanolamin (anandamid) 92, poté 2-arachidonylglycerol (2-AG) 93,94 a později řada dalších, např. 2-arachidonyl glyceryl éter, nazvaný noladin. 95 Endokanabinoidní systém má důležitou roli v udržování homeostázy organismu tím, že inhibuje uvolňování neurotransmiterů a brání tak rozvoji nadměrné neuronální aktivity v centrálním nervovém systému. V reakci na postsynaptické zvýšení intracelulárního vápníku indukované některými neurotransmitery jsou syntetizovány a následně uvolněny endokanabinoidy. 96,97 Tyto endokanabinoidní ligandy působí na presynaptické CB1 receptory velmi specifickým mechanismem účinku, který spočívá v tzv. retrográdní signalizaci a vede k inhibici uvolňování glutamátu a GABA 91,98 (Obr. 3). Princip retrográdní signalizace spočívá v inhibici akčních potenciálů a oslabení síly synaptické signalizace a může trvat hodiny až týdny. 75,99 Kromě této neurotransmiterové regulace mají endokanabinoidy vliv na další fyziologické i patologické stavy. Prostřednictvím aktivace CB1 i CB2 receptorů regulují např. příjem potravy, zprostředkovávají antiemetický účinek, protizánětlivý účinek, antineoplastický účinek, mají vliv na analgezii, imunosupresi či vznik závislosti. 100 20

Obrázek 3: Retrográdní signalizace endokanabinoidního systému Legenda: 2-arachidonylglycerol (2-AG) je syntetizován a následně secernován z postsynaptických neuronů a aktivuje CB1 receptory na presynaptických neuronech. Touto aktivací CB1 receptorů se mění síla synaptické signalizace v presynaptickém neuronu, což vede k inhibici uvolňování GABA a GLU. Inhibicí glutamátergní signalizace je omezena syntéza nového 2-AG. (Zdroj: http://idrasilrx.com/doctor-information/human-receptor-information/) 21

2.3.2. Vliv kanabimimetik na hladiny neurotransmiterů v mozku Podobně jako ostatní návykové látky, i kanabimimetika (psychoaktivní fytokanabinoidy i syntetické ligandy) zvyšují prostřednictvím CB1 receptoru hladiny DA v mezolimbickém okruhu odměny 101 a významně pozitivně ovlivňují i serotonergní funkce. 102 Naopak inaktivace či eliminace CB1 receptoru zeslabuje odpověď DA i 5-HT systému na podávání návykových látek a inhibuje i ostatní činnosti spojené s vyplavením těchto neurotransmiterů v NAc. 102 Z behaviorálního hlediska se chronická antagonizace CB1 receptoru projevuje fenotypem deprese, což se potvrdilo v klinických 103 i preklinických studiích. 104 Důsledky užívání kanabimimetik jsou výrazně ovlivněny věkem uživatele. Vystavení kanabinoidům v dospívání má významný vliv nejen na utváření endokanabinoidního systému, ale nadměrná stimulace CB1 receptoru v tomto období ovlivňuje také funkční zrání glutamátergního a GABA-ergního systému. 105 Tento mechanizmus byl prokázán ve studii na potkanech, kde byly adolescentní samice vystaveny agonistům CB1 receptorů, což vedlo ke změnám v dozrávání glutamátergního systému a v dospělosti tato zvířata vykazovala snížené hladiny glutamátu v hipokampu. 106 Podobně, podávání syntetického ligandu CB1 receptoru, WIN55,212-2 (WIN), potkanům v adolescenci způsobilo down-regulaci GABA-ergní transmise v PFC. Při aplikaci WIN dospělým jedincům se tento efekt nepotvrdil. 107 Tyto změny vyvolané expozicí kanabimimetikům v adolescenci mohou mít za následek psychotické, afektivní a depresivní poruchy, což bylo prokázáno v mnoha klinických i preklinických studiích sledujících vliv kanabimimetik na chování adolescentů. 108 22

3. Komorbidita deprese a závislosti Komorbidita je současný výskyt dvou anebo více chorob či poruch u jednoho člověka, přičemž tato onemocnění mohou vzniknout ve stejnou dobu nebo postupně. 109 Komorbidita deprese a látkové závislosti byla poprvé definována v DSM III 110 a je součástí i nejnovější edice DSM V. 111 K vysvětlení této komorbidity se nabízejí tři hypotézy: 1) Depresivní onemocnění vede k užívání návykových látek, tzv. teorie sebeléčení. 2) Závislost na návykové látce přispívá ke vzniku depresivního onemocnění. 3) Vznik závislosti i depresivní poruchy má společný neurobiologický podklad. Ad 1) Depresivní onemocnění vede k užívání návykových látek, tzv. teorie sebeléčení Teorie sebeléčení vysvětluje vznik drogové závislosti jako pokus pacienta zmírnit symptomy deprese způsobené monoaminergním deficitem pomocí různých návykových látek, které hladiny monoaminů zvyšují. Tato hypotéza se potvrdila v klinických studiích zkoumajících závislost na nikotinu 112, alkoholu 113, MET 114 a dalších návykových látkách. 112,115,116 Tyto výsledky byly podpořeny další klinickou studií, kdy léčba drogové závislosti byla účinnější u depresivních pacientů v porovnání s pacienty bez klinických známek deprese. 117,118 Teorie sebeléčení byla zkoumána i preklinicky a výsledky se shodují s výsledky klinických studií. Zvířata s depresivním fenotypem (transgenní model CB1 knock-out myší) vyhledávala ve vyšší míře nikotin, etanol, kokain a amfetamin. 119,120 Depresi podobný fenotyp navozený expozicí chronickému mírnému stresu způsobil u zvířat vyšší efekt odměny. 121 Depresivní fenotyp navozený modelem olfaktorické bulbektomie (OBX) způsobil vyšší vulnerabilitu k autoaplikaci amfetaminu 122, MET 123, CB1 receptorového agonisty WIN 124 a u kokainu vedl po odebrání drogy ke zvýšenému sklonu k relapsu. 125 V posledním zmíněném modelu vykazovali potkani menší míru behaviorálních projevů deprese po opakovaném intraperitoneálním podání nikotinu a stejně tak při samovolném přístupu k této látce v modelu operantní autoaplikace. 126 23

Ad 2) Závislost na návykové látce přispívá ke vzniku depresivního onemocnění Některé studie se přiklánějí k hypotéze vzniku deprese jako sekundárního onemocnění. Abstinenční syndrom, jev související s vysazením návykové látky, má mnoho společných rysů s depresivní poruchou, jak po stránce psychické (negativní nálady, kognitivní a motivační poruchy) tak neuroendogenní (deplece monoaminů, narušení funkce HPA osy), což se prokázalo např. u alkoholu 127, heroinu 128, nikotinu 129 a také u kofeinu. 130 Na základě zjištění, že abstinenční syndrom poskytuje jistou paralelu k příznakům deprese, byl vyvinut animální model deprese spočívající v odnětí podávání amfetaminů u hlodavců. 131 Nejenom akutní abstinenční syndrom, ale také chronická aplikace návykové látky vede k depresivnímu fenotypu, což se potvrdilo v klinické studii sledující vliv dlouhodobé expozice konopí 108,132 nebo v preklinické studii, kde chronická aplikace alkoholu vyvolala příznaky depresivního fenotypu u potkanů (delší čas imobility v testu nuceného plavání a snížení hladin brain derived neurotrophic factor - BDNF - v hipokampu). 133 Ad 3) Vznik závislosti i depresivní poruchy má společný neurobiologický podklad Podle této hypotézy mají na vznik obou chorob vliv stejné faktory, a to jak genetická predispozice 134, tak vliv životního prostředí, jako je nízké vzdělání, sociální izolace, špatná ekonomická situace, narušené interpersonální vztahy, trauma nebo týrání v dětství. 135 Depresivní stav i abstinenční syndrom tvoří základ pro dysregulaci hladin monoaminů 117, jmenovitě postihuje DA 136, 5-HT 137, NA, cholinergní 138, glutamátergní 139 a GABA-ergní systém. 140 Vedle monoaminergního deficitu má tato komorbidita ještě jeden společný neurochemický faktor, a to zvýšenou transmisi faktoru uvolňujícího kortikotropin (CRF) a naopak sníženou transmisi neuropeptidu Y (působící proti CRF), což má za následek horší zvládání stresu. 141 Vzájemné působení těchto dvou patologických stavů ovlivňuje jejich průběh a prognózu. Deprese má tendenci snižovat spolupráci ( compliance ) pacienta při léčbě drogové závislosti a zvyšovat riziko relapsu stimulantů, látková závislost zase zvyšuje riziko sebevražedných sklonů u depresivních pacientů. 142,143 Etiologická podobnost obou poruch by mohla podnítit budoucí vývoj inovativních antidepresiv s novým mechanismem účinku prostřednictvím okruhu odměny mezokortikolimbického dopaminergního systému. 136 24

