Úrovně regulace genové exprese eukaryot Svět RNA a bílkovin ZRÁNÍ pre-mrna Zrání pre-mrna Vytvoření čepičky (capping) Sestřih Editace C-terminální doména CTD platforma 1. Regulace aktivity RNAP II Defosforylovaná forma asociace s promotorem Fosforylace iniciace konformačních změn, stabilizace ternálního komplexu 2. Platforma pro asociaci komplexů posttranskripčních modifikací nascentního transkriptu Vytvoření čepičky, sestřih, rozštěpení, polyadenylace 1
Zrání pre-mrna Zrání pre-mrna Základní struktura čepičky: m7gpppn(m)pn(m)p 1974: mrna několika eukaryotických virů na 5 -konci není trifosfát, ale čepička Dnes: je na 5 -konci téměř všech eukaryotických mrna buněčného i virového původu Čepičce podobné struktury jsou i na 5 -konci většiny snrna (U1, U2, U3, U4, U5) čepičky První posttranskripční modifikace, předchází polyadenylaci i sestřihu Kotranskripční proces započatý krátce po iniciaci transkripce Typy čepičky: Typ 0: m 7 GpppN nižší eukaryota kvasinky, houby, améby Typ 1: m 7 GpppN(m) Typ 2: m 7 GpppN(m)pN(m) vyšší organismy 2
Základní struktura čepičky: m7gpppn(m)pn(m)p Základní struktura čepičky: m7gpppn(m)pn(m)p Typy čepičky: Typ 0: m 7 GpppN nižší eukaryota kvasinky, houby, améby Typ 1: m 7 GpppN(m) Typ 2: m 7 GpppN(m)pN(m) vyšší organismy Typy čepičky: Typ 0: m 7 GpppN nižší eukaryota kvasinky, houby, améby Typ 1: m 7 GpppN(m) Typ 2: m 7 GpppN(m)pN(m) vyšší organismy Modifikovaná čepička: 2,2,7m 3 GpppN(m)p (TMG čepička) Čepičce podobná struktura: U1, U2, U3, U4, U5 snrna Účast při sestřihu pre-mrna všechna eukaryota Zrání pre-mrna Časování syntézy čepičky: v jádře 5 -exonukleasy Úprava 3 -konce hydrolysující histonové mrna nechráněné RNA kotranskripční, dokončena brzy po započetí transkripce RNA <= 30 nukleotidů 3
Kotranskripční syntéza čepičky mechanismem 1. typu Odštěpení γ-fosfátu z nascentního transkriptu Přenos GMP z GTP na difosforylovaný 5 -konec RNA přes kovalentně vázaný intermediát Přenos -CH 3 z S-adenosylmethioninu na N 7 guaninu Methylace 2 -O-ribosy Cap I jádro Cap II - cytoplasma RTasa GTasa MTasa Cap I methyltransferasa Cap II methyltransferasa RTasa C. elegans: dva známé geny CEL1 574 aa N-konec - RTasa (236 aa) C-konec - velká podobnost s kvasinkovou a virovou GTasou C25A1.3 - MTasa (ABD1-like) GTasa MTasa Čepičkující enzymy a jejich geny Vaccinia virus: 130 kda binární komplex (geny D1 a D12) 95 kda RTasa (N-konec), GTasa (uprostřed) a MTasa (C-konec) 31 kda neznámá role, snad stimulátor Kvasinky: tři oddělené geny ScCET1 - RTasa (80 kda) ScCEG1 - GTasa (52 kda) ABD1 - MTasa (50 kda) Heterodimerický a bifunkční komplex podjednotky RTasa a GTasa HeLa buňky: dva známé geny HCE (human capping enzyme) 597 aa N-konec - RTasa C-konec - GTasa MTasa (55 kda) Čepičkující enzym mnohobuněčných živočichů je tvořen jednou dvojfunkční dvoudoménovou bílkovinou Méně obvyklé způsoby syntézy čepičky Trans-sestřih Bičíkovci (Trypanosoma, Euglena), Hlísti (C. elegans) 25% genů: operony obsahující polycistronické primární transkripty jednotlivé geny odděleny 100-400 bp spacery Zrání polycistronické pre-mrna: Rozštěpení a polyadenylace 3 -konce 5 -transkriptu Trans-sestřih 3 -transkriptu 22 bp SL RNA opatřená trimethylg čepičkou (jako U snrna) Zdrojem SL RNA je 5 -konec 100 bp prekursorové RNA transkribované RNA pol. II z repetitivní DNA (1kb repetice) SL RNA Rozštěpení Polycistronický primární transkript Trans-sestřih Zrání pre-mrna Zralá mrna Intron 4
Biologické funkce čepičky Stabilizace pre-mrna a mrna Stabilizace pre-mrna v jádře a mrna v cytoplasmě Ochrana před aktivitou 5 -exonukleas Stimulace polyadenylace Stimulace sestřihu pre-mrna Transport mrna z jádra do cytoplasmy Usnadnění a regulace translace Vývojová regulace v některých buňkách některých organismů CBP (cap-binding complex) Dimer CBP20 a CBP80 Sestřih pre-mrna Usnadnění navázání U1 snrnp k 5 -místu sestřihu Definice prvního (5 -) exonu Usnadnění polyadenylace Mechanismus souvisí s rozpoznáváním exonů Přítomnost čepičky a 3 -místa sestřihu má podobný efekt Nukleocytoplasmatický transport Zrání pre-mrna Nalezení polyadenylačního místa Polyadenylační signál Odštěpení 3 -konce pre-mrna Endolytické (endonukleasa) poly(a) řetězce Nezávisle na templátu Degradace 3 -fragmentu Význam poly(a) řetězce Export mrna z jádra Výjimka histonové mrna Translace Stabilizace mrna v cytoplasmě Alternativní polyadenylace Regulace degradace mrna 5
Specifikace místa polyadenylace - polyadenylační signál Bílkovinné faktory podílející se na polyadenyalci Mnohobuněční živočichové Zesilovač variabilní Mnohobuněční živočichové 10-30 nt 10-30 nt AAUAAA A Oblast bohatá GU a U Faktor CPSF Cleavage and polyadenylation specificity factor Podjednotky/Mw 160, 100, 73, 30 Štěpení a polyadenylace Vazba k AAUAAA Interakce s CstF, PAP a CF Im Polyadenylační signál Kvasinky DSE downstream element CstF Cleavage stimulation factor 77, 64, 50 Štěpení Vazba k downstream elementu Interakce s CPSF Výběr alternativních poly(a) míst UAUAUA Efficiency element UAUAUA apod. AAUAAA Positioning element Neexistuje konsensus PyA/Py(A) n DSE Nedůležité CF I m CF II m Cleavage factor I Cleavage factor II 72/68/59 + 25 dimer - 25 kd + 1/3 velkých podj. Není známo Štěpení První kontakt s RNA Vazba k CPSF Štěpení,??? U-rich Far upstream element Neexistuje konsensus Rostliny AAUAAA-like Near upstream element Neexistuje konsensus PyA/Py(A) n DSE Nedůležité PAP PABP Poly(A) polymerasa Poly(A)-binding protein 82 33 Štěpení a polyadenylace Katalyzuje polymerizaci AMP Interakce s CPSF Prodlužování poly(a) Stimulace PAP Kontrola délky poly(a) řetězce Štěpící komplex Výsledek endonukleolytického štěpení: 3 -OH a 5 -fosfát CPSF: jádro poly(a)osomu CFI první kontakt s RNA Která z těchto bílkovin je vlastní endonukleasou??? Poly(A) elongační komplex Elongace poly(a) řetězce: Nezávislá na templátu, zdrojem A je ATP Klíčová role PABP Není nutná účast CstF, CFI a CFII Nezbytná podmínka: vazba CPSF k AAUAAA V Předpoklad správného navázání PAP (PAP se špatně váže k RNA, vazba spíše prostřednictvím CPSF) PABP: Váže se na rostoucí poly(a) každých 10-11 nt Spolu s CPSF zabraňuje disociaci PAP z RNA Kontrola délky rostoucího poly(a) řetězce funkce pravítka??? 6
Polyadenylační faktory u rostlin??? CPSF-like CstF-like PAP více PABP genů Počet PABP genů: 1: S.cerevisiae, D.melanogaster 2: C.elegans, X.laevis 3: člověk 5: rýže 8: Arabidopsis thaliana Pozdní pylové geny Pohlavní orgány + 1 OS + 1 OS PABP geny u rostlin Kořeny Větší množství evolučně divergentních genů Tři evoluční větve u dvouděložných i jednoděložných Stáří nejméně 200 000 000 let Tkáňově specifická exprese Výrazná exprese pohlavních orgánech a zejména v pylu Výsledek funkční nebo regulační specializace??? Nové