mudr. richard barteček V L I V FA R M A K O G E N E T I C K Ý C H A FA R M A K O K I N E T I C K Ý C H FA K T O R Ů N A P R Ů B Ě H A L É Č B U P RV

mudr. richard barteček V L I V FA R M A K O G E N E T I C K Ý C H A FA R M A K O K I N E T I C K Ý C H FA K T O R Ů N A P R Ů B Ě H A L É Č B U P RV N Í C H E P I Z O D S C H I Z O F R E N I E

V L I V FA R M A K O G E N E T I C K Ý C H A FA R M A K O K I N E T I C K Ý C H FA K T O R Ů N A P R Ů B Ě H A L É Č B U P RV N Í C H E P I Z O D S C H I Z O F R E N I E Disertační práce mudr. richard barteček Říjen 2012

Disertační práce: Vliv farmakogenetických a farmakokinetických faktorů na průběh a léčbu prvních epizod schizofrenie univerzita: Masarykova Univerzita fakulta: Lékařská fakulta školící pracoviště: Psychiatrická klinika studijní obor: Psychiatrie školitel: Doc. MUDr. Tomáš Kašpárek PhD. autor: MUDr. Richard Barteček místo: Brno datum: Říjen 2012

P R O H L Á Š E N Í Prohlašuji, že jsem tuto disertační práci vypracoval samostatně pod vedením svého školitele a uvedl jsem všechny literární zdroje. Brno, Říjen 2012 MUDr. Richard Barteček

A B S T R A K T Základní terapeutickou modalitou psychotických poruch je farmakoterapie. Z klinické zkušenosti je patrné, že mezi pacienty existuje výrazná interindividuální variabilita v reaktivitě na užitá psychofarmaka. Personalizovaná terapie psychotických poruch by mohla vést k větší úspěšnosti léčby, snížení incidence a tíže nežádoucích účinků. Farmakogenetika a farmakogenomika jsou obory, které zkoumají vliv genetických faktorů na účinnost a snášenlivost léčiva. Farmakogenetický výzkum se zaměřuje jak na geny ovlivňující farmakokinetiku léčiva (enzymy metabolizující léčiva, enzymy ovlivňující prostupnost léčiva skrz tkáňové bariéry), tak na geny se vztahem k farmakodynamice (geny pro cílové receptory léčiva). V prezentované studii jsme se zaměřili na 2 geny, jejichž produkty mají vliv na farmakokinetiku risperidonu: CYP2D6 kódující enzym metabolizující risperidon a gen MDR1 kódující P-glykoprotein, který je důležitý v permeaci některých psychofarmak skrz hematoencefalickou bariéru, u tohoto genu byly zkoumány 2 polymorfismy 2677G>T/A a C3435T. Tato studie je první studií zkoumající vliv variability výše zmíněných genů na výsledek terapie risperidonem u české populace pacientů. Do studie bylo zařazeno celkem 35 pacientů s první epizodou psychotické poruchy. U těchto pacientů bylo provedeno genetické vyšetření dvou výše zmíněných genů a v pravidelných intervalech byly posuzovány symptomy, nežádoucí účinky, dávky risperidonu, komedikace a subjektivní snášení léčby. Pacienti s defektním metabolismem CYP2D6 podle výsledků nejsou optimálními kandidáty pro léčbu risperidonem, nebot vykazují menší ústup symptomů při léčbě risperidonem a větší incidenci nežádoucích účinků. Podobně menší účinnost a více nežádoucích účinků vykazovali v naší studii také pacienti s mutovanou alelou C3435T. Polymorfismus 2677G>T/A se naproti tomu jeví jako faktor, který může být důležitý v rozvoji přírůstku na váze. Studie ukázala, že farmakogenetický výzkum schizofrenie je v našich podmínkách proveditelný, ale zároveň poukázala na metodologické problémy, které by měly být v následujících studiích řešeny, zejména se to týká velikosti souboru, měření hladin léčiv a kontroly enviromentálních faktorů a komedikace. vii

A B S T R A C T Main therapeutic modality of psychotic disorders is pharmacotherapy. Clinical experience shows that there is a significant inter-individual variability between patients in reaction to different medication. Personalized pharmacotherapy of psychiatric disorders may lead to higher success rate of a treatment and lowering of an incidence and extent of adverse effects. Pharmacogenetics and pharmacogenomics are disciplines investigating an effect of genetic factors on drug efficacy and tolerability. Pharmacogenetic research focuses on genes influencing both pharmacokinetic factors (drug metabolising enzymes, enzymes affecting the drug permeation through tissue barriers) and pharmacodynamic factors (drug target receptor genes). In presented study 2 genes influencing the pharmacocinetics of antipsychotic risperidone were studied: gene for CYP2D6, enzyme metabolising risperidone, and MDR1 gene coding P-glycoprotein, enzyme influencing permeation of some drugs through blood-brain barrier; two single-nucleotide polymorfisms were studied in later gene (2677G>T/A and C3435T). Totally 35 first-episode psychosis patients were enrolled into the study. In these patients genetic examination of 2 aforementioned genes was conducted and patients underwent periodical assesment of symptoms, adverse effects severity, risperidone and comedication dosages and subjective attitude towards the treatment. According to our results patients with impaired CYP2D6 metabolism appear to be not optimal recipients of risperidone therapy, because they showed lower symptom reduction and higher incidence of some adverse effects. Similarly lower efficacy and higher adverse effects incidence were found in patients with C3435T polymorfism. 2677G>T/A polymorfism appeared to be factor that may be important in weight gain during risperidone treatment. This study showed that while pharmacogenetic research of psychotic disorders is feasible in our conditions, there are several issues that should be addressed in next similar studies, especially issues concerning sample size, drug blood levels measurement and control of different environmental factors during a study. ix

P U B L I K A C E Seznam publikací autora dizertační práce. Některé informace, obrázky a grafy obsažené v této práci se mohly objevit v předchozích autorových publikacích (pro celé texty vybraných publikací viz také Příloha B, str. 127). [1] R. Barteček. Scientologie a psychiatrie. Psychiatr. praxi (Print), 11(1):3 3, 2010. (Citováno na straně 4.) [2] R. Barteček, J. Juřica, J. Zrůstová, T. Kašpárek, E. Pindurová, and A. Žourková. Relevance of cyp2d6 variability in first-episode schizophrenia patients treated with risperidone. Neuro Endocrinol Lett, 33(2):236 244, 2012. [3] R. Barteček, J. Juřica, J. Zrůstová, E. Pindurová, T. Kašpárek, and A. Žourková. Aktivita cyp2d6 u pacientů léčených risperidonem. Čes. slov. psychiatr., 107(6):327 334, 2011. [4] R. Barteček, T. Kašpárek, and E. Češková. Withdrawal related adverse effects of antipsychotic medication in a patient with first-episode schizophrenia. Central European Journal of Medicine, 6:662 664, 2011. 10.2478/s11536-011-0055-8. [5] J. Juřica, R. Barteček, A. Žourková, E. Pindurová, A. Šulcová, T. Kašpárek, and O. Zendulka. Serum dextromethorphan/dextrorphan metabolic ratio for cyp2d6 phenotyping in clinical practice. J Clin Pharm Ther, 37(4):486 490, Aug 2012. [6] J. L. Stein, S. E. Medland, A. A. Vasquez, D. P. Hibar, R. E. Senstad, A. M. Winkler, R. Torro, K. Appel, and R. Barteček et al. Identification of common variants associated with human hippocampal and intracranial volumes. Nat Genet, 44(5):552 561, May 2012. xi

P O D Ě K O VÁ N Í Poděkování patří všem, bez jejichž přispění by tato práce v této podobě nemohla vzniknout, v první řadě tedy mému školiteli doc. MUDr. Tomáši Kašpárkovi PhD. za vynikající odborné vedení, dále prof. MUDr. Alexandře Žourkové CSc. za cenné rady týkající se farmakogenetického výzkumu, PharmDr. Janu Juřicovi PhD. za vypracování metodiky fenotypizace CYP2D6, Mgr. Evě Pindurové a Ing. Janě Zrůstové za provedení genotypizace genu CYP2D6, celému kolektivu Psychiatrické kliniky Fakultní Nemocnice Brno a Masarykovy Univerzity za jejich rady a pomoc při sběru dat a nakonec mým rodinným příslušníkům a blízkým za podporu v průběhu celého studia. xiii

O B S A H i Teoretická část 1 1 Úvod 3 1.1 Farmakoterapie duševních poruch 3 1.1.1 Obecně 3 1.1.2 Interindividuální variabilita v léčebné odpovědi 3 1.1.3 Vize personalizované léčby 5 1.1.4 Schizofrenie 6 1.2 Obsah práce 7 1.3 Farmakogenetika 7 1.3.1 Historie 7 1.3.2 Metody farmakogenetického výzkumu 8 1.3.3 Předmět výzkumu 13 1.3.4 Potenciální využití 20 1.3.5 Aspekty zavádění farmakogenetického testování do praxe 22 1.3.6 Současný stav 23 1.4 Risperidon a 9-OH-risperidon 28 1.4.1 Obecně o risperidonu 28 1.4.2 Metabolismus risperidonu 28 1.4.3 Rozdíly mezi risperidonem a jeho metabolitem 29 1.5 CYP2D6 31 1.5.1 CYP jako I. fáze metabolismu xenobiotik 31 1.5.2 CYP2D6 a jeho variabilita - fenotypická, genotypická, jejich vzájemný vztah. 31 1.5.3 Různý výskyt v populaci. 32 1.5.4 Induktory a inhibitory. 33 1.5.5 Možnosti vyšetřování genotypu 34 1.5.6 Možnosti vyšetřování fenotypu. 36 1.5.7 Důsledky interindividuální variability metabolismu risperidonu 37 1.6 P-gp 41 1.6.1 Prostup látek skrz hemato-encefalickou bariéru (HEB) 41 1.6.2 Popis P-glykoproteinu 42 1.6.3 Lokalizace 44 xv

xvi obsah 1.6.4 Gen MDR1 45 1.6.5 Studie významu P-gp u léčby risperidonem 47 1.6.6 Závěr 48 ii Experimentální část 51 2 Kazuistika 53 2.1 Úvod 53 2.2 Popis případu 54 2.3 Diskuze 55 2.4 Závěr kazuistiky 57 3 Studie 59 3.1 Úvod 59 3.2 Cíle studie 59 3.3 Zkoumané hypotézy 60 3.4 Metody 60 3.5 Výsledky 64 3.5.1 Základní charakteristika 64 3.5.2 CYP2D6 65 3.5.3 P-gp 70 iii Diskuze 77 4 Výsledky studie 79 4.0.4 CYP2D6 79 4.0.5 P-gp 82 4.0.6 Možné interakce mezi CYP2D6 a MDR1 87 4.0.7 Limitace studie 88 4.1 Výsledky studie - závěr 89 4.2 Farmakogenetické testování v psychiatrii v širším kontextu 90 5 Shrnutí a závěr 93 literatura 94 iv Přílohy 121