3.1. Deprese a její neurobiologický podklad Depresivní porucha je neuropsychiatrický syndrom charakterizovaný buněčnými a molekulárními odchylkami v nervových drahách centrálního nervového systému. 144 Podle DSM-5 se depresivní porucha dělí na velkou depresivní poruchu a poruchu deregulace nálady. 111 Depresivní porucha je multifaktoriální onemocnění vycházející ze společného působení genetických a environmentálních faktorů. Po expozici spouštěče (např. reserpin, virová infekce, u žen to může být i porod) se manifestuje jako velká depresivní porucha. Mezi nejznámější rizikové faktory podílející se na patofyziologii depresivní poruchy se řadí rodinná anamnéza, temperament, zneužívání či zanedbávání v dětství, brzké odloučení od matky, stres nebo traumatizující událost či zneužívání drog. 145-147 Přestože deprese má tendenci vyskytovat se v rodině (rodinná anamnéza), studie GWAS ( genowide association studies ) neobjevily žádný genový lokus podílející se na patologickém sklonu k rozvoji tohoto onemocnění. 148 Stejně tak samotný negativní faktor vnějšího prostředí, jako stres v dětství či traumatizující událost, nespustí depresivní poruchu bez genetické predispozice jedince. Mezi hlavní příznaky deprese dle DSM-5 patří smutná depresivní nálada, ztráta zájmu o dříve prováděné činnosti, změny chuti k jídlu (hubnutí nebo přírůstek na váze), poruchy spánku (insomnie nebo hypersomnie), zvýšená únava, ztráta energie, zpomalené pohyby a řeč, pocit bezcennosti, provinilosti, obtížné myšlení, soustředění a rozhodování, myšlenky na smrt. Pro diagnózu deprese musí trvat příznaky alespoň dva týdny. Deprese se svými projevy představuje velkou sociální zátěž v důsledku neschopnosti vykonávat každodenní činnosti v zaměstnání i v rodině. 111 Neurobiologický podklad vzniku deprese, i přes rozsáhlé množství výzkumů, není úplně jasný. Nejstarší hypotézou vyslovující příčinu neuropatologie deprese je monoaminergní teorie vysvětlující organický podklad poruchy především jako depleci monoaminů (hlavně 5- HT a NA) v CNS. 149 Tato hypotéza má však své limity, např. antidepresiva upravující monoaminergní transmisi zvyšují hladiny monoaminů v synapsích řádově v minutách, avšak klinický efekt se projeví až po 2 4 týdnech. Monoaminergní teorie také nevysvětluje další patologie vyskytující se u depresivních pacientů, jako makroskopické a mikroskopické strukturální změny mozku, dysregulaci ostatních neurotransmiterových systémů, dysregulaci 25

osy hypothalamus-hypofýza-nadledviny (HPA), změny ve střevní mikroflóře 150 či v imunitním systému. 151 Další hypotézy navrhují zahrnout patofyziologii dalších NT, jako glutamát 152, GABA 153 a neuropeptidů, jako kortikotropin uvolňující hormon (CRH). 154 Dále se také zdůrazňuje role dysfunkční glukokortikoidní homeostázy, HPA osy 155-157 a imunitního systému a jejich vliv na rozvoj nemoci. 151 Jiné teorie zdůrazňují převážně změny v neuroplasticitě, jako je hipokampální neurogeneze v dospělosti 158,159, či neurotrofní faktory, zejména BDNF. 160 BDNF spoluzodpovídá za plasticitu synapsí, růst nových synapsí a neurogenezi v hipokampu. 161 Nízké hladiny BDNF prokázané u depresivních pacientů 162 spolu se zvýšenou aktivitou HPA osy 163 a glutamátergní toxicitou se dávají do souvislosti se strukturálními a funkčními abnormalitami v mozku u lidí trpících depresivní poruchou. 164 Jako přídatné faktory vzniku deprese se pak nově zmiňují epigenetické mechanismy, jako např. acetylace histonů či metylace DNA, které mají značný vliv na různé nervové dráhy. V limbickém systému zvířat v animálních modelech deprese i u depresivních pacientů v humánních studiích post mortem byly nalezeny různé modifikace, např. deacetylace histonů, metylace DNA a změny na chromatinech. 165 Kromě psychofarmakologického přístupu se nabízí ještě pohled na depresivní poruchu z hlediska psychoterapeutického, popisujícího u depresivních jedinců negativní kognitivní schémata (negativní sebehodnocení). U manifestace depresivní poruchy se také zmiňuje narušená chronobiologie, tedy narušené cirkadiánní rytmy vzniklé např. prací na směny. Rozvrat cirkadiánních rytmů má negativní vliv na spánkový cyklus, učení, paměť a citlivost na stres, což jsou také časté projevy depresivní poruchy, např. insomnie se vyskytuje až u 60% pacientů s depresí. 166 Tyto faktory dále zvyšují u léčených pacientů riziko relapsu depresivní poruchy. 167 Deprese může být také značně ovlivněna nebo spuštěna vlivem pohlavních hormonů. Obecně estrogeny a testosteron, který se v neuronech konvertuje na estrogen, působí antidepresivně, naproti tomu progesteron působí prodepresivně. 168-170 Estrogeny zvyšují odbourávání MAO, tudíž se inhibuje odbourávání serotoninu a navíc estrogeny zvyšují expresi 5HT3A serotonergního receptoru v prefrontální kůře a NAc, což bylo potvrzeno v klinických i preklinických studiích. 171 Progesteron naopak hladiny MAO zvyšuje. 172 Pokles hladin estrogenů vede ke snížení hladin serotoninu a dopaminu, což se projeví únavou, nespavostí a 26

depresí. Ke vzniku depresivního stavu přispívá jak náhlý pokles hladin estrogenu např. po potratu, porodu, ovulaci, hysterektomii či ovariektomii 168, tak chronicky nízké hladiny přítomné v menopauze a taktéž fluktuace jejich hladin v období puberty, kojení, o menstruačního cyklu. 169 Pohlavní hormony mají navíc vliv na zrání HPA osy v období dospívání. Vliv estrogenů zvyšuje aktivitu HPA osy a tím se ženy stávají více citlivé na účinky stresu, zatímco androgeny mají naopak ochrannou roli. 173 3.2. Preklinické modelování komorbidity deprese a drogové závislosti Animální modely nemají za úkol plně zrcadlit lidskou chorobu, ale slouží k zachycení podobných symptomů daného onemocnění a k objasnění mechanismů probíhajících u lidí. Validita daného modelu se posuzuje podle jeho vhodnosti pro daný účel. U animálních modelů rozlišujeme 3 typy validit: 174,175 1) fenomenologická, 2) konstruktivní, 3) prediktivní. Fenomenologická validita zkoumá shodu projevu nemoci v animálním modelu a u člověka, což nelze navodit vždy, zvláště u psychiatrických diagnóz (např. subjektivní kritéria specifikovaná u depresivní poruchy, jako pocity bezcennosti či myšlenky na smrt). Nicméně některé příznaky deprese, jako poruchy spánku, kognitivní deficit, psychomotorická aktivita, úzkost, poruchy prepulzní inhibice, sociální stažení a anhedonie, mohou být definovány i objektivně, a to i u zvířat, prostřednictvím změn v chování nebo měřením fyziologických funkcí. 176,177 Příkladem, co se týče užívání návykových látek, jsou podobné symptomy u zvířete a člověka po podání drogy, např. behaviorální stereotypie po amfetaminových stimulanciích. Konstruktivní validita zkoumá mechanismus vzniku onemocnění a vychází ze shodné funkce humánního a animálního organismu po stránce biologické, chemické, apod. Příkladem může 27

být rozvoj depresivního fenotypu vlivem chronického stresu či strukturální změny v mozku po dlouhodobém užívání návykové látky. 174,178 Prediktivní validita je citlivost modelu pro predikci klinické účinnosti testovaných léčiv. Ke zhodnocení prediktivní validity je nutné model validovat nejprve se známými klinicky účinnými léčivy. Shodnosti účinku léčby u zvířat a u lidí dosahuje např. model OBX, u kterého lze kompenzovat fenotyp deprese chronickým, ne však akutním, podáváním antidepresiv. 178 3.2.1. Preklinické modelování látkové závislosti V animálních modelech lze jasně izolovat jednotlivé fáze rozvoje a průběhu drogové závislosti. Preklinický výzkum tak umožňuje lépe pochopit neurobiologii drogové závislosti a poskytuje možnost studovat jednotlivé proměnné, které mají vliv na adiktivní chování. Takové studie umožňují analýzu změn v chování zvířat po expozici návykovým látkám i sledování hladin neurotransmiterů v příslušných mozkových drahách. Zvířecí modely mají samozřejmě své limity vycházející z rozdílnosti člověka a zvířete na všech úrovních. Rozvoj závislosti na návykové látce je komplexní proces ovlivněný mnoha faktory a animální model nemůže obsáhnout stav člověka ve všech aspektech. Většina animálních modelů vychází z předpokladu, že droga má pozitivní posilovací účinky a stimuluje tak subjekt k vyhledávání další dávky. Motivace k opakovanému užití drogy může být na druhou stranu i z důvodu jejího averzivního účinku za účelem odstranění nepříjemných pocitů vyvolaných abstinenčním syndromem po přerušení opakované aplikace látky. 179 Stimulem pro vyvolání touhy po další aplikaci drogy (craving) může být i prostředí nebo určitý podnět nebo objekt, např. hudba nebo injekční stříkačka, které drogu připomínají a dochází k nervovému podráždění stejných mozkových oblastí jako při samotném užití drogy. 180 Tyto asociace lze použít i v animálních modelech jako je podmíněná preference místa, kde má zvíře spojeno prostředí s pozitivním zážitkem (po aplikaci drogy) či averze k místu, kde se jako negativní zážitek používá např. abstinenční syndrom zvířete. Dále jsou popsány základní metody studia drogové závislosti v animálních modelech. 28

3.2.1.1. Operantní autoaplikace ( operant self-administration ) Tento model slouží ke sledování spontánního příjmu drogy u zvířat. Používají se speciální boxy umožňující zvířeti automatické získání dávky drogy. K získání drogy musí zvíře vyvinout určité úsilí, např. stlačit páčku nebo vsunout hlavu do tzv. aktivního otvoru (nosepoke). Droga může být aplikována perorálně s použitím kapátka či dávkovače granulí, pomocí intragastrické sondy nebo implantovaného intravenózního katétru. Tato metoda umožňuje sledování adiktivního chování ve více paradigmatech. Při časově omezených podmínkách (většinou dvouhodinové měření) se využívá tzv. fixed ratio (FR), kdy zvíře musí splnit určitý fixní počet akcí (stlačení páčky/aktivace nose-poke) k získání drogy, např. při protokolu FR1 odpovídá jedna dávka drogy jednomu stlačení páčky. Výsledky získané z tohoto uspořádání ukazují konzumatorní chování zvířete. 123,181 Ke sledování apetitivního chování slouží tzv. progressive ratio (PR), které nutí zvíře k těžším a těžším podmínkám pro získání další dávky drogy tak, že nárok na počet aktivních stisků se během sezení zvyšuje. 182 Čím větší úsilí vynaloží zvíře k získání drogy, tím je vyšší pozitivní posilující efekt a následně návykový potenciál látky. Progresivní paradigma tedy imituje ztrátu kontroly nad užíváním drog, což vede k eskalaci spotřeby drogy a v tomto ohledu je model považován za vysoce prediktivní. 183 V modelu operantní autoaplikace lze také navodit fázi abstinence a poté sledovat relaps (rozdíl v příjmu látky před a po abstinenci). Abstinenci a následný relaps lze namodelovat tzv. fází extinkce, tedy odebráním drogy při stálém přístupu zvířete do operantní klece a po dosažení určitého kritéria (limit pro snížení počtu aktivních a neaktivních odpovědí) následuje závěrečná fáze, tzv. reinstatement, kdy je zvířeti opět nasazena návyková látka (nebo spuštěn stimul spojený s příjmem drogy, např. světlo nebo zvuk) za účelem obnovení vyhledávání drogy. 184 Jako potenciálně lepší nástroj k vytvoření spontánního relapsu u hlodavců byl navržen model nucené abstinence 185,186, kdy je zvíře na určitou dobu umístěno do domácí klece bez přístupu k návykové látce a reinstatement probíhá při opětovném vrácení do operantní klece, avšak bez možnosti získání drogy. Počtem aktivních odpovědí se v tomto modelu definuje hledání další dávky drogy, z čehož lze vyvodit míru tendence k relapsu drogové závislosti u zvířete. 29

