Metodika ozdravování česneku od virů pomocí kultivace meristému a in vitro kultur

Metodika ozdravování česneku od virů pomocí kultivace meristému a in vitro kultur Břetislav Křižan, Eva Ondrušiková, Martina Kudělková Lenka Wasserbauerová, Jana Krajíčková Kateřina Smékalová, Karel Dušek CERTIFIKOVANÁ METODIKA Mendelova univerzita v Brně, Zahradnická fakulta Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2010

Autorský kolektiv: Ing. Břetislav Křižan, Ph.D. Ing. Eva Ondrušiková, CSc. Ing. Martina Kudělková Ing. Lenka Wasserbauerová Mgr. Jana Krajíčková Ing. Kateřina Smékalová, Ph.D. Ing. Karel Dušek, CSc. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2010 ISBN: 2

Název: Autoři: Metodika ozdravování česneku od virů pomocí kultivace meristému a in vitro kultur Vypracoval kolektiv autorů pod vedením Ing. Břetislava Křižana, Ph.D. Ing. Břetislav Křižan, Ph.D., Ing. Eva Ondrušiková, CSc., Ing. Martina Kudělková - Mendelova univerzita v Brně, Zahradnická fakulta Ing. Lenka Wasserbauerová, Mgr. Jana Krajíčková - Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o. Ing. Kateřina Smékalová, Ph.D., Ing. Karel Dušek, CSc. - Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Oddělení zelenin a speciálních plodin Olomouc Vydal: Tisk: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. MediaDIDA s.r.o., Olomouc Vyšlo v roce: 2010 Vydáno bez jazykové úpravy. Kontakt na vedoucího autorského kolektivu: bretislav.krizan@seznam.cz Oponenti: Ing. Jaroslav Rod, CSc., Česká společnost rostlinolékařská Ing. Ivan Branžovský, CSc., MZe Praha Autoři fotografií: Břetislav Křižan, Martina Kudělková, Oldřiška Naušová Fotografie na úvodní straně: Rostlinky česneku kultivované z meristémů, autor Břetislav Křižan Dedikace: Metodika vznikla za finanční podpory Ministerstva zemědělství a je výstupem řešení projektu NAZV QH 71228 s názvem Ozdravení domácích genotypů česneku za účelem jejich uchování metodou kryokonzervace. Doba řešení 1.5.2007 31.12.2011 Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2010 ISBN: 3

4

Metodika ozdravování česneku od virů pomocí kultivace meristému a in vitro kultur Břetislav Křižan, Eva Ondrušiková, Martina Kudělková Lenka Wasserbauerová, Jana Krajíčková Kateřina Smékalová, Karel Dušek CERTIFIKOVANÁ METODIKA Mendelova univerzita v Brně, Zahradnická fakulta Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2010 5

Obsah 6 ÚVOD 7 1 CÍL METODIKY 9 2 METODICKÝ POSTUP OZDRAVOVÁNÍ ČESNEKU POMOCÍ CHEMOTERAPIE A IZOLACE MERISTÉMU 10 2.1 Vybavení a chemikálie potřebné k ozdravování 10 2.2 Testování zdravotního stavu rostlin 11 2.3 In vitro kultury založení a uchovávání 11 2.3.1 Složení živných médií 11 2.3.2 Příprava kultivačního média 13 2.3.3 Založení kultur a kultivační podmínky 14 3 SROVNÁNÍ NOVOSTI POSTUPŮ 15 4 POPIS UPLATNĚNÍ CERTIFIKOVANÉ METODIKY 16 5 EKONOMICKÉ ASPEKTY 16 6 SEZNAM POUŽITÉ SOUVISEJÍCÍ LITERATURY 18 7 SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ PŘEDCHÁZELY METODICE 19 8 PŘÍLOHY 20 6