S E Z N A M O B R Á Z K Ů Obrázek 1.1 Obrázek 1.2 Obrázek 3.1 Obrázek 3.2 Obrázek 3.3 Obrázek 3.4 Příklad grafu Manhattan (Manhattan plot) 11 Osud léčiva v organismu a možné cíle farmakogenetického výzkumu 14 PANSS skóre včetně subškál a pokles PANSS v průběhu studie v závislosti na různém genotypu CYP2D6 67 PANSS skóre včetně subškál a pokles PANSS v průběhu studie v závislosti na různém genotypu 2677G>T/A 71 PANSS skóre včetně subškál a pokles PANSS v průběhu studie v závislosti na různém genotypu C3435T 72 Změna hmotnosti (v procentech hmotnosti) v průběhu léčby risperidonem u všech sledovaných skupin 74 S E Z N A M TA B U L E K Tabulka 1.1 Tabulka 1.2 Tabulka 1.3 Tabulka 1.4 Tabulka 1.5 Tabulka 1.6 Hodnoty K i risperidonu a paliperidonu na vybraných receptorech a k P-glykoproteinu (MDR1) 30 Aktivita enzymu CYP2D6 a frekvence u vybraných alel a populací 33 Inhibitory CYP2D6 a jejich účinek na enzym 35 Příklady léčiv interagujících s P-gp s informací o způsobu jejich interakce 44 Četnosti alel u nejčastěji zkoumaných polymorfismů genu MDR1 u vybraných populací 46 Souhrn farmakogenetických studií zaměřených na vliv polymorfismů MDR1 při léčbě risperidonem 49 xvii

xviii Seznam tabulek Tabulka 3.1 Základní charakteristiky studovaného souboru 65 Tabulka 3.2 Frekvence alel ve sledovaném souboru 66 Tabulka 3.3 Tíže symptomů schizofrenie, jejich ústup a nežádoucí účinky při léčbě risperidonem v závislosti na různém genotypu CYP2D6 67 Tabulka 3.4 Výsledek léčby ve sledovaném souboru v závislosti na genotypu CYP2D6 68 Tabulka 3.5 Souhrn sledovaných veličin týkající se užívané medikace v průběhu studie v závislosti na genotypu CYP2D6 69 Tabulka 3.6 Medikace užívaná pacienty v průběhu studie 69 Tabulka 3.7 Subjektivní prožívání léčby v závislosti na genotypu CYP2D6 70 Tabulka 3.8 Tíže symptomů schizofrenie, jejich ústup a nežádoucí účinky při léčbě risperidonem v závislosti na různém genotypu MDR1 73 Tabulka 3.9 Výsledek léčby ve sledovaném souboru v závislosti na genotypu MDR1 74 Tabulka 3.10 Souhrn sledovaných veličin týkající se užívané medikace v průběhu studie v závislosti na genotypu MDR1 75 Tabulka 3.11 Subjektivní prožívání léčby v závislosti na genotypu MDR1 76

Část I T E O R E T I C K Á Č Á S T

Ú V O D 1 1.1 farmakoterapie duševních poruch 1.1.1 Obecně Objev chlorpromazinu v roce 1951 zahájil éru moderní psychofarmakoterapie [77, 96]. Před tímto objevem existovaly pouze omezené možnosti, jak ovlivnit příznaky u psychiatricky nemocných pacientů. Objev chlorpromazinu byl v tomto ohledu přelomovým okamžikem, následovaly objevy dalších látek. Farmakoterapie se stala základní a hlavní modalitou léčby duševních poruch. 1.1.2 Interindividuální variabilita v léčebné odpovědi Z klinické zkušenosti je patrné, že mezi pacienty existuje výrazná interindividuální variabilita v reaktivitě na užitá léčiva. Někteří pacienti dosáhnou při užívání zvolené medikace remise, u jiných se dosáhne jen částečného zlepšení a existují i takoví, u nichž nelze sledovat účinek léku vůbec. Někteří jedinci navíc vykazují nezanedbatelné nežádoucí účinky (NÚ). za prvé to vyplývá ze samotných vlastností duševních poruch tak, jak jsou klasifikovány dle diagnostických manuálů MKN-10 a DMS-IV. Tyto manuály jsou empirické (vycházejí z pozorovatelných znaků nebo jevů) a u většiny skupin duševních poruch také ateoretické (pouze v omezené míře je přihlíženo k etiologii poruch) [159]. Mnohé duševní poruchy tak nepředstavují jasně vymezené nemoci - tedy entity s jasně definovanou etiologií, patogenezí, projevy a symptomy, ale pouze poruchy, tedy entity, které jsou s větší určitostí vydělitelné od ostatních stavů a jsou definovány z velké části fenomenologicky, na základě klinických popisů [159]. I pokud je na duševní poruchy nahlíženo jako na nemoci, jsou považovány za nemoci etiologicky heterogenní [178]. Podobnost nemocí může být 3

4 úvod dána konvergencí různých patogenetických mechanismů. Jinými slovy: různí pacienti, byt vykazující podobné symptomy a jejich stav je označen jako jedna porucha, nemusí vůbec trpět stejnou nemocí. I u dnes poměrně jasně definovaných poruch, jako je například schizofrenie se předpokládá, že se jedná o skupinu nemocí, které jsou zatím nerozlišitelné [89]. Lze předpokládat, že tyto různé nemoci budou optimálně reagovat na jiný typ léčby. Jako dobře pochopitelný příklad podobného jevu z jiného oboru medicíny může posloužit příklad infekce. Infekce určitého orgánu různým agens se mohou svými symptomy podobat jedna druhé, ale terapie by měla zohlednit, zda je infekce způsobená bakteriemi, houbami či viry a také citlivost daného agens. Psychiatr je v tomto ohledu v obdobné situaci, v jaké musel být lékař na počátku éry antibiotik, který se snažil svým omezeným terapeutických armamentariem léčit infekce různými agens a mnohdy byla léčba neúspěšná, nebot lékař nevěděl a neměl možnost zjistit, že kupř. podává antibiotikum na rezistentní kmen bakterií, nebo u virové či mykotické infekce. 1 Etiologie a přesný sled patogenetických kroků, které vedou k propuknutí řady duševních poruch, zůstává, i přes značný pokrok na tomto poli, z velké části nejasný. Základním mechanismem účinku psychofarmak je ovlivnění přenosu signálu na chemických synapsích, je tedy pravděpodobné, že u duševních poruch je správný přenos signálu narušen. Je ale také pravděpodobné, že u různých poruch budou narušeny různé neurotransmiterové systémy a není vyloučeno, že prvotní změny jsou poměrně diskrétní. Z tohoto pohledu jsou psychofarmaka, často se svým ovlivněním široké palety receptorů, prostředkem značně hrubým. Výše zmíněné skutečnosti mohou vést jednak k tomu, že lékař podá lék u poruchy, která není daným lékem ovlivnitelná nebo že působení léku na nenarušené neurotransmiterové systémy povede k rozvoji nežádoucích účinků. 1 Tento problém je psychiatrii často vyčítán až do té míry, že je různými zájmovými skupinami označována za disciplínu nevědeckou [10]. Je ale nutno si uvědomit, že podobně na tom byla v minulosti drtivá většina medicínských oborů a dodnes u řady somatických chorob medicína tápe. Kupříkladu neznáme přesnou etiologii a patogenezi řadu onkologických, autoimunitních či neurodegenerativních onemocnění.

1.1 farmakoterapie duševních poruch 5 za druhé, i při užití stejného léku u stejné nemoci s jasně definovanou etiopatogenezí může být výsledek léčby různý. Příčinou je interindividuální variabilita pacientů. Cesta každého léčiva k cílovým terapeutickým strukturám je komplikován řadou faktorů. Léčivo je v různé míře metabolizováno a vylučováno, musí prostupovat skrze biologické bariéry. Všechny tyto faktory se mohou mezi pacienty lišit. Rovněž kaskáda dějů, které se spustí účinkem léčiva může být u různých pacientů různá. 1.1.3 Vize personalizované léčby Naprostá většina současných vodítek k léčbě duševních poruch sestává z protokolů, v nichž jsou popsány sekvence léčiv, která má lékař postupně vystřídat, dokud nenalezne takový lék nebo terapeutický postup, který je u daného pacienta účinný a u něhož jsou nežádoucí účinky vzhledem k přínosu zanedbatelné. Jako předposlední v řadě ověřených postupů jsou pak léčiva a postupy vyhrazené pro případy rezistentní na léčbu a jako poslední pak postupy experimentální. Terapeutická vodítka jsou sestavena dle zásad evidence-based medicine zhodnocením důkazů o prospěchu a rizicích různých léků. Z klinické zkušenosti je patrné, že pacient vůbec nemusí zareagovat na první podávaný lék. Jak bylo demonstrováno ve studii CATIE, je spíše pravidlem, že pacient vystřídá více antipsychotik, než je zvoleno to účinné a bezpečné [166]. Naopak existují případy, kdy pacient vystřídá řadu léků, než je nalezen ten skutečně účinný s minimem nežádoucích účinků. Tento časově náročný postup s sebou nese řadu negativ. Ze strany pacienta vede rozvoj nežádoucích účinků a prodlužování hospitalizace ke snižování důvěry k léčbě a následně i k non-kompliance. Podle některých indicií pak může u některých poruch vést delší doba neadekvátní terapie k progresi choroby a rozvoji rezistence na léčbu. (Jako příklad lze uvést předpoklad, že délka neléčené psychózy je prognostickým faktorem úzdravy [126].) Ze strany společnosti pak prodlužování hospitalizace vede ke zvyšování finanční náročnosti. Bohužel s aktuální úrovní znalostí je jiný postup zatím nemožný. Proti výše popsanému přístupu postavenému na protokolech léčby stojí vize personalizované terapie. V ide-

6 úvod álním případě bude v budoucnu možné na základě určitých objektivních kritérií odhadnout reaktivitu pacienta na léčbu a zvolit ihned v první době takový lék, který bude efektivní s minimem nežádoucích účinků. Od toho je současná věda samozřejmě ještě daleko. Přesto je možnost personalizované léčby lákavá a v posledních desetiletích stále více zkoumaná. 1.1.4 Schizofrenie Jednou z poruch, u níž je možnost individualizované terapie intenzivně zkoumána je schizofrenie. Schizofrenie je závažná invalidizující duševní porucha. Dle studie WHO Global Burden of Disease je jednou z čelních příčin invalidity. Na veškerých Disability Adjusted Life-Years - (což je počet let, po které je člověk neproduktivní, protože v důsledku nemoci či poruchy nepracuje nebo umírá předčasně) se schizofrenie podílí 1,1 %, čímž se mezi neuropsychiatrickými poruchami řadí na 3. místo za unipolární depresi (4,3 %) a poruchy vyvolané užíváním alkoholu (1,6 %) [119]. Díky tomuto a také díky pravidelným dlouhým hospitalizacím tak schizofrenie představuje závažnou finanční celospolečenskou zátěž. Na individuální úrovni vede schizofrenie svými příznaky ke značnému utrpení a snížení kvality života jak u pacientů, tak u jejich rodinných příslušníků. Léčba antipsychotiky s sebou navíc téměř vždy nese břemeno nežádoucích účinků. V současné době je dostupné množství antipsychotik a psychiatr často stojí před otázkou jaký lék zvolit, aby pacientovi pomohl a neublížil. Jakýkoliv ověřený postup, který by v tomto rozhodování mohl lékaři pomoci by byl vítán. Teoreticky existuje několik možností, jak zvýšit úspěšnost léčby psychofarmaky: Nejlépe na základě objektivních kritérií jasně a přesně definovat podtypy psychiatrických poruch a definovat, které léky jsou u daných podtypů nejúčinnější. Nalézt kritéria, podle nichž je možno vytipovat jedince, kterým je vzhledem ke svým specifikám v metabolismu léčiv, v prostupnosti látek skrz biologické bariéry, specifikám v cílových strukturách a obecně v reaktivitě na daná léčiva vhodné podávat nebo nepodávat zvolený lék.