3.2.1.2. Intrakraniální autostimulace ( intracranial self-stimulation, ICSS) Model spočívá v implantaci elektrody do mozku zvířete tak, aby elektricky stimulovala oblasti motivace a odměny po příslušném chování. 187 Uspořádání a protokoly jsou pak podobné jako v modelu operantní autoaplikace. 3.2.1.3. Podmíněná preference místa ( conditioned place preference, CPP) V základním protokolu CPP se zvířata umístí do arény, která má dvě snadno rozeznatelné části nebo komory (například různé barvy nebo struktury podlahy). Zpočátku se zvířata pohybují po celé aréně, přičemž v jedné z komor získávají drogu, ve druhé vehikulum. Účinek drogy je tedy spojen se specifickým prostředím. V případě, že látka disponuje pozitivním posilovacím účinkem, budou zvířata dávat přednost té komoře, kde byla látka aplikována a stráví tam více času ve srovnání s kontrolní komorou. 188 3.2.1.4. Averze k místu ( place aversion ) Tento model je založen na stejném principu jako CPP, avšak s očekávaným opačným efektem. Negativním zážitkem může být např. elektrický proud nebo abstinenční syndrom. Zvíře s abstinenčním syndromem je opakovaně umístěno do jedné části arény, po několika zopakování mu je umožněno prozkoumat celou oblast. Zvíře se v tomto momentu vyhýbá prostředí, které má spojené s nepříjemným zážitkem abstinenčních příznaků. 189 3.2.1.5. Rozlišování látek ( drug discrimination, DD) Tento model je dalším příkladem operantního chování, kdy je zvíře nuceno vykonávat určitou akci, aby získalo odměnu. K získání odměny musí rozlišit látky, které jsou mu podávány. Například pokud zvíře stlačí páčku po intravenózní aplikaci drogy, získá potravinovou peletu, zatímco pokud stlačí páčku po aplikaci vehikula, nezíská žádnou odměnu. To ho motivuje k rozlišování mezi drogou a kontrolním roztokem. 190 Z uvedených modelů poskytuje nejvyšší translační potenciál operantní autoaplikace látek, popřípadě operantní intravenózní autoaplikace látek ( IV drug self-administration ; IVSA) v případě nitrožilního přístupu přes katétr napojený na zdroj drogy. Tento model umožňuje sledovat u jednotlivých zvířat příjem drogy, jeho eskalaci i motivaci pracovat pro další dávku. Díky tomu nejlépe napodobuje všechny fáze drogové závislosti, s nimiž se setkáváme u člověka. 30

3.2.2. Preklinické modelování deprese u laboratorních zvířat Deprese je symptomaticky heterogenní onemocnění a její klinický profil se u jednotlivých pacientů liší. Ani etiologie tohoto onemocnění není zcela jasná, proto je modelování v preklinickém výzkumu poměrně obtížné. Bohužel zatím neexistuje žádný animální model, který by splňoval všechna kritéria validit. Nicméně v preklinické praxi se používají animální modely, které se s humánní depresí shodují vždy alespoň v některých symptomech. Tyto depresi podobné symptomy se testují pomocí behaviorálních testů, které slouží jak k prokázání depresivního fenotypu v daném modelu, tak k posouzení účinnosti antidepresivní léčby. 3.2.2.1. Animální modely s pozměněným genetickým základem Genetické modely se postupně vyvíjejí spolu s neuroendogenními hypotézami o vzniku deprese. Z monoaminergní teorie vychází např. model 5-HT1A receptor knock-out myši 191 či noradrenaline transporter knock-out myši. 192 Na základě teorie o HPA dysfunkci byl vyvinut model corticotropin-releasing hormone receptor-1 (CRH-R1) knock-out myši 193, zatímco na základě teorie o nedostatku neurotrofinů vznikl model BDNF knock-out myši. Všechny tyto modely však selhaly v behaviorálních testech jako vyvýšené křížové bludiště ukazující anxiózní profil či nucené plavání a konzumace sacharózy, které odhalují depresi podobné příznaky. 194 Teorie o vzniku deprese na epigenetickém základě mají v animálních modelech slibnější výsledky. Meaney a Szyf popsali u morčat vliv mateřské péče po porodu na modulaci genové exprese. Morčata, která matka málo čistila, měla hodně metylovanou DNA a byla málo odolná vůči stresu, zatímco hodně čištěná mláďata měla DNA demetylovanou a acetylovanou, což vedlo k vysoké expresi genu pro glukokortikoidní receptor a k vysoké odolnosti vůči stresu. 195 Dále existují animální modely založené na šlechtění za účelem získání příslušného fenotypu, např. Flinders Sensitive rat Line (FSL), tento model vykazuje neurochemické změny v serotonergním, cholinergním a dopaminergním systému, avšak HPA osa a GABA-ergní systém zůstávají na fyziologické úrovni. Tato zvířata mají snížený apetit, zhoršené psychomotorické funkce, poruchy spánku a imunity, avšak hédonické a kognitivní funkce jsou v normě. Model FSL má vysokou prediktivní validitu a lze ho použít k měření účinnosti antidepresiv. 196,197 31

Dalším příkladem animálního modelu založeného na šlechtění je kmen potkana Wistar-Kyoto (WKY). Tento model se vyznačuje dysregulací HPA osy a zvířata prokazují hyperaktivitu jako reakci na stres a další projevy depresivního fenotypu v behaviorálních testech deprese. 196 3.2.2.2. Modely založené na vystavení vlivu stresu V klinických studiích je známým rizikovým faktorem vzniku deprese prožitý psychosociální stres, např. týrání v dětství. 198 Stres je proto často používán také v animálních modelech k vyprovokování depresivního fenotypu u zvířat. Aktivace stresové osy je dobře prokazatelná v modelu naučené bezmocnosti ( learned helplessness ), kdy zvířata dostávají mírné elektrické šoky, které nemohou vlastním chováním nijak ovlivnit ani z nepříjemné situace uniknout. Jedná se o nekontrolovatelný, neodstranitelný a nepredikovatelný stres. Stejným mechanismem funguje tento model u lidí. U dětí je bezmocnost způsobena týráním nebo nejasnými a měnícími se pravidly ve výchově. Výsledkem je deplece noradrenalinu v hipokampu a frontální kůře a to převážně v souvislosti s neprediktovatelností situace. Odolnost jedince vůči stresu je do jisté míry naprogramována na úrovni genů. Na podobném principu (vliv určitého stresoru) a s podobnými výsledky, ve smyslu dlouhodobých neurochemických, neuroimunitních, neuroendokrinních a behaviorálních změn, funguje model sociální porážky a model chronického mírného stresu. Model sociální porážky je založen na střetnutí dvou jedinců stejného hlodavčího druhu a kmene, při kterém dojde k boji mezi zvířaty. Opakovaně porážený jedinec postupně vyvine pod vlivem sociálního stresu depresi podobný fenotyp. Podobně, v modelu chronického mírného stresu jsou zvířata vystavena po dobu minimálně 2 týdnů, většinou ale déle (až měsíce) mírnému stresoru jako např. sociální izolace (nebo naopak domácí klec s velkým počtem zvířat), žíznění, hladovění, změny v cyklu tmy a světla, naklápění klece, apod. 199 Hlavním behaviorální projevem tohoto modelu je anhedonie zvířat. Všechny tyto modely založené na vlivu stresu reagují na chronickou, ne však akutní, léčbu antidepresivy. 200 V klinických studiích je dále dobře prozkoumán faktor stresu v kritickém vývojovém (prenatálním či brzkém postnatálním) období a jeho vliv na vývoj deprese, tzv. early life stress. Tímto stresem se rozumí např. ztráta rodiče. 201 Odloučení potomka od matky se často používá i jako model deprese u potkanů. 202 Chronický stres ve vývojovém období má negativní vliv na HPA systém a kognitivní funkce. K narušení vztahu mezi matkou a potomkem může sloužit kromě samotného odloučení také stresor ve formě nedostatečného 32

množství podestýlky. Důsledkem je nemožnost vytvoření hnízda a zahrabání potomků, což naruší sociální vazbu mezi matkou a potomky, kteří mají později v dospělosti sníženou schopnost učení, zhoršenou paměť a sníženou neurogenezi. 203,204 3.2.2.3. Farmakologické modely Aplikace reserpinu 205,206 je model vycházející z monoaminergní hypotézy. 149 Reserpin je dnes již zastaralé antihypertenzivum a antipsychotikum, které neselektivně redukuje hladiny monoaminů v mozku, což se u potkanů projeví anhedonií, sníženou lokomocí a hypotermií. 207,208 Dalším modelem je abstinenční syndrom po psychostimulanciích. Abstinenční syndrom po amfetaminech či kokainu se u zvířat projevuje některými aspekty depresivního fenotypu, jako je snížené vnímání odměny nebo imobilita v behaviorálních testech nuceného plavání u potkanů či v testu držení za ocas u myší. 131 Tyto modely mají dobrou fenomenologickou validitu, avšak postrádají prediktivní validitu a konstruktivní validita je sporná. 200 3.2.2.4. Rozvrat cirkadiánního rytmu Depresivní pacienti často trpí na poruchy spánku a mají porušený cirkadiánní rytmus, naopak stabilizace tohoto biologického rytmu má pozitivní vliv na depresivní symptomy. 209 Rozvrácení cirkadiánního rytmu vyvolává depresi podobné symptomy také u zvířat. 210 Tento model se používá jen ojediněle, má jednoznačnou fenomenologickou validitu, avšak prediktivní a konstruktivní validita zatím nebyla přesvědčivě prokázána. 200 3.2.2.5. Chirurgické modely: olfaktorická bulbektomie (OBX) Model OBX spočívá v chirurgickém odstranění čichových bulbů, čímž dochází k přerušení eferentních drah vedoucích do limbického systému a vyšších mozkových center. Toto narušení limbicko-hypotalamické osy má za následek řadu změn, jak v chování zvířete (což se projevuje maladaptací a zvýšenou iritabilitou, změnami v sociálním chování a sníženými kognitivními funkcemi), tak změny neuroendokrinní (zvýšená noční sekrece kortikosteronu), neurochemické (monoaminergní změny) a neuroimunitní. Tyto změny jsou podobné těm, které jsou pozorovány v klinické medicíně u pacientů s depresí. 211-213 Model OBX má vysokou prediktivní hodnotu, protože odpovídá pouze na chronickou léčbu antidepresiv, bez odezvy na akutní léčbu či léčbu jinými farmaky, stejně jako v klinických studiích. To je důvodem, proč je vhodný pro studium komorbidity deprese a závislosti a bude detailně popsán dále. 33

