ší šířen METODY ANALÝZY NUKLEOVÝCH KYSELIN Polymerázová řetězová reakce
|
|
- Sabina Beranová
- před 9 lety
- Počet zobrazení:
Transkript
1 METODY ANALÝZY NUKLEOVÝCH KYSELIN Polymerázová řetězová reakce Většina metod analýzy DNA využívá možnost amplifikace DNA v in vitro podmínkách. Polymerázová řetězová reakce - PCR (polymerase chain reaction) je metoda, která umožňuje z komplexní (celkové) DNA namnožit vybraný úsek, např. určitý exon analyzovaného genu, bez předchozího klonování ve vektorech (viz dále). Předpokladem je znalost pořadí basí na začátku a na konci požadované sekvence DNA pro syntézu krátkého (oligonukleotidového) jednovláknového úseku DNA; primeru dlouhého bp. Princip PCR je obdobou replikace nukleových kyselin. Během PCR reakce dochází k cyklickému opakování enzymové syntézy nových řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA ve směru 5' 3', která je zprostředkovaná DNApolymerasou. Syntetizovaný úsek DNA je tepelně denaturován (při 95 o C) a se vzniklými dvěmi jednovláknovými molekulami DNA následně hybridizují primery (při o C). Napojm primerů je umožněna syntéza komplementárních vláken DNA (při o C), kterou zajišťuje DNA-dependentní-DNA-polymerasa Taq. Taq-polymerasa je izolovaná z bakterie vyskytující se v teplých pramenech a n proto inaktivována při vyšch teplotách v průběhu PCR reakce. DNA-polymerasa tvoří komplementární vlákna DNA podle matrice DNA jen od místa navázání primerů (navazováním nukleotidů k primeru - viz replikace). Časové omez PCR reakce určuje délku nově syntetizovaného vlákna DNA. Po 1. cyklu je replikovaný úsek DNA zdvojnásoben. Následuje dal denaturace a celý cyklus se opakuje. Množ vybraného úseku pokračuje geometrickou řadou. Po 30ti cyklech bývá DNA zmnožena řádově Tím, že PCR umožňuje získání relativně velkého množství DNA z velmi malých vzorků, nachází uplatnění v mnoha oblastech molekulární biologie. Metodu PCR schematicky znázorňuje následující obrázek. PCR je automatizovaný proces, který probíhá v přístroji označovaném thermocykler. Thermocykler je naprogramován tak, aby v jednotlivých teplotních krocích byly automaticky dodržované tepelné podmínky pro (a) denaturaci DNA, (b) pro připoj primerů a (c) tvorbu komplementárních vláken DNA. Reakční směs pro PCR obsahuje pufr (roztok, který udržuje stabilní ph), vzorek DNA, dostatečné množství všech čtyř typů nukleotidů (2'- deoxyribonukleosid-5'-trifosfáty dntp), primery a DNA-dependentní-DNA-polymerasu Taq. V reakční směsi jsou dále v optimalizované koncentraci přítomny hořečnaté ionty Mg 2+, ál elům m a dal řen
2 které tvoří rozpustný komplex s dntp, který rozpoznává DNA-polymerasa a chelační činidla (např. EDTA), která inhibují deoxyribonukleasy. PRINCIP METODY PCR (1 MOLEKULA) DENATURACE 1. CYKLUS PRIMERY Taq-POLYMERASA 2. CYKLUS CYKLUS 4. CYKLUS 5. CYKLUS (2 MOLEKULY) DENATURACE PRIMERY Taq-POLYMERASA (4 MOLEKULY) DENATURACE PRIMERY Taq-POLYMERASA (8 MOLEKUL) (16 MOLEKUL) ál elům m a dal řen (32 MOLEKUL)
3 Štěp DNA Restrikční endonukleasy Restrikční endonukleasy (restriktasy) jsou sekvenčně specifické bakteriální enzymy (endonukleasy), které chrání baktérii před vniknutím cizorodé DNA, například při infekci baktérie bakteriofágem. Cizí dvouvláknová DNA je restriktasou rozštěpena, vlastní DNA je proti působ enzymu chráněna (obvykle methylací některých basí). Restrikční endonukleasy mohou štěpit dvouvláknové molekuly DNA jakéhokoliv původu, pokud v nich existují pro ně specifická cílová místa štěp se specifickým pořadím basí pro určitou restriktasu. K rozštěp molekuly DNA dochází hydrolysou fosfodiesterových vazeb obou řetězců v restrikčním místě (místo štěp). Cílového místa jsou obvykle sekvence 4-6 bp. Štěp DNA může být uvnitř této cílové sekvence, případně před nebo za ní. Názvy restrikčních endonukleas jsou odvozovány od jména baktérie, ze které byly získány. V současné době je známo přes restriktas. Například restriktasa EcoR I byla získána z bakterie Escherichia coli, kmen RY 13. Cílová sekvence této restriktasy musí být na obou vláknech DNA shodná a štěp dvouvláknové molekuly DNA je od 5' konce. Pro restriktasu EcoR I to je mezi G a následující sekvencí AATTC od 5' konce (znázorněno značkou ), tzn. 5'-G AATTC-3'. Cílové sekvence tvoří velmi často palindrom (čt sekvence shodné z obou konců). Pokud dochází ke štěp DNA uprostřed palindromu, vznikají konce bez přesahů, tzv. tupé konce. Pokud nedochází ke štěp DNA uprostřed palindromu, vznikají přerušm fosfodiesterických vazeb DNA kohezní konce (lepivé konce, konce s přesahem), viz následující obrázek. 5'-AATGCTAATGCCTAGTCAAGCTTTCATCGAG AATTCCAGTCGAA-3' 3'-TTAGCTTTACGGATCAGTTCGAAAGTAGCTCTTAA GGTCAGCTT-5' 5'-AATGCTAATGCCTAGTCAAGCTTTCATCGAG 3'-TTAGCTTTACGGATCAGTTCGAAAGTAGCTCTTAA AATTCCAGTCGAA-3' GGTCAGCTT-5' ál elům m a dal řen
4 Několik příkladů běžných restrikčních endonukleas a jejich restrikčních míst je uvedeno v následující tabulce. Je uvedeno ze restrikční místo na jednom vlákně DNA ve směru 5' 3'. Bakteriální zdroj Název restriktázy Cílové místo štěp (dvouvláknová DNA) Arthrobacter luteus Alu I 5'-AG CT-3' (tupé konce) Bacillus amyloliquefaciens BamH I 5'-G GATCC-3' (kohezní konce) Escherichia coli RY 13 EcoR I 5'-G AATTC-3' (kohezní konce) Haemophilus influenzae Hind III 5'-A AGCTT-3' (kohezní konce) Moraxella sp. Msp I 5'-C CGG-3' (kohezní konce) Streptomyces albus Sal I 5'-G TCGAC-3' (kohezní konce) Staphylococcus aureus Sau 3A 5'- GATC-3' (kohezní konce) Thermus aquaticus Taq I 5'-T CGA-3' (kohezní konce) Restrikční mapy Působíme-li na izolovanou DNA určitou restriktasou, dojde k jejímu rozštěp na úseky (fragmenty) rozdílné délky podle umístění cílových sekvencí štěp v molekule DNA. Restrikční mapa ukazuje pomocí vzniklých fragmentů počet restrikčních míst v molekulách DNA a velikost fragmentů pro jednotlivé restrikčních endonukleasy. Informace jsou pak kompletovány pro molekuly DNA jednotlivých chromosomů. DNA rozdělená na jednotlivé fragmenty pak může být dále analyzována se zřetelem na polymorfismy v délce restrikčních fragmentů v populaci. Polymorfismy v délce fragmentů jsou podmíněné počtem párů basí mezi dvěma cílovými místy štěp. Jsou vyvolané např. mutací v cílovém místě štěp a tím jeho zrušm nebo různým počtem tandemových repetitivních sekvencí mezi dvěma místy štěp atp. Stanov polymorfismů genomů Detekce polymorfismů (rozdílů) se může týkat celé genomové, chromosomové nebo ál elům m a dal řen mitochondrální DNA, a nebo polymorfismů specifických genů nebo jejich specifických částí,
