Izolace, klonování a analýza DNA Ing. Pavel Kotrba, Ph.D., Ing. Zdeněk Knejzlík, Ph.D., Ing. Zdeněk Chodora Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha HTpavel.kotrba@vscht.czTH, HTzdenek.knejzlik@vscht.czTH, HTzdenek.chodora@vscht.czTH Ačkoliv se vzhled a chování živých tvorů v mnoha ohledech značně odlišuje, jejich genomy jsou vždy tvořeny DNA, která představuje nosič informace zapsané sekvencí ve které jsou 4 písmena genetického kódu adenin (A), thymin (T), cytosin (C) a guanin (G) rozloženy podél dvoušroubovice DNA. Až do počátku 70-tých let byla analýza molekuly DNA možná pouze nepřímo a to na základě mapovaní genů a sekvenování RNA a proteinů. Obrat nastal se zavedením metod molekulového klonování DNA (1972-1973; Boyer, Cohen a Berg), metody detekce specifických sekvencí DNA (1975; Southern) a rychlých metod sekvenace DNA (1975-1977; Sanger, Barrel, Maxam a Gilbert). Tyto a pozdější techniky genového inženýrství využívající dnes již komerčně dostupné enzymy umožňují cíleně manipulovat s DNA ve zkumavce i živém organismu a způsobily revoluci ve zkoumání života. Vedly k objevu nových skupin genů a proteinů a umožňují sledovat jejich evoluci. Umožňují sledovat expresi genů a studovat funkci proteinů a jejich jednotlivých částí. Díky možnosti nadprodukce rekombinantních proteinů zjednodušují jejich purifikaci. Možnost vyštěpit regulační oblasti genů dovoluje pochopit komplexní kontrolu genové exprese v organismu. V neposlední řadě je třeba zmínit možnosti praktického využití technologie rekombinantní DNA v medicíně (genové terapie, diagnostika) a biotechnologiích (produkce inzulínu v bakterii Escherichia coli, zavádění nových metabolických drah, odolné geneticky modifikované rostliny).
DNA-technologie je ve své podstatě založena na několika klíčových technikách: i) štěpení DNA specifickými restrikčními endonukleasami, které usnaňuje izolaci genů a manipulaci s nimi ii) příprava rekombinantní DNA a následné klonování (pomnožení) fragmentů DNA iii) hybridizace DNA umožňující detekovat specifické sekvence ve směsi na základě komplementarity bazí iv) sekvenování izolovaného úseku DNA, které umožní identifikovat geny a určit aminokyselinovou sekvenci kódovaných proteinů Štěpení DNA restrikčními endonukleasami a rekombinantní DNA Na rozdíl od proteinů nebo RNA nejsou geny v buňce přítomny jako samostatné entity, ale jsou součástí určitých úseků na celistvé molekule DNA. Jedním z mezníků, který usnadnil specifickou fragmentaci DNA a následně izolaci a pomnožení hledaného genu byl objev restrikčních endonukleas (1962; Aber, Nathans a Smith). Tyto enzymy, které jsou nejčastěji izolovány z bakterií, stěpí dvoušroubovici DNA v místech se specifickou lokální nukleotidovou sekvencí a vytvářejí fragmenty definované délky. Nejčastěji používaná skupina restrikčních endonukleas rozpoznává různé sekvence 4 až 8 nukleotidů na molekule DNA, kde štěpí. Společným rysem těchto sekvencí je, že je můžeme číst u dvouřetězcové molekuly zprava doleva na jednom řetězci stejně jako zleva doprava na řetězci druhém, hovoříme o palindromních sekvencích (Obr. 1A). Obrázek 1: Štěpení dvouřetězcové molekuly DNA restrikčními endonukleasami a spojování vzniklých fragmentů. (A) Některé bakteriální enzymy štěpí DNA ve specifických sekvencích přičemž generují kohézní konce (např. Sau3A ze Staphylococcus auresus kmene 3A, BamHI z Bacillus amyloliquefaciens kmene H nebo EcoR I z Eschericha coli kmene RY 13 nebo tupé konce (např. Hpa I z Haemophilus parainfluenzae). (B) Komplementární kohézní konce (jednořetězcové úseky DNA) dvou různých molekul DNA se mohou spojovat vodíkovými můstky a po kovalentním spojení DNA ligasou vzniká rekombinantní DNA.