3.2.3. Vliv modelu olfaktorické bulbektomie na hladiny neurotransmiterů v mozku Role dopaminu u depresivní poruchy souvisí především s hypofunkcí mezolimbické dopaminergní dráhy, což se projevuje kromě depresivního stavu také anhedonií a narušeným vnímáním odměny. 214,215 Hypofunkce mezokortikální dráhy se pak projevuje sníženou iniciativou a apatií. 216 Tento stav bývá následně kompenzován up-regulací postsynaptických D2 receptorů. 217,218 Klinicky je známo, že mírné zlepšení funkce dopaminergního systému je alespoň částečně odpovědné za antidepresivní účinek některých léků, jako např. bupropion - selektivní inhibitor zpětného vychytávání NA a DA 219, sulpirid - antagonista presynaptických D2/D3 receptorů, pramipexol - agonista postsynaptických D2/D3 receptorů 213 či 7- OH- DPAT - agonista postsynaptických D3 receptorů. 214 Tato zjištění jsou podporována některými preklinickými studiemi, které ukázaly, že např. mutantní myši disc1-q31l (disruptedinschizophrenia-1 protein) vykazující známky depresivního chování, mají snížené hladiny dopaminu, serotoninu a noradrenalinu v NAc. 220 Nicméně základní hladiny DA se u depresivního fenotypu velmi liší v různých oblastech mozku i mezi jednotlivci navzájem, což bylo prokázáno v preklinických studiích zaměřených na zkoumání DA u OBX zvířat, jejichž výsledky se neshodují. 213 Bylo prokázáno, že DA potlačuje pre-pro-enkefalinovou (ENK) genovou expresi ve striatu, což tedy může sloužit jako ukazatel dysfunkce DA. Zvýšené hladiny tohoto ukazatele byly nalezeny ve striatu OBX zvířat 221,222, což odpovídá i výsledkům jiné studie, kde byly ve striatu OBX potkanů detekovány snížené hladiny DA. 223 V rozporu s těmito daty stojí studie Masini a kol., který zaznamenal zvýšené bazální hladiny DA ve ventrálním a dorzálním striatu u OBX zvířat. 224 V bazolaterární amygdale a dorzálním hipokampu nebyl nalezen v hladinách DA žádný rozdíl mezi OBX a SHAM skupinami. 225 Možným vysvětlením rozdílů ve výsledcích by mohly být různé kmeny potkanů či genderové rozdíly, avšak tyto faktory nebyly dosud zkoumány. Jako další měřítko fungování dopaminergního systému může sloužit hustota dopaminergních receptorů. U depresivních pacientů 216,226,227 a u zvířat v modelu naučené bezmocnosti 228 byla v limbickém systému zaznamenána zvýšená denzita a senzitivita presynaptických D2/D3 receptorů. Aktivací těchto receptorů dochází k inhibici syntézy a uvolňování DA. Změny ve funkci DA-receptorů byly zkoumány také v modelu OBX, kdy tato zvířata vykazují zvýšenou denzitu presynaptických D1 a D2 receptorů ve ventrálním striatu ve srovnání s kontrolní skupinou. 221 Nicméně Sato a kol. ve své autoradiografické studii na myších žádný rozdíl mezi 34

skupinami neprokázali. 229 Ve studii zaměřené na expresi postsynaptického D1 receptoru se prokázala snížená exprese tohoto receptoru ve striatu u OBX s následnou kompenzací po chronickém podávání antidepresiv, avšak bez odpovědi na aplikaci kokainu, jakožto inhibitoru monoaminergního zpětného vychytávání. 230 V psychopatologii deprese hraje klíčovou roli také serotonin, respektive dysfunkce serotonergního systému, 231,232 který zajišťuje především emocionální stabilitu a ovlivňuje kognitivní funkce, sexuální chování, reaktivitu smyslů, apetit, spánek a citlivost na bolest. 49,50 Porucha serotonergní signalizace u OBX zvířat je dokonce jedním z klíčových aspektů validity tohoto modelu. 213 U OBX myší i potkanů byly ve většině studií prokázány snížené hladiny serotoninu v mnoha oblastech mozku souvisejících s depresí, jako prefrontální kůra, mesencefalon, NAc, hipokampus, corpus striatum a bazolaterální amygdala. 213,225,233,234 Ne všechny studie se však shodují, např. Watanabe a kol. zjistili u OBX zvířat naopak zvýšené hladiny serotoninu v některých limbických oblastech (v cingulu, fasciculu medialis telencephali, hipokampu a talamu). 235 Také uvolňování 5-HIAA (5-hydroxyindoloctová kyselina) z NAc je po odstranění bulbů sníženo, avšak při mírném stresovém stimulu se naopak výrazně zvyšuje. 236 K hyposerotonergním depresivním symptomům dále přispívají faktory jako kompenzační 5-HT hyperinervace PFC a zvýšený počet 5-HT transportérů, které byly zjištěny u OBX zvířat. 211,213 Nedostatek serotoninu v CNS navozený OBX operací je možné zvrátit pomocí chronického podávání antidepresiv. Antidepresiva typu SSRI (selektivní inhibitory zpětného vychytávání serotoninu) normalizují nejen hladiny serotoninu, ale i ostatních neurotransmiterů a v souvislosti s tím upravují i změny v chování a imunitní dysfunkce, typické pro OBX model. 211,213 U OBX zvířat byla dále prokázána zvýšená hustota 5HT2A receptorů na membráně krevních destiček se sníženou citlivostí na stimulační účinky exogenního 5HT. 213,237 I tyto změny lze normalizovat chronickým podáváním antidepresiv. Zdánlivý rozpor mezi počtem receptorů a jejich sníženou funkční aktivitou by mohl být odrazem vadného spojovacího mechanismu mezi receptorem, fosfatidylinositolem a systémem druhých poslů. 237,238 Obdobně v klinických studiích bylo u pacientů s depresí prokázáno, že hustota 5HT2A receptorů na destičkových membránách je zvýšena 238, zatímco koncentrace serotoninu v plazmě je snížena. 239 Olfaktorická bulbektomie má vliv také na hladiny noradrenalinu v různých oblastech mozku. Noradrenalin je neurotransmiter zodpovědný za kognitivní a motorické funkce, za koordinaci 35

volních pohybů a za emoce a náladu. 240 Depresi podobný stav je v OBX modelu charakterizován sníženými hladinami a zmenšeným obratem NA, zvýšenou hustotou presynaptických alfa-2 receptorů a naopak sníženou denzitou postsynaptických alfa-2 receptorů a dále pak dysfunkcí NA nervových zakončení a omezenou dostupností NA do synapsí. 241 U OBX potkanů byly dále zaznamenány snížené hladiny NA ve ventrálním a dorzálním striatu 224, frontální kůře a hypotalamu. 213 V bazolaterární amygdale a dorzálním hipokampu nebyl nalezen žádný rozdíl v hladinách NA mezi OBX a SHAM zvířaty. 225 Další změny v noradrenergním systému u OBX zahrnují zvýšenou denzitu beta-adrenoreceptorů v lymfocytech, amygdale 241 a v korových oblastech mozku. 242 Tento zvýšený počet receptorů je chápán jako kompenzační mechanismus snížených hladin NA, přičemž je ale senzitivita těchto receptorů utlumená. Tyto změny v počtu a funkci receptorů se shodují s výsledky klinických studií sledujícím tyto parametry v lymfocytech a krevních destičkách u pacientů s depresí 243,244 a také ve studiích post-mortem v mozcích sebevrahů. 245 U OBX je rovněž přítomna silná nerovnováha mezi excitačními a inhibičními neurotransmiterovými systémy, 241 což je podpořeno zjištěním, že koncentrace inhibičního NT glycinu je u OBX zvýšená 246, zatímco exctitačních NT, jako glutamátu a aspartátu, snížená. 247 Olfaktorickou bulbektomií je silně ovlivněn glutamátergní (GLU) systém, protože samotný chirurgický zásah přeruší glutamátergní neurony vedoucí z čichových bulbů, což pravděpodobně zodpovídá za behaviorální deficity OBX zvířat. Hlavní funkcí ionotropních glutamátergních receptorů (N-methyl-D-asparagová kyselina, NMDA) je fyziologické zvládání stresu a správné fungování krátkodobé paměti. Dysfunkce glutamátergního systému u OBX zvířat může sloužit k vysvětlení typických změn v jejich chování, tedy maladaptace ve stresujícím prostředí, poruchy učení a zhoršení stavu paměti, pozorovaných u potkanů v behaviorálních testech po odstranění jejich čichových bulbů. 248 Tyto poruchy chování pravděpodobně souvisí s dysfunkcí NMDA receptoru konkrétně v hipokampu a amygdale. 249 Snížená denzita NMDA receptorů byla nalezena u OBX hlavně v prefrontální kůře, amygdale a v talamu. 248,250 V kortexu OBX zvířat byly dále zjištěny snížené extracelulární hladiny glutamátu 247,251,252, zredukované množství vazebných míst pro GLU 252 a snížená vazebná afinita NMDA receptorů. 253 Naopak zvýšená funkce NMDA receptoru byla nalezena u OBX zvířat v amygdale. 254 V testu otevřeného pole (neznámé stresující prostředí) byly naměřeny zvýšené hladiny GLU u OBX potkanů, a to pouze v prvních 10 minutách, což odpovídá i 36