5 tzn. polymorfismů (rozdílů) v sekvenci (v pořadí nukleotidů) DNA. Rozdíly v sekvenci DNA mohou, ale nemusí ovlivnit určité fenotypové znaky. Identifikace a typizace určitých polymorfismů umožňuje rozliš jedinců např. s ohledem na preventivní opatř a léčbu choroby. Genotypové diagnostické metody (analýza DNA) jsou, na rozdíl od diagnózy podle fenotypových projevů, přesné. Pro stanov sekvenčního polymorfismu DNA mohou být žity přímé metody, kdy se stanovuje sekvence variabilní oblasti DNA (viz sekvencování) nebo nepřímé metody, založené na amplifikaci DNA nebo využívající restrikční endonukleasovou analýzu a selektivní hybridizaci restrikčních fragmentů se specifickými sondami. Dal techniky pro identifikaci polymorfismů využívají rozdílnou pohyblivost fragmentů DNA se standardní a mutantní formou genu při elektroforéze, která je odrazem konformačních polymorfismů nukleových kyselin. Vysoce rozlišovací techniky umožňují identifikaci i jednonukleotidových polymorfismů (SNP). Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) Působíme-li na izolovanou DNA jedince určitou restriktasou, dojde k jejímu rozštěp na úseky (fragmenty) rozdílné délky podle umístění cílových sekvencí štěp pro žitou restriktasu. DNA od různých jedinců stejného druhu pak může mít délku fragmentů (i jejich počet) buď shodnou, nebo rozdílnou. Pokud mezi jedinci téhož druhu při žití téže restriktázy nacházíme fragmenty rozdílné délky, pak hovoříme o polymorfismu v délce restrikčních fragmentů (RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism). Vysvětlm vzniku polymorfismu délky restrikčních fragmentů může být například mutace některého nukleotidu v cílové sekvenci štěp (variabilní restrikční místo). Restriktasa pak v takto změněné cílové sekvenci neštěpí a vzniká fragment, jehož délka je součtem délek dvou sousedních původních fragmentů. Naopak je též možné, že mutací vznikne nová cílová sekvence a tak dojde ke zkrác délky restrikčního fragmentu. Jinou možností vzniku polymorfismu délky restrikčních fragmentů je včlenění, nebo vyčlenění, nukleotidů mezi dvěmi cílovými sekvencemi - variabilita krátkých tandemově opakujících se repetic. Pak jsou získány restrikční fragmenty del (respektive krat). Schematické znázornění shodných úseků DNA vykazujících rozdílné příčiny vzniku polymorfismu délky restrikčních fragmentů ukazuje následující schéma zobrazující situaci na jednom vlákně DNA. ál elům m a dal řen
6 a) dvě restrikční místa (3 fragmenty) 5' TAATGCCTTCTCAAGCTTTCATCGAG AATTCCAGTCGAAAGCTTTCATCGAG AATTCCAGT 3' b) první restrikční místo zrušeno záměnou nukleotidů A C; 2 fragmenty 5' TAATGCCTTCTCAAGCTTTCATCGAGACTTCCAGTCGAAAGCTTTCATCGAG AATTCCAGT 3' c) vznik nového (dalho) restrikčního místa záměnou nukleotidů CC AA; 4 fragmenty 5' TAATG AATTCTCAAGCTTTCATCGAG AATTCCAGTCGAAAGCTTTCATCGAG AATTCCAGT 3' d) variabilita krátkých repetitivních sekvencí, zde CGAT, vede v obou molekulách ke štěp na dva fragmenty, ale odlišné délky 5' CGAAAGCTTCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATTCATCGAG AATTCC 3' 5' CGAAAGCTTCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATTCATCGAG AATTCC 3' Délka restrikčních fragmentů se dědí. Dědičnost se řídí pravidly Mendelovské genetiky (viz Monohybridismus). Velikosti restrikčních fragmentů můžeme hodnotit pomocí gelové elektroforézy. Fragmenty DNA mají záporný náboj, proto všechny fragmenty putují při jednosměrném proudu od záporné elektrody (-) k elektrodě kladné (+). Mezi nejžívaněj gelové nosiče patří agaróza a polyakrylamid, které působí molekulární síto (jsou porézní, velikost pórů určuje jejich hustota). Pomocí gelové elektroforézy můžeme rozdělit jednotlivé fragmenty DNA podle jejich velikosti. Malé molekuly (fragmenty) putují v gelu rychleji než velké. O rozlož jednotlivých restrikčních fragmentů v gelu se můžeme přesvědčit obarvm barvivem ethidiumbromidem. U eukaryotických genomů získáme z komplexní DNA vysoký počet fragmentů natolik velikostně rozdílných, že vytvářejí na elektroforetogramu souvislý pruh. V těchto případech žíváme pro identifikaci fragmentů, které potřebujeme pro dal analýzu, Southernovu metodu. ál elům m a dal řen
7 Southernův přenos Southernův přenos (blotting = "přepijákování") je metoda, která se žívá při zkoumání velikosti restrikčních fragmentů určitého úseku DNA. Principy Southernovy metody jsou následující: a) Pomocí vybrané restrikční endonukleasy je rozštěpena celková (komplexní) DNA získaná z jaderných buněk jedince. b) Získané fragmenty se rozdělí gelovou elektroforézou. c) Po denaturaci DNA jsou vzorky přeneseny na hybridizační membránu (nitrocelulóza nebo nylonová membrána). Gelové nosiče nejsou vhodné pro dal postupy protože jsou velmi křehké. d) Přenos (blotting) fragmentů z gelu na membránu se realizuje vzlínáním pufru z rezervoáru. e) Po přenes fragmentů nastupuje fixace fragmentů na podložku. f) Dalm krokem je hybridizace s radioaktivně značenou sondou (probou). Sondou bývá krátká sekvence DNA, která specificky hybridizuje s restrikčními fragmenty na základě komplementarity basí. Při diagnostice dědičných chorob je vybrána sonda, která je komplementární k fragmentu, na kterém leží vyšetřovaný gen (extragenová sonda) nebo je komplementární přímo s krátkou sekvencí vyšetřovaného genu (intragenová sonda). ál elům m a dal řen
8 g) Po opláchnutí nenavázané sondy se autoradiograficky hodnotí lokalizace fragmentů, u kterých došlo k hybridizaci sondy. Jako sondu lze např. žívat DNA z knihoven cdna (viz dále). cdna (komplementární DNA, copy DNA), je DNA získaná reversní transkripcí mrna. Takto získaná DNA nenese sekvence odpovídající intronům. V případě, že DNA analýzu nelze vyhodnotit ze pomocí délky nebo počtu restrikčních fragmentů, je možné využít dal metodu založenou na specifické hybridizaci vzorku DNA a to s tzv. alelově specifickou sondou. Alelově specifické sondy jsou oligonukleotidy o délce přibližně 20 bp, které hybridizují s neštěpenou denaturovanou DNA v místě, kde je úplná shoda všech komplementárních nukleotidů. Stačí tedy odchylka v jediném nukleotidu, aby k hybridizaci nedošlo. Alelově specifické sondy mohou tedy velmi citlivě stanovit i velmi malé genetické změny ve zkoumané DNA, pokud jsou lokalizovány v místě hybridizace sondy, nikoliv ale všechny mutace vyšetřovaného genu. Polymorfismus konformace jednořetězcových vláken DNA nebo RNA (SSCP) Polymorfismus jednořetězců nukleových kyselin ukazuje sekvenční rozdíly mezi alelami. Sekvenční rozdíly (i rozdíl jedné base) se odrazí na odlišné pohyblivosti vyšetřovaných jednořetězcových úseků DNA nebo RNA ( o velikosti pb) při nedenaturujících elektroforetických podmínkách. Polymorfismus konfirmace dvouřetězců (DSCP) Při pomalé renaturaci fragmentů DNA se vytvářejí duplexy DNA. Duplexy s úplnou komplementaritou basí (homoduplexy) mají v nedenaturujících gelech odlišnou (vyš) elektroforetickou pohyblivost než heteroduplexy, jejichž řetězce nemají úplnou komplementaritu basí. Heteroduplexy jsou důkazem bodových mutací v genomech. Sekvencování DNA Sekvencování DNA je stanov primární struktury, pořadí nukleotidů, v molekulách DNA. Cílem zkoumání je stanov pořadí nukleotidů celého genomu (např. projekt HUGO). Tato informace je základ pro exaktní genetickou diagnostiku a v perspektivě i pro kauzální genetickou terapii a odezvu jednotlivých pacientů na podání léčiva (farmakogenetika). K zjišťování pořadí (sekvence) basí v určitém úseku DNA se žívají různé metody sekvencování, často automatizované. ál elům m a dal řen