Různé druhy bakterií produkují různé restrikční endonukleázy, které jim slouží jako ochrana proti cizorodé DNA. Vlastní DNA těchto bakterií je v cílových místech chráněna proti štěpení metylací adeninu nebo cytosinu a cizorodá (např. virová) DNA, která většinou metylována není, je v buňce rozštěpena a tím inaktivována. Je poměrně jednoduché nalézt restriční endonukleasy, které vyštěpí z DNA fragment obsahující např. hledaný gen. Známá velikost fragmentu může být následně využita pro jeho přečištění ze směsi úseků vzniklých při štěpení chromozomální DNA. Některé restrikční endonukleasy štěpí cílovou sekvenci tak, že zanechávají na koncích fragmentu krátké přečnívající jednořetězcové úseky nazývané kohézní konce. Tyto konce se mohou spojit vodíkovými můstky na základě komplementarity bazí s koncem jiného fragmentu DNA generovaným stejným enzymem (nebo enzymem produkujícím stejné kohézní konce) (Obr. 1B). Následným propojením konců pomocí enzymu DNA ligasy objeveného v roce 1967 Gellertem vzniká tzv. rekombinantní molekula DNA. DNA ligasa, která vytváří vazbu mezi 3 hydroxylovou skupinou ribosy jedné molekuly DNA a fosfátem na 5 hydroxylu ribosy molekuly druhé umožňuje i spojení DNA fragmentů generovaných restrikčními endonukleasami, které nevytváří kohézní konce, ale tzv. tupé konce (např. Hpa I v Obr. 1A). Spojit pak lze konce generované různými enzymy, avšak s menší účinností. Elektroforetické dělení fragmentů DNA Fragmenty DNA generované restrikčními endonukleasami mohou být rozděleny na základě velikosti pomocí elektroforézy ve vhodném gelu molekulovém sítu. DNA je díky fosfátovým skupinám spojujícím jednotlivé deoxyribonukleosidy nabita záporně a ve stejnosměrném elektrickém poli putuje ke kladnému pólu, přičemž delší úseky se pohybují pomaleji, protože obtížněji prochází póry v hustém gelu. Nejčastěji se pro rozdělení fragmentů dvouřetězcové DNA o velikostech několika set až 20 000 párů bazí (pb) používají agarózové gely. Velmi dlouhé molekuly DNA lze v agarózovém gelu rozdělit pomocí speciální techniky pulzní elektroforézy, kdy se periodicky mění směr elektrického pole což umožní proplétání i celých bakteriálních nebo kvasničných chromozomů póry gelu. Oproti tomu velmi krátké fragmenty DNA do velikosti 500 pb a především jednořetězcové DNA se elektroforeticky analyzují na polyakryamidových gelech s menšími póry, které umožňují rozlišení rozdílu jedné báze. Bezbarvá DNA je v gelu vizualizována po navázání specifických molekul fluoreskujících v ultrafialovém světle. Případně může být DNA před elektroforézou
označena radioaktivním prvkem, nejčastěji radioizotopem P PP (β-zářič) a detekce pak probíhá na fotografickém papíře. 32 Klonování DNA in vivo Pod pojmem molekulové klonování si představujeme především pomnožení specifického (často cizorodého) fragmentu DNA v hostitelském organismu schopném jej efektivně několikanásobně namnožit a vytvářet identické kopie této DNA (klony). Nicméně termín klonování je často nesprávně používán i pro izolaci určitého genu z buněčné DNA, protože jeho pomnožení tuto izolaci významně usnadňuje. Pro klonování DNA in vivo je nejprve nutno vytvořit rekombinantní DNA, která sestává z klonovaného fragmentu a tzv. klonovacího vektoru. Klonovací vektor je genetický element, který je schopen samostatné reprodukce v hostitelském organismu, tj. musí být schopen autonomní replikace. Rekombinantní DNA je následně vnesena do buňky hostitele, kterým je nejčastěji bakterie Escherichia coli (kmen neprodukující restrikční endonukleasy) kde je při růstu buněčné kultury DNA mnohonásobně replikována - klonována. Pro klonování kratších úseků DNA do délky asi 30 000 pb se využívají viry např. bakteriofágy M13 nebo λ a plasmidy. Bakteriální plasmidy, které jsou v porovnání s bakteriálním chromozomem (průměrně 3 500 000 pb) velmi malou cirkulární molekulou DNA (řádově 10 až a 100 tisice pb) nesoucí tzv. mimochromozomální genetickou informaci jsou v buňce často obsaženy ve více kopiích. Identifikace minimální délky plasmidů potřebné pro jejich existenci v hostitelské buňce umožnila zkonstruovat poměrně malé molekuly DNA (2000 až 10 000 pb), které lze z buněk snadno izolovat. Plasmidové vektory (Obr. 2) obsahují vedle počátku replikace také tzv. selekční marker, tj. gen který přináší určitou výhodu a zajišťuje tak stabilní udržení plasmidu v hostitelské buňce. Může jím být např. rezistence k antibiotiku nebo gen, který hostitel postrádá a který je za určitých růstových podmínek nezbytný. Další specifickou součástí klonovacích vektorů bývá úsek který obsahuje řadu cílových sekvencí pro různé restrikční endonukleasy umožňující inzerci klonovaného fragmentu. Vedle klonovacích vektorů existují i specializované plasmidy umožňující expresi specifického genu v hostitelském organismu za účelem studia funkce genu nebo pro nadprodukci proteinu. Pokud je hostitel jiný než E. coli ve které se provádí klonování, musí plasmid obsahovat také počátek replikace a selekční marker specifický pro studovaný organismus a hovoříme o tzv. shuttle vektorech (z angl. shuttle kyvadlový).