Seznam zkratek BAP - 6-benzylaminopurin ECPGR - European Cooperative Programme for Plant Genetic Resources ELISA - Enzyme Linked Imunosorbent Assay GA 3 - kyselina giberelová GCLV - Garlic common latent carlavirus IPGRI - International Plant Genetic Resources Institute LYSV - Leek yellow stripe potyvirus NAA - kyselina 1-naftyloctová NAZV - Národní agentura pro zemědělský výzkum MZe - Ministerstvo zemědělstvi ČR OYDV - Onion yellow dwarf potyvirus PVP K-25 - polyvinylpyrrolidon K-25 RT-PCR - Polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí SRS - Státní rostlinolékařská správa ÚKZUZ - Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský SLV - Shallot latent carlavirus Úvod Na olomouckém pracovišti VÚRV, v.v.i. je ve formě polní kolekce dlouhodobě udržována největší kolekce dlouhodenních, vegetativně množených česneků v Evropě (a zřejmě i na světě), která zahrnuje 647 různých genotypů česneku. Udržování a péče o tuto kolekci vychází ze zákonů č. 148/2003 Sb. (Zákon o konzervaci a využívání genetických zdrojů rostlin a mikroorganismů významných pro výživu a zemědělství) a č. 458/2003 Sb. (Prováděcí vyhláška k zákonu o genetických zdrojích rostlin) a mezinárodní spolupráce ČR s organizacemi IPGRI a ECPGR. Ačkoli termín udržování a péče nedefinuje přesné požadavky na zdravotní stav rostlin v kolekci, bylo již v roce 2004 zřejmé, že kolekce je výrazně napadena virovými chorobami. Při testování náhodného souboru 57 genotypů z celkového počtu 622 genotypů dlouhodenních vegetativně množených česneků bylo zjištěno, že 95 % rostlin z tohoto souboru je nakaženo virem OYDV, 93 % virem GCLV, 49 % virem SLV a 61 % virem LYSV. V celém souboru nebyla nalezena jediná zcela zdravá rostlina, naopak 18 % testovaných rostlin bylo nakaženo kompletní sadou všech těchto čtyř virů (Klukáčková et al. 2004). Tyto výsledky napověděly, že zdravotní stav kolekce je minimálně alarmující. V roce 2007 bylo zahájeno řešení grantového projektu NAZV QH 71228 s názvem Ozdravení domácích genotypů česneku za účelem jejich uchování metodou kryokonzervace a dobou řešení 1.5.2007-31.12.2011. Na řešení výzkumného úkolu spolupracují 3 pracoviště, a to: Výzkumný ústav rostlinné 7

výroby, v.v.i.; Mendelova univerzita v Brně, Zahradnická fakulta a Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o. Ačkoli tato metodika ozdravování česneku od virových chorob vychází jako jeden z výstupů projektu, který není cíleně zaměřen na uživatele z řad šlechtitelů, množitelů a pěstitelů česneku, mohou postupy v ní popsané sloužit k rozšíření jejich vědomostí a znalostí. Cílovou skupinou uživatelů metodiky jsou však především orgány státní správy (SRS, ÚKZUZ) a vědecká a výzkumná pracoviště a školy, které se problematice česneku a příbuzných plodin, jejich zdravotního stavu apod. věnují. Prezentované postupy mohou být experimentálně aplikovány při dalším výzkumu na jiných genotypech česneku, popř. na plodinách česneku příbuzných (cibule, šalotka, pór a některé okrasné cibuloviny např. tulipány, kosatce, mečíky apod.), kterým se problémy s virovými chorobami také nevyhýbají. V metodice je publikován postup, podle kterého jsou v současné době ozdravovány genotypy česneku vybrané jako nejcennější část národní kolekce dlouhodenních, vegetativně množených česneků. Je přáním autorů, aby publikované informace sloužily k ozdravování dalších genotypů, aby bylo možno uchovávat a množit zdravý materiál, tohoto důležitého druhu zeleniny. Princip známých metod ozdravování česneku od virových chorob: a) Izolace a kultivace meristémů in vitro Metoda spočívá v odběru (izolaci) meristému buď z již sterilně kultivovaných segmentů stroužků či rostlin, nebo z desinfikovaných stroužků. Narostlým rostlinkám (prorůstajícím stroužkům) je v tomto případě sterilně odebrán meristém tak, že dvěma podélnými řezy mimo osu pochev je obnažen růstový vrchol a z něj pak vypreparován meristém velikosti 0,3 až 0,8 mm. Meristémy jsou dále kultivovány v celistvé rostliny ve sterilním prostředí laboratoře. Pro zdárný vývoj izolovaného meristému je nutná přítomnost NAA v kultivačním médiu. b) Termoterapie Při použití této metody je využíváno působení zvýšené teploty během kultivace (zpravidla 37 o C a více) na sterilně kultivovaný materiál po dobu 25 až 60 dní. Zvýšená teplota zabraňuje množení viru, jakož i jeho distribuci v rostlině. c) Termoterapie s izolací meristému Jedná se o kombinovanou metodu, kdy jsou nejprve stroužky nebo rostliny kultivovány při zvýšené teplotě (zpravidla 37 o C a více) a následně je z takto ošetřených rostlin sterilně odebrán meristém. Meristém je dále kultivován v celistvou rostlinu. 8