9 Jedna z žívaných metod je enzymová Sangerova metoda, která je založena na enzymově katalyzované terminaci syntézy DNA po zabudování dideoxyribonukleotidu (ddntp - 2',3'- dideoxyribonukleosid-5'-trifosfát) do nově vznikajícího komplementárního vlákna. Při sekvencování Sangerovou metodou je DNA, která má být sekvencována, žita matrice pro syntézu komplementárního vlákna. Dideoxyribonukleotidy se začleňují do vlákna syntetizované DNA náhodně na místo příslušného nukleotidu (2'-deoxyribonukleosid-5'- trifosfátu). Po zabudování dideoxyribonukleotidu, který postrádá 3'-OH skupinu, nemůže DNA-polymerasa k němu v důsledku nepřítomnosti 3'-OH skupiny připojit dal nukleotid a syntetizovaný řetězec DNA se nemůže dále prodlužovat. Výsledkem enzymové Sangerovy metody je vznik různě dlouhých fragmentů DNA, které nesou na konci určitý, fluorochromy nebo radioaktivně značený, dideoxyribonukleotid ddgtp, ddatp, ddttp, ddctp. Délka fragmentu a jeho koncový dideoxyribonukleotid informuje o sekvenci nukleotidů v analyzovaném vzorku DNA. Metoda je schematicky znázorněna na následujícím obrázku. Sekvencování je prováděno ve čtyřech vzorcích, kdy každý analyzovaný vzorek stanovuje pořadí jednoho ze čtyř nukleotidů. Každý analyzovaný vzorek obsahuje směs (i) čisté DNA, která má být sekvencována, (ii) značený primer, připojující se k vláknu analyzované DNA, (iii) směs všech čtyř nukleotidů (A, G, C, T) a v každém vzorku jeden ze čtyř ddntp, který je koncový inhibitor syntézy DNA a (iiii) DNA-polymerasu. ál elům m a dal řen
10 3' 5' Analyzovaná DNA (jednovláknová) 5' 3' Značený primer DNA-polymerasa, primer, nukleotidy - rozděl do čtyř zkumavek. Přidány jednotlivé ddntp: ddatp, ddctp, ddgtp, ddttp Následuje syntéza komplementárního vlákna (značeno barevně pro jednotlivé ddntp) ve směru 5' 3' podle analyzovaného vzorku jednovláknové DNA (černá čára; směr 3' 5') A C G T A C G T A C G T Elektroforéza A C G T - Sekvence nukleotidů je odečtena z gelu podle délky fragmentů s příslušnými koncovými ddntp Výsledná sekvence na syntetizovaném vlákně: 5'- C T A G T A G G T C C A - 3' Sekvence analyzované DNA (komplementarita párování basí): 3'- G A T C A T C C A G G T - 5' Automatické sekvencování Automatickém sekvencování je plně automatizovaný proces, který umožňuje rychlou analýzu vzorků. Při srovnání s výše uvedenou enzymovou metodou má tyto odlišnosti: (i) syntéza DNA je asymetrická polymerasová řetězová reakce, která probíhá v termocykleru za účasti Taq DNA-polymerasy; (ii) pro stanov produktů ončených specifickou basí se + ál elům m a dal řen
11 žívají čtyři odlišné fluorescenční značky; (iii) délka stanovené sekvence je mezi basemi. Detekce produktů sekvenčních reakcí probíhá v průběhu elektroforézy automaticky pomocí laserového detektoru napojeného na počítač, který z pořadí signálů přímo hodnotí sekvenci DNA. Obrázek ukazuje výsledek automatického sekvenování; převzato otevřená encyklopedie com). DNA čipy (expresní profilování), DNA microarrays DNA čipy jsou skleněné destičky, na které je umístěno velké množství cdna (desítky tisíc) nebo krátkých specifických sekvencí jednotlivých genů (mikromnožství pro každý vzorek). Hybridizace s fluorescenčním barvivem značenou sondou cdna, vytvořenou z mrna sledované tkáně, umožní stanovit, které geny jsou v této tkáni v daném období exprimovány (aktivní) a i intenzitu jejich transkripční aktivity. Vizualizace hybridizace se provádí v zaříz využívajícím počítačovou analýzu. Metoda expresního profilování na DNA čipech pomáhá stanovit v jednom vzorku souboru aktivitu velkého počtu genů, mnohdy i všech známých genů daného organismu. Hodnoc může být zaměřeno na různé situace je např. reakce organismu na působ nepříznivých vnějch podmínek nebo na expresi komplexu genů při různých onemocněních i s možností posoudit genovou expresi při jejich léčbě a to i se zřetelem k věku jedince (viz dále Prenatální vývoj a stárnutí organismu). V současné době n tato metoda využívána rutinně, je velmi nákladná. Vyžaduje oup drahého technického vybav a drahá je také syntéza primerů i proved PCR pro vytvoř DNA čipu. ál elům m a dal řen
12 Převzato otevřená encyklopedie com Genové inženýrství Kohezní konce jsou jednovláknové úseky DNA, které mohou na principu komplementarity bází hybridizovat s kohezním koncem i jiné DNA. Může tak dojít i k hybridizaci s cizí molekulou DNA, například plasmidu a eukaryotní buňky, pokud obě DNA byly štěpeny stejnou restriktasou. Použitím enzymu ligasy je možné vytvořit fosfodiesterovou vazbu a tak napojit úsek jedné DNA molekuly s úsekem jiné molekuly DNA. Tímto způsobem vzniká rekombinantní DNA. Pokud jde o kruhovou DNA plasmidu, musí hybridizaci předcházet linearizace molekuly DNA. Ke štěp a linearizaci je zvolena restriktasa, která DNA plasmidu štěpí ze v jednom místě a vytváří v místě štěp kohezní konce. Fragment lidské DNA (insert) má shodné kohezní konce linearizovaná DNA plasmidu, což umožňuje hybridizaci na koncích rozštěpené DNA plasmidu s fragmentem lidské DNA na základě komplementarity basí. Při hybridizaci se uplatňuje také, mimo jiné, enzym ligasa, který zajišťuje spoj vláken DNA. ál elům m a dal řen
13 působ restrikční endonukleasy na DNA plasmidu DNA plasmidu působ restrikční endonukleasy na lidskou DNA DNA plasmidu s inzertem lidské DNA Klonování lidské DNA Velikost genomu lidských buněk vyžaduje při molekulárně genetické analýze využití klonování DNA. Klonování DNA umožňuje např. štěp DNA restrikčními endonukleasami na fragmenty a vytvoř rekombinantní DNA s DNA vhodného vektoru (nosiče). Jako vektory se žívají bakteriální plasmidy, jinou možností je využití virového nosiče, jsou například bakteriofágy. Po vprav vektoru, například plasmidu do baktérie, je možné množit klony baktérií (tedy potomky jedné baktérie) s tímto vektorem a tím zapojit do procesu replikace zkoumaný úsek DNA. Touto metodou lze vytvořit genomové knihovny, tzn. různé klony baktérií s různými fragmenty DNA. Soubor klonů pak může představovat DNA celého eukaryotického genomu. Pro vytvář genomové knihovny savců je optimální délka fragmentů pro vprav do plasmidového vektoru okolo 40 kb. Jednotlivé fragmenty jsou připraveny tak, aby se jejich koncové sekvence navzájem překrývaly. Tím vznikají klony (knihovny genomové DNA), ve kterých fragmenty DNA vytvářejí informaci nejen o jednotlivých fragmentech, ale tím, že se vzájemně překrývají, i o jejich vzájemném sousedství (sledu) v komplexní DNA. Genomová DNA jednoho jedince je ve všech jeho buněčných typech stejná (s výjimkou buněk imunitního systému a nádorových buněk). Při konstrukci genomových knihoven se v současné době žívají i uměle vytvořené vektory. ál elům m a dal řen