Pro molekulové klonování velmi dlouhých úseků DNA se dnes využívá umělých chromozómů. Jedním z nich je kvasničný umělý chromozóm YAC (z angl. yeast artificial chromosome) umožňující vložit mezi ramena lineárního chromozomu (obsahuje vedle počátku replikace centromeru, jež zajišťuje udržení rekombinantní DNA a koncové telomery) až 1 000 000 pb. V bakteriích lze podobné úseky DNA klonovat s využitím BAC (z angl. bacterial artificial chromosome) založeném na plasmidu F z E. coli. Příprava genomové knihovny DNA a knihovny cdna Rozštěpení buněčné DNA pomocí specifických restrikčních endonukleas generuje 9 obrovské množství fragmentů (řádu milionů v případě lidkého genomu čítajícího 3.10P P pb). Každý z fragmentů buněčné DNA vložený do klonovacího vektoru a pomnožený v hostitelské buňce (Obr. 2) Obrázek 2: Klonování DNA v bakteriích. Klonovaný úsek DNA je vložen do bakteriálního plasmidu a rekombinantní plasmid je vnesen do hostitelské buňky schopné DNA přijmou t (kompetentní buňky ) a replikovat. V selekčním médiu obsahujícím nap ř. antibiotikum rostou pouze buňky nesoucí daný plasmid ( plasmid obsahuj e ge n pro resistenci k antibiotiku ). Mnohonásobně pomnožený plasmid lze z buněk vyizolovat v čisté formě a naklonovaný fragmen t DNA vyštěpit pomocí restričních endonukleas.
představuje klon genomové DNA a soubor rekombinantních plasmidů nesoucích různé fragmenty představuje tzv. knihovnu genomové DNA. Množství fragmentů lze snížit neúplným stěpením DNA a dále použít umělé chromozomy. Knihovny genomové DNA se využívají především pro získání dostatečného množství genetického materiálu pro určení sekvence genomu. Z genomové knihovny lze izolovat žádaný gen jen v některých případech. Jedná se především o bakteriální geny, jejichž kódující oblasti nejsou přerušeny nekódujícími sekvencemi (introny) a na poměrně krátkém úseku DNA zůstává celistvý gen. Genomový klon obsahující žádaný gen lze identifikovat hybridizací se značenou sondou nebo jeho vnesením do mutantního hostitele, který danou vlastnost postrádá (je-li projev genu detekovatelný). V případě vyšších organismů v jejichž genech jsou kódující sekvence (exony) přerušeny introny lze využít alternativní strategii zpětný přepis mediátorové RNA (mrna) do sekvence DNA. V buňce z níž je mrna izolována totiž po přepisu genu (transkripci) již došlo vystřižení intronů z mrna, její sekvence tak odpovídá celistvé kódující oblasti a je zakončena sekvencí několika desítek adenosinů. Pro přepis mrna in vitro se využívá specifické DNA polymerasy, enzymu reverzní transkriptasy (RT) izolované z retrovirů (1970; Baltimore a Temin). Podobně jako jiné DNA polymerasy neumí RT iniciovat polymeraci de novo, ale vyžaduje přítomnosti krátkého úseku DNA (očka - prime u) r již připojeného na matrici (mrna) podle které vytváří komplementární vlákno DNA, tzv. cdna (z angl. Complementary DNA). Jako obecného primeru