d) Chemoterapie Metoda využívá působení tzv. antivirotik (látek inhibujících množení virové RNA). Tyto látky jsou přidávány do médií, na nichž jsou rostliny kultivovány. Nejběžnější používanou látkou je ribavirin v dávkách od 5 mg.l -1 do 100 mg.l -1 média. e) Chemoterapie s izolací meristému Jedná se o kombinovanou metodu, kdy jsou nejprve stroužky nebo rostliny kultivovány na médiu obsahujícím antivirotikum a následně je z takto ošetřených rostlin sterilně odebrán meristém. Meristém je dále kultivován v celistvou rostlinu. f) Metoda Cryo-knife V tomto případě se jedná o využití ultranízkých teplot při kryokonzervaci rostlin (-196 o C) k eliminaci virů. Rostlinný materiál, který je po uchování metodou kryokonzervace odtáván a opětovně kultivován, je tímto v podstatě ozdraven, neboť buňky napadené viry zpravidla kryokonzervaci nepřežijí. 1 Cíl metodiky Cílem předkládané Metodiky ozdravování česneku od virů pomocí kultivace meristému a in vitro kultur je zveřejnit metodický postup, podle kterého je možno genotypy česneku ozdravit od virových chorob, resp. metodický postup, kterým bylo při ozdravování dosaženo nejlepších výsledků. Další známé a dříve či jinde využívané techniky ozdravování česneku jsou v úvodu metodiky uvedeny pro přehled a z důvodu poskytnutí ucelených informací. 9

2 Metodický postup ozdravování česneku pomocí chemoterapie a izolace meristému 2.1 Vybavení a chemikálie potřebné k ozdravování Přístrojové zabezpečení Pro zajištění všech kroků nutných k úspěšnému ozdravování česneku od virových chorob je vhodné využít následující prostory: Chemická laboratoř a přípravna roztoků Laboratoř vybavená pro testování rostlin metodou ELISA Laboratoř vybavená pro práci s in vitro kulturami a kultivační místnost Výše uvedené laboratoře musí být vybaveny přístroji: Chladnička (+ 4 C) Mraznička (-20 C) Stereoskopický binokulární mikroskop Autokláv Laminární box Kultivační místnost ph-metr Analytické laboratorní váhy Termostat Destilační (popř. demineralizační) přístroj Homogenizér vzorků Promývačka mikrotitračních destiček Absorbanční ELISA reader (filtr λ = 405 nm) Pipety s nastavitelným objemem v celkovém rozsahu 0,1μl 10ml Multikanálová pipeta s objemem 20-200 μl Chemikálie Chemikálie pro imunochemii: sady testovacích sér (IgG + konjugát) pro jednotlivé viry, Na 2 CO 3, NaHCO 3, NaCl, KCl, KH 2 PO 4, NaHPO 4 12H 2 O, HCl, NaOH, PVP K-25, Tween 25, sušené mléko, diethanolamin Chemikálie pro in vitro kultury a ozdravování: NH 4 NO 3, KNO 3, MgSO 4 7H 2 O, KH 2 PO 4, CaCl 2 2H 2 O, FeSO 4 7H 2 O, Na 2 EDTA 2H 2 O, MnSO 4 H 2 O, ZnSO 4 7H 2 O, Na 2 MoO 4 2H 2 O, CuSO 4 5 H 2 O, H 3 BO 3, KI, CoCl 2 6H 2 O, AlCl 3 6H 2 O, sacharóza, agar (B & 10

V commercial agar S 1000, Itálie), BAP, GA 3, NAA, thiamin, kyselina nikotinová, glycin, myo-inositol, HgCl 2, ribavirin, etanol, NaOH, KOH Materiál Laboratorní sklo a plasty Mikrotenové sáčky na uchování vzorků Skalpely, pinzety, očkovací jehly 2.2 Testování zdravotního stavu Výchozí testování genotypů česneku určených k ozdravení provedeme metodou ELISA podle metodiky firmy Bioreba. Vzorky listových čepelí homogenizujeme ručním nebo poloautomatickým homogenizérem a k testování použijeme sady testovacích sér (IgG + konjugát) pro jednotlivé viry a lyofilizované pozitivní a negativní kontrolní vzorky od firmy Bioreba. Dle metodiky této firmy připravíme i pufrovací roztoky. Absorbanci vzorků měříme ELISA readerem při 405 nm. Podrobný popis testování metodou ELISA lze najít v publikaci Smékalová et al., 2010. Testování na přítomnost virů je možné provádět i podle metodik dalších výrobců sér, popřípadě metodou RT-PCR. Testování rostlin česneku udržovaných v in vitro kultuře provádíme, jakmile rostlinky vypěstované z meristémů dosáhnou výšky 10 cm. Z rostlin odebíráme vzorky nejstarších listů, které jsou při pasážování kultur odstraňovány. Každou rostlinu testujeme samostatně. 2. 3 In vitro kultury založení a uchovávání 2. 3. 1 Složení živných médií Pro ozdravování českých genotypů česneku se osvědčilo médium MS (Murashige, Skoog 1962). Použití dalších médií, publikovaných v pracích Haque et al., (2003); Ucman et al. (1998) a použití média WPM (Lloyd, McCown, 1981) přináší výsledky při kultivaci genotypů z Asie. Pro pěstování českých genotypů jsou tato média nepoužitelná. Médium MS použijeme ve dvou modifikacích, a to jako médium R25 (MS bez růstových regulátorů s 25 mg.l -1 ribavirinu) a médium C1 (MS s 0,5 mg l -1 BAP, 0,1 mg l -1 NAA a 0,5 mg l -1 GA3) viz tabulka 1. Příprava používaných médií je popsána dále. 11