14 cdna knihovny jsou vhodné pro zkoumání transkripčně aktivních genů. Principem je získání mrna z určitého typu buněk (určité tkáně, orgánu), které jsou specializované na tvorbu některého polypeptidu. Pomocí reverzní transkripce je pak získána cdna (komplementární), která je začleněna do vhodného vektoru a následně namnožena. cdna knihovny obsahují, na rozdíl od knihoven genomových, ze informaci o funkčních genech. Informace obsažená v cdna knihovnách je omezena ze na exony příslušného genu (viz úpravy mrna transkripce). Knihovny cdna buněk odlišných tkání nejsou identické, závisí na expresi genů v konkrétních buňkách určité tkáně. To znamená, že se bude lišit cdna knihovna např. buněk jater a svalové tkáně. DNA diagnostika Metody molekulární genetiky umožňují zpřesnění rizika onemocnění pro členy rodin s výskytem Mendelovsky děděných chorob. Metody DNA diagnostiky můžeme rozdělit na metody přímé a nepřímé. Přímé metody Pomocí metody PCR se amplifikují jednotlivé úseky genu, ve kterém je očekáván nález mutace, a jednotlivé části genu (fragmenty) se pak vyšetří na přítomnost mutace. (i) (ii) (iii) Metody SSCP a DSCP (viz výše), které využívají rozdíly ve fyzikálněchemickém chování molekul DNA nesoucích mutaci v porovnání se standardní molekulou DNA (bez mutace), kdy změna sekvence mění konformaci fragmentu DNA a tím i rychlost pohybu fragmentu v gelu. Přítomnost variabilního restrikčního místa (viz RFLP). V některých genech vzniká mutací nové restrikční místo pro určitou restriktasu (přítomnost variabilního restrikčního místa) nebo restrikční místo kauzální mutací zaniká. Přítomnost nebo nepřítomnost tohoto restrikčního místa je pak přímým důkazem mutace. Jako příklad takové situace uvádíme v na populaci nejfrekventovaněj mutaci v genu, který kóduje enzym fenylalaninhydroxylasu (PAH). Mutace vytváří nové restrikční místo pro restriktasu Sty I. Mutace v obou alelách genu PAH vede ke vzniku fenylketonurie. Sekvencování zachycuje konkrétní změnu v sekvenci nukleotidů. Tato metoda se v přímé diagnostice většinou využívá až když je ve sledovaném genu nalezena přibližná lokalizace mutace, například změnou pohyblivosti určitého fragmentu ál elům m a dal řen genu v elektoforéze. Sekvencovat celý gen je pracné a finančně nákladné.
15 Nepřímá diagnostika Nepřímá metoda je metodou rodokmenovou, kdy je třeba získat DNA od postiženého jedince, jeho rodičů, sourozenců, případně dalch členů rodiny. Nepřímá metoda je založena na polymorfismu délky restrikčních fragmentů - RFLP (viz výše, dále Mendelovská dědičnost, Vazba genů). Dal součástí molekulárně genetické analýzy situace v rodině je žití vhodné sondy (próby), která hybridizuje s úsekem vyšetřovaného genu (vnitrogenová sonda) nebo v jeho blízkosti (mimogenová sonda) (viz Vazba genů, Metoda Southern-blot). Princip vyšetř spočívá v tom, že od jednotlivých osob získáme jaderné buňky, ze kterých izolujeme DNA. DNA je rozštěpena vhodnou restrikasou. Dal postup je založený na Southernově metodě (viz výše). Pomocí DNA postiženého jedince je možné stanovit lokalizaci alel sledovaného genu na fragmentu určité délky. Délka restrikčních fragmentů je děděna podle Mendelových pravidel. Na základě těchto pravidel je možné, při existenci polymorfismu délky restrikčních fragmentů v rodině, stanovit genotypy členů rodiny. Jestliže lze pomocí RFLP jednoznačně stanovit genotyp všech členů rodiny, je vyšetř plně informativní. V případě, kdy vyšetř n informativní nebo je informativní ze částečně, je nutné žít jinou restrikční endonukleasu, která by informativní výsledek poskytla. Následující obrázky uvádějí příklady konkrétní rodinné situace. Všimněte si rozdílu mezi situací, kdy gen je lokalizován na autosomu a na heterochromosomu X, kdy ženy mají dva chromosomy X a muži ze jeden X chromosom. Výskyt choroby je v obrázcích znázorněn genealogickými značkami. V dolní polovině obrázku jsou výsledky vyšetř RFLP. Jedná se o schematické znázornění výsledků elektroforézy, kdy jednotlivé osoby mají odpovídající elektroforetogram znázorněn čárou pod svou rodokmenovou značkou. Poznatky získané na základě metod molekulární genetiky jsou využívány ve farmaceutickém průmyslu a v prenatální i postnatální diagnostice monogenně děděných chorob. Výhodou molekulárně genetických technik je jejich relativně vysoká spolehlivost, rychlost získání výsledků. Je možné pracovat i s velmi malým množstvím tkáně, nebo s jadernými buňkami vzorků krve. Perspektivou je využití metod genového inženýrství při kauzální terapii genetických chorob. Pro procvič genetických zákonitostí uvádíme v následujících obrázcích schematicky diagnostiku metodou RFLP. ál elům m a dal řen
16 A) V rodině, ve které je matka a dcera postižena brachydaktylií (AD) bylo provedeno DNA vyšetř členů rodiny metodou RFLP. Výsledek vyšetř je graficky znázorněn (rodokmen a elektroforéza fragmentů DNA Southern-blot). a) Posuďte, zda je vyšetř informativní a pokud ano, jaký je genotyp plodu, u které se zatím choroba neprojevila. b) v případě, že vyšetř n informativní, vypočítejte pravděpodobnost, že plod bude postižen pomocí Mendlových zákonitostí o dědičnosti. Genotyp matky a dcery postižené brachydaktylií je Aa (viz AD děděné choroby), otec s normálně vyvinutými prsty rukou má genotyp aa. Pro prenatální diagnostiku plodu musí být provedeno vyšetř všech členů rodiny včetně plodu metodou RFLP. fragmenty a 2 1 A a a Aa Aa nebo aa Vyšetř n informativní. Genotyp plodu nelze určit. Vysvětl: Otec je heterozygot v délce restrikčních fragmenů a homozygot v alelách (aa). Matka je homozygotka v délce fragmenů a heterozygotka v alelách (Aa). Prvorozená dcera zdědila od matky dominantní alelu, která je ve vazbě s fragmentem 1, a od otce recesivní alelu vázanou na fragment 2. Plod zdědil od otce recesivní alelu, která je ve vazbě s fragmentem 1. Od matky jeden z fragmentů 1, ale nelze identifikovat zda ve vazbě s dominantní nebo recesivní alelou. V tomto případě podle Mendelových zákonitostí o dědičnosti můžeme ze ál elům m a dal řen konstatovat pravděpodobné riziko postiž, které u AD onemocnění je 50%.