se v tomto případě s výhodou využívá krátkého oligonukleotidu poly(deoxyt) a vzniká heteroduplexní dvouřetězcová RNA/DNA molekula (Obr. 3).RNA je následně naštěpena pomocí enzymu RNasy H a druhé vlákno DNA je syntetizováno pomocí DNA polymerasy, Obrázek 3: Příprava cdna. Molekula mrna je zpětně přepisována do sekvence komplementární DNA retrovirovým enzymem reverzní transkriptasou a po částečném rozštěpení mrna v heteroduplexní dvoušroubovici DNA/RNA enzymem RNasou H je druhé vlákno DNA dosyntetizováno enzymem DNA polymerasou
která využívá nerozštěpenou RNA jako primer. Vytvořená dvouřetězcová DNA je následně vložena do klonovacího vektoru a vzniká cdna klon. Soubor cdna klonů připravený z mrna izolované z určité tkáně se nazývá knihovna cdna. Je třeba si uvědomit, že na rozdíl od knihovny genomové DNA obsahuje knihovna cdna pouze ty kodující sekvence, které jsou v dané buňce (tkáni) v daný čas exprimovány. Knihovna cdna je však cenným materiálem umožňujícím predikovat aminokyselinové sekvence kódovaného proteinu nebo jeho nadprodukci proteinů v bakteriálních nebo kvasničných buňkách, které nejsou schopny vyštěpovat introny. Sekvenování DNA Do současné doby byla stanovena sekvence stovek genomů živočichů, rostlin a mikroorganismů. V dnešní době se pro vysokokapacitní sekvenace využívá výlučně metoda publikovaná Sangerem v roce 1975. V principu jsou elektroforézou v polyakrylamidovém gelu analyzovány různě dlouhé fragmenty jednořetězcové DNA vznikající in vitro za pomoci enzymu DNA polymerasy na podkladě matrice, kterou je sekvenovaný úsek DNA (Obr. 4). Jako matrice se používá jedno- nebo dvouřetězcový fragment DNA klonovaný ve vhodném vektoru nebo úsek pomnožený in vitro pomocí tzv. polymerasové řetězové reakce (PCR). Různě dlouhé fragmenty s definovaným začátkem mohou vznikat v jedné reakční směsi díky třem vlastnostem DNA polymerasy: i) tento enzym umí připojovat jednotlivé deoxyribonukleosidfosfáty (A, T, G, C) komplementární k matrici pouze jedním směrem. Polymerasa totiž napojuje nový 2 -deoxyribonukleosid prostřednictvím fosfátu na 5 hydroxylové skupině ribosy na 3 hydroxyl ribosy (Obr. 4A) z koncového deoxyribonukleosidu rostoucího řetězce DNA. ii) neumí iniciovat polymeraci de novo, ale vyžaduje přítomnosti krátkého úseku DNA (primeru) již napojeného na sekvenovanou molekulu a ten prodlužuje. Primer poskytuje 3 hydroxyl ribosy jako kosubstrát polymerační reakce. Často je primer navíc modifikován fluoreskující molekulou, což umožní u automatických sekvenátorů detekci vytvořeného fragmentu po průchodu sekvenačním gelem. iii) polymerace se zastaví ve chvíli, kdy je do vznikající DNA inkorporována molekula takřka shodná s přirozeným A, T, G, nebo C, na kterou však již nelze napojit další stavební element DNA. Jako terminátor polymerace se používá 2,3 -dideoxyribonukleosidtrifosfát, který postrádá 3 hydroxylovou skupinu (Obr. 4A).