Zásobní roztoky Zásobní roztoky usnadňují celkový postup přípravy médií. Rozdělením na jednotlivé roztoky je zabráněno vzájemnému vysrážení některých solí, což značně komplikuje příjem živin rostlinou. Každou chemikálii rozpustíme zvlášť a teprve po úplném rozpuštění jednotlivých chemikálií v destilované vodě smícháme vzniklé dílčí roztoky dle níže uvedeného pořadí a doplníme destilovanou vodou na požadovaný objem. K přípravě kultivačního média MS použijeme následující zásobní roztoky: Makroelementy Roztok připravíme 20krát koncentrovaný (tj. na 20 l média). K přípravě použijeme 1000 ml odměrnou baňku. Navážíme: 33,00 g NH 4 NO 3 ; 38,00 g KNO 3 ; 7,40 g MgSO 4 7H 2 O a 3,40 g KH 2 PO 4. Roztoku dávkujeme 50 ml do 1 l připravovaného média. Roztok chloridu vápenatého Roztok připravíme 50krát koncentrovaný (tj. na 50 l média). K přípravě použijeme 500 ml odměrnou baňku. Navážíme: 22,00 g CaCl 2 2H 2 O. Roztoku dávkujeme 10 ml do 1 l připravovaného média. Mikroelementy Roztok připravíme 50krát koncentrovaný (tj. na 50 l média). K přípravě použijeme 250 ml odměrnou baňku. Navážíme: 845,00 mg MnSO 4 H 2 O; 430,00 mg ZnSO 4 7H 2 O; 310,00 mg H 3 BO 3 ; 41,50 mg KI; 12,50 mg Na 2 MoO 4 2H 2 O; 1,25 mg CuSO 4 5H 2 O; 1,25 mg CoCl 2 6H 2 O a 1,25 mg AlCl 2 6H 2 O. Roztoku dávkujeme 5 ml do 1 l připravovaného média. Vitamíny Roztok připravíme 25krát koncentrovaný (tj. na 25 l média). K přípravě použijeme 250 ml odměrnou baňku. Navážíme: 10,00 mg thiaminu, 50,00 mg pyridoxinu; 50,00 mg kyseliny nikotinové a 200,00 mg glycinu. Roztoku dávkujeme 10 ml do 1 l připravovaného média. Roztoky růstových regulátorů Roztoky připravíme do 50 ml odměrných baněk. Koncentrace roztoku BAP je 1 mg.ml -1. V případě kyselin NAA a GA 3 připravíme roztoky o koncentraci 0,1 mg.ml -1. BAP a NAA rozpustíme napřed v malém množství 5 % NaOH a doplníme destilovanou vodou na požadovaný objem. GA 3 je nutno napřed rozpustit v malém množství etanolu a pak doplnit destilovanou vodou na požadovaný objem. 12

Všechny zásobní roztoky skladujeme v temnu v ledničce při teplotě 4 C. Roztoky makroelementů, mikroelementů a roztok chloridu vápenatého lze takto skladovat až 1 rok, roztok vitamínů a roztoky regulátorů růstu maximálně 2 měsíce. Potom je nutno připravit roztoky čerstvé. 2.3.2 Příprava kultivačního média Tabulka 1: Složení kultivačních médií R25 a C1 (modifikované MS). Složka (mg l -1 ) Chemoterapie R25 Kultivace meristémů C1 NH 4 NO 3 1 650 1 650 KNO 3 1 900 1 900 MgSO 4 7H 2 O 370 370 KH 2 PO 4 170 170 CaCl 2 2H 2 O 440 440 FeSO 4 7H 2 O 27 27 Na 2 EDTA 2H 2 O 37 37 MnSO 4 H 2 O 16,9 16,9 ZnSO 4 7H 2 O 8,6 8,6 Na 2 MoO 4 2H 2 O 0,25 0,25 CuSO 4 5 H 2 O 0,025 0,025 H 3 BO 3 6,2 6,2 KI 0,83 0,83 CoCl 2 6H 2 O 0,025 0,025 sacharóza 20 000 20 000 agar 7 000 7 000 BAP 0 0,5 GA 3 0 0,5 NAA 0 0,1 thiamin 0,1 0,1 pyridoxin 0,5 0,5 kys. nikotinová 0,5 0,5 glycin 2 2 myo-inositol 100 100 ribavirin 25 0 ph 5,8 5,8 13

