Estrogeny a dal í látky s vlivem na jaderné receptory produkované sinicemi K. Hilscherová E. Sychrová, T. Štěpánková, K. Bártová, L. Bláha Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí Přírodovědecká fakulta, Masarykova Universita, Brno
Bioaktivní látky v sinicích Extrakty z vodních kv t v t í ú inky ne dle obsahu cyanotoxin (ryby, oboj ivelníci, bezobratlí, savci) Vodní kv ty mohou akumulovat r zné antropogenní chemické látky Ú inek sm sí z vodního kv tu = výsledek interakcí mnoha endogenních i akumulovaných látek (spolup sobení, antagonism, synergismus) H H H 3 S N NH NH NH H 3 C H NH Známé cyanotoxiny Dal í bioaktivní látky produkované sinicemi CH 3 H 3 C CH CH 3 N NH NH H 2 C H 3 C CH 3 C H 3 NH CH 3 NH NH NH CH NH HN NH 2 CH 3 CH 3 Antropogenní kontaminanty N H C H 3
Bioaktivní látky v sinicích tvo í komplexní sm s V in vivo studiích bylo po p sobení extrakt ze sinicového vodního kv tu zji t no ovlivn ní fertilizace, reprodukce, vývoje oocyt, kvality spermatu u savc, sam ího reproduk ního systému u savc a pták, p e ití, reprodukce u bezobratlých ivo ich Specifické mechanismy ú inku endokrinní disrupce, toxicita dioxinového typu, imunotoxicita, neurotoxicita Cíl studie: Zjistit zda sinice produkují látky, které by mohli p sobit d le itými specifickými mechanismy a tak naru ovat fungování endokrinního systému
Endokrinní disrupce Mo né následky Naru ení homeostázy, reprodukce, vývoje i chování Posun v pom ru pohlaví, poruchy sexuálního vývoje Sní ená plodnost, líhnivost Sní ená imunita Karcinogeneze Malformace
Naru ení hormonální regulace Syntéza hormon Transport Inhibice Interakce s receptory Metabolizace Stimulace
Studované mechanizmy ú inku Interakce s jadernými receptory d le ité mechanismy chronické toxicity Toxicita dioxinového typu Aryl hydrokarbonový receptor (AhR) indukce detoxika ních systém naru ení funkce jater, imunity a reprodukce, endokrinního a nervového systému, karcinogenita, embryotoxicita cross-talk s jinými hormonálními signálními drahami Anti/estrogenita Estrogenní receptor (ER) vývoj pohlaví, ízení reprodukce, karcinogeneze, ovliv uje bun nou proliferaci a diferenciaci, vývoj a homeostázu Anti/androgenita Androgenní receptor (AR) vývoj pohlaví, zejména sam ích pohlavních charakteristik, ízení reprodukce, karcinogeneze, ovliv uje r st, spermatogenezi Glukokortikoidní aktivita Glukokortikoidní receptor (GR) ovliv uje vývoj, metabolismus, immunitní odpov, reakci na stres Anti/retinoidní aktivita Receptor kyseliny retinové (RAR) reguluje r st, morfogenezi, apoptozu a diferenciaci, ovliv uje nervový a imunitní systém, vid ní a embryonální vývoj
Biodetek ní systémy Estrogen or xenoestrogen ER P ER Protein Phosphorylation of ER: Ligand-Independent Activation ERE- Luc + ER P P ER ER DNA Binding Nuclear Factors mrna Luciferase Light Estrogenic Effects ER-Responsive Genes Bun né linie s reporterovým genem luciferázou pod kontrolou: AhR toxicita dioxinového typu (krysí karcinom jater, H4IIE.luc) ER anti/estrogenicita (lidský prsní karcinom, MVLN / z MCF-7) AR anti/androgenicita,gr glukokortikoidní aktivita (lidský prsní karcinom, MDA-kb2) RAR retinoidní aktivita (my í embryonální karcinom, P19/A15)
Komplexní vodní kv ty z prost edí Sample Species composition Date of sampling Locality Total microcystin content (µg/g dw) A Microcystis aeruginosa 8 ctober 2004 Brno - reservoir n.d. (90%), Microcystis wesenbergii (10%) B Microcystis aeruginosa 1 ctober 2007 Brno - reservoir 410 (30%), Microcystis wesenbergii (20%), Microcystis ichthyoblabe (25%), Aphanizomenon sp. (25%) C Anabaena spiroides 19 August 1998 Jedovnice - pond n.d. D Aphanizomenon flosaquae (70%), Microcystis viridis (30%) l ovec 14 August 1997 Skalka - dam reservoir E Planktothrix agardhii 8 September 2004 Dubice - flooded pit 2290 715