17 B) Využití RFLP pro nepřímou diagnostiku (vazebná analýza) u autosomálně recesivního onemocnění (např. fenylketonurie, cystická fibróza) 2 A A A 1 aa a AA a a Vysvětl: Postižený chlapec je recesivní homozygot aa. Oba rodiče jsou heterozygoti Aa. Oba rodiče jsou zároveň i heterozygoti v délce restrikčních fragmentů; heterozygocie alel a restrikčních fragmentů jsou dva na sobě nezávislé jevy. Postižený syn je homozygot v délce fragmentů 1. To znamená, že od obou rodičů zdědil fragment 1, se kterým je ve vazbě recesivní alela sledovaného genu. Na homologních chromosomech u rodičů je tedy alela A ve vazbě s fragmentem 2 a alela a (mutovaná) s fragmentem 1. S fragmentem 2 u obou rodičů je ve vazbě dominantní alela A. Genotyp druhorozené dcery je AA, je homozygota pro fragmenty 2. Vyšetř plodu ukázalo, přítomnost fragment 1 a 2 (jedem byl zděděn od otce, druhý od matky. Genotyp plodu je Aa. Dítě bude zdravé. Vyšetř metodou RFLP je plně informativní. ál elům m a dal řen
18 C) Využití RFLP pro nepřímou diagnostiku (vazebná analýza) u gonosomálně recesivních onemocnění (např. hemofílie, barvoslepost). 2 X + X + X + X + 1 X - X - X - Vysvětl: X chromosom dědí synové od matky. Dcery dědí jeden chromosom X od matky, druhý chromosom X od otce. Ženy mohou být přenašečkami mutované alely (heterozygotky X + X - ). Mužové jsou buď zdraví (X + Y) nebo nemocní (X - Y). Při RFLP analýze bude u mužů detekován ze jeden restrikční fragment (jeden chromosom X), u žen dva (dva chromosomy X). Prvorozený syn je postižený (X - ). Postižený chlapec získal X chromosom s mutací (X - ) ve sledovaném genu od heterozygotní matky (X + X - ). Mutovaný gen je u matky ve vazbě s fragmentem 1. S fragmentem 2 je u matky ve vazbě nemutovaný gen ((X + ). Otec je zdráv (X + ); nemutovaný gen je ve vazbě s fragmentem 2. Dcera je heterozygotka v délce fragmentů. Její genotyp je X + X -. U plodu mužského pohlaví, které bylo stanoveno cytogenetickým vyšetřm buněk plodu, byl nalezen fragment 2 nesoucí nemutovaný gen. Tato situace představuje úspěšnou DNA diagnostiku. Vyšetř je informativní. ál elům m a dal řen
Analýza DNA. Co zjišťujeme u DNA
Analýza DNA Co zjišťujeme u DNA Genetickou podstatu konkrétních proteinů Mutace bodové (sekvenční delece nebo inzerce nukleotidů, záměny), chromosomové aberace (numerické, strukturní) Polymorfismy konkrétní
VíceCo zjišťujeme u DNA ACGGTCGACTGCGATGAACTCCC ACGGTCGACTGCGATCAACTCCC ACGGTCGACTGCGATTTGAACTCCC
Analýza DNA Co zjišťujeme u DNA Genetickou podstatu konkrétních proteinů Mutace bodové (sekvenční delece nebo inzerce nukleotidů), chromosomové aberace (numerické, strukturální) Polymorfismy konkrétní
VíceAnalýza DNA. Co zjišťujeme u DNA DNA. PCR polymerase chain reaction. Princip PCR PRINCIP METODY PCR
o zjišťujeme u DN nalýza DN enetickou podstatu konkrétních proteinů Mutace bodové (sekvenční delece nebo inzerce nukleotidů), chromosomové aberace (numerické, strukturální) Polymorfismy konkrétní mutace,
VíceCo zjišťujeme u DNA ACGGTCGACTGCGATGAACTCCC ACGGTCGACTGCGATCAACTCCC ACGGTCGACTGCGATTTGAACTCCC
Analýza DNA Co zjišťujeme u DNA genetickou podstatu konkrétních proteinů mutace bodové, sekvenční delece/inzerce nukleotidů, chromosomové aberace (numerické, strukturální) polymorfismy konkrétní mutace,
VíceRIGORÓZNÍ OTÁZKY - BIOLOGIE ČLOVĚKA
RIGORÓZNÍ OTÁZKY - BIOLOGIE ČLOVĚKA 1. Genotyp a jeho variabilita, mutace a rekombinace Specifická imunitní odpověď Prevence a časná diagnostika vrozených vad 2. Genotyp a prostředí Regulace buněčného
VíceMolekulární genetika II zimní semestr 4. výukový týden ( )
Ústav biologie a lékařské genetiky 1.LF UK a VFN, Praha Molekulární genetika II zimní semestr 4. výukový týden (27.10. 31.10.2008) prenatální DNA diagnostika presymptomatická Potvrzení diagnózy Diagnostika
Víceší šířen VAZEBNÁ ANALÝZA Vazba genů
VAZEBNÁ ANALÝZA Vazba genů Americký genetik Thomas Morgan při genetických pokusech s octomilkami (Drosophila melanogaster) popsal zákonitosti o umístění genů na chromosomech, které existují až do současnosti
VíceKlonování DNA a fyzikální mapování genomu
Klonování DNA a fyzikální mapování genomu. Terminologie Klonování je proces tvorby klonů Klon je soubor identických buněk (příp. organismů) odvozených ze společného předka dělením (např. jedna bakteriální
VíceHybridizace nukleových kyselin
Hybridizace nukleových kyselin Tvorba dvouřetězcových hybridů za dvou jednořetězcových a komplementárních molekul Založena na schopnosti denaturace a renaturace DNA. Denaturace DNA oddělení komplementárních
VíceImplementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci. reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/
Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/28.0088 Hybridizační metody v diagnostice Mgr. Gabriela Kořínková, Ph.D. Laboratoř molekulární
VícePolymorfizmy detekované. polymorfizmů (Single Nucleotide
Polymorfizmy detekované speciálními metodami s vysokou rozlišovací schopností Stanovení jednonukleotidových polymorfizmů (Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs) Příklad jednonukleotidových polymorfizmů
VíceZáklady genetiky 2a. Přípravný kurz Komb.forma studia oboru Všeobecná sestra
Základy genetiky 2a Přípravný kurz Komb.forma studia oboru Všeobecná sestra Základní genetické pojmy: GEN - úsek DNA molekuly, který svojí primární strukturou určuje primární strukturu jiné makromolekuly
VíceIzolace, klonování a analýza DNA
Izolace, klonování a analýza DNA Ing. Pavel Kotrba, Ph.D., Ing. Zdeněk Knejzlík, Ph.D., Ing. Zdeněk Chodora Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha HTpavel.kotrba@vscht.czTH, HTzdenek.knejzlik@vscht.czTH,
VíceDetekce Leidenské mutace
Detekce Leidenské mutace MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE 3. Restrikční štěpení, elektroforéza + interpretace výsledků Restrikční endonukleasy(restriktasy) bakteriální enzymy štěpící cizorodou dsdna na kratší úseky
VíceMENDELOVSKÁ DĚDIČNOST
MENDELOVSKÁ DĚDIČNOST Gen Část molekuly DNA nesoucí genetickou informaci pro syntézu specifického proteinu (strukturní gen) nebo pro syntézu RNA Různě dlouhá sekvence nukleotidů Jednotka funkce Genotyp
Více2. Z následujících tvrzení, týkajících se prokaryotické buňky, vyberte správné:
Výběrové otázky: 1. Součástí všech prokaryotických buněk je: a) DNA, plazmidy b) plazmidy, mitochondrie c) plazmidy, ribozomy d) mitochondrie, endoplazmatické retikulum 2. Z následujících tvrzení, týkajících
VíceDNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH. Michaela Nesvadbová
DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH Michaela Nesvadbová Význam identifikace živočišných druhů v krmivu a potravinách povinností každého výrobce je řádně a pravdivě označit
VíceMOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE. 2. Polymerázová řetězová reakce (PCR)
MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE 2. Polymerázová řetězová reakce (PCR) Náplň praktik 1. Izolace DNA z buněk bukální sliznice - izolační kit MACHEREY-NAGEL 2. PCR polymerázová řetězová reakce (templát gdna) 3. Restrikční