Prvním krokem při přípravě média je dokonalé rozvaření agaru (v jedné čtvrtině celkového objemu média). Do rozvařeného agaru postupně přidáváme zásobní roztoky v pořadí: makroelementy, roztok dihydrátu chloridu vápenatého, mikroelementy, vitamíny, fytohormony. Vždy pečlivě zamícháme. Dále přidáme navážený FeSO 4 7H 2 O, Na 2 EDTA 2H 2 O, myo-inositol a sacharózu. Tyto složky médií včetně všech regulátorů růstu přidáváme před sterilizací autoklávováním. Pouze v případě médií pro chemoterapii přidáváme ribavirin do již sterilního média filtrací. ph upravíme 5 % vodným roztokem NaOH na hodnoty stanovené v tabulce 1. Médium sterilizujeme párou v autoklávu 25 minut při teplotě 120 o C a přetlaku 100 kpa. 2.3.3 Založení kultur a kultivační podmínky Dělené cibule rozdružíme na jednotlivé stroužky a po odstranění zaschlých listů stroužky povrchově desinfikujeme pomocí 0,2 % chloridu rtuťnatého (vysoce toxická látka, označení T+). Doba desinfekce je 17 minut. Potom stroužky umístíme do sterilní destilované vody na 10 minut a toto opláchnutí 3x opakujeme, vždy po deseti minutách. Stroužky ukládáme vcelku na médium R25 do 23 mm širokých zkumavek. Je možné používat i úzké mikrobiologické zkumavky, ale stroužky je pak nutno seříznout. Stroužky zapichujeme z 1/3 do média. Řádně označené zkumavky se stroužky umístíme do kultivační komory. Kultivace probíhá na médiu R25 (MS bez růstových regulátorů s 25 mg.l -1 ribavirinu). Teplotu během kultivace udržujeme v rozmezí 22 24 o C, fotoperiodu nastavíme na režim 16 hodin světlo 8 hodin tma. K osvětlení používáme zářivkové trubice s intenzitou 22 μmol.m -2.s -1. Takto kultivované kultury vytvářejí velké množství kořenů. Při velikosti nadzemní části cca 10 cm vyjímáme rostliny ze zkumavek a pod binokulární lupou sterilně odebíráme meristémy tak, že dvěma podélnými řezy mimo osu pochev je obnažen růstový vrchol a z něj pak vypreparován meristém velikosti 0,3 až 0,8 mm. K odběru meristémů použijeme 2 skalpely s výměnnými čepelkami č. 11. Ozdravování česneku pomocí izolace meristému v podmínkách in vitro je popsáno v řadě předchozích prací: (Havránek, 1972; Ucman et al., 1998; Ayabe a Sumi, 2001). Meristémy dále kultivujeme jednotlivě ve zkumavkách v celistvé rostliny za shodných kultivačních podmínek jako stroužky. Ke kultivaci meristémů použijeme médium C1 (MS s 0,5 mg l -1 BAP, 0,1 mg l -1 NAA a 0,5 mg l -1 GA3) viz tabulka 1. Každé 4 týdny rostlinky pocházející z meristémů přemístíme (tzv. přepasážujeme) na čerstvé médium. Při pasážování zakracujeme rostliny na cca 3 cm, tím rostliny udržujeme v růstu. U rostlin, které multiplikují, nerozdělujeme trsy skalpelem, ale kultivujeme rostliny tak dlouho, dokud nedojde k samovolnému oddělení jednotlivých rostlin. V případě rozkrojení trsu skalpelem hrozí uhynutí 14