1.2 obsah práce 7 Ve výzkumu jsou využívány různé přístupy, kupř. jsou hledány biochemické markery, zobrazovacími metodami se pátrá po intermediárních fenotypech, pomocí nichž by bylo možno nalézt subtypy duševních poruch. Jedním ze stěžejních přístupů jsou však přístupy genetické a právě proto je koncept personalizované terapie spojován s pojmem farmakogenetika. 1.2 obsah práce Tato disertační práce je malým příspěvkem k farmakogenetickému výzkumu schizofrenie. Představuje výsledek studie, která probíhala na Psychiatrické klinice Fakultní Nemocnice Brno a Masarykovy Univerzity ve spolupráci s Oddělením lékařské genetiky Fakultní nemocnice Brno, Ústavem farmakologie a Ústavem patologické fyziologie Masarykovy Univerzity. Následující text je koncipován do dvou částí. V teoretické, přehledové části bude pojednáváno nejprve o farmakogenetice, její historii, metodách, předmětu a využití výzkumu, dále bude s ohledem na obsah experimentální části rozebrána farmakogenetika 2D6 isoformy Cytochromu P- 450 (CYP2D6) a P-glykoproteinu (P-gp) s ohledem na antipsychotikum risperidon. V experimentální části bude jako první prezentována kazuistika demonstrující praktické dopady některých skutečností popsaných v teoretické části; hlavním jádrem pojednání je pak prezentace studie, jejímž cílem bylo zhodnotit vliv variability CYP2D6 a P-gp na účinnost a snášenlivost risperidonu. 1.3 farmakogenetika 1.3.1 Historie V roce 1959 použil Vogel poprvé termín farmakogenetika [7], mnohem později se objevil termín farmakogenomika [80]. Základní hypotézou těchto oborů je, že interindividuální variabilita v odpovědi na léčiva je podmíněna genetickými faktory. Farmakogenetika zkoumá vliv jednotlivých mutací konkrétního genu na efekt léčiva, farmakogenomika pak tuto souvislost zkoumá z pohledu celého genomu. Sledován pak může být přímo genotyp, nebo mo-

8 úvod hou být sledovány produkty exprese jednotlivých genů - fenotyp. Výzkum variability na úrovni fenotypu se objevil již v 50. letech minulého století, kdy technologie umožnila identifikaci rozdílů v enzymech metabolizujících léčiva a detekci rozdílných metabolitů užívaných látek [7]. Byl to tedy vliv farmakokinetických faktorů na terapeutickou odpověd, který byl zkoumán jako první. Farmakogenetika byla dlouho definována jako obor zabývající se dědičností lékové odpovědi ve vztahu k metabolismu léků [129]. Teprve mnohem později s rozvojem molekulární genetiky začal výzkum variability farmakodynamických faktorů a jejího vlivu na odpověd na léčbu. Tento výzkum se zaměřuje na hledání rozdílů v genech kódujících zejména terapeutické cílové struktury, především receptory neurotransmiterů. Je pravdou, že lékařská genetika již poskytla praktické výsledky v podobě možnosti diagnostikovat některá dědičná onemocnění, je to ale její podobor - farmakogenetika, která slibuje přivést genetické metody přímo do oblasti primární péče [38, 128]. 1.3.2 Metody farmakogenetického výzkumu Základním cílem farmakogenetického výzkumu je nalézt genetické nebo fenotypické markery, které by mohly predikovat individuální reaktivitu pacienta na léčbu a získat dostatečné důkazy, které by ospravedlnily analýzu takových markerů v klinické praxi. Při aplikaci poznatků získaných farmakogenetickým výzkumem se pak předpokládá provedení analýzy zvolených markerů u každého pacienta. Farmakogenetická studie je většinou vztažena k jednomu léku, méně vhodně na celou skupinu léků. Generalizace na jiné léky pak může napovědět jakým dalším směrem výzkum zaměřit. 1.3.2.1 Genotyp Farmakogenetický výzkum s užitím genotypizace je v současnosti využíván častěji než výzkum na úrovni fenotypu [79]. Takto je zkoumaná celá řada genů od genů pro enzymy metabolizující léčiva až po geny pro receptory jako cílové struktury léků. Tradiční přístup s využitím konvenčních statistických metod je starší, v posledních letech se,

1.3 farmakogenetika 9 zejména díky rozvoji genetického testování a výpočetní techniky, objevují i metody zkoumající celý genom - takzvané celo-genomové asociační studie [135]. Jedinci se mezi sebou liší množstvím mutací v řadě genů. Tyto mutace mají nejčastěji podobu jednonukleotidových polymorfismů (single-nucleotid polymorphism, SNP), uplatňují se ale také tandemové repetice (copy number variations, CNV) nebo delece [135]. Dle některých zdrojů je pravděpodobné, že se na variabilitě odpovědi na léčbu podílejí také epigenetické faktory jako například methylace [150], výzkum těchto faktorů vyžaduje specifické přístupy. výhodou přístupu analyzující přímo genotyp je časová stabilita genetických markerů. Výsledek genotypizace je odrazem neměnné predispozice daného pacienta. Na druhou stranu toto může být vnímáno také jako nevýhoda: tento přístup zcela zanedbává vlivy prostředí, zejména vlivy lékových interakcí. studie kandidátních genů představují, jak již bylo zmíněno, starší metodu. U této formy farmakogenetického výzkumu je nutné mít, zcela dle zásad výzkumu založenému na hypotéze, jisté teoretické informace o zkoumaném léku a jeho farmakokinetice a farmakodynamice a analýzu cílit na takové geny, k jejichž produktům zkoumané léčivo vykazuje afinitu nebo jejichž produkty se podílejí na patofyziologii zkoumaného onemocnění [135]. Není například příliš smysluplné zkoumat geny pro enzym, který se vůbec nepodílí na metabolizaci daného léku. Pravda ale je, že někdy mohou být zkoumané geny od hlavního předpokládaného patofyziologického řetězce značně vzdáleny, příkladem budiž farmakogenetický výzkum genu pro oxytocinový receptor při léčbě schizofrenie antipsychotiky [162]. design tradičních farmakogenetických studií zjednodušeně vypadá takto: U pacientů je měřena intenzita příznaků, nežádoucích účinků popř. jiné veličiny týkající se léčby zvolenou substancí, o které má výzkumník zájem. Optimálně se toto měření děje za prospektivního sledování; pro náročnost prospektivního sledování se řada výzkumníků uchyluje ke studiím retrospektivním nebo průřezovým. V průběhu studie jsou pacienti genotypizování jednou ze zmí-

10 úvod něných metod. V další analýze jsou pak tito pacienti rozděleni do skupin dle zjištěných alel zkoumaných genů. Následně jsou sledované veličiny týkající se reaktivity na léčbu porovnávány mezi takto definovanými skupinami za užití standardních statistických metod. gwas studie V posledních letech se objevila nová metodika genetického výzkumu, která vyžaduje analýzu až několika milionů genetických variant a následné statistické zpracování výsledků využitím sofistikovaných metod vícerozměrné analýzy. Toto vše je možné jednak díky rozvoji genetických metod umožňující stále levnější a rychlejší genotypizaci mnoha genů a také díky nárůstu dostupného výpočetního výkonu. Tyto studie se označují jako Genomewide association studies (zkráceně GWAS, česky ne zcela přesně přeloženo jako celo-genomové studie). [135] Tento způsob genetické analýzy byl zprvu využíván v genetické epidemiologii při výzkumu polygenně podmíněných onemocnění [135], následně ale své využití našel i ve farmakogenetickém výzkumu [104]. metodika GWAS se od metodiky tradičních farmakogenetických studií liší. Sledování a kvantifikace veličin spojených s reaktivitou na léčbu je shodná. U GWAS však není provedena analýza jednoho genu nebo omezeného množství genů. Místo toho je proveden průzkum celého genomu a je hledáno velké množství - obvykle i tisíce - genetických variant. Při nejčastějším typu GWAS se pak hledají ty genetické varianty, které se nenáhodně liší mezi skupinami pacientů a kontrol (v případě epidemiologických studií) nebo mezi skupinami pacientů různě reagujících na léčbu. [104, 181] výhodou GWAS studií je zejména skutečnost, že nevyžadují apriori žádnou teorii o farmakokinetice či farmakodynamice daného léku. Díky tomu, že jsou mezi mnoha genetickými variantami nalezeny ty, které se pojí s určitou reaktivitou na léčbu, umožňuje tento výzkum naopak vést k objevu nových teorií o fungování léčiva nebo patofyziologii zkoumaného onemocnění. Umožňují také vzít v potaz geny, jejichž funkce je neznámá, a tudíž by nemohly být použity v přístupu kandidátních genů, stejně tak ob-

1.3 farmakogenetika 11 Obrázek 1.1: Příklad grafu Manhattan (Manhattan plot) Jedním ze způsobů grafické prezentace výsledků GWAS je graf Manhattan. Na obrázku je příklad grafu Manhattan (Manhattan plot) jako výstupu imaginární GWAS studie. Na ose x jsou vyznačeny jednotlivé genetické varianty, na ose y je vyznačena úroveň statistické významnosti asociace. lasti genomu, které nekódují žádné proteiny, ale podílejí se na regulaci transkripce a translace. [74, 104] limitace GWAS studií jsou několikeré: možnost falešně pozitivních a falešně negativních výsledků a s tím související nutnost velkých souborů pacientů, insensitivita k vzácným genetickým variantám, potenciální možnost chyb při genotypizaci, neznámá funkce zjištěných genů, možnost bias při nevhodně zvoleném souboru pacientů [181]. Z výše uvedených důvodů nejsou GWAS studie některými autory uznávány jako studie, které samostatně postačují k prokázání skutečného vlivu nalezených genetických variant [113]. 1.3.2.2 Fenotyp Farmakogenetický výzkum na základě fenotypu je možný zejména u enzymů metabolizujících xenobiotika, u nichž lze měřit koncentrace původních látek a metabolitů. Teoreticky je sice možné představit si měření fenotypu na základě afinity neurotransmiterů k receptorům, hlavní místo má ale fenotypizace ve farmakogenetickém výzkumu enzymů metabolizujících xenobiotika [27]. Stejně jako u prospektivních studií využívajících genotypizaci je u této formy farmakogenetického výzkumu mít vstupní teoretické znalosti, kupříkladu musí být známo, kterým enzymem je zvolený lék metabolizován.