VíceCrossing-over. over. synaptonemální komplex
Genetické mapy Crossing-over over v průběhu profáze I meiózy princip rekombinace genetického materiálu mezi maternálním a paternálním chromosomem synaptonemální komplex zlomy a nová spojení chromatinových
VíceMetody molekulární biologie
Metody molekulární biologie 1. Základní metody molekulární biologie A. Izolace nukleových kyselin Metody využívající různé rozpustnosti Metody adsorpční Izolace RNA B. Centrifugační techniky o Princip
VíceMOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII. Martina Nováková, VŠCHT Praha
MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII Martina Nováková, VŠCHT Praha MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE V BIOREMEDIACÍCH enumerace FISH průtoková cytometrie klonování produktů PCR sekvenování
VíceGenové knihovny a analýza genomu
Genové knihovny a analýza genomu Klonování genů Problém: genom organismů je komplexní a je proto obtížné v něm najít a klonovat specifický gen Klonování genů Po restrikčním štěpení genomové DNA pocházející
Více"Učení nás bude více bavit aneb moderní výuka oboru lesnictví prostřednictvím ICT ". Základy genetiky, základní pojmy
"Učení nás bude více bavit aneb moderní výuka oboru lesnictví prostřednictvím ICT ". Základy genetiky, základní pojmy 1/75 Genetika = věda o dědičnosti Studuje biologickou informaci. Organizmy uchovávají,
VíceMolekulární základy dědičnosti. Ústřední dogma molekulární biologie Struktura DNA a RNA
Molekulární základy dědičnosti Ústřední dogma molekulární biologie Struktura DNA a RNA Ústřední dogma molekulární genetiky - vztah mezi nukleovými kyselinami a proteiny proteosyntéza replikace DNA RNA
VíceVyužití DNA markerů ve studiu fylogeneze rostlin
Mendelova genetika v příkladech Využití DNA markerů ve studiu fylogeneze rostlin Ing. Petra VESELÁ Ústav lesnické botaniky, dendrologie a geobiocenologie LDF MENDELU Brno Tento projekt je spolufinancován
Vícerodokmeny vazby mezi členy rodiny + popis pro konkrétní sledovaný znak využití Mendelových zákonů v lékařství genetické konzultace o možném výskytu
Genealogie Monogenní dědičnost rodokmeny vazby mezi členy rodiny + popis pro konkrétní sledovaný znak využití Mendelových zákonů v lékařství genetické konzultace o možném výskytu onemocnění v rodině Genealogické
Více2 Inkompatibilita v systému Rhesus. Upraveno z A.D.A.M.'s health encyclopedia
2 Inkompatibilita v systému Rhesus Upraveno z A.D.A.M.'s health encyclopedia 3 Inkompatibilita v systému Rhesus Úkol 7, str.119 Které z uvedených genotypových kombinací Rh systému u manželů s sebou nesou
VíceSylabus témat ke zkoušce z lékařské biologie a genetiky. Struktura, reprodukce a rekombinace virů (DNA viry, RNA viry), význam v medicíně
Sylabus témat ke zkoušce z lékařské biologie a genetiky Buněčná podstata reprodukce a dědičnosti Struktura a funkce prokaryot Struktura, reprodukce a rekombinace virů (DNA viry, RNA viry), význam v medicíně
VíceInovace studia molekulární a buněčné biologie
Inovace studia molekulární a buněčné biologie Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. MBIO1/Molekulární biologie 1 Tento projekt je spolufinancován
VíceMIKROBIOLOGIE V BIOTECHNOLOGII
Biotechnologie MIKROBIOLOGIE V BIOTECHNOLOGII Využití živých organismů pro uskutečňování definovaných chemických procesů pro průmyslové nebo komerční aplikace Organismus je geneticky upraven metodami genetického
VíceIvo Papoušek. Biologie 8, 2015/16
Ivo Papoušek Biologie 8, 2015/16 Doporučená literatura: Metody molekulární biologie (2005) Autoři: Jan Šmarda, Jiří Doškař, Roman Pantůček, Vladislava Růžičková, Jana Koptíková Izolace nukleových kyselin
VíceVýukový materiál zpracován v rámci projektu EU peníze školám
http://vtm.zive.cz/aktuality/vzorek-dna-prozradi-priblizny-vek-pachatele Autorem materiálu a všech jeho částí, není-li uvedeno jinak, je Mgr. Eva Strnadová. Dostupné z Metodického portálu www.rvp.cz ;
VíceNUKLEOVÉ KYSELINY. Základ života
NUKLEOVÉ KYSELINY Základ života HISTORIE 1. H. Braconnot (30. léta 19. století) - Strassburg vinné kvasinky izolace matiére animale. 2. J.F. Meischer - experimenty z hnisem štěpení trypsinem odstředěním
VícePolymerázová řetězová reakce. Základní technika molekulární diagnostiky.
Polymerázová řetězová reakce Základní technika molekulární diagnostiky. Kdo za to může? Kary Mullis 1983 Nobelova cena 1993 Princip PCR Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction PCR) umožňuje
VíceMetody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin
Metody používané v MB analýza proteinů, nukleových kyselin Nukleové kyseliny analýza a manipulace Elektroforéza (délka fragmentů, čistota, kvantifikace) Restrikční štěpení (manipulace s DNA, identifikace
VíceMetody studia historie populací. Metody studia historie populací
1) Metody studia genetické rozmanitosti komplexní fenotypové znaky, molekulární znaky. 2) Mechanizmy evoluce mutace, přírodní výběr, genový posun a genový tok 3) Anageneze x kladogeneze - co je vlastně
VícePříprava vektoru IZOLACE PLASMIDU ALKALICKÁ LYZE, KOLONKOVÁ IZOLACE DNA GELOVÁ ELEKTROFORÉZA RESTRIKČNÍ ŠTĚPENÍ. E. coli. lyze buňky.
Příprava vektoru IZOLCE PLSMIDU LKLICKÁ LYZE, KOLONKOVÁ IZOLCE DN E. coli plasmidová DN proteiny proteiny + + vysrážená plasmidová lyze buňky + snížení ph chromosomální DN centrifugace DN chromosomální
VíceMolekulárn. rní. biologie Struktura DNA a RNA
Molekulárn rní základy dědičnosti Ústřední dogma molekulárn rní biologie Struktura DNA a RNA Ústřední dogma molekulárn rní genetiky - vztah mezi nukleovými kyselinami a proteiny proteosyntéza replikace
VíceCrossing-over. Synaptonemální komplex. Crossing-over a výměna genetického materiálu. Párování homologních chromosomů
Vazba genů Crossing-over V průběhu profáze I meiózy Princip rekombinace genetického materiálu mezi maternálním a paternálním chromosomem Synaptonemální komplex Zlomy a nová spojení chromatinových řetězců
VíceGenetický polymorfismus
Genetický polymorfismus Za geneticky polymorfní je považován znak s nejméně dvěma geneticky podmíněnými variantami v jedné populaci, které se nachází v takových frekvencích, že i zřídkavá má frekvenci
VíceChromosomy a karyotyp člověka
Chromosomy a karyotyp člověka Chromosom - 1 a více - u eukaryotických buněk uložen v jádře karyotyp - soubor všech chromosomů v jádře jedné buňky - tvořen z vláknem chromatinem = DNA + histony - malé bazické
VíceTerapeutické klonování, náhrada tkání a orgánů
Transfekce, elektroporace, retrovirová infekce Vnesení genů Vrstva fibroblastů, LIF Terapeutické klonování, náhrada tkání a orgánů Selekce ES buněk, v nichž došlo k začlenění vneseného genu homologní rekombinací
VícePříprava rekombinantních molekul pro diagnostické účely
1 Příprava rekombinantních molekul pro diagnostické účely doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. bartosm@vfu.cz Přírodovědecká fakulta MU, 2014 2 Obsah přednášky 1) Pojem rekombinantní DNA 2) Historické milníky
VíceNávrh směrnic pro správnou laboratorní diagnostiku Friedreichovy ataxie.
Návrh směrnic pro správnou laboratorní diagnostiku Friedreichovy ataxie. Připravila L.Fajkusová Online Mendelian Inheritance in Man: #229300 FRIEDREICH ATAXIA 1; FRDA *606829 FRDA GENE; FRDA Popis onemocnění
VíceDIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU
Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální
VíceKlonování gen a genové inženýrství
Klonování gen a genové inženýrství Genové inženýrství užite né termíny Rekombinantní DNA = DNA, ve které se nachází geny nejmén ze dvou zdroj, asto ze dvou zných druh organism Biotechnologie = manipulace
VíceMendelova genetika v příkladech. Genetické markery
Mendelova genetika v příkladech Genetické markery Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a Státním rozpočtem ČR InoBio CZ.1.07/2.2.00/28.0018 Hodnocení genetické proměnlivosti Fenotypový
VíceMIKROBIOLOGIE V BIOTECHNOLOGII
Biotechnologie MIKROBIOLOGIE V BIOTECHNOLOGII Termín biotechnologie byl poprvé použit v roce 1917 Procesy, při kterých se na tvorbě výsledného produktu podílejí živé organismy Širší definice: biotechnologie
VíceAmplifikační metody umožňují detekovat. k dispozici minimálně kopií DNA,
Diagnostické amplifikační metody nevyužívající PCR Amplifikační metody umožňují detekovat jedinou kopii cílové DNA, zatímco při hybridizačních metodách musí být k dispozici minimálně 10 4-10 5 kopií DNA,
Více1. Definice a historie oboru molekulární medicína. 3. Základní laboratorní techniky v molekulární medicíně
Obsah Předmluvy 1. Definice a historie oboru molekulární medicína 1.1. Historie molekulární medicíny 2. Základní principy molekulární biologie 2.1. Historie molekulární biologie 2.2. DNA a chromozomy 2.3.
VíceDIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU
Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální
VíceZákladní pojmy obecné genetiky, kvalitativní a kvantitativní znaky, vztahy mezi geny
Obecná genetika Základní pojmy obecné genetiky, kvalitativní a kvantitativní znaky, vztahy mezi geny Doc. RNDr. Ing. Eva PALÁTOVÁ, PhD. Ing. Roman LONGAUER, CSc. Ústav zakládání a pěstění lesů LDF MENDELU
VíceVýzkumné centrum genomiky a proteomiky. Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i.
Výzkumné centrum genomiky a proteomiky Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i. Systém pro sekvenování Systém pro čipovou analýzu Systém pro proteinovou analýzu Automatický sběrač buněk Systém pro sekvenování
VíceMetody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin
Metody používané v MB analýza proteinů, nukleových kyselin Nukleové kyseliny analýza a manipulace Elektroforéza (délka fragmentů, čistota, kvantifikace) Restrikční štěpení (manipulace s DNA, identifikace
VíceCytogenetika. chromosom jádro. telomera. centomera. telomera. buňka. histony. páry bazí. dvoušroubovice DNA
Cytogenetika telomera chromosom jádro centomera telomera buňka histony páry bazí dvoušroubovice DNA Typy chromosomů Karyotyp člověka 46 chromosomů 22 párů autosomů (1-22 od největšího po nejmenší) 1 pár
VíceZDRAVOTNÍ NEZÁVADNOST POTRAVIN
ZDRAVOTNÍ NEZÁVADNOST POTRAVIN Možnosti stanovení Listeria monocytogenes popis metod a jejich princip Mária Strážiková Aleš Holfeld Obsah Charakteristika Listeria monocytogenes Listerióza Metody detekce
VíceDeoxyribonukleová kyselina (DNA)
Genetika Dědičností rozumíme schopnost rodičů předávat své vlastnosti potomkům a zachovat tak rozličnost druhů v přírodě. Dědičností a proměnlivostí jedinců se zabývá vědní obor genetika. Základní jednotkou
VíceGenetické markery, markery DNA
Obecná genetika Genetické markery, markery DNA Prof. Ing. Dušan GÖMÖRY, DrSc. Ing. Roman LONGAUER, CSc. Ústav zakládání a pěstění lesů LDF MENDELU Brno Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním
VíceGENETIKA. Dědičnost a pohlaví
GENETIKA Dědičnost a pohlaví Chromozómové určení pohlaví Dvoudomé rostliny a gonochoristé (živočichové odděleného pohlaví) mají pohlaví určeno dědičně chromozómovou výbavou jedince = dvojicí pohlavních
VíceEvropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti NUKLEOVÉ KYSELINY
Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti NUKLEOVÉ KYSELINY 3 složky Nukleotidy dusík obsahující báze (purin či pyrimidin) pentosa fosfát Fosfodiesterová vazba. Vyskytuje se mezi
VíceDědičnost vázaná na X chromosom
12 Dědičnost vázaná na X chromosom EuroGentest - Volně přístupné webové stránky s informacemi o genetickém vyšetření (v angličtině). www.eurogentest.org Orphanet - Volně přístupné webové stránky s informacemi
VíceInovace studia molekulární a buněčné biologie
Inovace studia molekulární a buněčné biologie Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. MBIO1/Molekulární biologie 1 Tento projekt je spolufinancován
VíceInovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/
Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/07.0354 Genomika (KBB/GENOM) Poziční klonování Ing. Hana Šimková, CSc. Cíl přednášky - seznámení s metodou pozičního klonování genů
VíceEnzymy v molekulární biologii, RFLP. Molekulární biologie v hygieně potravin 3, 2014/15, Ivo Papoušek
Enzymy v molekulární biologii, RFLP Molekulární biologie v hygieně potravin 3, 2014/15, Ivo Papoušek Enzymy v molekulární biologii umožňují nám provádět celou řadu přesně cílených manipulací Výhody enzymů:
VícePOLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR)
POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR) Polymerázová řetězová reakce (PCR, z anglického Polymerase Chain Reaction) je metoda rychlého zmnožení (amplifikace) vybraného úseku DNA. Množený (amplifikovaný) úsek
VíceReplikace, transkripce a translace
Replikace, transkripce a translace Pravděpodobnost zařazení chybné báze cca 1:10 4, reálně 1:10 10 ; Proč? Výběr komplementární base je zásadní pro správnost mezigeneračního předávání genetické informace
VíceMolekulární genetika
Molekulární genetika Genetické inženýrství Technologie rekombinantní DNA Vektor Genomová DNA Štěpení RE Rozštěpení stejnou RE, lepivé konce Ligace Transformace Bakteriální chromozóm Rekombinantní vektor
VíceEPIGENETIKA reverzibilních změn funkce genů, Epigenetické faktory ovlivňují fenotyp bez změny genotypu. Epigenetická
EPIGENETIKA Epigenetika se zabývá studiem reverzibilních změn funkce genů, aniž by při tom došlo ke změnám v sekvenci jaderné DNA. Epigenetické faktory ovlivňují fenotyp bez změny genotypu. Epigenetická
VíceBakteriální transpozony
Bakteriální transpozony Transpozon = sekvence DNA schopná transpozice, tj. přemístění z jednoho místa v genomu do jiného místa Transpozice = proces přemístění transpozonu Transponáza (transpozáza) = enzym
VíceEnzymy používané v molekulární biologii
Enzymy používané v molekulární biologii Rozdělení enzymů 1. Podle substrátové specifity: většina metod molekulární biologie je závislá na použití enzymů, jejichž substrátem jsou nukleové kyseliny. Tyto
VíceInovace studia molekulární a buněčné biologie
Investice do rozvoje vzdělávání Inovace studia molekulární a buněčné biologie Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. Investice do rozvoje vzdělávání
VíceGENETIKA. zkoumá dědičnost a proměnlivost organismů