namnoženého materiálu. Jakmile nadzemní části rostlin dosáhnou velikosti 10 cm, odebíráme listy k testování přítomnosti virů (metoda ELISA nebo RT-PCR). V průběhu kultivace se u některých rostlin začne projevovat vodnatění. Je to děj, při kterém ve zkumavce dochází k hyperhydrataci (převodnění pletiv). Vodnatění může být způsobeno vysokou vzdušnou vlhkostí, mají na něj vliv osmotické látky (tedy sacharóza) v médiu, koncentrace agaru a cytokininy. U rostlin se projevuje špatným vývojem pletiv, sklovitým a celkově nezdravým vzhledem světle zelené, někdy až hnědé barvy. Průduchy vodnatěním napadených rostlin ztrácejí svoji funkci (Novák, 1990; Wu et al., 2009). U rostlin, které jsou jen lehce postiženy, odstraníme zvodnatělé vnější části, rostliny zakrátíme a dále kultivujeme. Tyto rostliny je potřeba častěji přenášet na čerstvé médium. Většina těchto rostlin poté projevuje normální vývoj. Silně vodnaté jedince zlikvidujeme. Jak stroužky, tak i izolované meristémy, mohou být v kultuře napadány infekcemi. Bakteriální infekce řešíme přenesením rostlin na médium s přípravkem Proclin 400 (Supelco). 3 Srovnání novosti postupů Od dob prvního ozdravování česneku v České republice v letech 1971-1987 Ing. Pavlem Havránkem, CSc., nebyly postupy ozdravování již dále zdokonalovány, patrně z důvodů vysoké reinfekce tehdy ozdraveného materiálu. Vývoj poznatků v oblasti in vitro kultur, metod uchovávání (kryokonzervace), i použití chemikálií z řady antivirotik však umožňuje experimentálně ověřit další postupy. Metodika, která vznikala v letech 2007-2010 za spolupráce odborníků 3 pracovišť (Mendelova univerzita v Brně - Zahradnická fakulta, Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. a Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o.) přináší originální postup ozdravování, založený na kombinaci metody chemoterapie s metodou izolace meristému, a tím přináší zefektivnění dosavadních postupů založených pouze na izolaci meristému, jak bylo publikováno dříve (Havránek, 1972). Oproti klasické metodě ozdravení pomocí izolace meristému, jejíž úspěšnost se pohybuje od 25 % do 42 % ozdravených rostlin, je metodou kombinující chemoterapii s izolací meristému ozdraveno od 47 % do 89 % rostlin. Tento úspěch lze přikládat hlavně zvýšené účinnosti metody při ozdravování od GCLV, protože přítomnost tohoto viru je limitním faktorem v celkovém hodnocení účinnosti ozdravení. Předložená metodika se na základě provedeného výzkumu detailně zabývá nejdůležitějšími úseky celého ozdravovacího cyklu a definuje pracovní postupy tak, aby bylo dosaženo přijatelných výsledků při ozdravování. Celoroční množení pomocí moderních biotechnologických metod v laboratorních podmínkách použitím in vitro kultur rostoucích na umělých 15

živných médiích, představuje velkou perspektivu pro zefektivnění ozdravování. Ve sterilním prostředí in vitro kultur je minimalizováno riziko infekce houbovými nebo bakteriálními chorobami a je vyloučeno napadení živočišnými škůdci přirozenými vektory virových infekcí. Ve fázi množení je téměř vyloučeno riziko reinfekce již ozdraveného materiálu. In vitro kultury je možno pěstovat a množit v průběhu celého roku. 4 Popis uplatnění certifikované metodiky Metodika ozdravování česneku od virů, která se zabývá kombinací metod chemoterapie a izolace meristému v podmínkách in vitro kultivace, je určena zejména pracovištím genových bank, orgánům státní správy (SRS, ÚKZUZ), vědeckým a výzkumným pracovištím a školám, které se problematice česneku a příbuzných plodin, jejich zdravotnímu stavu apod. věnují. Zajímavé informace však přináší i pěstitelům česneku a dalším zájemcům. Metodika bude využívána k ozdravení zejména českých genotypů česneku, a to s cílem jejich uchování metodou kryokonzervace, může však sloužit i k ozdravení množitelského materiálu, popřípadě celých výsadeb. Postupy popsané v metodice mohou být rovněž při dalším výzkumu experimentálně aplikovány na další genotypy česneku, popř. ostatní cibuloviny. 5 Ekonomické aspekty Česnek je hospodářsky významnou plodinou, i když je v ČR v současnosti pěstován na relativně malé ploše cca. 300 ha. Od roku 2001 kdy byl česnek pěstován na 1018 ha, došlo k drastickému snížení ploch v důsledku dovozu z Polska a asijských zemí. V roce 2008 bylo na 304 ha vyprodukováno 1759 t česneku. Průměrný výnos česneku je 5,78 t/ha a průměrná spotřeba na obyvatele klesla z 1,2 kg (v roce 2000) na 0,7 kg (v roce 2008). Na základě skutečností, které se udály v roce 2010 na našem a především zahraničním (zejména čínském) trhu s česnekem, je pravděpodobné, že plochy pěstování česneku budou u nás v nejbližších letech rapidně narůstat. Přestože je v metodice popsán unikátní postup ozdravování, který je efektivnější než dříve používané postupy, není zcela snadné jednoznačně specifikovat jeho ekonomický přínos. Rostliny pocházející z ozdravování při použití výše zmíněného postupu jsou použity k uchování metodou kryokonzervace a jejich hodnota, tedy hodnota unikátního genetického a navíc ozdraveného materiálu je značná, ale obtížně vyjádřitelná. Oproti klasické metodě ozdravení pomocí izolace meristému, jejíž úspěšnost se pohybuje od 25 % do 42 % ozdravených rostlin, je metodou kombinující chemoterapii s izolací meristému ozdraveno od 47 % do 89 % 16