době, kdy OBX zvířata projevují typické hyperaktivní chování v tomto testu. Toto specifické chování OBX zvířat lze normalizovat pomocí NMDA antagonisty dizocilpinu. 255 V klinických studiích byly u depresivních pacientů nalezeny technikou MRI naopak vysoké hladiny glutamátu a jeho metabolitů v okcipitálním kortexu a ve frontálním kortexu post mortem. 256 Podobně v animálním modelu chronického mírného stresu byly prokázány zvýšené hladiny glutamátu v hipokampu a amygdale. 257 V tomto modelu i v klinických studiích měl ketamin, antagonista NMDA, rychlý antidepresivní účinek. 258 Opačné účinky než excitační glutamát má inhibiční NT GABA. GABA-ergní systém se u OBX zvířat jeví jako hyperaktivní a to zejména v kůře amygdaly, kde je zvýšený i obrat a zvýšená denzita GABA-A receptorů. 178,213 K up-regulaci GABA-A dochází také ve frontální kůře OBX zvířat, naopak počet GABA-B receptorů je v tomto regionu snížen. 178 Také allopregnalon, jeden z nejsilnějších endogenních allosterických modulátorů GABA-A je zvýšen ve frontální kůře a v amygdale u OBX zvířat. 259 Podobně jako u glutamátu, klinické studie zkoumající hladiny GABA u depresivních pacientů, docházejí k opačným výsledkům, než jaké se prokázaly v modelu OBX. Pacienti s depresí vykazují nízké hladiny GABA v plazmě 260 a v okcipitálním kortexu, což lze normalizovat pomocí SSRI. 261,262 Dále studie post mortem ukázaly ztrátu GABA-ergních interneuronů v prefrontální kůře 263 a snížené koncentrace dekarboxylázy kyseliny glutamové. 264 Nicméně GABA-ergní neurotransmise je velmi plastická a prochází dynamickými změnami převážně v reakci na akutní a chronický stres. 265 Tato zjištění mohou ale potenciálně limitovat validity OBX modelu. Obr. 4 znázorňuje příklad propojení neurotransmiterových systémů a jejich vliv na patofyziologii některých duševních poruch, včetně deprese. 37

Obrázek 4: Schematické znázornění anatomických a funkčních vztahů mezi prefrontální kůrou a mozkovým kmenem monoaminergních jader Legenda: Prefrontální kůra (PFC) je inervována z monoaminergních jader mozkového kmene (ventrální tegmentální oblast, VTA; locus coeruleus, LC; raphe nuclei, RN) prostřednictvím dopaminu (DA), noradrenalinu (NE) a serotoninu (5-HT) přes aktivaci příslušných receptorů (D1, D2, alfa-1-adrenergní, 5-HT1A, 5-HT2A) a zároveň vysílá zpětnou signalizaci k těmto jádrům. Reciproční spojení mezi PFC a monoaminergními jádry je významné v patofyziologii a léčbě deprese. Zdroj: Hensler JG. Catecholamine/Serotonin interactions: systems thinking for brain function and disease. Adv Pharmacol. 2013;68:167-97. 38

3.2.4. Komorbidita deprese a závislosti v preklinických studiích Jako vhodný animální model pro studium komorbidity deprese a látkové závislosti se jeví model OBX díky svým neurochemickým abnormalitám v neuronálním okruhu mozku souvisejícím s vnímáním odměny, což přispívá ke sklonu k užívání návykové látky. 122 Kombinace modelů OBX a IVSA se osvědčila ve studiích zaměřených na amfetamin 122, MET 123, agonistu CB1 receptoru WIN 124 a kokain. 125 Přestože jeden z hlavních projevů deprese, jak u člověka, tak v modelu OBX, je anhedonie, depresivní jedinci zároveň disponují vyšší vulnerabilitou k příjmu drogy. 122 Vysvětlením tohoto současného výskytu anhedonie a vyššího příjmu návykové látky by mohl být rozdíl mezi konzumatorním a apetitivním chováním. Konzumatorní chování vede k uspokojení základních potřeb (jídlo, pití, sexuální chování, příjem drogy), apetitivní chování slouží ke zkoumání něčeho nového (učení, motivace, vyhledávání drogy). 266 Jak depresivní stav, tak amfetaminová autoaplikace potlačují konzumatorní chování (příjem potravy) a naopak zvyšují apetitivní chování. 267 Tento jev reflektuje změny v mezolimbických oblastech mozku, kde jsou centra pro obě tato chování. 268 Konkrétně v modelu OBX dochází v mezolimbických oblastech mozku k dysregulaci DA systému vlivem up-regulace dopaminergního receptoru spolu s enkefalinovou plasticitou (zvýšení pre-pro-enkefalinové genové exprese ve ventrálním striatu) 221, což má za následek na jednu stranu snížení transmise dopaminu projevující se anhedonickými symptomy, na stranu druhou, supersenzitivita dopaminergních receptorů a enkefalinová hyperexprese zvyšují posilující vlastnosti návykových látek a tudíž i pravděpodobnost vzniku drogové závislosti. 269 3.2.4.1. Závislost na amfetaminových stimulanciích v modelech deprese u zvířat Většina preklinických studií zaměřených na studium komorbidity deprese a závislosti na amfetaminových stimulanciích využívá právě model OBX. Jako model deprese se osvědčila i samotná aplikace amfetaminových stimulancií a následné odnětí. 131 OBX zvířata prokazují vyšší vulnerabilitu k příjmu amfetaminových stimulancií v modelu IVSA v závislosti na dávce. Nízká dávka amfetaminu (0,10 mg/kg/infúze) nebo MET (0,08 mg/kg/infúze) vede k vyšší autoaplikaci látky u OBX potkanů v porovnání s kontrolní skupinou 122,123, zatímco poměrně vysoká dávka amfetaminu (0,25 mg / kg / infuze) již nevede 39

k rozdílnosti v příjmu mezi skupinami OBX a SHAM 122, což by se dalo vysvětlit přítomností abstinenčního syndromu po vysoké dávce. OBX potkani si také začínají amfetamin aplikovat dříve (již od prvního dne IVSA) a s vyšší frekvencí ve srovnání s kontrolní skupinou 270, což se vysvětluje rozdílným dopaminergním fungováním na základě zvýšené denzity a senzitivity D2 receptorů ve ventrálním striatu u OBX zvířat. Navíc současné podání antagonisty D2 receptoru sulpiridu vede ke snížení počtu aktivních odpovědí, protože antagonizace tohoto receptoru ruší posilující účinek amfetaminu. 122 Toto zjištění je podpořeno také klinickou studií u depresivních pacientů. 271 Další hypotézy vysvětlující rychlejší akvizici a vyšší autoaplikované dávky drogy, jako lepší kapacita učení nebo zvýšená lokomoce OBX zvířat, byly vyvráceny. V experimentech zaměřených na učení a paměť prokázaly OBX myši i potkani naopak deficitní kognitivní schopnosti 178,272 a v experimentech zaměřených na lokomoci projevují sice OBX zvířata hyperlokomoci, avšak pouze ve stresu, např. v neznámém prostředí za specifických podmínek prudkého osvětlení, a to pouze v prvních minutách testování. 273,274 Navíc v IVSA experimentech se nepotvrdil rozdíl mezi OBX a SHAM ve frekvenci použití neaktivního nose-poke či páčky, čímž se sleduje právě hyperlokomoce zvířat. 122,124 U OBX zvířat bylo pozorováno také zvýšené vyhledávání kokainu, avšak pouze v modelu IVSA 125, nikoliv v modelu CPP 275, zde se však nabízí jako vysvětlení mírně deficitní paměť OBX zvířat. 276 Jako další animální model pro studium komorbidity deprese a závislosti byl použit model deprese získaný šlechtěním, SwLo (Swim Low-active) potkani, projevující depresivní fenotyp nízkou aktivitou v testu nuceného plavání. Takto vyšlechtěná zvířata vykazují zvýšenou autoaplikaci amfetaminu a kokainu per os 277, což se však nepotvrdilo při příjmu těchto látek intravenózně. 278 Jak již bylo zmíněno, odnětí drogy či její chronické užívání vede k řadě příznaků shodných s projevy u depresivních pacientů (depresivní nálada, anhedonie apod.). Stejného výsledku lze dosáhnout u zvířat po odnětí psychostimulačních látek. 131,279 Po vysazení amfetaminu vykazují potkani zvýšenou imobilitu v testu nuceného plavání a myši v testu visu za ocas, což je považováno za depresivní symptomatologii. 280 Odnětí kokainu (méně častou amfetaminu) se projevuje úzkostným chováním zvířat, což se prokázalo v testu vyvýšeného křížového bludiště 281, vysokofrekvenční ultrazvukovou vokalizací 282, obranným zahrabáváním se 283 či 40