GENETIKA zkoumá dědičnost a proměnlivost organismů Dědičnost: schopnost organismů uchovávat informace o své struktuře a funkčních schopnostech a předávat je svým potomkům Proměnlivost (variabilita) je
VíceHybridizace. doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. bartosm@vfu.cz
Hybridizace doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. bartosm@vfu.cz Přírodovědecká fakulta MU, 2013 Obsah přednášky 1) Způsoby provedení hybridizace 2) Hybridizace v roztoku 3) Příprava značených sond 4) Hybridizace
Více1. Téma : Genetika shrnutí Název DUMu : VY_32_INOVACE_29_SPSOA_BIO_1_CHAM 2. Vypracovala : Hana Chamulová 3. Vytvořeno v projektu EU peníze středním
1. Téma : Genetika shrnutí Název DUMu : VY_32_INOVACE_29_SPSOA_BIO_1_CHAM 2. Vypracovala : Hana Chamulová 3. Vytvořeno v projektu EU peníze středním školám Genetika - shrnutí TL2 1. Doplň: heterozygot,
VíceMendelistická genetika
Mendelistická genetika Základní pracovní metodou je křížení křížení = vzájemné oplozování organizmů s různými genotypy Základní pojmy Gen úsek DNA se specifickou funkcí. Strukturní gen úsek DNA nesoucí
Více14. přednáška z BIOLOGIE pro Bakaláře studující fyzioterapii, optometrii a pro nutriční terapeuty M.Gabriel, BÚ LF MU
14. přednáška z BIOLOGIE pro Bakaláře studující fyzioterapii, optometrii a pro nutriční terapeuty Genová diagnostika. 4. 1. 2012 M.Gabriel, BÚ LF MU Pojem alela. Geny existují v různých formách a mohou
VíceBiologie - Oktáva, 4. ročník (humanitní větev)
- Oktáva, 4. ročník (humanitní větev) Biologie Výchovné a vzdělávací strategie Kompetence k řešení problémů Kompetence komunikativní Kompetence sociální a personální Kompetence občanská Kompetence k podnikavosti
VíceZákladní genetické pojmy
Základní genetické pojmy Genetika Věda o dědičnosti a proměnlivosti organismů Používá především pokusné metody (např. křížení). K vyhodnocování používá statistické metody. Variabilita v rámci druhu Francouzský
VíceVyužití rekombinantní DNA při studiu mikroorganismů
Využití rekombinantní DNA při studiu mikroorganismů doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. bartosm@vfu.cz Přírodovědecká fakulta MU, 2014 1 2 Obsah přednášky 1) Celogenomové metody sekvenování 2) Sekvenování H.
VíceInovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/
Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/07.0354 Genomika (KBB/GENOM) Analýza transkriptomu Ing. Hana Šimková, CSc. Cíl přednášky - seznámení s moderními metodami komplexní
VíceUSING OF AUTOMATED DNA SEQUENCING FOR PORCINE CANDIDATE GENES POLYMORFISMS DETECTION
USING OF AUTOMATED DNA SEQUENCING FOR PORCINE CANDIDATE GENES POLYMORFISMS DETECTION VYUŽITÍ AUTOMATICKÉHO SEKVENOVÁNÍ DNA PRO DETEKCI POLYMORFISMŮ KANDIDÁTNÍCH GENŮ U PRASAT Vykoukalová Z., Knoll A.,
VíceAUG STOP AAAA S S. eukaryontní gen v genomové DNA. promotor exon 1 exon 2 exon 3 exon 4. kódující oblast. introny
eukaryontní gen v genomové DNA promotor exon 1 exon 2 exon 3 exon 4 kódující oblast introny primární transkript (hnrna, pre-mrna) postranskripční úpravy (vznik maturované mrna) syntéza čepičky AUG vyštěpení
VíceNěkteré vlastnosti DNA důležité pro analýzu
Některé vlastnosti DNA důležité pro analýzu Spiralizace Denaturace Záporný náboj Syntéza Ligace Rekombinace Mutabilita Despiralizace Reasociace Štěpení Metody používané k analýze DNA Southern blotting
VíceDIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR
Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální choroby
VíceMolekulárně biologické a cytogenetické metody
Molekulárně biologické a cytogenetické metody Molekulárně biologickému vyšetření obvykle předchází na rozdíl od všech předcházejících izolace nukleových kyselin, což je ve většině případů DNA jako nositelka
VíceInovace studia molekulární a buněčné biologie
Investice do rozvoje vzdělávání Inovace studia molekulární a buněčné biologie Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. Investice do rozvoje vzdělávání
VíceZáklady molekulární biologie KBC/MBIOZ
Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ 4. Metody molekulární biologie I Izolace DNA a RNA Specifické postupy pro baktérie, kvasinky, rostlinné a živočišné tkáně U RNA nutno zabránit kontaminaci RNasami
VíceIvo Papoušek. Biologie 6, 2017/18
Ivo Papoušek Biologie 6, 2017/18 Doporučená literatura: Metody molekulární biologie (2005) Autoři: Jan Šmarda, Jiří Doškař, Roman Pantůček, Vladislava Růžičková, Jana Koptíková Izolace nukleových kyselin
VíceMgr. et Mgr. Lenka Falková. Laboratoř agrogenomiky. Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Mendelova univerzita
Mgr. et Mgr. Lenka Falková Laboratoř agrogenomiky Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Mendelova univerzita 9. 9. 2015 Šlechtění Užitek hospodářská zvířata X zájmová zvířata Zemědělství X chovatelství
VíceZáklady molekulární biologie KBC/MBIOZ
Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Ivo Frébort 4. Metody molekulární biologie I Izolace DNA a RNA Specifické postupy pro baktérie, kvasinky, rostlinné a živočišné tkáně U RNA nutno zabránit kontaminaci
VíceLaboratoř molekulární patologie
Laboratoř molekulární patologie Ústav patologie FN Brno Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. 19.11.2014 Složení laboratoře stálí členové Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Mgr. Květa Lišková Mgr. Lenka Pitrová
VíceYi TPMT. Diagnostická souprava. Návod k použití. Haasova 27 Brno Česká republika. tel.:
Yi TPMT Diagnostická souprava Návod k použití Výrobce: YBUX s.r.o. Haasova 27 Brno 616 00 Česká republika IČ 63487951 tel.: +420 541 423 710 e-mail: ybux@ybux.eu Název: Yi TPMT Popis: Diagnostická souprava
VíceBiologie - Oktáva, 4. ročník (přírodovědná větev)
- Oktáva, 4. ročník (přírodovědná větev) Biologie Výchovné a vzdělávací strategie Kompetence k řešení problémů Kompetence komunikativní Kompetence sociální a personální Kompetence občanská Kompetence k
VíceEvropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti. Translace, techniky práce s DNA
Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti Translace, techniky práce s DNA Translace překlad z jazyka nukleotidů do jazyka aminokyselin dá se rozdělit na 5 kroků aktivace aminokyslin
VíceZáklady molekulární biologie KBC/MBIOZ
Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Mária Čudejková 2. Transkripce genu a její regulace Transkripce genetické informace z DNA na RNA Transkripce dvou genů zachycená na snímku z elektronového mikroskopu.
VíceInovace studia molekulární a buněčné biologie
Investice do rozvoje vzdělávání Inovace studia molekulární a buněčné biologie Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. Investice do rozvoje vzdělávání
VíceTypy nukleových kyselin. deoxyribonukleová (DNA); ribonukleová (RNA).
Typy nukleových kyselin Existují dva typy nukleových kyselin (NA, z anglických slov nucleic acid): deoxyribonukleová (DNA); ribonukleová (RNA). DNA je lokalizována v buněčném jádře, RNA v cytoplasmě a
VíceDědičnost pohlaví Genetické principy základních způsobů rozmnožování
Dědičnost pohlaví Vznik pohlaví (pohlavnost), tj. komplexu znaků, vlastností a funkcí, které vymezují exteriérové i funkční diference mezi příslušníky téhož druhu, je výsledkem velmi komplikované série
Více