12 úvod základní metodika se podobá metodice studií s využitím genotypu. I v tomto případě jsou pacienti sledovaní a jsou kvantifikovány různé veličiny, místo genotypizace je u nich ale provedena fenotypizace. U farmakogenetického výzkumu týkajícího se enzymů metabolizujících léčiva jsou často při určení fenotypu využívány tzv. testovací substance, což jsou látky, které jsou metabolizovány stejným enzymem, jako zvolené léčivo. Pacientům je tato látka většinou jednorázově podána a po určité době je pak změřena koncentrace testovací látky a jejích metabolitů v moči [14], v krvi [192] nebo slinách[52] ; z těchto výsledků se spočítá metabolický poměr (metabolic ratio) jako poměr koncentrace mateřské látky a jejího metabolitu [192]. Jinou možností je měřit přímo metabolický poměr léčiva a jeho metabolitu [153]. Intenzita metabolismu je dána metabolickým poměrem. Při konečném hodnocení jsou pak pacienti bud rozděleni do skupin podle intenzity metabolizace (a ve statistickém hodnocení jsou použity odpovídající parametrické či neparametrické statistické metody analyzující rozdíly mezi skupinami) nebo mohou být sledované veličiny korelovány s metabolickým poměrem. výhodou tohoto přístupu je skutečnost, že je v tomto případě měřen přímo fenotyp, tedy bere v úvahu také vlivy prostředí. Jak bude demonstrováno v dalším textu, aktivita mnoha enzymů nezávisí pouze na genetických faktorech, ale může být ovlivněna jinými látkami - zvýšena induktory a snížena inhibitory. Zjišt ování fenotypu tedy bere v úvahu aktuální aktivitu enzymu v dané chvíli, která se může lišit od teoretické aktivity odvozené z genotypu. Tím je tato metoda vhodnější všude, kde se předpokládá vliv například lékových interakcí. aplikace této formy farmakogenetického výzkumu předpokládá využití řady testovacích substancí, které jsou podány jednorázově; v literatuře se tento přístup označuje jako koktejlový. V takovém případě je možno změřit aktivitu několika metabolizujících enzymů najednou. Metabolický poměr se měří jako poměr koncentrací mateřské látky a odpovídajícího metabolitu. [19] Na základě výsledků pak může být nasazena nebo upravena farmakoterapie - kupř. by nebyl podáván takový lék, jehož defektní metabolismus by vedl ke zvýšenému

1.3 farmakogenetika 13 riziku závažných nežádoucích účinků, nebo by mohla být upravena dávka - sníženo dávkování u pacientů s narušeným metabolismem, nebo zvýšena u pacientů s výraznějším metabolismem zvoleného léku. 1.3.3 Předmět výzkumu Každé léčivo má po svém podání pacientovi poměrně složitý osud a účinek léčiva je ovlivněn mnoha faktory. Léky jsou po svém vstupu do organismu metabolizovány, v krvi se může nacházet jak původní léčivo, tak jeho metabolity, které mohou být aktivní a tedy rovněž vykazovat farmakodynamický účinek. Metabolity jsou následně z těla jistou rychlostí vylučovány. Odpověd na léčivo, at už terapeutická nebo toxická, závisí dále na koncentraci léku na místě aktivity. Kritickou determinantou účinku léku je tedy jeho distribuce, což je komplexní proces, který zahrnuje transport léčiva skrz biologické bariéry z místa resorpce do krve a z krve na místo účinku eventuálně na místo exkrece [103]. Farmakogenetický výzkum se může uplatnit všude, kde léčivo vykazuje afinitu k nějakému proteinu. Enzymy metabolizující léky, pumpy ovlivňující prostup skrz biologické bariéry a vylučování a také samotné cílové struktury, nejčastěji receptory, jsou proteiny. Osud léčiva s vyznačenými potenciálními cíli farmakogenetického výzkumu jsou zobrazeny na obrázku 1.2. 1.3.3.1 Metabolismus a vylučování Léčiva jsou v podstatě xenobiotika a jako taková jsou metabolizovaná a následně vylučována. Metabolizace xenobiotik se děje nejčastěji ve dvou krocích [103]. fáze 1 První krok metabolismu xenobiotik vede ke zvýšení polarity sloučenin různými reakcemi, nejčastěji oxidací, méně často redukcí, hydrolýzou, cyklizací nebo decyklizací. Mezi enzymatické systémy uplatňující se při oxidaci patří systém cytochromu P450, který se uplatňuje také při redukci, flavin-obsahující monooxygenázový systém, alkohol dehydrogenáza, aldehyd dehydrogenáza, oxidáza monoaminů a peroxidáza. V hydrolýze se pak uplatňuje esteráza, amidáza a epoxid hydroxyláza. Naprostá většina těchto re-

14 úvod Obrázek 1.2: Osud léčiva v organismu a možné cíle farmakogenetického výzkumu Psychofarmakon (1) po vstupu do organismu může podstupovat jaterní metabolismus (2). V krvi (3) lze zjistit jak původní substanci, tak její metabolity, které mohou a nemusí být aktivní. Metabolity mohou být vylučovány ledvinami (4). Psychofarmakon a jeho aktivní metabolity pak v různé míře prostupují skrz hematoencefalickou bariéru (HEB, 5) až k místě svého působení - do mozku (6). Velká písmena vyznačují nejčastější cíle farmakogenetického výzkumu: A - enzymy jaterního metabolismu, B - enzymy facilitující nebo omezující prostupnost skrz HEB, C - receptory.

1.3 farmakogenetika 15 akcí probíhá v hladkém endoplasmatickém retikulu jater, některé enzymy jsou ale exprimovány také v jiných tkáních jako například v mozku. Nejdůležitější z výše zmíněných enzymatických systémů je právě cytochrom P450 se svými četnými izoenzymy, kdy každý izoenzym vykazuje afinitu k jinému spektru substrátů. [103] fáze ii Druhá fáze bezprostředně předchází vylučování látky. Probíhá jako konjugační reakce za účasti nejrůznějších enzymů a kofaktorů. Produktem konjugačních reakcí jsou látky, které již nevykazují farmakodynamickou aktivitu. Mezi konjugační reakce patří methylace, sulface, acetylace, glukuronidace, konjugace glutathionem anebo glycinem [103]. využití Jak již bylo zmíněno interindividuální variabilita metabolismu léčiv stála na počátku farmakogenetického výzkumu v 50. letech 20. století, tehdy samozřejmě nikoliv pomocí dnešních metod genetického výzkumu, ale za pomocí metod farmakologických [7]. V podstatě se jednalo o fenotypizaci popsanou výše. Při farmakogenetickém výzkumu enzymů metabolizující léčiva je snaha zjistit, zda pacienti se zvýšeným nebo sníženým metabolismem reagují na zvolené léčivo jinak než pacienti s metabolismem normálním. Jak bude popsáno dále, pro farmakogenetiku psychofarmak je nejdůležitějším enzymem systém Cytochrom P-450 se svými četnými izoenzymy [42]. Díky své důležitosti je také nejlépe prozkoumaným xenobiotikametabolizujícím enzymatickým systémem. Ostatní enzymatické systémy jsou prozkoumány méně, je ale pravděpodobné, že také mohou ovlivňovat reaktivitu pacientů na některá léčiva [7]. Na tomto místě budiž předesláno, že existuje mnoho izoenzymů Cytochromu P-450, každý má své substráty, které metabolizuje [7]. Této skutečností je využíváno ve fenotypizaci, kdy se používá řada rozdílných testovacích substancí, přičemž je každá z nich metabolizovaná jiným enzymem nebo na jiný produkt [19]. S rozvojem genotypizace byly nalezeny polymorfismy v genech pro enzymy metabolizující xenobiotika. Samozřejmě je možné hledat vliv takto zjištěných polymorfismů na efekt léčiva. Vhodnější je však zjistit, jak se tyto genetické varianty odrážejí ve funkci enzymu, tedy které varianty podmiňují enzym se sníženou a které se zvýšenou

16 úvod funkcí, eventuálně jestli některé polymorfismy nevedou k vyšší nebo nižší ovlivnitelnosti enzymu induktory nebo inhibitory; jinými slovy nalézt vztah genotyp - fenotyp. Ne vždy je taková jasná souvislost patrná. Příklad izoenzymu s dobře zjištěným vztahem genotyp - fenotyp je 2D6 izoenzym Cytochromu P-450 (CYP2D6) [81], zatímco například u izoenzymu 1A2 je souvislost patrně složitější [7]. Dalšími důležitými izoformami jsou 2C19 (CYP2C19) a 3A4 (CYP3A4) [7]. Systému Cytochromu P450 se zvláštním ohledem na CYP2D6 bude věnován zvláštní oddíl v dalším textu. Dokonce i u enzymů, u kterých je vztah genotyp - fenotyp dobře definovaný, nelze s jistotou říci, že genotypizací zjišt ujeme skutečnou aktivitu. Tvrzení o takto zjištěné aktivitě je pouze aproximace, takto zjištěná aktivita neodráží s naprostou jistotou aktuální fenotyp, který může, jak již bylo zmíněno, záviset také na faktorech prostředí. Z diskrepance mezi aktivitou odvozenou z genotypu a skutečnou můžeme usuzovat na aktuálně působící vlivy prostředí, zejména jestli aktuální komedikace působí například jako inhibitor nebo induktor. V dalším textu bude na jedné kazuistice ukázáno, jak může taková diskrepance vypadat a jaké může mít klinické dopady (viz strana 53). 1.3.3.2 Prostup skrz biologické bariéry biologické bariéry obecně Jak již bylo zmíněno, každé léčivo musí prostupovat v různé míře přes biologické bariéry. Biologické bariéry rozdělují organismus do několika více či méně oddělených kompartmentů. Každá biologická bariéra sestává z jednoho nebo více druhů buněk, které společně vytvářejí rozhraní mezi dvěma fyziologickými prostředími (např. krev a centrální nervový systém v případě hematoencefalické bariéry). Složky každé bariéry jsou tak představovány buněčnými membránami odpovídajících buněk se všemi náležitostmi - lipidovou dvojvrstvou a proteiny celulární membrány včetně transportérů - a bazální membránou. Rozhraní mezi krví a jiným prostředím je povětšinou tvořeno minimálně dvěma typy buněk, jednou z nich jsou vždy endoteliální buňky kapilár, druhou bývají epiteliální buňky odpovídající tkáně. Bariéry můžeme podle propustnosti zjednodušeně dělit do dvou skupin: První skupina má fenestrovaná spojení mezi