regulační funkce? Úloha při skladování mrna??? PABP3 + 3 OS Konstitutivní, silné Obvykle definovaná délka Savci: cca 250 nt Kvasinky: 60-70 nt Regulace délky poly(a) řetězce Rovnovážná populace mrna dynamický jev variabilní délka poly(a) řetězce Zrající oocyty, vajíčka a raná embrya: Translační regulace genové exprese 2 populace mrna translatovaná a translačně neaktivní (skladovaná) 2 Způsoby regulace délky poly(a) řetězce: 1. Zrající oocyty: aktivace nukleas > degradace poly(a) > translační inaktivace 2. Embrya: Kontrolované prodlužování krátkých oligo(a) řetězců během cytoplasmatické polyadenylace -> translační aktivace Cytoplasmatická polyadenylace CPE (cytoplasmic polyadenylation element) a vazebné bílkoviny Důležitá přítomnost AAUAAA Aktivita CPSF a PAP (stejné bílkoviny jako v jádře) u virů a bakterií Viry Adenoviry, SV40 využívajíbuněčný polyadenylační aparát Vaccinia virus kóduje vlastní poly(a) polymerasu Heterodimer - PAP + PABP v jednom katalytická podjednotka RNA-vazebná podjednotka Různé viry - klouzání polymerasy po templátu (slippage) poly(a) podle krátkých poly(u) sekvencí Bakterie jeden krok v procesu degradace mrna Intaktní mrna RNA fragmenty vzniklé endonukleolytickou degradací Poly(A) řetězec umožňuje navázání komplexu degradujících enzymů 7
Zrání pre-mrna Metabolismus histonové mrna Replikace DNA S-fáze buněčného cyklu: syntéza DNA koordinovaná syntéza množství histonů Histonová mrna 70 typů H mrna (savci) fluktuace poločasu života během buněčného cyklu neobsahuje introny, není polyadenylovaná synchronizovaná regulace exprese všech H genů S-fáze 35 x nárůst abundance H mrna aktivace transkripce zvýšení stability (T 1/2 = 45-60 min) konec S-fáze úbytek H mrna represe transkripce destabilizace mrna (T 1/2 = 10 min) Formování 3 -konce histonových pre-mrna Vlásenka se smyčkou 6nt vlásenka, 4nt smyčka 31 kb SLBP vážící se k vlásence 5 X Koordinace posttranskripční regulace všech 70 H mrna: stejný 3 -konec; vlásenka se smyčkou (SL) stem-loop-binding protein (SLBP) HDE (histone downstream element) purine-rich sekvence 10 nt oblast, 15 nt od vlásenky 3 Formování 3 -konce histonové mrna ZFP100 (100 kda zinc-finger protein) Zodpovědný za správný průběh zpracování 3 -konce histonové mrna jen v S-fázi buněčného cyklu U7 snrna TMG Místo endonukleolytického štěpení U7 snrnp??? Vlastní endonukleasa??? 8
Zrání pre-mrna Editace RNA Místně specifická změna sekvence RNA odchylující jí od sekvence DNA (RNA) templátu, mimo změn způsobených sestřihem a polyadenylací RNA Široce rozšířená Všechny skupiny organismů Bakterie, prvoci, houby, rostliny, živočichové Všechny buněčné kompartmenty Jádro, mitochondrie, plastidy Všechny hlavní typy RNA mrna, trna, rrna, 7SL RNA Editace RNA Popsané typy editace RNA Celá řada posttranskripčních úprav RNA probíhajících působením širokého spektra vzájemně nepříbuzných molekulárních mechanismů 1. Místně specifická delece nukleotidů 2. Místně specifická inserce nukleotidů, které nejsou kódovány genomovou DNA Typ editace Inserce/delece U Delece N Inserce N Záměna N Editovaná RNA Různé mrna (krna) Vasopressin mrna mrna, trna, SSU rrna trna (5 konc. 3 nt) trna (3 konc. nt) Organismus Bičíkovci (Trypanosoma, Leishmania, Crithidia, Bodonis) Hlodavci (GA) Physarum a další hlenky (C, U, AA, CU, GU, GC, UA), paramyxoviry (G), Ebola (A) Améby, chytridiomycety plži, hlavonožci, ptakopysk, kuře Kde M J M M 3. Enzymatická modifikace chemické struktury nukleotidů konverze nukleotidů Editace umožňuje expresi různých variant RNA bez nutnosti změn v DNA genomu Konverze C->U Konverze U->C Konverze A->I ApoB mrna Různé mrna, trna, introny Cox1 mrna Různé mrna Glutamát receptor mrna Serotonin 2C receptor mrna Introny pre-mrna Savci Vyšší rostliny Hlenky (Physarum) Vyšší rostliny, zejména játrovky Mozek savců Mozek savců Vyšší rostliny J M, C M M, C J J M 9
Zrání pre-mrna Mechanismy inserční/deleční editace RNA 2 základní skupiny mechanismů posttranskripční inserce/delece kotranskripční inserce/delece Posttranskripční inserce/delece U v krna bičíkovců 1986 první popis editace (Benne et al., Cell 46: 819-826) Inserce čtyř U do mrna pro podjednotky II cytochrom oxidasy (cox) v kinetoplastu Trypanosoma brucei a Crithidia fasciculata Rozsah editace Mnohem častější inserce než delece Od několika nukleotidů po více než 50% výsledné mrna (pan-editing) Guide RNA (grna) zdroj chybějící informace; 2 možné modely Enzymatickéštěpení/ligace (cleavage/ligation model) Autokatalytická transesterifikace Cleavage/ligation model Kotva duplex mezi grna a pre-mrna Analogie autokatalytického mechanismu sestřihu intronů Endonukleolytické rozštěpení pre-mrna na konci dvoušroubovice editační endonukleasa Inserce terminální uridylyl transferasa (TUTasa) Delece U-specifická exonukleasa Ligace RNA ligasa Komplexní mechanismus mrnp částice - editosom Pan-editing více grna pro jednu pre-mrna 10
Kotranskripční editace Specifická inserce G do mrna pro P protein kódovaný RNA genomem paramyxovirů 1-6 vložených G -> vznik alternativních ORF Analogicky: inserce A do mrna pro glykoprotein Ebola viru Trans-faktory důležité pro inserci/deleci v krna grna 50-70 bazí; obecná sekundární struktura, formování grnp částice 3 důležité oblasti 1) kotva homologie k editované pre-mrna 2) vodící oblast (guide region) templát pro editaci U 3) oligo(u) řetězec na 3 -konci stabilizace 5 -produktu štěpící reakce během editačního komplexu Polymerase stuttering (koktavá polymeráza): mechanismus transkripce podle pseudotemplátu Mechanismus: přerušení transkripce, couvnutí mrna po templátu, opětovné nasednutí a pokračování transkripce Kde: Klouzavé CnUn řetězce v RNA templátu Bílkovinné faktory endonukleasa, TUTasa/exonukleasa, RNA ligasa, RNA helikasa (disociace grna od pre-mrna) Editosom velký multienzymový komplex Mechanismy konverze nukleotidů během editace RNA Mechanismy konverze nukleotidů během editace RNA C->U: Apolipoprotein B obratlovců, změna kodonu CAA (Glu) -> UAA (STOP) Arabidopsis Editosom multiproteinový komplex; 27 kd enzym cytidin deaminasa + množství dalších proteinů Hydrolytická deaminace po osekvenování popsáno 456 C -> U konverzí během zrání pre-mrna v organelách, 441 z nich v ORF Hydrolytická deaminace Důležitý kontext místa editace, regulační sekvence Zejména: Zejména: C -> U C -> U A -> I A -> I 11
Mechanismy konverze nukleotidů během editace RNA A-> I Kvasinková trna, introny pre-mrna rostlin a obratlovců (Glutamát receptor v mozku savců) V intronech často předcházejí sestřihu Variabilní rozsah: 1 až >50% A v molekule Nutné vysoce organizované struktury RNA Adenosin deaminasa aktivní na dsrna Hydrolytická deaminace Rodiny ADAR a ADAT Adenosin deaminasa aktivní na RNA či trna Zrání pre-mrna 12