rostlin. Hodnocení se vztahuje k původnímu počtu stroužků před ozdravováním, nikoliv k výsledkům diagnostických testů jednotlivých genotypů. Tento úspěch lze přikládat hlavně zvýšené účinnosti při ozdravování od GCLV, protože přítomnost tohoto viru je limitním faktorem v celkovém hodnocení účinnosti ozdravení. Vezmeme-li v úvahu fakt, že rostliny ozdravované zde doporučenou metodou mají větší multiplikační koeficient (3,75) oproti ostatním metodám (1,8 termoterapie; 1,94 izolace meristému), je zřejmé, že lze při tomto vyšším multiplikačním koeficientu ozdravit méně jedinců, které bude možné do potřebného počtu dále namnožit, což souvisí s menším počtem testů. Náklady na testování zdravotního stavu jsou totiž největší nákladovou položkou celého ozdravování. Při použití navrhované efektivnější metody, při jejíž aplikaci dochází i lepšímu množení rostlin, je možné uspořit až 35 % nákladů na ozdravování. V současné situaci, kdy náklady na ozdravení genotypu v konečném počtu 160 ks zdravých rostlin (minimum rostlin pro uchování metodou kryoprezervace) se pohybují zhruba od 21 000 Kč do 36 000 Kč v závislosti na počtu testů a rostlin udržovaných v kultuře in vitro, činí úspora při použití navrhované metody od 7 350 Kč do 12 600 Kč v případě jednoho genotypu. Teoreticky, budou-li do budoucna ozdravovány další genotypy udržované v národní kolekci doporučenou metodou, bude možné uspořit při ozdravení dalších 572 genotypů (50 zbývajících genotypů řešeno v rámci přípravy této metodiky) při průměrné úspoře 9975 Kč na jeden genotyp až částku 5 705 700 Kč. Pokud budou rostliny česneku ozdravovány nejen pro další uchovávání, ale i pro produkci, bude dosaženo dalších ekonomických úspor. Toto lze prezentovat alespoň na příkladu jediného viru. Jak již bylo mnoha autory publikováno, vir OYDV způsobuje o 39 60 % nižší výnos (přítomnost OYDV byla potvrzena v 95 % testovaných genotypů). Čistě teoreticky, by tedy ozdravením výsadbového materálu česneku v ČR pouze od tohoto viru, mohlo být dosaženo většího výnosu o 686 1055 t, při udržení současných pěstebních ploch. V současné době je cena konzumního česneku již téměř na hranici 200 Kč za 1 kg a neustále narůstá. Tedy při průměrné ceně konzumního česneku 196 Kč za 1 kg, znamená rozdíl ve výnosu napadených a zdravých jedinců finanční hodnotu 134 456 000 206 780 000 Kč. Ozdravený materiál je však ve volné půdě znovu reinfikován. Výše uvedený vyšší výnos by bylo možné opakovaně dosáhnout pouze při stále opakované výsadbě zdravých rostlin. 17

6 Seznam použité související literatury AYABE, M., SUMI, S.: A novel and efficient tissue culture metod - stem-disc dome culture for producing virus-free garlic. Plant Cell Reports. 2001, 20:503-507. HAQUE, M. S., WADA, T., HATTORI, K.: Shoot regeneration and bulblet formation from shoot and root meristem of garlic cv Bangladesh Local. Asian Journal of Plant Science. 2003, 2 (1): 23-27, p. 23-27. ISSN :1682-3974 HAVRÁNEK, P.: Viruprosté klony česneku kuchyňského získané z meristematických kultur. Sborník ÚVTI Ochrana rostlin. 1972. vol. 8, p. 291 298. HAVRÁNEK, P.: Vliv virového onemocnění na výnosy česneku kuchyňského. Sborník ÚVTI Ochrana rostlin. 1975. vol. 10, p. 251 256. KLUKÁČKOVÁ, J., NAVRÁTIL, M., VESELÁ, M., HAVRÁNEK, P., ŠAFÁŘOVÁ, D.: Occurence of garlic viruses in the Czech Republic. Acta fytotechnica et zootechnica, 2004, 7: 126 128. LLOYD, G., MCCOWN, B.: Commercially-feasible micro-propagation of Mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot tip culture. International Plant Propagation. 1981, vol. 30, p. 421 427. MURASHIGE, T., SKOOG, F.: A revised medium for rapid growth and boiassays with tobaco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 1962, vol. 15, p. 473 497. NOVÁK, F. J.: Explantátové kultury a jejich využití ve šlechtění rostlin, Academia Praha, 1990, ISBN 80-200-0344-4. QUOIRIN, M., LEPOIVRE, P.: Improved média for in vitro culture of Prunus sp. Acta Horticulturae. 1977, vol. 78, p. 437 442. SHIBOLETH, Y., M., GAL-ON, A., KOCH, M., RABINOWITCH, H., D., SALOMON, R. Molecular characterization of onion yellow harf virus (OYDV) infecting garlic (Allium sativum L.) in Izrael: Thermotherapy inhibic virus elimination by meristem tip culture. Ann. Appl. Biol. 2001, 138: 187-195 SMÉKALOVÁ, K., STAVĚLÍKOVÁ, H., DUŠEK, K.: Distribution of viruses in the garlic germplasm collection of the Czech Republic. Journal of Plant Pathology, 2010, 96 (1): 273-274. 18