1.3 farmakogenetika 17 endoteliálními buňkami a tyto bariéry pak ovlivňují distribuci látek pouze v omezené míře (rozhraní mezi krví a většinou systémových orgánů - játra, ledviny apod). Druhou skupinou jsou pak bariéry s těsnými mezibuněčnými spoji, které pro distribuci látek představují závažnou bariéru a vytvářejí tak farmakologicky sekvestrované oblasti. Příkladem bariér významnou měrou ovlivňujících prostupnost léčiv budiž hematoencefalická bariéra (HEB), bariéra krevmozkomíšní mok, placentární bariéra, bariéra v mléčné žláze a bariéra krev-testes. [103] Vzhledem k tomu, že koncentrace léčiva v místě působení je důležitá a místo působení psychofarmak je farmakologicky sekvestrovaná oblast - mozek - je míra prostupnosti léku skrz HEB limitující pro jeho účinek. Důležitou složkou biologických bariér jsou membránové transportní proteiny, které se chovají jako pumpy facilitující transport látek skrz buněčné membrány. Mohou se dělit dle několik kritérií: podle subcelulární orientace (basolaterální resp. luminální a apikální resp. abluminální), podle směru čerpání látky (influxní čerpající látky do buňky a efluxní z buňky), a dle zdroje energie (primární, sekundární). Umístěním a směrem čerpání látky je pak dáno, zda transportér prostup látky skrz bariéru usnadňuje nebo znemožňuje 2. [103] Tak jako u jiných proteinů i u těchto mohou nejrůznější mutace ovlivnit jejich aktivitu, afinitu k substrátům i k potenciálním induktorům a inhibitorům [103]. Právě zde nachází farmakogenetika další cíl svého výzkumu. hematoencefalická bariéra a bariéra krev - mozkomíšní mok Léčiva musí při vstupu do mozku překonat bud HEB nebo bariéru krev-mozkomíšní mok nacházející se v choroideálním plexu. HEB je se svou až 1000-krát větší plochou mnohem důležitější než druhá zmiňovaná bariéra, a je také hlavním místem vstupu léků do mozku. Endoteliální buňky v HEB jsou spojeny těsnými spojeními, jsou polarizované, vykazují malou míru endocytózy a transcelulárního prostupu potenciálně toxických substancí. Pasivní difuse skrz HEB je proto omezena na malé lipofilní molekuly. Hlavním módem transportu látek do mozku je 2 Vysoká afinita léčiva k transportéru tedy nemusí znamenat jeho snadnější transport do místa působení, ale naopak jeho lepší transport z buněk tvořících bariéru, a tudíž jeho horší prostupnost skrz ní.

18 úvod transcytóza pomocí receptory-mediované endocytózy, velkou důležitost mají také různé transportéry. Transportéry ve formě efluxních pump jsou rovněž důležité v omezení prostupu xenobiotik do mozku [103]. V rámci farmakogenetiky jsou nejlépe prozkoumány právě některé z těchto efluxních pump, konkrétně P-glykoprotein. Možnost jejich ovlivnění induktory a inhibitory se také jeví jako další významný zdroj interakcí mezi léčivy. 1.3.3.3 Cílové struktury a struktury odpovídající za rozvoj nežádoucích účinků terapeutický účinek Bezprostředním mechanismem účinku psychofarmak je většinou jejich působení na nejrůznější receptorové systémy [165], méně často na jiné proteiny, kupř. transportní proteiny (serotoninový transportér u antidepresiv apod.)[165]. Na těchto receptorech působí psychofarmaka nejčastěji jako antagonisté, méně často jako agonisté. Míra vazby molekuly léčiva na receptor je dána jeho afinitou. Vazbou léčiva na receptory se ovlivní vazba přirozených substrátů a v součinnosti s touto změnou dochází ke kaskádě dalších jevů zprostředkovaných dalšími proteiny, které se podílejí na intracelulární transdukci signálu. Tato kaskáda mnohdy zasahuje na subcelulární úrovni až k ovlivnění transkripce jiných proteinů a v širším měřítku k ovlivnění celých neurotransmiterových systémů. [165] Jako kandidátní geny pro farmakogenetický výzkum jsou myslitelné jakékoliv z genů kódujících proteiny v této kaskádě. První nasnadě jsou přímo geny pro receptory, na které se léčivo váže. Afinita psychofarmaka k receptorům sloužilo jako první vodítko k volbě cílů farmakogenetického výzkumu. Nejčastějšími zkoumanými neurotransmiterovými systémy jsou v případě psychofarmak systém dopaminergní a serotoninergní. [98] Při snaze o to definovat kandidátní geny mezi geny kódujícími proteiny podílejícími se na přenášení signálu dále v kaskádě intracelulární signalizace a proteinů podílejících se na intracelulárních dějích, lze narazit na problém jejich velkého množství. Zmíněné kaskády a děje navíc nejsou do detailu plně pochopené a mnoho proteinů není dozajista známo, nebo není známa jejich plná funkce. Vzhledem k této skutečnosti je vhodnější vytipovat nadějné

1.3 farmakogenetika 19 geny pomocí GWAS studií. Jejich vliv je pak možno prokázat v dalších prospektivních studiích. nežádoucí účinky U nežádoucích účinků způsobených známou aktivitou léčiva na receptorech je situace obdobná jako u účinků terapeutických. Jako kandidátní geny pro farmakogenetický výzkum je možné použít geny pro receptory, o kterých je známé, že jsou léčivem ovlivněné. Mechanismus vzniku některých nežádoucích účinků, a to i poměrně častých (metabolické nežádoucí účinky u antipsychotik 2. generace), nebo závažných (agranulocytóza u klozapinu) není zcela prozkoumán. V tomto případě opět nacházejí využití GWAS studie, které mohou nalézt zatím neznámé patogenetické souvislosti jako přidanou hodnotu k nalezení markerů vulnerabilních jedinců. 1.3.3.4 Jiné GWAS studie mohou potenciálně odhalit i takové geny, které s přímým účinkem léčiva souvisí jen vzdáleně a mohou tak přispět ke vzniku nových teorií o mechanismu účinku léčiva nebo patofyziologii zkoumaného onemocnění [74, 104]. Ale i v přístupu zaměřeném na kandidátní geny existuje možnost zkoumat geny, které na první pohled s mechanismem působení léčiva nesouvisí. Jak již bylo zmíněno, zkoumány tak mohou být v první řadě geny pro proteiny v informační kaskádě spuštěné prvotním ovlivněním receptoru (kupř. enzymy intracelulární transdukce, proteiny regulující buněčný cyklus, transkripční faktory). Tato kaskáda ale může zasahovat také jiné neurotransmiterové, enzymatické a hormonální systémy, které se mohou podílet na terapeutickém efektu nepřímo. Jako příklad výzkumu možného nepřímého působení léku budiž studie zkoumající podíl oxytocinu na terapeutickém účinku antipsychotik, které jako kandidátní geny zvolily geny pro oxytocinové receptory [162]. Další možností je jako kandidátní geny využít takové, které se podílí na patofyziologii zkoumaného onemocnění, přičemž je možné, že tak budou odhaleny podtypy onemocnění, které na léčbu reagují lépe nebo hůře.

20 úvod 1.3.4 Potenciální využití Jak již bylo zmíněno - cílem farmakogenetiky je nalézt takové genetické markery, které by umožňovaly zjistit, který lék bude u daného pacienta účinný, dobře snášený a následně dle toho nasadit adekvátní terapii. Uvažujeme-li o ú- činnosti farmakoterapie, pak je nutno zmínit problém farmakorezistence. Farmakorezistence je pojem definovaný často různými autory různě. Dle nejčastěji užívané definice se u schizofrenie farmakorezistence konstatuje, když má pacient navzdory dvěma pokusům o farmakologickou terapii antipsychotiky výraznou perzistující pozitivní nebo negativní symptomatologii společně s narušeným sociálním a pracovním fungováním [106]. Podobná je i definice farmakorezistence u periodické depresivní poruchy, kde se za farmakorezistentního pacienta považuje takový, který má perzistující symptomatologii i přes 2 adekvátní terapeutické postupy - antidepresivní kůry [161]. U bipolární afektivní poruchy je farmakorezistence obtížněji definovatelná, at už kvůli samotné povaze této poruchy, kdy se střídají depresivní a manické fáze, nebo z důvodu obtížné definice adekvátního terapeutického farmakologického postupu za situace, kdy ne všechna užívaná léčiva mají prokázanou efektivitu u všech možných podob této poruchy [44]. Většina definic farmakorezistence u bipolární afektivní poruchy, včetně definice Mezinárodní společnosti pro bipolární poruchy (International Society for Bipolar Disorders, ISBD), tak definují farmakorezistenci zvlášt pro akutní manickou či depresivní epizodu a také farmakorezistenci při udržovací terapii [44]. Ve všech případech figuruje v definicích farmakorezistence pojem adekvátní terapie, kterou se myslí terapie lékem s prokázanou účinností na danou poruchu a to při dostatečném dávkování a po dostatečně dlouhou dobu [106, 44, 161]. Podle různých autorů se procenta farmakorezistentních pacientů se schizofrenií pohybují kolem 12-48 % [24, 102, 40] a u periodické depresivní poruchy 20 % [26], u bipolární afektivní poruchy z příčin výše uvedených je přesné procento farmakorezistentních pacientů obtížně určitelné. Je pochopitelně vyvíjena značná snaha redukovat počet pacientů nereagujících adekvátně na léčbu. Otázka je,

1.3 farmakogenetika 21 zda může být farmakogenetický výzkum využit k redukci počtu farmakorezistentních pacientů. Úspěšné využití potenciálních výstupů farmakogenetického výzkumu je možné pouze v případě, když tyto výsledky mohou vést ke změně terapie. pseudofarmakorezistence jako zjevná neúčinnost léků Výše uvedené definice neříkají nic o možných příčinách farmakorezistence. Někteří autoři rozlišují v tomto ohledu pseudofarmakorezistenci a skutečnou farmakorezistenci [106, 161]. Analýzou příčin pseudofarmakorezistence uvedených v literatuře [106, 161] lze odvodit, že pseudofarmakorezistence je taková rezistence, u níž lze nalézt jiné faktory než je prostá odolnost poruchy na léčbu. Pomineme-li faktory, které přímo odporují definici farmakorezistence (nízké dávky léčiva, krátká doba léčebného pokusu), pak mezi příčiny pseudofarmakorezistence patří chybná diagnóza, přítomnost komorbidit, non-adherence pacienta a pak všechny faktory, které vedou k nedostatečnému množství léčiva v místě jeho působení [106]. U psychofarmak jsou v podstatě dvě možnosti, jak by posledně jmenovaný typ pseudofarmakorezistence mohl vznikat: Extenzivní metabolismus vede k nedostatečně nízkým hladinám léčiva v krvi nebo extenzivní působení transportérů v HEB vede k nedostatečným koncentracím léku v místě akce. V tomto případě by farmakogenetické testování mohlo odhalit příčinu a terapie by mohla být adekvátním způsobem upravena - v případě extenzivního metabolismu zvýšením dávky, v případě zvýšené aktivity efluxních pump v HEB hypoteticky využitím inhibitorů těchto pump. pravá farmakorezistence jako skutečná neúčinnost léků Odsuneme-li stranou pseudofarmakorezistenci, je možné, že farmakogenetika může mít svůj význam i při skutečné farmakorezistenci. Je možné, že ač je u některých pacientů farmakorezistence přítomná již od počátku, tak u jiných se rozvíjí postupně. Tomu napovídá jednak snížení responze k léčivu po jeho předchozí dlouhotrvající expozici - tachyfylaxe [160] a jednak také nálezy, že důležitým prognostickým faktorem responze na antipsychotika u schizofrenie je délka neléčené psychózy [126]. Farmakorezistence by pak v tomto případě představovala progresi choroby, poškození v důsledku psychotické epizody. Hypo-

22 úvod teticky by pak rychlá a účinná léčba mohla rozvoji farmakorezistence zabránit. Zvolit správný účinný lék je jedním z cílů právě farmakogenetického testování. 1.3.5 Aspekty zavádění farmakogenetického testování do praxe Dle Fleemana a kol. [42] musí každý farmakogenetický test, u něhož se uvažuje, že by mohl být zaveden do rutinní praxe, prokázat, že u něj byly provedeny studie s dostatečnou: Analytickou validitou Klinickou validitou Klinickou utilitou Dále by takové studie měly prokázat Ekonomickou výhodnost testu K tomuto výčtu je možno přidat také Praktickou proveditelnost a využitelnost testu analytická validita znamená, že studie byly provedeny za užití metod stanovení genotypu nebo fenotypu s dostatečnou specifitou. klinická validita je prokázána, když je v dostatečné míře demonstrován vztah mezi genotypem a fenotypem. Studie tento vztah prokazující by měly brát v úvahu také vlivy prostředí jako je konkomitantní medikace. klinická utilita znamená, že testem zjištěné údaje o genotypu nebo fenotypu mohou vést ke změně teraputického plánu. Jinými slovy - studie musí prokázat vliv genetických či fenotypických variant na účinnost popřípadě snášenlivost léčiva. ekonomická výhodnost Farmakogenetický test by měl být finančně dostupný. Optimálně by testování vedlo k celkovému snížení nákladů. Pokud je toto bráno v úvahu, pak lze říci, že náklady na test by po odečtení ušetřených nákladů na léčbu neměly překračovat jistou únosnou mez.

1.3 farmakogenetika 23 Většina dosavadních studií se soustředila především a klinickou validitu a utilitu. Zatím je pouze málo ekonomických studií, které by se týkaly farmakogenetického testování. [42] praktická proveditelnost a využitelnost znamená, že test je v běžných podmínkách proveditelný, například nevyžaduje speciální materiální a technické zázemí, a že jeho zejména časová náročnost umožňuje úpravu terapeutického postupu. Příklad: Při terapii lékem A je nutno 2 týdny čekat než je možno klinicky určit, zda je lék účinný, když účinný není, terapeutická vodítka doporučují lék zaměnit. Pokud by provedení farmakogenetického testu a doručení výsledků lékaři trvalo déle než 2 týdny, pak takový test není prakticky využitelný, nebot po 2 týdnech již bude lék dle vodítek považován za účinný nebo neúčinný a bude zaměněn. Informace získané farmakogenetickým testem by pak nepřinášely žádnou přidanou hodnotu. Z výše uvedeného plyne, že k zavedení zvoleného farmakogenetického testu do praxe je nutno provést zejména prospektivní studie. GWAS studie nesplňují výše zmíněná kritéria a jak již bylo zmíněno mohou sloužit toliko k vytipování genů pro další studie. 1.3.6 Současný stav Vize personalizované medicíny společně s rozvojem genetiky vedl v posledních desetiletích k velkému optimismu ohledně potenciálního zavádění farmakogenetických testů do praxe. Postupem času se ale objevila řada překážek - inkonzistence výsledků týkající se i nadějných genů, metodologické problémy obecně spojované s genetickým výzkumem a u polygenní dědičnosti zvláště, nedostatek prospektivních a ekonomických studií, které by ospravedlňovaly zavedení testů do praxe. Tyto překážky vedly k jistému útlumu optimismu dokonce i u autorů, kteří ještě nedávno farmakogenetiku propagovali [78]. Přesto se zdá, že farmakogenetika v psychiatrii postupuje rychleji než v jiných oborech medicíny, možná s výjimkou onkologie, kde je rychlost vývoje uspíšena snadnou dostupností tkání, le-

24 úvod talitou onkologických onemocnění, toxicitou a vysokou cenou onkologických léků [79]. 1.3.6.1 Metabolismus a cílové struktury Jak již bylo zmíněno farmakogenetický výzkum se dlouho zabýval dědičností terapeutické odpovědi na základě metabolismu léčiv, tedy na farmakokinetické faktory. Výsledkem tohoto výzkumu bylo zavedení prvních finančně dostupných, komerčně dodávaných testů ke stanovení variant genů pro některé enzymy metabolizující psychofarmaka kupř. AmpliChip CYP 450 od firmy Roche, který byl první farmakogenetický test schválený FDA pro praktické využití. I přes relativně malý počet potenciálních enzymů významných v metabolismu psychofarmak, dlouhá léta výzkumu a rozvoj výše zmíněných komerčních testů, nejsou výsledky jednoznačné, neexistuje dostatek prospektivních studií a testování na enzymy metabolizující psychofarmaka zatím nebylo zavedeno do širší praxe [78]. Se snižováním finanční náročnosti se však snižují nároky na výhodnost farmakogenetického testování a tak otázka budoucího využití stanovování aktivity enzymů metabolizujících psychofarmaka zatím zůstává otevřená. Paralelně se rozvíjí i výzkum vlivu variability na úrovni genů pro jiné farmakokinetické faktory (zejména transportní proteiny) a geny pro terapeutické cílové struktury a struktury odpovídající za rozvoj nežádoucích účinků. Do toho procesu zasahuje také rozvoj metodiky genetického testování, zejména GWAS studie. Většina moderních psychofarmak vykazuje afinitu k široké paletě receptorů různých neurotransmiterů včetně dopaminu, serotoninu, histaminu, acetylcholinu, glutamátu, noradrenalinu. Pokud zvážíme rozsah genetické variability v kombinaci s velkým množstvím vzájemně se ovlivňujících potenciálních cílů léčiva, rozsah variability na farmakodynamické úrovni pravděpodobně značně převyšuje variabilitu na úrovni farmakokinetické. Výzkum v této oblasti již vedl k pozitivním výsledkům a motivoval vznik dalších komerčně dodávaných testů, které jsou již dostupné, nebo budou dostupné v nejbližší době. Z výše uvedeného je patrné, že AmpliChip CYP 450 stál v úvodu vlny první generace farmakogenetických testů.

1.3 farmakogenetika 25 Kromě toho se již objevil první případ, kdy farmaceutická firma využila farmakogenetiky k průkazu účinnosti vlastního léčiva (Vanda Pharmaceuticals u antipsychotika iloperidon). 1.3.6.2 První generace farmakogenetických testů amplichip cyp 450 od firmy Roche Molecular Systems Inc. je první farmakogenetický test schválený FDA ke klinickému využití. Schvalovací proces byl úspěšně ukončen v lednu 2005 [84]. Tento test je postavený na technologii genetických mikročipů (pojem nepřesně přeložený z anglického microarrays ). Principem je hybridizace na skleněném mikročipu s fluorescenčním značením. Tato technologie umožňuje testování tisíců vzorků současně a její hlavní výhodou je rychlost a spolehlivost [84]. Hlavní nevýhodou zůstává cena - jedno vyšetření v ČR stojí asi 15 000 Kč [91]. Druhou nevýhodou je skutečnost, že testován je pouze omezený počet alel. Mikročip v komerčně dodávaném setu obsahuje 15 000 oligonukleotidových sond, což umožňuje testovat 20 alel genu CYP2D6, 7 duplikací genu CYP2D6 a 3 alely pro CYP2C19, přičemž zabudovaný software obsahuje algoritmy, které z určených alel odvodí fenotyp [79, 137]. AmpliChip zatím nenalezl v psychiatrii širší využití i přesto, že někteří autoři již navrhli schémata úpravy dávkování některých léčiv, kupříkladu risperidonu [81]. Systém je více využíván v onkologii k úpravě dávkování CYP2D6- dependentního léčiva tamoxifenu [79]. luminex tag-it mutation detection kit od firmy Luminex využívá technologii genetických mikročipů na bázi mikrosfér [148] Byl vyvinut v roce 2007. Systém je schopen detekovat 7 nulových alel genu pro CYP2C19, 12 alel genu pro CYP2D6 stejně jako nejčastější delece a duplikace; je to tedy vhodný systém pro detekci pacientů s nulovými alelami a tedy nulovou funkcí enzymu. O potenciálním využití tohoto systému v budoucnosti platí to, co bylo napsáno o systému AmpliChip. pgxpredict : clozapine je systém vyvinutý firmou Genaissance Pharmaceuticals Inc., v roce 2005 koupený firmou Clinical Data. Systém byl komerčně dostupný mezi

26 úvod lety 2007 a 2008. Jak je z názvu patrné, tento test měl být využíván při léčbě klozapinem - antipsychotikem vyhrazeným pro pacienty s rezistentní psychózou. Řídce se vyskytujícím, ale o to závažnějším nežádoucím účinkem klozapinu je agranulocytóza, který se vyskytuje dle některých zdrojů u 0,4 % pacientů [51]. U léčby klozapinem je proto nutné pravidelně monitorovat krevní obraz. Riziko vzniku agranulocytózy bylo dle některých studií vázáno na 5 genů, 2 z nich jsou geny pro histokompatibilní komplex (HLA) [90, 97] Pgxpredict : CLOZAPINE byl na základě analýzy varianty pro gen HLA-DQB1 schopen rozeznat pacienty s nízkým a zvýšeným rizikem rozvoje agranulocytózy. U pacientů v první skupině bylo riziko poloviční a u druhé skupiny 2,5-násobné oproti běžné populaci. Z toho plyne, že provedení testu Pgxpredict : CLOZAPINE neanulovalo nutnost monitorace krevního obrazu. Navíc klozapin je podáván u rezistentních pacientů, u nichž jsou další možnosti terapie přinejlepším omezené. Ani umístění pacienta do rizikové skupiny by tak pravděpodobně nevedlo k rozhodnutí klozapin nepodávat. Je pravděpodobné, že toto byl důvod, proč firma Clinical Data nakonec produkt Pgxpredict : CLOZAPINE přestala nabízet. V současné době údajně firma pracuje na druhé generaci testu [79]. phyziotype system je řada testů od firmy Genomas, které kombinují analýzu několika genetických markerů s biostatistickým algoritmem, pomocí kterého jsou výsledky genetické analýzy zpracovány. V současnosti jsou dostupné 4 testy, 2 z nich jsou zajímavé pro psychiatrii. První z nich je HILOmet PhyzioType, který analyzuje geny pro CYP2D6, 2C9 a 2C19 (20, 6 respektive 8 alel). Tento test tak představuje konkurenci pro AmpliChip a Luminex Tag-It Mutation Detection Kit. Druhý test je PIMS PhyzioType, který je údajně schopen určit riziko rozvoje metabolických nežádoucích účinků atypických antipsychotik. V době psaní této práce firma aktuálně čekala na výsledky patentového řízení a tak byly informace o tomto systému na oficiálních internetových stránkách omezené [47]. Dle údajů dostupných v literatuře tento systém sleduje přítomnost 384 SNP v 222 genech, mimo jiné geny pro apolipoproteiny a jejich receptory, lipázy, růstové faktory, xenobiotika metabolizující en-

1.3 farmakogenetika 27 zymy, cytokiny, receptory neurotransmiterů (serotonin, dopamin, acetylcholin, histamin, glutamát), proteiny nitrobuněčné signalizace, koagulační faktory a fibrinolýzy a další geny, u kterých byla prokázána vazba k metabolismu glukózy, cholesterolu, mastných kyselin, lipidů, tlaku krve [79]. Na základě nespecifikovaného algoritmu pak tento systém určí, které antipsychotikum bude mít u pacienta nejmenší riziko metabolických nežádoucích účinků. Právě uzavřenost algoritmu a nejasnosti na základě jakých informací byly zvoleny účinky jednotlivých genů, jsou největšími problémy tohoto produktu. 1.3.6.3 Užití farmakogenetických testů farmaceutickými společnostmi ve schvalovacím řízení léků - Iloperidon Iloperidon je antipsychotikum s dlouhou anamnézou neúspěchu u regulačních organizací. Jeho výzkum započala firma Hoechst již v 90. letech minulého století, přes další dvě farmaceutické společnosti (Titan Pharmaceuticals a Novartis) se v roce 2004 dostal do portfolia firmy Vanda Pharmaceuticals a teprve v roce 2009 byl schválen FDA ke klinickému užití [79]. Vanda pharmaceuticals je firma s úzkou vazbou k farmakogenetickému výzkumu a dle některých autorů to byly právě farmakogenetické výsledky, které nakonec napomohly úspěšné registraci tohoto léku [79]. V posledních letech proběhlo několik farmakogenetických studií se zaměřením na iloperidon. Tři z nich využívaly přístup kandidátních genů - jedna nalezla výraznější prodloužení QT intervalu u pacientů s defektním metabolismem CYP2D6 [115], další prokázala, že signifikantní zlepšení symptomů schizofrenie při léčbě iloperidonem bylo pouze u pacientů homozygotních pro polymorfismus rs1800169 v genu pro ciliární neurotrofický růstový faktor [76], studie z roku 2010, která nenalezla vztah polymorfismu genu pro serotoninový receptor 2C a přibíráním na váze při léčbě iloperidonem [171]. GWAS studie u léčby iloperidonem byly provedeny dvě - jedna z nich nalezla vztah mezi reaktivitou na iloperidon a 6 geny 3 [75] a druhá nalezla vztah mezi QT pro- 3 Nalezené geny jsou NPAS3, XKR4, TNR, GRIA4, GFRA2, NUDT9P1/HTR7.

28 úvod longací a jinými 6 geny 4 [179]. Zajímavé je, že ani jedna GWAS studie mezi signifikantně asociovanými geny nenalezla geny zjištěné při prvních studiích s kandidátními geny. Dalším problémem je, že GWAS studie - jak již bylo zmíněno - nesplňují dle některých autorů požadavky pro to, aby poskytovaly průkaz jednoznačného vztahu mezi genem a sledovaným účinkem [42, 79]. Po GWAS studii by měly následovat prospektivní studie s vytipovanými geny. I tak iloperidon poskytuje zajímavý příklad využití farmakogenetiky přímo farmaceutickou firmou. Je však pravděpodobné, že dlouho zůstane osamocen. Farmakogenetické testování a individualizovaná terapie jako taková totiž ve svém důsledku vede k zúžení možné cílové populace pro daný lék, a tudíž i potenciální snížení zisku farmaceutické firmy. 1.4 risperidon a 9-oh-risperidon 1.4.1 Obecně o risperidonu Risperidon je dle současných vodítek lékem první volby u schizofrenie. Jedná se o antipsychotikum patřící mezi deriváty benzisoxazolu. Risperidon je selektivní monoaminergní antagonista s vysokou afinitou k 5HT2, D2, α1, α2 adrenergním a H1 histaminergním receptorům. Risperidon je rovněž antagonistou jiných receptorů, na které se však váže s nižší afinitou; má nízkou až střední afinitu k 5HT1C a 5HT1D a 5HT1A receptorům a nízkou afinitu k D1 dopaminergním receptorům. Risperidon vykazuje nulovou afinitu k muskarinovým a β1 a β2 adrenergním receptorů. [57] Risperidon je rovněž substrátem pro P-glykoprotein [81], což je membránový transportní protein ovlivňující prostup xenobiotik skrz hematoencefalickou bariéru (viz sekce 1.6). 1.4.2 Metabolismus risperidonu Hlavní cestou metabolizace risperidonu je 9-hydroxylace odehrávající se především v játrech. Minoritní cestou je N- 4 Nalezené geny jsou CERKL, SLCO3A1, BRUOL4, NRG3 (Neuregulin 3), PALLD (palladin), NUBPL

1.4 risperidon a 9-oh-risperidon 29 dealkylace [57]. 9-hydroxylaci risperidonu katalyzuje predominantně CYP2D6, přičemž vznikají 2 enantiomery (+)- 9-OH-risperidon a (-)-9-OH-risperidon [81]. Existují údaje napovídající, že na tvorbě 9-OH-risperidonu se podílí rovněž CYP3A4; usuzuje se tak pro změny v koncentraci risperidonu a 9-OH-risperidonu po podání inhibitorů a induktorů CYP3A4 [81]. Risperidon neinhibuje CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19 ani CYP3A4, jeho mírná inhibice CYP2D6 je při terapeutických dávkách risperidonu pravděpodobně klinicky nevýznamná [57]. Risperidon a jeho metabolity jsou eliminovány močí a v malé míře faeces [57]. 1.4.3 Rozdíly mezi risperidonem a jeho metabolitem Hlavní metabolit risperidonu 9-OH-risperidon dal vznik samostatně užívanému antipsychotiku (paliperidon). Přípravek Invega obsahuje směs obou enantiomerů, oba enantiomery mají dle dostupných informací shodné vlastnosti a shodnou farmakodynamickou aktivitu [120]. Dle údaje výrobce je paliperidon antagonistou D2 a 5HT2A receptorů, stejně jako antagonista alfa1 a alfa2 adrenergních receptorů a H1 receptorů, přičemž nemá afinitu k cholinergním ani beta adrenergním receptorům [120], takto popsaný farmakodynamický profil se výrazně neliší od farmakodynamického profilu risperidonu. Existují však údaje o tom, že se tyto 2 látky ve svém účinku přeci jen vykazují výraznější rozdíly. Údaje v databázi Programu screeningu psychoaktivních léků NIMH napovídají, že risperidon má vyšší afinitu k 5HT2A, alfa1 a alfa2 adrenergním receptorům[112]. V tabulce 1.1 jsou hodnoty K i risperidonu a paliperidonu na některých receptorech. Z dalších zdrojů je pak patrné, že paliperidon má delší biologický poločas a podstupuje pouze omezenou jaterní metabolizaci CYP2D6 a 3A4, 59% dávky paliperidonu je vyloučeno v nezměněné formě ledvinami [120]. Jeden z nejdůležitějších rozdílů mezi risperidonem a 9-OH-risperidonem je v jejich prostupnosti skrz hematoencefalickou bariéru. Dle údajů v literatuře prostupuje risperidon skrz HEB snadněji než 9-OH-risperidon [180]. Jak bylo zmíněno výše (viz str. 17), prostupnost látek skrz HEB je ovlivněna řadou transportérů exprimovaných v buňkách bariéry. Jedním z nejvýznamnějších transportérů je P-gly-

30 úvod Receptor Risperidon (K i ) Paliperidon (K i ) D 1 460 41 D 2 4 2,8 D 3 10 6,9 D 4 9 54,3 5HT 1A 210 480 5HT 2A 0,5 1,2 5HT 2C 25 48 α 1 0,7 10,1 H 1 20 3,4 M 1 >10 000 >10 000 MDR1 36,1 177 Tabulka 1.1: Hodnoty K i risperidonu a paliperidonu na vybraných receptorech a k P-glykoproteinu (MDR1) [41, 114]. koprotein, kterému bude v dalším textu věnován samostatný oddíl (viz sekce 1.6). Na tomto místě budiž zmíněno, že P-glykoprotein je ATP-dependentní efluxní pumpa, která se vyvinula v různých tkáních jako mechanismus protekce před xenobiotiky. P-glykoprotein se za fyziologických podmínek nachází v tenkém střevě, ledvinách a rovněž v hematoencefalické bariéře [81]. V hematoencefalické bariéře se tento transportér uplatňuje v regulaci prostupu látek skrz bariéru. Jedním ze způsobů výzkumu transportu látek pomocí transportních proteinů je analýza množství látky ve tkáních chráněných biologickou bariérou u modelových organismů s plně aktivním transportérem oproti organismům s vyřazeným genem pro daný transportér (knokautované organismy). S využitím této metody bylo zjištěno, že vyřazením genu pro P-gp narůstá v mozku více koncentrace 9-OH-risperidonu než risperidonu [93, 180]. 5 5 Zajímavé je, že toto se děje, i když má risperidon dle měření vyšší afinitu k P-gp než 9-OH-risperidon (K i risperidonu = 36,1, K i 9-OHrisperidonu = 177) [41].