Komplexní vodní kv ty z prost edí Sample Species composition Date of sampling Locality Total microcystin content Vzorky (µg/g dw) A Microcystis aeruginosa 8 ctober 2004 Brno - reservoir n.d. (90%), Microcystis wesenbergii Vodný (10%) extrakt z biomasy B Microcystis Frakce aeruginosa 1 polární 1 ctober 2007 Brno - reservoir 410 (30%), Microcystis Frakce 2 mén polární obsahující microcystiny wesenbergii (20%), Microcystis ichthyoblabe (25%), Aphanizomenon sp. (25%) C Anabaena spiroides 19 August 1998 Jedovnice - pond n.d. D Aphanizomenon flosaquae (70%), Microcystis viridis (30%) l ovec 14 August 1997 Skalka - dam reservoir E Planktothrix agardhii 8 September 2004 Dubice - flooded pit 2290 715
250 ESTRGENNÍ AKTIVITA PR-ANDRGENNÍ AKTIVITA % of E 2 max induction 200 150 100 50 0 0.000078 0.00078 0.0078 0.000625 0.00625 0.0078 0.03125 0.000625 0.00625 0.0078 0.03125 0.0015 0.015 0.15 0.0015 0.015 0.15 0.025 0.25 2.5 A A 1 A 2 B B 1 B 2 150 V polární (bez MC) i mén polární frakci (s MC) % of E 2 max induction 100 50 0 0.000078 0.00078 0.0078 0.0078 0.078 0.78 0.000625 0.00625 0.00078 0.0039 0.0078 0.0125 0.03125 0.125 0.0078 0.03125 C C 1 C 2 D D 1 D 2 250 200 150 100 50 0 0.000078 0.00078 0.00156 0.003125 0.000078 0.000625 0.00078 0.00625 0.0078 0.03125 0.000078 0.00078 % of E 2 max induction E E 1 E 2 equivalent biomass concentration (g dw/l)
Sample Species Collection Cyanobacteria Laboratorní kultury Place of origin Toxin Estrogen equivalent production (EEQ, ng E 2 /L ) Country Water body (µg/g dw) 1x EC 20 EC 50 1 Anabaena flos-aquae UTEX USA Mississippi n.d. 0.67 0.58 0.19 2 Aphanizomenon flos-aquae PCC Netherland Lake Brielse Meer MC n.d. CYN 3100 n.s. n.s. n.s. 3 Aphanizomenon flos-aquae SAG Canada unspecified n.d. n.s. n.s. n.s. 4 Aphanizomenon gracile RCX Ireland Lake LoughNeagh n.d. 1.5 1.82 0.79 5 Aphanizomenon gracile 6 Aphanizomenon klebahnii CCALA 7 Cylindrospermopsis raciborskii SAG Germany Lake Plussee SAG Great Britain Hungary reservoir Queen Elizabeth Lake Balaton MC 2500 8 Microcystis aeruginosa PCC Netherland reservoir Braakman CYN n.d. 9 Planktothrix agardhii CCALA Germany Lake Plussee MC 170 CYN n.d. 10 Planktothrix agardhii SAG France Rendeau MC 200 CYN n.d. Algae n.d. 0.67 0.74 0.61 n.d. n.i. 0.69 0.66 n.d. 1.7 1.6 1.7 11.8 6.2 7.2 0.48 0.51 0.54 n.i. 0.75 0.81 11 Chlorella kessleri CCALA USA 1.9 1.2 0.69 12 Scenedesmus quadricauda CCALA Germany Greifswald 3.88 4.5 2.7
Sample Species Collection Cyanobacteria Laboratorní kultury Place of origin Toxin Estrogen equivalent production (EEQ, ng E 2 /L ) Country Water body (µg/g dw) 1x EC 20 EC 50 1 Anabaena flos-aquae UTEX USA Mississippi n.d. 0.67 0.58 0.19 2 Aphanizomenon flos-aquae PCC Netherland Lake Brielse Meer MC n.d. CYN 3100 n.s. n.s. n.s. 3 Aphanizomenon flos-aquae SAG Canada unspecified n.d. n.s. n.s. n.s. 4 5 Aphanizomenon gracile Aphanizomenon gracile RCX 6 Aphanizomenon klebahnii CCALA 7 Ireland Lake LoughNeagh SAG Germany Lake Plussee Great Britain reservoir Queen Elizabeth SAG Zakoncentrování Cylindrospermopsis raciborskii organických látek Hungary na SPE Lake Balaton MC 2500 8 Microcystis aeruginosa PCC Netherland reservoir Braakman CYN n.d. MC 170 9 Planktothrix agardhii CCALA Germany Lake Plussee CYN n.d. Vodné extrakty z biomasy MC 200 10 Planktothrix agardhii SAG France Rendeau CYN n.d. Algae Vzorky Exudáty (C18 ASIS HLB + ALLTECH CARBGRAFF) n.d. 1.5 1.82 0.79 n.d. 0.67 0.74 0.61 n.d. n.i. 0.69 0.66 n.d. 1.7 1.6 1.7 11.8 6.2 7.2 0.48 0.51 0.54 n.i. 0.75 0.81 11 Chlorella kessleri CCALA USA 1.9 1.2 0.69 12 Scenedesmus quadricauda CCALA Germany Greifswald 3.88 4.5 2.7
