Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin

Transkript

1 Metody používané v MB analýza proteinů, nukleových kyselin

2 Proteiny analýza a manipulace Izolace, purifikace (rozdělovací metody) Centrifugace Chromatografie Elektroforéza Blotting (identifikace, western blott) Strukturní analýza (MALDI-TOF, X-ray crystallography, NMR)

3 Centrifugace - frakcionace buněčných lyzátů

4 Figure 8-10 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

5 chromatografie

6

7 Figure 8-13b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

8 Figure 8-13c Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

9 ELEKTROFORÉZA Princip dělení nabitých částic na základě různých elektroforetických pohyblivostí Použití analytické i preparativní

10 Parametry separace náboj velikost tvar Koncentrace gelu nižší dělení pouze podle náboje vyšší nebo gradient dělení také podle velikosti a tvaru Vliv ph - ovlivňuje náboj, stabilitu, aktivitu "kyselá" (kyselé ph): "alkalická" (alkalické ph): + + Směr migrace závisí na pi proteinů všechny nemusí "putovat gelem"

11 ELFO na PAGE v přítomnosti SDS (Sodium Dodecyl Sulphate dodecylsíran sodný) SDS se váže na proteiny, uděluje jim uniformní záporný náboj SDS-PAGE

12 Vyhodnocení

13 2D elektroforeza - Isoelektrická fokusace (IEF) - SDS-PAGE

14 2D elektroforeza IEF + SDS-PAGE

15 2D separace Kombinace: isoelektrická fokusace/sds PAGE

16 WESTERN BLOTTING 1. elektroforéza rozdělení proteinů, např. SDS-PAGE 2. blotting přenos na membránu, např. elektroforeticky 3. detekce (většinou imunodetekce)

17 - Specifické protilátky - SDS PAGE - 2D elfo

18 Sekvenční analýza proteinů (primární struktura) Edmanovo odbourávání hmotnostní spektrometrie (MALDI TOF) Bioinformatika (geno(mo)vé databáze)

19 hmotnostní spektrometrie (mass spectrometry) MALDI -TOF

20

21 Struktura proteinu Rentgenostrukturní analýza (X-ray crystallography) NMR (z roztoků)

22

23 Nukleové kyseliny analýza a manipulace Restrikční štěpení (manipulace s DNA, identifikace specifických sekvencí) Elektroforéza (délka fragmentů, čistota, kvantifikace) Hybridizace (identifikace specifických sekvencí) Amplifikace DNA (PCR) klonování Sekvenace DNA

24 Restrikční štěpení Restrikční endonukleásy štěpení specifické sekvence tupé/kohezní konce Figure 8-31 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

25

26

27 Restrikční endonukleasy - příklady

28 o rozdělení makromolekul dle mobility v elektrickém poli o DNA záporně nabitá o vizualizace interkalační činidla, fluorofory (Et-Br excitace UV, toxický!) o Marker : DNA o známé mol. Hmotnosti o Nosič: agaroza Elektroforeza separace galaktóza a 3,6-anhydrogalaktóza

29

30

31 Příklady: Barvení ET-Br Parciální štěpení PFGE

32 Hybridizace - detekce specifických sekvencí

33 Northen/Southern Blotting hybridizace elektroforeticky separovaných molekul RNA/DNA

34

35 Proba specificky značená radioaktivně (32P), chemicky (digoxygenin), protilátkou

36 Hybridizace - detekce specifických sekvencí In situ- Lokalizace genů na chromosomech

37 PCR (polymerase chain reaction) Namnožení specifického úseku DNA analýza genu (přítomnost, mutace) genové exprese (RT PCR) kvantifikace DNA (qpcr) 3 kroky: 1) denaturace rozpad dvoušroubovicové str. - ssdna 2) annealing - nasednutí primerů na specifická místa ssdna 3) polymerace - syntéza DNA (termostabilní DNA polymeraza) Např. 30 cyklů (z 1 původní molekuly DNA lze získat po 32 cyklech až 1 miliardu kopií)

38

39

40

41 (thermo)cycler

42 Klonování Produkce specifických proteinů Příprava knihoven (DNA, cdna)

43 Figure 8-40 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

44 DNA and cdna library Figure 8-41 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

45 Figure 8-42 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

46 Figure 8-43 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

47 Figure 8-44 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

48 Basic components of a plasmid cloning vector that can replicate within an E. coli cell. Plasmid vectors contain a selectable gene such as ampr, which encodes the enzyme - lactamase and confers resistance to ampicillin. Exogenous DNA can be inserted into the bracketed region without disturbing the ability of the plasmid to replicate or express the ampr gene. Plasmid vectors also contain a replication origin (ORI) sequence where DNA replication is initiated by host cell enzymes. Inclusion of a synthetic polylinker containing the recognition sequences for several different restriction enzymes increases the versatility of a plasmid vector. The vector is designed so that each site in the polylinker is unique on the plasmid.

49 DNA cloning in a plasmid vector permits amplification of a DNA fragment. A fragment of DNA to be cloned is first inserted into a plasmid vector containing an ampicillin-resistance gene (ampr). Only the few cells transformed by incorporation of a plasmid molecule will survive on ampicillincontaining medium. In transformed cells, the plasmid DNA replicates and segregates into daughter cells, resulting in formation of an ampicillin resistant colony.

50 Figure 8-46 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

51 Produkce specifických Proteinů Rekombinantní proteiny

52 Fingerprinting RFLP délka restrikčních fragmentů VNTR délka repetic (variabilní počet tandemových repetic - VNTR) STR délka krátkých tandemových repetic

53 Figure 8-47a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

54 Sekvenování DNA

55

56

57

58

59 Tkáňové kultury kmenové buňky o Složení media (hormony, růstové faktory) vliv na diferenciaci

60 Tkáňové kultury in vitro o Vitamíny, aminokyseliny, glukosa, minerály o Sérum hormony, růstové faktory o Vhodný podklad o Kontaktní inhibice konfluentní vrstva

61 Tkáňové kultury růstová křivka o Lag fáze o Log fáze o Plató (stacionární fáze) vyčerpání média, kontaktní inhibice

62 pasážování o Prodloužení proliferace (vyšší počet buněk) o Některé linie omezený počet pasáží X permanentní linie

63 A mouse fibroblasts B chick muscle cells C rat nerve cells D tobaco cells (in liquid culture) Figure 8-4 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

64 Table 8-1 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

65 Příprava protilátek monoklonální polyklonální

66 polyklonální protilátky

67 Monoklonální protilátky

68 ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay