Využití metody kryoterapie pro ozdravení bramboru od virových patogenů

Transkript

1 Ing. Miloš Faltus, Ph.D. Ing. Jiří Zámečník, CSc. Ing. Petr Dědič, CSc. Ing. Vendulka Horáčková, CSc. Využití metody kryoterapie pro ozdravení bramboru od virových patogenů CERTIFIKOVANÁ METODIKA Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o. 2012

2 Metodika je výstupem řešení výzkumného projektu NAZV QH91164 Využití kryoterapie k ozdravení bramboru a chmele od vybraných patogenů. Metodika proběhla oponentním řízením. O uplatnění metodiky byla dne uzavřena smlouva podle ustanovení 269 zákon č. 513/1991 Sb., obchodního zákoníku. ÚKZUZ Brno, jako certifikační orgán, vydal dne Osvědčení č.j /KÚ/UKZUZ/212 o uznání uplatněné certifikované metodiky. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha, 2012 ISBN

3 Autoři: Ing. Miloš Faltus, Ph.D. (25%) Ing. Jiří Zámečník, CSc. (25%) Ing. Petr Dědič, CSc. (25%) Ing. Vendulka Horáčková, CSc. (25%) Název: Využití metody kryoterapie pro ozdravení bramboru od virových patogenů Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, , Praha 6 Ruzyně Metodika je veřejně přístupná na adrese Náklad: 250 výtisků Vyšlo v roce 2012, první vydání Vydáno bez jazykové úpravy Kontakt na autory: faltus@vurv.cz zamecnik@vurv.cz dedic@vuhhb.cz horackova@vuhhb.cz Autor fotografií: Miloš Faltus Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha, 2012 ISBN

4 VYUŽITÍ METODY KRYOTERAPIE PRO OZDRAVENÍ BRAMBORU OD VIROVÝCH PATOGENŮ Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i

5 Miloš Faltus a kol. Využití metody kryoterapie pro ozdravení bramboru od virových patogenů CERTIFIKOVANÁ METODIKA Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i

6 Využití metody kryoterapie pro ozdravení bramboru od virových patogenů Tato metodika představuje novou a velice účinnou metodu eliminace některých virových patogenů bramboru pomocí působení kryogenních teplot. V metodice jsou popsány základní principy metody, postup přípravy rostlinného materiálu, vystavení kryogenním teplotám i princip následného hodnocení zdravotního stavu explantátů bramboru pomocí metod ELISA. Tato metodika bude využita pro zvýšení efektivity produkce bezvirózní sadby bramboru. Use of the cryotherapy for virus elimination in potato This method is a novel and highly effective method for elimination of some viral pathogens in potato by means of a cryogenic temperature treatment. Basic principles of the method, steps of explants preparation, cryogenic treatment and presence of viral pathogens evaluation are described. This method will be utilized for an improvement of virus-free seeds production efficiency in potato. Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i

7 Obsah: I. Cíl metodiky... 8 II. Vlastní popis metodiky... 8 a) Princip metody... 8 b) Materiál ) Přístrojové vybavení ) Chemikálie ) Drobné pomůcky ) Rostlinný materiál a kultivační podmínky ) Kultivační media ) Příprava sterilního silikagelu pro dehydrataci vzorků c) Postup metody kryoterapie pro ozdravení bramboru od virových patogenů ) Namnožení explantátů ) Předkultivace explantátů ) Izolace vzrostných vrcholů a jejich sycení sacharosou ) Dehydratace vzrostných vrcholů nad silikagelem ) Vystavení explantátů kryogenním teplotám ) Regenerace explantátů ) Testování zdravotního stavu III. Srovnání novosti postupů IV. Popis uplatnění metodiky V. Ekonomické aspekty VI. Seznam použité související literatury VII. Seznam publikací, které předcházely metodice VIII. Dedikace IX. Jména oponentů:

8 I. Cíl metodiky Cílem metodiky je stanovit postup pro eliminaci vybraných virových patogenů bramboru pomocí metody kryoterapie. II. Vlastní popis metodiky a) Princip metody Tato metoda je založena na poznatku, že rostliny jsou za jistých okolností schopny tolerovat působení ultranízkých teplot (bod varu tekutého dusíku, cca -196 C). Podstatou metody kryoterapie je vystavení otužených explantátů ultranízké teplotě, kdy dochází k poškození zpravidla diferencovaných rostlinných buněk. Pokud je distribuce viru v rostlinách omezena na víceméně diferencované buňky a meristém explantátu je viry nezasažen, lze takto s vysokou pravděpodobností zbavit explantát přítomnosti virů. Ultranízká teplota tedy neničí samotný virus, ale pouze rostlinou buňku, která obsahuje virus. Tím dojde k eliminaci dalšího šíření viru v rostlině a při regeneraci dochází v optimálním případě k regeneraci pouze meristematické části, která je viruprostá. Účinnost této metod je závislá na distribuci viru v rostlině a na její schopnosti tolerovat působení utranízkých teplot. b) Materiál 1) Přístrojové vybavení Pro provedení metody kryoterapie je třeba disponovat následujícím přístrojovým vybavením: Práce s tkáňovými kulturami rostlin v in vitro podmínkách: kultivační box laminární box Vybavení pro sterilizaci materiálu a kultivačních médií: autokláv horkovzdušný sterilizátor třepačka Přístroje pro přípravu a uchování kultivačních médií: analytické váhy přesné váhy ph-metr laboratorní míchačka mikrovlnná trouba chladnička Přístroje pro ELISA diagnostiku ELISA-reader vymývačka mikrotitračních destiček 8

9 Nádoby na tekutý dusík: Dewarova nádoba pro uchování tekutého dusíku polystyrénová nádoba na tekutý dusík polystyrénová nádoba na kryozkumavky v lázni tekutého dusíku Záznamy a výpočty: počítač tiskárna 2) Chemikálie V následujícím seznamu jsou uvedeny všechny chemikálie potřebné pro metodu kryoterapie pro ozdravení bramboru od virových patogenů: Kultivační média: destilovaná voda makroelementy dusičnan amonný, dusičnan draselný, dusičnan vápenatý, dihydrogen fosforečnan draselný, chlorid vápenatý, síran hořečnatý mikroelementy - chlorid kobaltnatý, síran měďnatý, síran draselný, síran železnatý, kyselina boritá, jodid draselný, síran manganatý, molybdenan disodný, síran zinečnatý, železito-sodná sůl kyseliny etylendiaminotetraoctové vitamíny a další účinné látky thiamin, pyridoxin, kyselina nikotinová, glycin fytohormony indol-3-octová kyselina, kinetin, kyselina giberelová sacharosa (P.A.) agar (Sigma Aldrich) Úprava ph média: hydroxid - hydroxid draselný kyselina - kyselina chlorovodíková Kryoprotektivní roztok: destilovaná voda sacharóza (P.A.) Chladící médium: tekutý dusík ELISA: imunodiagnostické soupravy pro detekci jednotlivých virů metodou ELISA (včetně pufrů, protilátek a substrátu) 3) Drobné pomůcky Následující pomůcky jsou nezbytné pro realizaci metody kryoterapie pro ozdravení bramboru od virových patogenů: Příprava médií, roztoků a jejich dávkování: Erlenmeyerova baňka 500 ml odměrný válec 1000 ml 9

10 Pasteurova pipeta 3 ml střička váženky dávkovač magnetické míchadlo kopisťka jednokanálové pipety, vícekanálové pipety a špičky Práce se sterilním materiálem: skalpel nůžky pinzety stojánek na nástroje hliníková folie Kultivace rostlin: kultivační zkumavky s hliníkovým uzávěrem (rozměry 12 x 1,7 cm) stojánek na zkumavky plastové kultivační nádoby (rozměry 10 x 10 x 9 cm, Duchefa) plastové Petriho misky (průměr 6 cm) skleněné Petriho misky (průměr 15 cm) Erlenmeyerova baňka (objem 25 ml) Izolace a dehydratace vzrostných vrcholů: injekční jehly (rozměry 0,7 x 40 mm) stříkačky (objem 10 ml) filtrační papír (průměr 11 cm) skleněné Petriho misky (průměr 4, 12, 15 a 20 cm) hliníkové plíšky (rozměr 20 x 6 x 0,05 mm) nádobky na silikagel (objem 200 ml) Kryoterapie: kryozkumavky (objem 1,8 ml, NUNC) polystyrénový džbán (objem 1L) stojánek na kryozkumavky Odtání vzorků: Erlenmeyerova baňka (objem 100 ml) nerezová miska parafilm ELISA: mikrotitrační destičky stojánky a kyvety 10

11 4) Rostlinný materiál a kultivační podmínky Výchozím materiálem pro kryokonzervaci bramboru jsou rostliny převedené do explantátových kultur v podmínkách in vitro. Rostliny in vitro bramboru se uchovávají obvykle ve zkumavkách (12x1,7 cm) s hliníkovým víčkem. Pro lepší ventilaci kultivačních zkumavek je vhodné víčko provrtat a do otvoru umístit molitanový hranolek o velikosti (1x1x2cm). Explantáty jsou pěstovány v kultivačním boxu při teplotě 22 ± 1 C, hustotě světelného toku 80 μmol m -2 s -1 a fotoperiodě 16/8 h. Plastové krabičky o velikosti 10 x 10 x 9 cm urychlují postup multiplikace explantátů. 5) Kultivační media Pro kultivaci rostlin se používají dva typy agarových kultivačních medií. Jedno je tzv. multiplikační, které se používá pro namnožení explantátů bramboru do potřebného počtu a druhé medium je tzv. regenerační, které stimuluje regeneraci explantátů bramboru po kryoterapii. Multiplikace in vitro rostlin probíhá na modifikovaném kultivačním mediu podle Grospietsche et al. (1999) bez kaseinu a myo-inositolu a se sníženým obsahem dusíku (Tab.1), s 30 g l -1 sacharosy a 6 g l -1 agaru. Regenerační medium má shodné složení jako množící medium, ale pro podporu regenerace rostlin navíc obsahuje směs fytohormonů (0,5 mg l -1 kyseliny indol-3-octové, 0,5 mg l -1 kinetinu, 0,2 mg l -1 kyseliny giberelové). Tab. 1: Složení modifikovaného kultivačního média podle Murashige a Skooga (1964) Složky média Chemický vzorec/ zkratka* Zastoupení jednotlivých složek v kultivačním médiu (mg l -1 ) MAKROELEMENTY Chlorid vápenatý CaCl 2 332,02 Dihydrogenfosforečnan draselný KH 2 PO Dusičnan draselný KNO Síran hořečnatý MgSO 4 180,54 Dusičnan amonný NH 4 NO 3 412,5 MIKROELEMENTY Chlorid vápenatý, hexahydrát CoCl 2.6H 2 O 0,025 Síran měďnatý, pentahydrát CuSO 4.5H 2 O 0,025 Železito-sodná sůl kyseliny FeNaEDTA * 36,7 etylendiaminotetraoctové Kyselina fosforečná H 3 PO 4 6,2 Jodid draselný KI 0,83 Síran manganatý, dihydrát MnSO 4.H 2 O 16,9 Molybdenan disodný Na 2 MoO 4.2H 2 O 0,25 Síran zinečnatý, heptahydrát ZnSO 4.7H 2 O 8,6 VITAMÍNY A DALŠÍ LÁTKY Glycin C 2 H 5 NO 2 2 Kyselina nikotinová C 6 H 5 NO 2 0,5 Pyridoxin C 8 H 11 NO 3 0,5 Thiamin C 12 H 17 N 4 OS 0,1 11

12 6) Příprava sterilního silikagelu pro dehydrataci vzorků Dehydratace explantátů bramboru probíhá v suchém vzduchu nad sterilním silikagelem. Silikagel o hmotnosti 50 g se umístí do skleněné nádobky o objemu 200 ml se závitem a kovovým víčkem pro možnost sterilace horkým vzduchem. Vysoušení probíhá v horkovzdušném sterilizátoru s nucenou ventilací při teplotě 170 C po dobu 2 dnů. Pak se nádoby se silikagelem uzavřou víčkem a ponechají ve sterilizátoru po dobu 10 hodin, tak aby po automatickém vypnutí přístroje došlo k ochlazení silikagelu na laboratorní teplotu do doby před započetím dehydratace. c) Postup metody kryoterapie pro ozdravení bramboru od virových patogenů Postup kryoterapie explantátů bramboru lze rozdělit do sedmi postupných kroků: Namnožení explantátů Předkultivace explantátů Izolace vzrostných vrcholů a jejich sycení sacharosou Dehydratace vzrostných vrcholů nad silikagelem Vystavení tekutému dusíku proces kryoterapie Regenerace explantátů Hodnocení přítomnosti virových patogenů Postup využití metody kryoterapie pro ozdravení bramboru od virových patogenů je schematicky znázorněn na Obr.1. 1) Namnožení explantátů Explantáty bramboru se uchovávají v kultivačních zkumavkách s 5 ml multiplikačního media. Pro namnožení explantátů do potřebného počtu 100 rostlin se provedou dvě multiplikace při subkultivačním intervalu 3-4 týdny. Matečné rostliny se nařežou na nodální segmenty a kultivují v krabičkách se 100 ml multiplikačního media. Při první multiplikaci se vysadí jedna krabička s třiceti nodálními segmenty a při druhé multiplikaci se z třiceti rostlin odvodí sto nodálních segmentů a vysadí se do třech krabiček. 2) Předkultivace explantátů Po třech až čtyřech týdnech kultivace in vitro rostlin bramboru se z nich odvodí nodální segmenty. Ze sta explantátů se připraví tři sta nodálních segmentů a ty se vysadí po 100 kusech do třech krabiček s 50 ml multiplikačního media. Po čtyřech dnech kultivace se do každé krabičky s nodálními segmenty aplikuje 25 ml 2 M roztoku sacharosy. 3) Izolace vzrostných vrcholů a jejich sycení sacharosou Po 5 až 6 dnech kultivace nodálních segmentů zalitých roztokem 2 M sacharosy se vyizolují vzrostné vrcholy vyrostlé z nodálních pupenů. Vrcholy se izolují z nodálních segmentů pomocí injekční jehly, která se použije jako mikroskalpel. Vrcholy se umístí do Petriho misky (12 cm) na sterilní filtrační papír nasycený 0,7 M roztokem sacharosy (14 ml) s fytohormony shodného složení jako v regeneračním mediu (0,5 mg l -1 kyseliny indol-3-octové, 0,5 mg l -1 kinetinu, 0,2 mg l -1 kyseliny giberelové). Apikální vrcholy se sytí v roztoku sacharosy po dobu 20 hodin při 22 C. 12

13 Namnožení explantátů Odvození nodálních segmentů Aplikace 2 M sacharosy Umístění vrcholů na plíšky Sycení vrcholů 0,7 M sacharosou Izolace vzrostných vrcholů Dehydratace vrcholů nad silikagelem Ponoření vrcholů do tekutého dusíku Odtátí vzorků ve vodní lázni Regenerace explantátů pro testy zdravotního stavu Vysázení na regenerační medium Obr. 1. Postup kryoterapie explantátových kultur bramboru. 13

14 4) Dehydratace vzrostných vrcholů nad silikagelem Po nasycení vzrostných vrcholů bramboru sacharosou se explantáty umístí na hliníkové plíšky po deseti kusech, vždy dva plíšky se umístí do jedné Petriho misky (4 cm). Plíšky a malé Petriho misky usnadňují manipulaci s explantáty. Spodní část Petriho misky se spolu s plíšky a explantáty vloží pomocí sterilní pinzety do nádoby se silikagelem. Dehydratace vrcholů nad silikagelem probíhá ve sterilní místnosti v laminárním boxu, při teplotě C. Doba dehydratace explantátů je přibližně 1,5 až 2 hodiny v závislosti na velikosti explantátů a je ukončena při dosažení vlhkosti materiálu 0,4 g vody na 1 g sušiny. V případě použití jiných nádob či jiného množství silikagelu je nezbytné odzkoušet postup dehydratace explantátů a stanovit optimální dobu dehydratace. Kontrola míry dehydratace se provádí vážením na analytických vahách s přesností 0,01 mg. Nejprve se zváží Petriho misky (4 cm) s hliníkovými plíšky bez explantátů, pak s explantáty před dehydratací a následně po dehydrataci. Nakonec se kontrolní vzorky dosouší 72 hodin v sušárně při 105 C pro získání hmotnosti sušiny. 5) Vystavení explantátů kryogenním teplotám Po vysušení jsou explantáty přilepeny k plíškům zaschlým přebytkem roztoku sacharosy. Díky tomu lze s plíšky manipulovat, aniž by došlo k náhodnému odpadnutí explantátu. Nejprve se připraví polystyrenová nádoba, která slouží jako stojánek pro kryozkumavky a zároveň jako nádoba na tekutý dusík. Tato nádoba se naplní tekutým dusíkem a pak se do ní umístí kryozkumavky a i ty se naplní tekutým dusíkem. Plíšky s explantáty se pomocí pinzety přenesou a co nejrychleji ponoří do tekutého dusíku v polystyrenové nádobě. Po ochlazení explantátů na teplotu tekutého dusíku (-196 C) se plíšky umístí do kryozkumavky a uzavřou víčkem. Víčko kryozkumavky se nedotahuje, ale mohl tekutý dusík pronikat přes závit do kryozkumavky. 6) Regenerace explantátů Standardní doba pobytu vzorků v tekutém dusíku je 60 minut. Po otevření víčka se hliníkové plíšky rychle vytáhnou pinzetou z kryozkumavek a i s vrcholy se ponoří do vodní lázně o laboratorní teplotě. Explantáty se po jejich odlepení od plíšků vyjmou z vody a přenesou na regenerační medium s fytohormony (0,5 mg l -1 kyseliny indol-3-octové, 0,5 mg l -1 kinetinu, 0,2 mg l -1 kyseliny giberelové). Hodnocení životnosti rostlin se provede po dvou týdnech a hodnocení regenerace po osmi týdnech od vysazení. Za živé se považují explantáty, u nichž je patrný růst a nedochází u nich ke ztrátě chlorofylu. Apikální růst spojený s tvorbou stonku je známkou regenerace rostliny. 7) Testování zdravotního stavu Pro kontrolu zdravotního stavu ozdravovaných materiálů je nezbytné používat pouze takové detekční a diagnostické metody, které jsou při aplikaci vhodných postupů přípravy testovaných materiálů schopné s dostatečnou spolehlivostí a reprodukovatelností stanovit přítomnost či absenci sledovaných patogenů. V současnosti se téměř výlučně pro laboratorní diagnózu virů bramboru využívá sérologická imunoenzymatická metoda ELISA. Všechny viry bramboru a to jak při sériové diagnóze z rostlin, tak v experimentální práci, se nejčastěji detekují pomocí základního postup ELISA označovaného DAS (dvojitý protilátkový sendvič). Většinou se používají komerčně dostupné, převážně polyklonální protilátky (diagnostické soupravy). Zásadním požadavkem je jejich reaktivita s co nejširším izolátovým spektrem příslušného viru. Tyto soupravy (např. Primediagnostics, Bioreba, Adgen aj.) jsou pro 14

15 praktickou fytosanitární diagnostiku zpravidla plně vyhovující. Vlastní postup vychází z původní obecné metody vypracované Clarkem a Adamsem (1976), jejich ověření pro viry bramboru (Dědič, 1983, 1985, 1987), vlastních modifikací (Dědič, 1988a, Dědič a Kameníková, 1989) a úprav doporučených výrobci jednotlivých protilátek. Tyto úpravy spočívají zejména v rozdílech ve složení pufrů, koncentraci a objemu protilátek nebo rostlinné šťávy, délky a teploty inkubace a způsobu inkubace protilátek. Z modifikací lze kromě DAS-ELISA pro diagnózu virů bramboru používat zejména TAS-ELISA, uměle bi- a vícevalentní protilátky, společnou inkubaci konjugátů s antigenem (koktejl ELISA), kompozitní vzorky apod. (Dědič, 1988a, 1989, Dědič et al., 1994). Detekční limit ELISA na úrovni cca 2 µg ml -1 zpravidla z hlediska citlivosti detekce plně vyhovuje. U některých virů bramboru, speciálně u PLRV, případně PVA, u kterých je jejich koncentrace obecně nižší, proměnlivá a závisí na řadě faktorů (teplota, stáří rostlin, na translokaci a nerovnoměrné lokalizaci viru po infekci apod.), je nezbytné pro dosažení spolehlivých výsledků tyto faktory plně respektovat i při využívání této obecně citlivé metody (Dědič, 1988b, Dědič et al., 1993, Dědič a Ptáček, 1995). Kromě základního postupu DAS ELISA lze v případě potřeby použít též modifikaci označovanou jako TAS ELISA spočívající v aplikaci univerzálních konjugovaných protilátek proti protilátkám použitým ve druhé vrstvě diagnostického sendviče. Stejně tak je možné, v některých případech (např. u PLRV) modifikovat vlastní postup DAS ELISA takovým způsobem, že antigen a konjugované protilátky lze aplikovat současně (koktejl ELISA). Vlastní diagnostický postup lze tak nejen zefektivnit (úspora práce), ale i urychlit, případně zvýšit citlivost detekce. Ve všech těchto alternativách se jako prioritní jeví výběr účinných protilátek (od vhodného komerčního dodavatele), postihujících s dostatečnou citlivostí též všechny případné izoláty příslušného viru. Pro dosažení spolehlivých výsledků diagnózy je nezbytné respektovat obecné zásady průběhu koncentrace viru v diagnostikovaných objektech (viz např. Dědič, 1988b, 1998). Po ukončení ozdravovacího procesu lze provést testování ELISA přímo ze šťávy rostlin vedených in vitro, a následně u rostlin vedených in vivo (ve skleníku, případně na poli). Obecně lze stanovit přítomnost každého sledovaného viru bramboru (PLRV, PVY, PVA, PVM, PVX a PVS); toto hodnocení je však vždy nutné považovat pouze za předběžné, orientační, umožňující případnou redukci počtu ozdravovaných materiálů v dalším postupu. Koncentrace viru může v důsledku terapie být dočasně potlačena až pod úroveň detekčního limitu a existuje tak reálné nebezpečí výskytu, v závislosti na sledovaném viru, falešných negativ. Typickým příkladem může být virus svinutky bramboru (PLRV), u kterého přímá detekce ze zkumavkových rostlinek vedených in vitro nedávala uspokojivé výsledky z hlediska výše extinkčních hodnot u řady izolátů tohoto viru. Bylo nezbytné prodlužovat inkubační doby substrátu na minimálně 120 min., které však ani u méně účinných protilátek významně nezvýšilo spolehlivost detekce, navíc však vyvolalo nebezpečí nespecifického výsledku. Úspěšně byla používána modifikace koktejl ELISA, kde navíc dochází k úspoře pracovních a materiálových nákladů a k urychlení postupu vlastní diagnózy. U klonů, kde nebyla prokázána virová infekce při předběžném testování z rostlinek in vitro, se provedete komplexní otestování zdravotního stavu rostlin in vitro po 6-8 týdnech růstu ve skleníku za optimálních světelných a teplotních podmínek. K testu je používán opět postup DAS- ELISA, případně jeho modifikace. Provádí se diagnóza všech sledovaných virů tj. PLRV, PVY, PVA, PVM, PVX a PVS a rovněž závěrečné laboratorní hodnocení jejich komplexu. Při 15

16 práci s rozsáhlejšími soubory rostlin lze při plném zachování vysoké spolehlivosti testů využít některé modifikace ELISA racionalizující vlastní diagnózu. Jsou to zejména: A) Koktejl Elisa, který je podle našich výsledků použitelný pouze pro diagnózu PLRV. Extrahovaná šťáva je přímo na ELISA paletě smísena s enzymovým konjugátem a spolu s ním inkubována přes noc v chladničce. Mimo nižší pracnost, materiálové úspory a urychlení testu byla prokázána též vyšší citlivost diagnózy. Pro PLRV, který je v rostlinách bramboru lokalizován v obtížněji extrahovatelných částech (floém) a jehož koncentrace je více závislá na vnějších podmínkách, jsou tyto přednosti významné. Spolehlivý důkaz viruprostého stavu má pro výchozí materiály zásadního významu, jinak může následně dojít k nežádoucímu masovému namnožení a rozšíření infikovaných jedinců již v podmínkách rychlého množení in vitro a tím k znehodnocení celých, rozsáhlých populací meriklonů. B) Aplikace uměle polyvalentních protilátek, kde podle konkrétní situace je možno mísit protilátky a též jejich enzymové konjugáty a spojit tak do jedné reakce detekci více virů. Je důležité, aby protilátky, které budou použity k sestavení vícevalentních směsí vykazovaly podobnou reakční dynamiku. Rovněž některé nově vyvíjené imunologické techniky např. Luminex-xMAP, mohou při aplikaci v podobě multiplexu, současně diagnostikovat rozsáhlé soubory patogenů z jednoho extraktu (Dědič, 2011). C) použití kompozitního vzorkování listů, které je vhodné zejména pro kontrolu rozsáhlých souborů, např. materiálů ze skleníků a polní vegetace, s předpokládanou nižší frekvencí výskytu sledovaného viru. V závislosti na sledovaném viru lze před vlastní extrakcí šťávy vytvářet kompozity obvykle do čtyř lístků. Tento systém kontroly byl úspěšně ověřen jak u explantátových, tak skleníkových a polních rostlin bramboru (Dědič et al., 1996, 1999, 2006a, Horáčková a Dědič, 2011). Pro ucelenost této kapitoly zabývající se exaktní diagnózou je nutné ještě uvést, že v současné době existují další laboratorně-diagnostické postupy, založené na detekci nukleových kyselin patogenů. Jsou to zejména metody molekulární hybridizace, polymerázové řetězové reakce (PCR) a polymerázové řetězové reakce v reálném čase (Q- PCR). Přes plně srovnatelné a i lepší výsledky oproti ELISA z hlediska citlivosti, jsou zejména v důsledku jejich nízké sériovosti, pracnosti, obtížné přípravě extraktů a mnohonásobně vyšší nákladnosti, pro praktické potřeby využívány pouze okrajově. Z těchto důvodů se jimi nezabýváme ani v této metodice. III. Srovnání novosti postupů Zdravotní stav porostů bramboru, s ohledem na stupeň jejich zamoření virovými chorobami, je důležitým intenzifikačním faktorem jejich produktivity. Závažná virová onemocnění bramboru jsou vyvolaná virem svinutky bramboru (PLRV), virem Y, případně virem A bramboru (PVY a PVA). Virové choroby v závislosti na odrůdě, pěstitelských i klimatických podmínkách pěstování snižují výnosy hlíz u sekundárně infikovaných rostlin (rostliny vyrostlé z infikované sadby v předchozích letech) o 10-80%. Z praktického hlediska se proto virová onemocnění brambor často dělí na těžká, vyvolaná virem svinutky bramboru, virem Y bramboru a virem A bramboru, a virová onemocnění lehká, způsobená virem M, virem X a virem S bramboru. Při vyšším stupni zamoření, ke kterému dochází velmi snadno u porostů zejména při opakovaném přesazování "vlastní" necertifikované sadby, vzniká též výrazná výnosová deprese, která může v krajním případě dosáhnout až hodnot uváděných 16

17 pro individuální infikované rostliny. Výnosové ztráty jsou zesilovány kombinacemi virů, nejčastěji při společné infekci s velmi rozšířeným virem S. Práce na ozdravení infikovaných materiálů byly dosud řešeny s ohledem na výskyt jak těžkých viróz, tak s požadavkem na komplexní ozdravení. Nejdříve byla používána cesta aktivního vyhledávání zdravých jedinců pomocí vizuální a později laboratorní diagnózy a s následným jejich intenzivním rozmnožováním v izolovaných podmínkách buď pomocí stonkových řízků (např. ve Skotsku a Kanadě), případně hlíz, nebo jejich částí (též u nás). Teprve rozpracování a zavedení techniky explantátových (meristémových) kultur v šedesátých letech minulého století, spolu s termoterapií, později též s chemoterapií, však umožnilo získat zdravé jedince i ze zcela zamořených genotypů (odrůd). Tyto techniky nalezly v devadesátých letech minulého století uplatnění i u nás a spolu s metodami rychlého vegetativního množení regenerantů in vitro a systémem kontroly zdravotního stavu metodou ELISA byly využity pro získání zdravých výchozích šlechtitelských materiálů vedených v technických izolátorech. Aplikace těchto metod umožnila zkrácení postupu udržovacího šlechtění a množení bramboru min. o 2 3 roky. Nově navržená metoda kryoterapie dále zefektivňuje proces ozdravování sadby bramboru. Tato metoda je vysoce účinná pro eliminaci virů PLRV a PVY. Průměrná účinnost ozdravení pomocí kryoterapie je 67 % u viru PLRV a 64 % u viru PVY, což je přibližně dvojnásobek ve srovnání s dosud užívanými metodami termoterapie a kryoterapie. Hlavní předností je však zkrácení doby ozdravování, protože pro ozdravení stačí pouze jeden cyklus působení kryogenních teplot. IV. Popis uplatnění metodiky Uživatelem metodiky Kryoterapie je Ústřední bramborový svaz ČR. Využitím této metodiky pro ozdravení bramboru od virových patogenů dojde ke zkrácení a zefektivnění procesu ozdravování sadbového materiálu bramboru. V. Ekonomické aspekty Náklady na zavedení metody Náklady na zavedení postupů uvedených v metodice závisí na tom, jestli se zavádí nově celý provoz pro práci s rostlinami v aseptických podmínkách nebo se pouze implementuje metodika ozdravování explantátů pomocí kryoterapie do stávajících provozů tkáňových kultur. V případě, že laboratoř již postup kultivace explantátů používá, jsou náklady na zavedení postupu dané pouze nákupem chemikálií a pomůcek pro kryoterapii, pokud nejsou již k dispozici. Náklady na zavedení celého aseptického provozu jsou následující: Vybavení pro sterilizaci materiálu a kultivačních médií: autokláv od 105 tis. Kč (repasovaný do 40 tis. Kč) horkovzdušný sterilizátor od 34 tis. Kč třepačka od 38 tis. Kč Celkem od 177 tis. Kč (112 tis. Kč) Práce s tkáňovými kulturami rostlin v in vitro podmínkách: kultivační box od 300 tis. Kč (repasovaný od 200 tis. Kč) 17

18 laminární box Celkem od 150 tis. Kč od 450 tis. Kč (350 tis. Kč) Přístroje pro přípravu a uchování kultivačních médií: analytické váhy od 43 tis. Kč (bez interní kalibrace od 23 tis. Kč) přesné váhy od 7,5 tis. Kč stolní ph-metr od 25 tis. Kč laboratorní míchačka od 5 tis. Kč chladnička cca 4 tis. Kč mikrovlnná trouba cca 1 tis. Kč dávkovač od 4 tis. Kč pipety (3 ks) od 7 tis. Kč Celkem od 96,5 tis. Kč (76,5 tis. Kč) Přístroje pro ELISA diagnostiku ELISA reader Vymývačka mikrotitr. destiček Vícekanálové pipety Celkem Spotřební materiál Sklo Plasty Chemikálie Pinzety, nůžky, skalpely Celkem od 200 tis. Kč od150 tis. Kč od 20 tis. Kč od 370 tis. Kč cca 10 tis. Kč cca 12 tis. Kč cca 35 tis. Kč cca 5 tis. Kč cca 62 tis. Kč Cena za zavedení celého provozu 1156 tis. Kč (971 tis. Kč) Z uvedeného přehledu je patrné, že zavedení celého provozu ozdravování explantátů bramboru v in vitro podmínkách začíná na částce přibližně 970 tis. Kč, která je odvozena od nákladů za vybavení laboratoře přístroji pro práci s materiálem v aseptických podmínkách a ELISA diagnostiky. Protože se předpokládá, že nová metodika nahradí stávající postupy eliminace některých patogenů bramboru, lze konstatovat, že materiálové náklady na zavedení celého provozu nepřekročí náklady na spotřební materiál potřebný pro metodu kryoterapie bez diagnostiky virů, tedy přibližně do 40 tis. Kč. Ekonomický přínos pro uživatele Rozsah uplatnění metodiky je daný efektivitou metody pro jednotlivé druhy virů bramboru. Bylo zjištěno, že metoda kryoterapie je účinná na eliminaci virů svinutky bramboru (PLRV) a viru Y bramboru (PVY). Tyto viry se vyskytují v ozdravované sadbě; tím je podmíněna i míra rozsahu uplatnění metodiky kryoterapie pro eliminaci virů bramboru. 18

19 Předpokládané ekonomické přínosy a další přínosy jsou odvozeny od zkrácení doby vedení explantátů ve specifikovaných podmínkách in vitro o cca 50% oproti původním postupům (zejména termoterapie v kombinaci s kulturou vrcholových meristémů). Kalkulované náklady na ozdravování lze tak snížit v rozsahu odpovídajícímu zkrácení doby vedení a pasážování v podmínkách in vitro. (viz. Nabídka služeb VÚB Ozdravení genotypu od jednoho nebo několika virů v podmínkách in vitro Kč/1 genotyp; - Služby, Nabídka služeb č.6). Vzhledem k tomu, že nová metodika povede ke zkrácení postupu ozdravování sadby, předpokládá se úspora nákladů ve výši 1 tis. Kč na jeden ozdravovaný genotyp. VI. Seznam použité související literatury Dussert S, Engelmann F, Noirot M, 2003, Development of probabilistic tools to assist in the establishment and management of cryopreserved plant germplasm collections. CryoLetters 24, s Grospietsch M., Stodulková, E., Zámečník, J., 1999, Effect of osmotic stress on the dehydration tolerance of Solanum tuberosum shoot tips. CryoLetters 20, s Keller, ERJ, Kaczmarczyk, A, Senula, A, 2012, Cryopreservation for plant genebanks - A matter between high expectations and cautious reservation. CryoLetters 29, s Murashige T., Skoog F.A., 1962, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15, s Panta A, Panis B, Ynouye C, Criel B, Swennen R, Roca W, 2006, Improvement of potato cryopreservation for the long-term conservation of Andean landraces at CIP. In: Abstract Book of Cryo Hamburg Schaefer-Menuhr A, Mueller E, Wagner EM, 1996, Cryopreservation: an alternative for longterm storage of old potato varieties. Potato Res. 39, s VII. Seznam publikací, které předcházely metodice Dědič, P.: Některé výsledky dosažené s postupem ELISA při detekci virů S, X, A a svinutky bramboru. Sbor.IX.konf.Ochr.Rostl.Brno,1983: Dědič, P.: Využití testu ELISA při sériové diagnóze virů ve šlechtění brambor. Sbor. Moderní metody imunoanal. CSVTS Praha, 1985: Dědič,P.: Racionalizace sériové ELISA diagnózy virů bramboru. Sbor.VŠÚB ČSVTS H.Brod,1987: Dědič,P.: Diagnóza viru M bramboru [PVM] přímým a nepřímým postupem ELISA. Rostl.Vyroba 34,1988 a: Dědič,P.: Diagnóza virů bramboru metodou ELISA v dužině sekundárně infikovaných hlíz a v kličcích. Věd.práce OSEVA VŠÚB Havl.Brod 11, 1988 b: Dědič,P. - Kameníková,L.: Storage of samples infected with potato viruses prior to large-scale testing by ELISA. Abstr.EAPR, Virol.sect.Bologna, 15,1989. Dědič,P.: Detection of potato viruses X, M, S, A, Y and Leafroll by ELISA with artificial polyvalent antibodies.. Plant Virol., Proc.X.conf.Cz.plant virol.praha,1989: Dědič,P. - Ptáček,J. - Pohořelá,M.: Diagnóza viru svinutky bramboru [PLRV] v potomstvu primárně infikovaných rostlin bramboru. Rostl. Výr.,39,1993: Dědič,P. - Ptáček,J.: Imunoenzymatická diagnóza viru Y bramboru [ PVY ] v potomstvu primárně infikovaných rostlin. Rostlinná Výroba 41,1995: Dědič,P. - Ptáček,J. - Pohořelá,M. - Domkářová,J.: Detekce viru S bramboru v tuzemském a dováženém sadbovém materiálu. Věd. práce VÚB Havlíčkův Brod, 12, 1996:

20 Dědič,P.: Interference viru S bramboru s dalšími viry při infekci brambor. Bramborářství VI, č.5/98, 1998: 4-6 Dědič,P., Ptáček,J., Filigarová,M., Čeřovská,M.: Současná imunologická diagnóza viru S bramboru (PVS). Vědecké práce VÚB, 13, 1999: Dědič,P., Ptáček,J., Horáčková, V.: The possibility of latent virus eradication in potato breeding. Poster 34. Abstracts EAPR/Eucarpia section, , Carlow, Irsko Horáčková, V., Dědič, P.: Metodika přípravy bezvirových materiálů v novošlechtění a udržovacím šlechtění bramboru s využitím biotechnologických a virologických postupů. Praktické informace č. 27, VÚB Havlíčkův Brod, 2009, 28p. Dědič,P.: Nové racionální postupy laboratorní diagnózy virů bramboru Multiplex ELISA a Luminex-xMap. Vědecké práce - Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, 2011, 19: Zámečník J., Faltus M., Bilavčík A., 2007, Cryoprotocols used for cryopreservation of vegetatively propagated plants in the Czech cryobank, ISSN , Advances in Horticultural Science, 21(4), s Zámečník J., Bilavčík A., Faltus M., 2007, Metody dehydratace vzrostných vrcholů pro kryoprezervaci vegetativně množených plodin, ISBN , In: Vliv abiotických a biotických stresů na vlastnosti rostlin 2007, Praha , s Zámečník J., Faltus M., Bilavčík A., 2006, Conservation of biodiversity of vegetative propagated crops by cryopreservation methods, In: Plenary papers of the Conference "Biotechnology 2006", 15th-16th February 2006, University of South Bohemia, České Budějovice, s VIII. Dedikace Metodika je výstupem řešení výzkumného projektu NAZV QH91164 Využití kryoterapie k ozdravení bramboru a chmele od vybraných patogenů. IX. Jména oponentů: Odborný oponent: Ing. Viktor Kopačka, Vesa Velhartice, a.s., Velhartice Oponent ze státní správy: Ing. Barbora Dobiášová, Odbor osiv a sadby, ÚKZÚZ, Praha 5 20