úlekovou reakcí. 284 Dalšími projevy odnětí drogy shodujícími se s depresivními projevy jsou anhedonie projevující se sníženým zájmem o sladký roztok 285, dále ztráta sexuální apetence 285, poruchy spánku 286 nebo zhoršená péče o srst. 287 Jedná se o reverzibilní stav a po opětovném nasazení psychostimulační látky dochází k normalizaci projevů, např. znovunavrácení zájmu o sladký roztok, jak bylo potvrzeno po opětovném nasazení kokainu. 288 Kromě behaviorálních projevů se odnětí psychostimulačních látek shoduje s depresí i po stránce neurochemické a endokrinní. Jedná se konkrétně o změny v systému noradrenergním (zvýšená vazba na NA-transporter, desenzitizace alfa-2 receptorů) 289, serotonergním (změna citlivosti 5-HT2A, 5-HT1B, downregulace 5-HT3, snížené hladiny extracelulárního 5-HT) 290,291 a dopaminergním (snížená vazba na DA transportér, downregulace D1, up-regulace D2, snížené hladiny DA). 292 Dále byly u těchto zvířat pozorovány zvýšené hladiny kortikosteronu, adrenokortikotropního hormonu (ACTH) 293 a faktoru uvolňujícího kortikotropin (CRF) v limbickém systému 294 jako projev dysfunkce HPA osy. Souvislost mezi depresí a odnětím psychostimulační látky navíc doplňuje účinnost různých antidepresiv, která zmírňují projevy abstinenčních příznaků. 295 3.2.4.2. Závislost na kanabimimetických látkách v modelech deprese u zvířat Většina studií zaměřených na zkoumání role endokanabinoidního systému ve zvířecích modelech deprese zaznamenala sníženou aktivitu tohoto systému. 296,297 Blokáda kanabinoidních CB1 receptorů, ať už farmakologická nebo genetická, indukuje u zvířat stav, který je podobný melancholické depresi u člověka se symptomy, jako je snížení příjmu potravy, zvýšená úzkost a přecitlivělost na stres. 104 Naopak stimulace CB1 receptorů vyvolává stejný antidepresivní účinek jako např. antidepresiva desipramin a fluoxetin v modelech deprese u potkana, tzn. normalizuje stav vzniklý v modelu OBX 298 a snižuje imobilitu v testu nuceného plavání. 299 Tyto antidepresivní účinky lze opět zvrátit podáním antagonisty CB1 receptorů, což vede zpět k depresivnímu fenotypu. 299 Dále bylo prokázáno, že aktivace CB1 receptoru působí preventivně proti kognitivním deficitům ve zvířecím modelu deprese vyvolané stresem. 300 Tyto údaje svědčí o tom, že endokanabinoidní systém je jedním z mechanismů zapojených do patofyziologie vzniku a průběhu deprese a tedy do budoucna i možným cílem vývoje nových antidepresiv. 132 41

4. Mezipohlavní rozdíly v charakteristice látkové závislosti Interindividuální rozdíly mezi pacienty v průběhu látkových závislostí mají mnoho příčinných faktorů. Jedním z těchto faktorů je genderová odlišnost. Drogová závislost má u žen a mužů odlišné charakteristiky, počínaje volbou návykové látky a její dávkou, přes zahájení a průběh, až po tendenci k relapsu v období abstinence. Příčinou těchto pohlavních rozdílů je nejen vliv pohlavních hormonů, ale pravděpodobně také genetické odlišnosti na základě pohlavních chromozomů, odlišná farmakokinetika a farmakodynamika a v klinické praxi v neposlední řadě hraje velký vliv socio-kulturní pozadí. Ať už je příčina jakákoliv, pohlavní odlišnosti jsou v problematice drogové závislosti prokázané a měly by se promítnout ve strategii léčby. Tuto problematiku zpracovává přehledový článek Pohlaví a drogová závislost: od animálních modelů ke klinické praxi. Citace: Amchová P., Kučerová J. Pohlaví a drogová závislost: od animálních modelů ke klinické praxi. Česká a Slovenská Psychiatrie, Praha: Česká lékařské společnost J.E Purkyně, 2015, roč. 111, č 2, s. 72-78. ISSN 1212-0383. 42

43

44

45

46

47

48

49

5. Cíle práce Cílem této práce je prozkoumat komorbiditu deprese a látkové závislosti s využitím zvířecích modelů na behaviorální i neurochemické úrovni. Dalším cílem je zjištění mezipohlavních rozdílů v relapsu závislosti v translačním operantním modelu metamfetaminové závislosti. Dílčí cíle: 1. Zavést potkaní model komorbidity deprese a kanabinoidní závislosti, kde bude depresivní fenotyp navozen olfaktorickou bulbektomií a drogová závislost modelem operantní autoaplikace syntetického agonisty CB1 receptoru WIN55-212,2. 2. Zaznamenat a zhodnotit případné odlišnosti v hladině dopaminu v nucleus accumbens shell v potkaním modelu deprese navozené olfaktorickou bulbektomií za bazálních podmínek a dále zhodnotit změny hladin dopaminu po akutní dávce WIN55-212,2 pomocí metody in vivo mikrodialýzy. 3. Zaznamenat a zhodnotit bazální profil hladin dopaminu, serotoninu, glutamátu a GABA a některých jejich metabolitů v potkaním modelu olfaktorické bulbektomie a sledovat změny hladin těchto neurotransmiterů po akutní dávce metamfetaminu prostřednictvím metody in vivo mikrodialýzy. 4. Zaznamenat a zhodnotit mezipohlavní rozdíly v příjmu a relapsu metamfetaminové závislosti v modelu operantní autoaplikace metamfetaminu po periodě nucené abstinence u samců a intaktních samic potkanů. 50

Provedené studie: Studie 1: Operantní autoaplikace WIN55-212,2 v modelu deprese navozené olfaktorickou bulbektomií a in vivo mikrodialýza po akutní dávce WIN55-212,2 (Cíl 1 a 2). Studie 2: In vivo mikrodialýza po akutní dávce metamfetaminu v modelu olfaktorické bulbektomie (Cíl 3). Studie 3: Operantní autoaplikace metamfetaminu a modelování relapsu po období nucené abstinence u potkaních samců a samic (Cíl 4). 51

6. Materiál a metody Konkrétní metodiky jsou detailně popsány u jednotlivých studií, tato část si klade za cíl popsat obecněji v souvislostech hlavní metodologické přístupy, které tato práce využívá. Experimenty byly provedeny v souladu s platnými právními předpisy o ochraně zvířat a doporučeními Evropské komise pro práci s laboratorními zvířaty. Protokoly experimentů byly řádně schváleny Odbornou komisí uživatelského zařízení Lékařské fakulty Masarykovy univerzity, 3. lékařské fakulty Univerzity Karlovy a Ústavu biomedicíny na Univerzitě v Cagliari (Itálie) a příslušnými státními orgány. Byly učiněny všechny kroky vedoucí k redukci počtu zvířat použitých v experimentech a k minimalizaci jejich nepohodlí a utrpení. 6.1. Model deprese navozený olfaktorickou bulbektomií (OBX) 6.1.1. Chirurgická příprava pro model OBX u potkana Zvířata podstoupila chirurgický zákrok v celkové anestezii po předchozím randomizovaném rozdělení do skupin OBX a SHAM. U skupiny OBX byl po částečném vyholení lebky proveden řez směrem k čumáku, odstraněny měkké pokrývky lební a vyvrtány dva otvory o průměru 2 mm ve vzdálenosti 7 mm či 7,5 mm od bregma a 1,5 mm či 2 mm laterálně od střední čáry v závislosti na váze zvířete (230 ± 10 či 260 ± 10 g). U skupiny OBX byly těmito otvory nasáty čichové laloky (bulby) pomocí tupé injekční jehly připojené na vývěvu dle standardního postupu. 241 K zastavení krvácení byly otvory vyplněny hemostatickým materiálem, rána byla ošetřena antibiotickým zásypem a sešita. U skupiny SHAM se postupovalo podle stejné metodiky pouze bez odstranění bulbů. Po dobu rekonvalescence bylo se zvířaty denně manipulováno (tzv. handling ) z důvodu zabránění rozvoje agresivního chování. 211-213 Rekonvalescence byla stanovena na 20 dní, což je doba potřebná k vytvoření depresivního fenotypu a taktéž doba pro zotavení se po zákroku. K ověření účinnosti metody se použil lokomotorický test a test preference sacharózy. Po skončení všech experimentů byla provedena pitva a vizuální kontrola k ověření správnosti provedení operace a zvířata s neúplným odstraněním obou bulbů anebo s poškozením jiné části mozku byla z analýzy vyloučena. Obr. 5 znázorňuje mozek potkana před olfaktorickou bulbektomií (5A) a po odstranění bulbů (5B). 52

Obrázek 5A: Mozek potkana s čichovými bulby Obrázek 5B: Mozek potkana po OBX 6.2. Model látkové závislosti navozený operantní autoaplikací 6.2.1. Chirurgická příprava pro model IVSA u potkana Zvířata podstoupila chirurgický zákrok v celkové anestezii, při kterém jim byl zaveden přes vena jugularis externa do pravé srdeční síně permanentní intrakardiální silastický katétr. Vnější konec katétru byl veden podkožním tunelem a vyúsťoval ven v oblasti mezi lopatkami. Katétr sloužil během experimentu k připojení zvířete na infuzní pumpu s drogou, a to přes vodič s otočným ložiskem umožňující volný pohyb zvířete (Obr. 6 a 7). Katétry byly proplachovány denně heparinizovaným cefazolinem z důvodu zabránění infekce a ucpání katétru. Rekonvalescence po zákroku trvala 3-5 dní, zvířata byla ustájena samostatně a s jídlem a vodou ad libitum. Během rekonvalescence byly sledovány změny chování a tělesné hmotnosti. Pokud došlo k poškození nebo ucpání katétru, bylo zvíře z experimentu vyloučeno. 53

Obrázek 6 : Připojení zvířete na vodič Obrázek 7: Infuzní pumpa 6.2.2. Protokol experimentu IVSA WIN55,212-2 (WIN) Experiment probíhal denně po dobu 120 min, 7 dní v týdnu, během temné fáze obráceného světelného režimu. Zvířata byla umisťována do standardních experimentálních boxů (29,5x32,5x23,5 cm, Med Associates, Vermont, USA) řízených počítačovým softwarem MED Associates MED-PC software Med Associates, Vermont, USA). Každý box byl vybaven 2 páčkami definovanými jako aktivní a pasivní, zvukovým a světelným zdrojem. Po stisknutí aktivní páčky následovalo: zhasnutí červeného světla, rozsvícení bílého světla nad páčkou, zatažení obou páček a aktivace infuzní pumpy dávkující WIN. Stlačením neaktivní páčky se infuzní pumpa nespustila, úkon se však započítal, což sloužilo k určení indexu bazální úrovně aktivity. Test probíhal po celou dobu experimentu v protokolu FR1, tzn. každé správné provedení úkolu bylo odměněno injekcí WIN, po dobu 30 dnů. Poté následovala fáze extinkce, tedy výměna WIN za vehikulum (1% Tween 80 ve fyziologickém roztoku). Ostatní experimentální parametry byly ponechány beze změny, stisknutí aktivní páčky vedlo k infuzi 0,1 ml vehikula doprovázeného stimulačním světlem. Výsledky z této fáze vypovídají o chování zvířat bez účinku drogy. Pokud počet stisků aktivní páčky klesl 10 a celkový počet stisků (aktivní i neaktivní) 20, bylo chování definováno jako ztráta motivace aplikovat si drogu. 54

6.2.3. Protokol experimentu IVSA MET Experiment probíhal denně po dobu 90 min, 7 dní v týdnu, během temné fáze obráceného světelného režimu. Zvířata byla umisťována do standardních experimentálních boxů (30x25x30 cm, Coulbourn Instruments, USA) řízených počítačovým softwarem Graphic State Notation 3.03 (Coulbourn Instruments, USA). Každý box byl vybaven 2 otvory ( nose-poke ) definovanými jako aktivní a pasivní, zvukovým a světelným zdrojem. Po vsunutí hlavy zvířete do aktivního otvoru následovalo: blikání světla, aktivace infuzní pumpy dávkující MET a poté desetisekundový interval doprovázený zhasnutím světla, tzv. time-out, kdy je znemožněna aplikace další dávky, přestože aktivita zvířete je monitorována. Vložení hlavy do neaktivního otvoru infuzní pumpu nespustilo, bylo však zaznamenáváno pro určení indexu bazální úrovně aktivity. Test probíhal v protokolu FR1 po dobu 14 dnů. Poté přešli potkani do fáze nucené abstinence, tzn. po dobu následujících 14 dnů byli umístěni v domácích klecích bez přístupu k droze. Fáze reinstatement probíhala opět v IVSA kleci po dobu 90 minut, avšak bez možnosti získání drogy. Aktivace aktivního nose-poke byla hodnocena jako hledání další dávky drogy, zatímco aktivace neaktivního nose-poke jako nespecifická pohybová a průzkumná činnost. Pro vyhodnocení relapsu byl počet aktivních odpovědí převeden na procento z průměrného bazálního počtu behaviorálních odpovědí zvířete během doby tréninku. 6.2.4. Protokol experimentu autoaplikace sladkých pelet Tento experiment byl navržen za účelem stanovení příjmu přirozené odměny a zhodnocení mezipohlavních rozdílů. Test byl proveden ve stejných experimentálních klecích jako IVSA MET (Obr. 8). Podle protokolu FR1 sloužil nose-poke k aktivaci podavače sladkých pelet a každá aktivace vedla k dodání 1 pelety (BioServ, sweet dustless rodent pellets, F0021- Purified Casein Based Formula 45 mg). Experiment probíhal denně po dobu 30 minut během 10 dní v temné fázi obráceného světelného režimu a operantní klec byla po celou dobu osvětlena. 55

Obrázek 8 : Experimentální box: po stranách otvory nose-poke, uprostřed podavač pelet 6.3. Metoda in vivo mikrodialýzy Mikrodialýza je mini-invazivní technika umožňující monitorování tkáňových metabolitů, v našich studiích konkrétně DA po akutní aplikaci WIN a DA, 3-methoxytyramin (3-MT), 3,4- dihydroxyfenyloctová kyselina (DOPAC), homovanilová kyselina (HVA), 5-HT a 5- hydroxyindoloctová kyselina (5-HIAA), glutamát a GABA po akutní aplikaci MET, v extracelulární tekutině pomocí implantované mikrodialyzační sondy na přesně stanoveném místě (pro oba naše experimenty byla zvolena stěna NAc = NAc shell). V tomto místě se do tkáně vloží mikrodialyzační sonda, která je tvořena semipermeabilní membránou a vstupním a výstupním dutým vláknem. In vivo mikrodialýza pak umožňuje sledování hladin testovaných látek a neuromediátorů v mozku u volně se pohybujícího zvířete. 301 6.3.1. Chirurgická příprava pro metodu in vivo mikrodialýzy Zvířata podstoupila chirurgický zákrok v celkové anestezii, při kterém jim byl po částečném oholení hlavy, dezinfekci kůže a uchycení ve stereotaktickém přístroji proveden řez s následným odstraněním měkkých pokrývek lebních. Do lebky se podle příslušných stereotaktických koordinát vyvrtal otvor v místě NAc shell: A: +2,0 mm, L: ±1,2 mm od bregmy, V: 6,2 mm od kosti týlní. 302 Tímto otvorem byla zavedena mikrodialyzační sonda, 56

která se následně upevnila zubním cementem. Během této operace byl zároveň zvířatům implantován intravenózní katétr (stejný postup jako u IVSA) pro budoucí i.v. aplikaci drogy. Rekonvalescence po zákroku trvala 48 hodin. Zvířata se špatným umístěním sondy byla vyloučena ze statistické analýzy. Kontrola proběhla po skončení experimentu pomocí barvení kresylovou violetí jednotlivých koronárních mozkových řezů. 6.3.2. Protokol experimentu in vivo mikrodialýzy Experiment byl proveden nejprve za bazálních podmínek, později pod vlivem akutní dávky drogy (WIN 0,3 mg/kg, i.v.; MET 5 mg/kg, i.p.) nebo vehikula (fyziologický roztok 2 ml/kg). U každého zvířete byla mikrodialyzační sonda promývána Ringerovým roztokem a ve dvacetiminutových intervalech z ní byl odebírán dialyzát (Obr. 9). K získání dat o bazální hodnotě neurotransmiterů se odebraly 3 vzorky před aplikací, poté se podala bolusová dávka WIN/MET/VEH a pokračovalo se v odběrech v pravidelných intervalech po dobu 3 hodin od aplikace. Získané vzorky byly analyzovány metodou HPLC-MC ( high-performance liquid chromatography combined with mass spectrometry ), která slouží ke kvantitativnímu stanovení hladin neurotransmiterů a jejich metabolitů. 303 Obrázek 9: Mikrodialyzační sonda: umístění v lebce zvířete a proces odběru dialyzátu (Zdroj: https://www.basinc.com/products/iv/md.html) 57

6.4. Behaviorální testy 6.4.1. Test preference sacharózy Test preference sacharózy je metoda, která se používá k detekci an/hedonického chování u zvířat. V testu se posuzuje zájem zvířete o sladký nápoj ve srovnání s vodou. U zvířat s depresivním fenotypem se předpokládá nižší příjem sacharózy, což reprezentuje anhedonii. Test byl proveden v domácí kleci. Zvířata byla ustájena samostatně a měla volný přístup k potravě i vodě. Potkani podstoupili 24 -hodinový trénink pro adaptaci na pití ze dvou lahví (obě láhve byly naplněny vodou). V samotném testu pak byla jedna láhev vyměněna za 2% roztok sacharózy. Pro vyloučení chyby v preferenci jedné strany se umístění lahví se sacharózou a vodou u zvířat střídalo a po 4h se strany vyměnily. Láhve byly zváženy po 4 a 24 hodinách. Preference se vypočítala jako procento z příjmu sacharózy v porovnání k celkovému množství vypité kapaliny, tedy preference sacharózy = sacharóza/ (voda + sacharóza) x 100. 6.4.2. Test pohybové aktivity Tento test se používá k testování úrovně obecné pohybové aktivity, ale i úzkostného či depresivního chování. Protokol experimentu pro testování pohybové aktivity OBX zvířat U depresivního fenotypu se jako výsledek tohoto testu předpokládá hyperlokomoce zvířat jakožto projev maladaptace v cizím a jasně osvětleném prostředí. Potkani byli umístěni jednotlivě do arény o velikosti 42x30x60cm vybavené infračervenými čidly pro snímání pohybu. Použita byla aparatura Digiscan Animal Activity Analyser (Omnitech Eletronics, USA). Pro zvýšení intenzity osvětlení byly diagonálně v protilehlých rozích umístěny dvě 90W žárovky a vnější strany stěn byly pokryty hliníkovou fólií. Během 10 minut byla měřena horizontální aktivita, vertikální aktivita (postavení zvířete na zadní nohy) a celková vzdálenost, kterou zvíře urazilo. 58

Protokol experimentu pro testování pohybové aktivity samců a samic potkana Testem jsme hodnotili lokomoční a průzkumnou činnost u samic a samců ještě před zahájením IVSA experimentu z důvodu vyloučení možnosti, že by tyto vlastnosti ovlivnily užívání drogy. Potkani byli v osvětlené místnosti umístěni jednotlivě do arény o velikosti 45x45x30cm vybavené infračervenými čidly pro snímání pohybu. Použita byla aparatura Actitrack system (Panlab, Španělsko). Během 10 minut byla měřena horizontální pohybová aktivita, vertikální aktivita a dále doba strávená ve vnitřní části arény za účelem vyhodnocení rozdílu stavu úzkosti u samců a samic. 6.4.3. Test behaviorálních projevů v průběhu in vivo mikrodialýzy V průběhu in vivo mikrodialýzy byly sledovány specifické projevy chování zvířat po podání látky (VEH/MET). Tyto projevy byly rozděleny do 3 kategorií: 304,305 a) Nehybnost (imobilita): útlum, zavřené oči, akineze, snížená schopnost reagovat na podněty z prostředí b) Pohyblivost (lokomoce) - nestereotypní činnost: čichání, péče o srst, panáčkování, chůze c) Stereotypní činnost: stereotypní čichání, lízání, hlodání a pohyby hlavy Jednotlivé projevy byly zaznamenávány každých 20 minut (ve stejnou dobu s odběrem dialyzátu) dvojitě zaslepeným pozorovatelem, který neznal skupinu SHAM/OBX ani léčbu VEH/MET. Behaviorální změny byly sledovány po celou dobu mikrodialyzačního experimentu (60 min před aplikací látky až 3 h po podání MET/ 2 h po podání fyziologického roztoku) a byly vyhodnoceny v jednotlivých dvacetiminutových intervalech samostatně pro každé zvíře jako procento času stráveného v každé kategorii chování. 59