Estrogenita u laboratorních kultur Významné EEQs v exudátech v t iny druh % E2max induction 150 100 50 0 Aphanizomenon gracile CCALA Aphanizomenon gracile SAG Planktothrix agardhii CCALA Planktothrix agardhii SAG % E 2max induction 150 100 50 0 Anabaena flos-aquae Microcystis aeruginosa Cylindrospermopsis raciborskii Chlorella k essleri 1.23 3.7 11.1 33.3 100 500 0.5x 1x 5x 10x calibration curve E2 (pm) concentration factor -50 1.23 3.7 11.1 33.3 100 500 0.5x 1x 5x 10x calibration curve E2 (pm) concentration factor Estrogenní aktivita extrakt obou druh as a u sinice Aphanizomenon gracile ze 2 r zných sbírek % E2max induction. 350 300 250 200 150 100 50 0-50 Aphanizomenon gracile CCALA Aphanizomenon gracile SAG Chlorella k essleri Scenedesmus quadricauda ú inky nesouvisely s koncentrací sledovaných cyanotoxin (MC, CYN) 1.23 3.7 11.1 33.3 100 500 E2 calibration (pm) 0.0031 0.0093 0.028 0.083 0.25 concentration (g/l)
Estrogenní ekvivalenty v biomase Environmentální vzorky EEQ 20 (ng/g dw) Sample crude extract permeate eluate A 730 200 140 B 970 360 19 C n.s. n.s. n.s. D 760 * 150 220 E n.c. 2200 n.c. Laboratorní kultury Sample Species Collection Maximal induction (% E 2 max) EEQ 50 (ng E 2 /g dw) EEQ 20 EEQ 80 (ng E 2 /g dw) 4 Aphanizomenon gracile RCX 319 280 113-667 5 Aphanizomenon gracile SAG 92 15 10-24 11 Chlorella kessleri CCALA 86 62 54-72 12 Scenedesmus quadricauda CCALA 66 58 113 l.i. Exudáty 0,5 12 ng/l
Estrogenní ekvivalenty v biomase Environmentální vzorky EEQ 20 (ng/g dw) Sample crude extract permeate eluate A 730 200 140 B 970 360 19 C n.s. n.s. n.s. D 760 * 150 220 E n.c. 2200 n.c. Rámcový odhad pro brn nskou p ehradu Laboratorní kultury P i hustot 20 000 bun k/ml EEQ v biomase cca 0,8 ng/l P i hustot 100 000 bun k/ml EEQ EEQ 4,3 50 ng/l EEQ 20 EEQ 80 Sample Species Collection Maximal induction (% E 2 max) (ng E 2 /g dw) (ng E 2 /g dw) 4 Aphanizomenon gracile RCX 319 280 113-667 5 Aphanizomenon gracile SAG 92 15 10-24 11 Chlorella kessleri CCALA 86 62 54-72 12 Scenedesmus quadricauda CCALA 66 58 113 l.i. Exudáty 0,5 12 ng/l
Environmentální relevance Koncentrace EEQ v hladinách ng/l mohou vyvolávat reprodukční toxicitu u vodních organismů. Zha et al. 2008. Kompletní inhibice F-1 generace v multigenerační studii na střevlích (0.2 ng/l ethinylestradiolu EE2, Gobiocypris rarus). Toxicol. Appl. Pharmacol. 226: 298-308 Zha et al. 2008. vlivnění plodnosti, rodivosti, feminizace samců, vznik ova-testis, zvýšený VTG v plazmě (4 ng/l EE2, Gobiocypris rarus, 21 dní). Ecotoxicol. Environ. Safety 71: 390-399 Kidd et al. 2007. Kolaps rybích populací po expozici estrogenu (5 ng/l EE2, 7 let). Proceedings of the National Academy of Sciences 104(21):8897-8901 Controls +Ethinylestradiol
Shrnutí Látky z cyanobakterií a as mohou ovliv ovat signálování jaderných receptor Nezji t na významná aktivita dioxinového typu, glukokortikoidní i anti/retinoidní aktivita Zji t no naru ení signálování androgenního receptoru Nejvýznamn j í efekt: ESTRGENITA u p írodních i laboratorních biomas u sinic i as v extraktech i v exudátech (! Ú inky u více druh!) v polární i mén polární frakci (více látek) nesouvisí se známými cyanotoxiny? cyano-fyto estrogeny? D kuji za pozornost http:/www.recetox.muni.cz