Obrázek 4: Sekvenování DNA Sangerovou metodou. (A) Rozdíl mezi deoxy a dideoxynukleosidtrifosfáty. (B) Metoda využívá skutečnost i, že DNA polymerasa syntetizuje molekulu DNA z deoxynukleosidtrifosfátů podle komplementárního vlákna připojováním deoxynukleosidfosfátů na 3 hydroxylovou skupinu ribosy. Malá příměs dideoxynukleosidtrifosfátu (terminátor u ), který postrádá hydroxy l na ribose v 3 pozici, do reakce způsobuje občasné ukončení prodlužování řetězce DNA. V jedné reakci tak vznikají různě dlouhé fragmenty zakončené vždy přidaným terminátorem. Délka fragmentů je následně stanovena elektroforézou a sekvence DNA je určena z kombinace vysledků 4 reakcí do nichž byl přidán vždy jeden dideoxynukleosidtrifosfát. Sekvenační reakce se pro každou sekvenovanou DNA provádí čtyřikrát vždy však s jiným terminátorem polymerace. Tak je možno určit zda je fragment zakončen A, T, G a nebo C a přiřadit jim pozici podle délky vzniklého fragmentu (Obr. 4B). Efektivnější, avšak nákladnější, možností je použití terminátorů polymerace modifikovaných fluoreskující molekulou, která je pro každý terminátor jiná. Pak je možno provést pouze jednu reakci se směsí všech terminátorů a při elektroforéze identifikovat 4 různé fluorescenční signály. Identifikace specifických sekvencí pomocí hybridizace se značenými sondami V případě, že se dvouřetězcová DNA vystaví teplotám okolo 100 º C nebo vysokému ph (ph 13) dochází k její denaturaci, tzn. rozrušení vodíkových vazeb spojující jednotlivé komplementární páry bazí přičemž kovalentní vazby v řetězcích zůstávají zachovány. Významné bylo zjištění, že proces denaturace je vratný (1961; Marmur a Doty) a že se mohou
komplementární řetězce DNA při snížení teploty na 65 º C po čase opět spojovat na základě Watson-Crickovského párování bazí hybridizovat. K obdobné hybridizační reakci dochází mezi libovolnými jednořetězcovými molekulami nukleových kyselin (DNA/DNA, DNA/RNA, RNA/RNA) pokud obsahují komplementární sekvence. Toto zjištění vedlo ke vzniku techniky umožňující identifikovat specifické nukleotidové sekvence pomocí značených nukleotidových sond. Sondou bývá jednořetězcová DNA o délce 10 až 1000 bazí, která je modifikovaná radioaktivním prvkem nebo chemickou molekulou, jež umožní její detekci. Techniku umožňující např. zjistit velikost fragmentu obsahujícího žádaný gen ve směsi vzniklé rozštěpením chromozomální DNA určitou restrikční endonukleasou vyvinul v roce 1975 Southern (Obr. 5). Obrázek 5: Detekce specifické DNA pomocí hybridizace se značenou sondou (Southern blo t). Princip této metody lze aplikovat i na detekci specifické RNA (Nothern Blot). Pro značení sond se dnes, spíše než radioizotopy, používá modifikace organickými molekulam i, které jsou následně detekovány pomocí specifických protilátek konjugovaných s enzymem, jehož aktivitu je možno detekovat nap ř. pomocí chromogenního substrátu.
Fragmenty DNA se nejprve elektroforeticky rozdělí a po denaturaci při vysokém ph se přenesou se na vhodnou membránu, kde jsou jednořetězcová vlákna DNA zafixována. Následně se přidá značená sonda komplementární k jednomu vláknu hledané sekvence a dochází k hybridizaci. Po odmytí přebytku sondy se detekuje fragment, na kterém došlo k jejímu navázání, tj. kde se nalézá hledaná sekvence. Celý proces se nazývá Southernův přenos (angl. Southern blotting). Z uvedeného je zřejmé, že je třeba znát alespoň část sekvence hledaného úseku DNA nebo alespoň odpovídající sekvence z příbuzných organismů a tuto techniku nelze užít pro vyhledávání zcela neznámých genů. Svůj velký význam však hybridizační techniky mají především v oblasti diagnostiky. Je-li sonda krátká (okolo 20 nukleotidů) může se stabilně navázat při vyšší teplotě pouze pokud je s cílovou sekvencí zcela komplementární. Tímto způsobem lze například odhalit bodové mutace - záměny bazí - v některých genech. Jinou variantu lze použít použít pro zjištění zda se v dané buňce nachází určitá RNA, tedy zda dochází k expresi určitých genů. Metoda obdobná Southernově přenosu se při analýze RNA nazývá Northern blotting. Metody in situ hybridizace umožňují