7. Výsledky a diskuse Tato část dizertační práce je prezentována formou úvodu, popisu jednotlivých studií a hypotéz, na nichž byly založeny. U každé studie je citován a vložen příslušný publikovaný článek. 7.1. Studie 1: Operantní autoaplikace WIN55-212,2 v modelu deprese navozené olfaktorickou bulbektomií a in vivo mikrodialýza po akutní dávce WIN55-212,2 Experiment byl navržen z důvodu zavedení nové návykové látky v modelu komorbidity látkové závislosti a deprese, konkrétně se jednalo o aplikaci agonisty CB1 receptoru (WIN) v modelu IVSA u OBX potkanů. Z předchozích studií vyplývá, že OBX potkani si v rámci modelu IVSA aplikují ve srovnání s kontrolní skupinou vyšší dávky nikotinu 126, amfetaminu 122 a MET 123, a i přes klinicky prokázanou asociaci mezi kouřením marihuany a syndromem deprese, neexistují data o příjmu této drogy v jakémkoli animálním modelu deprese. Cílem studie bylo ověření rozdílů mezi skupinami OBX a SHAM jak po stránce behaviorální (motivace pracovat pro další dávku WIN) v modelu IVSA, tak po stránce neurochemické (vyplavení DA v NAc shell po akutní dávce WIN) procesem in vivo mikrodialýzy. K ovlivnění vzniklého návykového chování, s cílem snížit autoaplikaci WIN, jsme použili agonistu 5-HT1B receptoru, CGS-12066B. CGS má velký potenciál v modulaci návykového chování 52,53, což se potvrdilo v preklinických studiích, ve kterých stimulace 5HT1B receptoru vedla ke snížení vyhledávání další dávky alkoholu 306-308 a amfetaminu. 55 Pracovní hypotézy: a) Předpokládali jsme, že si zvířata ze skupiny OBX budou aplikovat vyšší dávky WIN v souladu s teorií sebeléčení. 60

b) Předpokládali jsme, že akutní aplikace CGS-12066B povede ke snížení vyhledávání WIN. c) Předpokládali jsme, že hladiny dopaminu za bazálních podmínek budou u OBX ve srovnání se SHAM nižší a po podání akutní dávky WIN se koncentrace DA v NAc shell u obou skupin výrazně zvýší. Uspořádání pokusu operantní autoaplikace: 1. den OBX operace 2. 20. den Rekonvalescence 21. 22. den Test preference sacharózy Test lokomotorické aktivity 23. den IVSA operace 24. 27.den Rekonvalescence 28. 58.den IVSA WIN Uspořádání pokusu in vivo mikrodialýza po akutní dávce WIN55-212,2: Čas (min) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 SHAM OBX Odběr dialyzátu BASELINE Aplikace WIN (0,3mg/kg) Odběr dialyzátu 61

Studie byla provedena ve spolupráci s Ústavem neurověd na Univerzitě v Cagliari v Itálii (Department of Neuroscience, University of Cagliari), kde byly uskutečněny experimenty v rámci odborné stáže v roce 2012. Citace: Amchova P, Kucerova J, Giugliano V, Babinska Z, Zanda MT, Scherma M, Dusek L, Fadda P, Micale V, Sulcova A, Fratta W, Fattore L. Enhanced self-administration of the CB1 receptor agonist WIN55,212-2 in olfactory bulbectomized rats: evaluation of possible serotonergic and dopaminergic underlying mechanisms. Frontiers in Pharmacology, Lausanne: Frontiers Media SA, 2014, roč. 5, s. "44-1"-"44-15". ISSN 1663-9812. IF (2014) 3,802 Počet citací bez autocitací: WOS: 1 Scopus: 3 62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

7.2. Studie 2: In vivo mikrodialýza po akutní dávce metamfetaminu v modelu olfaktorické bulbektomie: stanovení hladin DA a metabolitů, 5-HT a metabolitů, GLU a GABA v NAc shell Experiment byl navržen z důvodu objasnění vnímání odměny na základě neurochemických změn v modelu OBX. Funkce neurotransmiterových systémů byla v modelu OBX podrobně popsána, avšak vliv bulbektomie na jednotlivé regiony v mozku související s odměnou v rámci dysregulace neurotransmiterových systémů zatím testován nebyl. Návykové látky silně ovlivňují systém odměny v mozku, a to konkrétně ve stěně NAc, nikoliv v jádře 309, což bylo prokázáno ve studiích s kanabinoidy a opioidy 310, psychostimulačními látkami 311 a nikotinem. 312 Cílem studie bylo systematicky zhodnotit hladiny neurotransmiterů (DA, 5-HT, GLU a GABA) a jejich metabolitů ve stěně NAc a zjistit, zda existují rozdíly u OBX a SHAM, jak za bazálních podmínek, tak po podání bolusové dávky MET. Pracovní hypotézy: a) Předpokládali jsme, že OBX zvířata budou mít nižší bazální hladiny DA, 5HT a GLU a naopak vyšší hladiny GABA v NAc shell, což odpovídá fenotypu deprese. b) V souladu s výsledky z předchozího experimentu jsme předpokládali, že po aplikaci MET dojde k nižšímu vyplavení DA u OBX zvířat v porovnání se SHAM. Dále jsme předpokládali, že u obou skupin dojde po podání MET ke zvýšenému vyplavení 5-HT a GLU a naopak snížení hladin GABA. c) Předpokládali jsme, že behaviorální profil se bude mezi skupinami lišit, a to za bazálních podmínek i po podání MET. 78

Uspořádání studie: Čas (min) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 Odběr dialyzátu VEH Odběr dialyzátu BASELINE MET Odběr dialyzátu Kratší doba odběru dialyzátu po aplikaci VEH je z důvodu nepředpokládané změny v hladinách neurotransmiterů v čase. Studie byla provedena ve spolupráci s Ústavem farmakologie na 3LF Univerzity Karlovy v Praze, kde byla provedena operace OBX a metoda in vivo mikrodialýza a s Ústavem organické technologie VŠCHT v Praze, kde byla provedena metoda HPLC. Citace: Rudá-Kučerová J, Amchová P, Havlíčková T, Jeřábek P, Babinská Z, Kačer P, Syslová K, Šulcová A, Šustková-Fišerová M. Reward related neurotransmitter changes in a model of depression: An in vivo microdialysis study. The World Journal of Biological Psychiatry, Abingdon: Taylor & Francis LTD, 2015, roč. 16, č. 7, s. 521-535. ISSN 1562-2975. IF (2014) 4,183 Počet citací bez autocitací: WOS: 0 Scopus: 0 79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

7.3. Studie 3: Operantní autoaplikace metamfetaminu a modelování relapsu po období nucené abstinence u potkaních samců a samic Experiment byl navržen z důvodu posouzení mezipohlavních rozdílů v příjmu MET a vulnerability k relapsu v modelu operantní autoaplikace MET u potkanů. Existuje mnoho klinických důkazů o existenci pohlavních rozdílů v problematice závislostí, které jsou podpořeny i preklinickými nálezy. Relaps je jedním z hlavních úskalí v klinické praxi při léčbě závislosti na návykových látkách. Přestože absolutní počet žen užívajících MET je nižší než počet mužů, ženy inklinují ke zvýšené eskalaci příjmu drogy, častějšímu vzniku závislosti a relapsu. 313,314 Tyto rozdíly mezi pohlavími vyzývají ke specifické strategii léčby závislostí a rozdílnému přístupu v prevenci relapsů. 315 V preklinickém výzkumu závislostí lze navodit relaps po předchozím odebrání drogy několika způsoby. V modelu IVSA se běžně využívá model extinkce, tedy odnětí drogy při stálém přístupu zvířete do operantní klece, nicméně toto paradigma nenapodobuje velmi dobře humánní léčbu, protože pacient obvykle přeruší užívání drog v drogovém odvykacím centru a po tuto dobu nemá přístup k prostředí souvisejícím s drogami. Proto byl vyvinut model nucené abstinence, kdy zvíře nemá přístup do operantního boxu a je drženo po určitou dobu v domácí kleci, což lépe vystihuje klinickou situaci. Mnoho preklinických studií, které posuzují pohlavní rozdíly, izolují hormonální vliv a to buď odstraněním vaječníků a následnou hormonální substitucí 316,317 nebo konstantním sledováním estrálního cyklu. 318,319 Výsledky z těchto studií ukazují zvýšený příjem drog pod vlivem estradiolu 181,317,320,321 a naopak útlum pod vlivem progesteronu 314,322, avšak možnosti klinických aplikací těchto zjištění jsou omezené. Kolísající hladiny hormonů u volně cyklujících samic sice mohou zkreslovat výsledky testů zaměřených na mezipohlavní rozdíly, nicméně ideální zvířecí model s vysokou fenomenologickou, prediktivní a konstruktivní validitou pro testování prevence relapsu by neměl být založen pouze na bázi hormonálních změn. Cílem naší studie bylo zaznamenat a zhodnotit rozdíly mezi samicemi a samci potkana při samovolné aplikaci MET a poté ve fázi relapsu po periodě nucené abstinence se zachováním přirozených hormonálních vlivů. Dále jsme hodnotili případné mezipohlavní rozdíly 95

v získávání chutné potravy (ve formě sladkých pelet) s cílem porovnat chování zvířat vůči přirozené odměně vs. návykové látce. Pracovní hypotézy: 1) Předpokládali jsme, že za bazálních podmínek budou samci a samice projevovat stejnou pohybovou a explorační činnost. 2) Předpokládali jsme, že bude zaznamenán mezipohlavní rozdíl v příjmu MET. 3) Předpokládali jsme, že samice budou vykazovat vyšší aktivitu k získání drogy ve fázi reinstatement, tzn. vyšší vulnerabilitu k relapsu. Uspořádání studie: 1. den Test lokomoční aktivity IVSA operace 2. 7. den Rekonvalescence 8. 21. den IVSA (14 dní) 22. - 35. den Nucená abstinence (14 dní) 24. 27. den Reinstatement (IVSA klec bez drogy) Studie byla provedena na Ústavu farmakologie na LFMU v Brně. 96

Citace: Rudá-Kučerová J, Amchová P, Babinská Z, Dušek L, Micale V, Šulcová A. Sex differences in the reinstatement of methamphetamine seeking after forced abstinence in Sprague-Dawley rats. Frontiers in Psychiatry, Lausanne: Frontiers, 2015, roč. 6, č. 91, s. 1-8. ISSN 1664-0640. IF dosud nebyl přidělen, ale časopis je indexován ve Web of Science. Počet citací bez autocitací: WOS: 1 Scopus: 1 97

98

99

100

101

102

103

104

105