UCMAN, R., ŽEL, J., RAVNIKAR, M.: Thermotherapy in virus elimination from garlic: influences on shoot multiplication from meristems and bulb formation in vitro. Scientia Horticulturae. 1998. vol. 73, p.193 202 WU, M., CHEN, L. J., LONG, Y. J.: Analysis of ultrastructure and reactive oxygen species of hyperhydric garlic (Allium sativum L.) shoots. In vitro Cell. Dev. Bol. Plant, 2009, vol. 45, p. 483-490. 7 Seznam publikací, které předcházely metodice KARLOVÁ, K., DUŠEK, K., STAVĚLÍKOVÁ, H.: Virové choroby u kolekce genetických zdrojů česneku v České republice. In: Hauptvogel, P. (ed.) Hodnotenie genetických zdrojov rastlín pre výživu a pol nohospodárstvo. Zborník abstraktov z 5. vedeckej konferencie s medzinárodnou účasťou, 6. 7. května 2008, Piešťany, Slovenská republika. str. 14, ISBN 978-80-88872-74-0 KARLOVÁ, K., DUŠEK, K., STAVĚLÍKOVÁ, H.: Occurrence of virus diseases in collection of genetic resources of garlic in the Czech Republic. In: Meglič, V.; Bastar, M.T. (eds.): Book of abstracts of 19 th Eucarpia Conference, Genetic Resources Section, Ljubljana, Slovenia, May 26 th 29 th, 2009. p. 40, ISBN 978-961-6505-40-6. KARLOVÁ, K., DUŠEK, K., STAVĚLÍKOVÁ, H.: Virus diseases in collection of genetic resources of garlic in the Czech Republic. Agriculture (Poĺnohospodárstvo). 2009. 55(1): 58-60. NAUŠOVÁ, O., KUČEROVÁ, Z., ONDRUŠIKOVÁ, E., KŘIŽAN, B., WASSERBAUEROVÁ, L., SOUKUPOVÁ, J., KARLOVÁ, K., STAVĚLÍKOVÁ, H., DUŠEK, K.: Zhodnocení účinnosti metody izolace meristému při ozdravování 20 odrůd česneku. In ŘEHOUT, V. Biotechnology 2008. 1. vyd. České Budějovice: Scientific Pedagogical Publishing, 2008, s. 193-195. ISBN 80-85645-58-0. ONDRUŠIKOVÁ, E., SASKOVÁ, H., ČECHOVÁ, J., KŘIŽAN, B.: The effect of genotype on sanitation of garlic plants (Allium sativum L.) In New developments in green gene technology. 1. vyd. Szeged, Hungary: Biological Research Center, Hungarian Academy of Sciences, 2009. SMÉKALOVÁ, K., STAVĚLÍKOVÁ, H., DUŠEK, K.: Distribution of viruses in the garlic germplasm collection of the Czech Republic. Journal of Plant Pathology, 2010, 96 (1): 273-274. 19

8 Přílohy: Obr. 1: Stroužky česneku prorostlé na médiu R25 vhodné pro preparaci meristému Obr. 2: Práce s binokulární lupou v prostředí flow-boxu 20

Obr. 3: Izolace meristému z rostlin česneku Obr. 4: Infekce na kulturách česneku 21

Obr. 5: Rostlina česneku před odběrem meristému Obr. 6: Umístění zkumavek s kultivovanými meristémy v řízených podmínkách 22

Obr. 7: Binokulární lupa používaná pro izolace meristémů Obr. 8: Pohled na meristém česneku ukrytý pod prvním listem, zvětšeno 25x Základ 1. listu Meristém Podpučí 23