detekci pozice specifických sekvencí na celých chromosomech nebo sledování exprese genů (RNA) v různých buňkách např. u vyvíjejícího se embrya. Nejnovější aplikaci hybridizační techniky 2 představují DNA čipy umožňující na prostoru cmp P studovat expresi tisíců genů. V podstatě jsou na tenké sklíčko pomocí robota navázány v přesném místě krátké úseky DNA vždy odpovídající určitému genu, jednomu v jedné pozici na čipu. K těmto imobilizovaným neznačeným sondám pak hybridizuje např. směs cdna, získaná ze studovaných buněk nebo tkání. cdna je značená fluoreskující molekulou, která umožní detekci cdna molekuly navázané v určité pozici na čipu čímž je potvrzena (nebo vyvrácena při absenci signálu) exprese odpovídajícího genu a z intenzity fluorescenčního signálu lze získat i kvantitativní výpověď o úrovni exprese. Polymerasová řetězová reakce - klonování DNA in vitro Díky znalosti sekvence mnoha genomů je dnes možno klonovat celou řadu genů in vitro bez nutnosti připravovat knihovny genomové DNA nebo cdna. Technika, která toto umožňuje se nazývá polymerasová řetězová reakce (PCR; z angl. polymerase chain reaction) a byla zavedena v roce 1985 Mullinsem. Pro namnožení určitého úseku DNA postačuje znalost nukleotidových sekvencí mezi nimiž se žádaný fragment nalézá (Obr. 6). Dva syntetické oligonukleotidy, každý komplementární k jednomu řetězci DNA, slouží po hybridizaci na cílové sekvence na molekule DNA denaturované za vysoké teploty jako primer
P kopií Obrázek 6: Klonování definovaného úseku DNA pomocí polymerasové řetězová reakce (PCR). Vzhledem k tomu, že je dvouřetězcová DNA je v jednotlivých cyklech tepelně denaturována používají, se pro syntézu nových řetězců DNA termostabilní polymerasy. Počet kopií useku DNA mezi dvěma primery (každý je komplementární k jednomu vláknu dvouřetězcové DNA) roste při opakování cyklů geometrickou řadou. pro iniciaci polymerace DNA. Nový řetězec DNA je syntetizován podle matrice z přítomných 2 -deoxyribonukleosidtrifosfátů enzymem DNA polymerasou a primer zůstává připojen na jeho konci. Při první takové reakci vzniká pouze jeden klon DNA avšak při několikanásobném opakování této reakce v jedné zkumavce roste množství DNA klonů geometrickou řadou (Obr. 6). Po n opakováních reakce (cyklech), kterých se obvykle provádí 20 až 30, vzniká z jedné molekuly matrice teoreticky 2P n 6 (10P P až 9 10P P klonů). Každý cyklus, který trvá 2 až 5 minut, sestává ze třech kroků. Nejprve je dvouřetězcová matrice tepelně denaturována při 95 º C, poté je teplota snížena tak, aby bylo umožněno nasednutí primeru na cílovou sekvenci a následně je teplota změněna na optimum pro DNA polymerasu a probíhá syntéza komplementárního vlákna DNA. Vzhledem k tomu, že se používají extrémní teploty při kterých dochází k inaktivaci běžných enzymů, používají se termostabilní DNA polymerasy izolované z termofilních bakterií. První DNA polymeráza tohoto typu, Taq polymerasa, byla získána z bakterie Thermus aquaticus a její teplotní optimum je 72 º C.
PCR je extrémně sensitivní metoda která umožňuje detekovat a amplifikovat DNA molekuly ze stopového množství matrice. Po předchozím přepisu populace mrna pomocí reverzní transkriptázy a přídavku specifického primeru lze touto metodou amplifikovat ze směsi jeden klon cdna. PCR se stala významným nástrojem v diagnostice genetických poruch (např. mutací genů) nebo virových onemocnění v jejich počátku, kdy je titr viru nízký. V soudním lékařství je PCR využívána např. při určování otcovství. V lidském genomu se v určitých místech, lokusech, nachází hypervariabilní tzv. mikrosatelitní sekvence tvořené opakujícími se (repetitivními) sekvencemi, např. CACACA Počet repetitivních sekvencí v určitém lokusu je v populaci různý (4 až 40). Jedinec získává jedno uspořádání od matky a jedno od otce, přičemž pravděpodobnost výskytu shodného uspořádání u geneticky nepříbuzných jedinců je nízká. Použitím oček komplementárních k sekvencím ohraničujících takové lokusy lze pomocí PCR amplifikovat úseky jejichž velikost závisí na přesném počtu repetitivních sekvencí a umožňuje tak určit příbuznost.