1.5 cyp2d6 31 Zmíněné rozdíly mají dle některých autorů za následek, že se orálně podávaný risperidon jeví být dvojnásobně potentnější oproti paliperidonu [88]. 1.5 cyp2d6 1.5.1 CYP jako I. fáze metabolismu xenobiotik Cytochrom P450 (CYP) představuje hlavní metabolickou cestu mnoha léčiv a významný zdroj interindividuální variability odpovědi pacientů na léčbu. Systém CYP obsahuje nejvýznamnější enzymy I. fáze metabolismu xenobiotik. Ve vysokém množství jsou obsaženy mimo jiné v membránách endoplasmatického retikula jater, ale také buňkách střevní stěny, v menší míře pak v buňkách ledvin, plic a mozku. V lidském genomu je 57 genů pro různé CYPy. Každý gen je pojmenován zkratkou CYP (což znamená, že patří do systému CYP), číslem, které udává rodinu, do níž patří, písmenem, které určuje podrodinu a konečně číslem, které určuje konkrétní enzym. V posledních letech byla identifikována celá řada konkrétních CYPů, z nichž každý vykazuje specifitu pro určité substráty. Z těchto enzymů jsou nejdůležitější CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 a CYP3A4, které metabolizují 90% všech léčiv metabolizovaných systémem CYP. Mnoho z léků metabolizovaných CYP patří mezi antidepresiva a antipsychotika. [42] Co se týče antipsychotik, tak mezi nejdůležitější CYP patří CYP2D6 (metabolizuje risperidon, chlorpromazin, haloperidol, aripiprazol), CYP3A4 (metabolizuje quetiapin, v malé míře také klozapin, risperidon, ziprasidon), CYP1A2 (metabolizuje chlorpromazin, klozapin a olanzapin), CYP2C19 (metabolizuje v malé míře klozapin) [7]. 1.5.2 CYP2D6 a jeho variabilita - fenotypická, genotypická, jejich vzájemný vztah. CYP2D6 je izoenzym, jež katalyzuje biotransformaci až 30 % léčiv katalyzovaných CYPy. CYP2D6 vykazuje největší interindividuální variabilitu ze všech cytochromů. Za to mohou jednak faktory genetické, k široké variabilitě však přispívá možnost ovlivnění aktivity CYP2D6 jinými látkami - inhibitory jeho aktivity [103].

32 úvod Gen pro CYP2D6 se nachází na dlouhém raménku 22. chromozomu [80]. Jednotlivé alely tohoto genu mohou podmiňovat expresi plně funkčního enzymu, částečně funkčního enzymu, nebo zcela nefunkčního enzymu. Nejčastější alelou v naší populaci je CYP2D6*1 - podmiňuje expresi plně funkční alely, nejčastější dysfunkční alelou je CYP2D6*3, *4 a *5 [42]. Čtyři hlavní fenotypické varianty jsou: ultra-rychlý metabolizátor (ultra-rapid metaboliser, UM), jež vykazuje vyšší než trojnásobnou aktivitu oproti nejčastější variantě, kterým je rychlý metabolizátor (extensive metaboliser, EM). Pomalý metabolizátor (poor metaboliser, PM) vykazuje nulovou aktivitu CYP2D6. Aktivita intermediárního metabolizátora (intermediate metaboliser, IM) je v oblasti mezi EM a PM. [81] Existuje několik schémat odvození fenotypu ze známého genotypu, podle nejčastěji užívaného schématu má EM 2 plně funkční alely genu pro CYP2D6, IM má jednu alelu podmiňující enzym s nulovou aktivitou a jednu alelu s částečnou aktivitou. PM má obě alely podmiňující zcela nefunkční enzymy; výše zmiňované alely CYP2D6*3, *4 a *5 odpovídají za 98% všech PM v populaci [42]. UM pak má více kopií plně funkční alely, se zvýšenou aktivitou se ale pojí pouze přítomnost multiplikací alel podmiňující expresi aktivního enzymu - 2D6*1XN, *2XN a *35XN [80]. Existují však i jedinci, kteří jsou fenotypicky UM bez duplikace nebo multiplikace plně funkční alely. Přesný mechanismus zvýšení aktivity CYP2D6 u těchto jedinců není znám [80]. 1.5.3 Různý výskyt v populaci. Zastoupení jednotlivých fenotypů se v různých populacích liší. Dle de Leona je v americké populaci UM fenotyp zastoupen v 1,5%, přičemž v populaci bílých Američanů je to 1,4% a v populaci Afroameričanů 2,7%; IM jsou mnohem častější ve východoasijské populaci než v evropské populaci [81]. Co se týče zastoupení PM v různých populacích: 7% Evropanů, asi 1-3% Asiatů a Afričanů je PM [81]. Udávaná procenta se však dle různých zdrojů mohou lišit. Pro srovnání - zastoupení některých alel pro gen CYP2D6 v různých populacích v tabulce 1.2.

1.5 cyp2d6 33 Alela Funkce Evropa Švédsko USA (Kavkazská pop.) USA (Afroameričané) *1 normální 33-36 % 46,7 % 27-40 % 29-35 % *2 normální 22-33 % 32,4 % 26-34 % 18-27 % *3 ztráta 1-4 % 1,4 % 1-1,4 % < 1 % *4 ztráta 12-23 % 24,4 % 18-23 % 6-9 % *5 ztráta 2-7 % 4,3 % 2-4 % 6-7 % *6 ztráta 1-1,4 % 0,9 % 1 % < 1 % *9 snížená 0-2,6 % - 2-3 % < 1 % *10 snížená 1,4-2 % - 2-8 % 3-8 % *17 snížená < 1 % - < 1 % 15-26 % *41 snížená 30-40 % - - - *1XN zvýšená < 1 % - < 1 % 1,3 % *2XN zvýšená 1,5 % - < 1 % 1,3 % *4XN ztráta < 1 % - < 1 % 2,3 % Tabulka 1.2: Aktivita enzymu CYP2D6 a frekvence u vybraných alel a populací [42, 73]. 1.5.4 Induktory a inhibitory. CYP2D6 metabolizuje velké množství substrátů a tak je zde velký potenciál pro nejrůznější lékové interakce. Pacienti se schizofrenií mohou užívat léky v nejrůznějších kombinacích. U těchto jedinců je vyšší riziko nežádoucích účinků polypragmazie. CYP2D6 může být inhibován (jeho aktivita může být snížena). Inhibice CYPů může být reversibilní nebo ireversibilní. V případě reversibilní inhibice, je funkce daného CYP okamžitě po vyloučení inhibitoru obnovena, ale v případě ireversibilní inhibice musí být syntetizován nový enzym, aby se obnovila aktivita CYP. Reverzibilní inhibice je závislá na dávce, vlastnostech molekuly a vylučovacím poločase daného inhibitoru, přičemž při metabolizaci inhibitoru mohou vzniknout látky s odlišným typem inhibice i poločasem vylučování. Ireverzibilní inhibice je navíc závislá na čase nutném k syntetizaci nového enzymu [103]. Mezi inhibitory CYP2D6 patří látky, které se při léčbě s risperidonem občas kombinují, některá antipsychotika (kupř. chlorpromazin, haloperidol), antidepresiva (fluoxetin, bupropion, clomipramin, imipramin, citalopram a fluvoxamin - poslední 2 jmenované jako slabé inhibitory), ale i

34 úvod jiné látky. Podrobnější seznam inhibitorů CYP2D6, i s údajem, jak silně enzym inhibují, je v tabulce 1.3. Na rozdíl od některých jiných izoenzymů CYP není možno, dle většiny zdrojů, aktivitu CYP2D6 zvýšit induktory [81], výjimečně se uvádí možná indukce rifampinem a dextromethorfanem [31]. 1.5.5 Možnosti vyšetřování genotypu Díky znalostem o vztahu genotypu a fenotypu CYP2D6 lze funkci enzymu odhadnout genotypizací. První metodou využívanou na genotypizaci CYP2D6 byla analýza restrikčních fragmentů (RFLP) s následným Southernovým přenosem [158]. Další vyhledávací metodou byla metoda jednovláknového konformačního polymorfismu (SSCP), která pomohla odhalit další nové polymorfismy [17]. V současné době jsou však tyto metody nedostatečně specifické. Pro rychlou identifikaci lze použít alelově specifickou polymerázovou reakci (AS-PCR), jejíž výhodou je minimální riziko kontaminace a vyloučení falešně negativních výsledků [50]. Pro detekci velkých genových delecí a duplikací a pro detekci hybridních genů a strukturních přestaveb slouží long range PCR [141]. Mezi moderní metody DNA diagnostiky patří PCR v reálném čase, při níž jsou detekovány významné polymorfismy nulových alel *3, *4, *6, *7 a *8 pomocí fluorescenčně značených sond [164]. Nejvýznamnější detekční metodou je sekvenování, které zachytí všechny sekvenční změny ve sledovaných úsecích díky jeho vysoké spolehlivosti a citlivosti. Sekvenování je považováno za referenční metodu, která již nevyžaduje kontrolní materiál. Jinou obdobou sekvenování je pyrosekvenování založené na detekci uvolňovaného pyrofosfátu [189]. Jak již bylo uvedeno (viz sekce 1.3.6.2), v posledních letech se stává genetické testování dostupnější díky novým technologiím jako jsou například DNA mikročipy a DNA čipy na bázi mikrosfér [79]. Příkladem může být například AmpliChip CYP 450, Luminex Tag-It Mutation Detection Kit nebo HILOmet Phyzio System [79]. Zopakujme, že výhodnou těchto metod je rychlost a spolehlivost. Nevýhodou pak stále zůstává cena a skutečnost, že jsou schopny zachytit pouze několik definovaných polymorfismů.

1.5 cyp2d6 35 Látka Skupina Inhibitor amiodaron antiarytmikum střední amitriptilin antidepresivum slabý bupropion antidepresivum střední celecoxib NSAID střední chlorfeniramin antihistaminikum střední chlorpromazin antipsychotikum střední cimetidin H2-antihistaminikum střední cinacalcet kalcimimetikum silný citalopram antidepresivum slabý clomipramin antidepresivum střední desipramin antidepresivum slabý diphenhydramin antihistaminikum střední doxepin antidepresivum střední duloxetin antidepresivum střední fluvoxamin antidepresivum slabý fluoxetin antidepresivum silný halofantrin antimalarikum střední haloperidol antipsychotikum střední hydroxyzin antihistaminikum slabý imipramin antidepresivum střední methadon opioid střední methotrimeprazin antipsychotikum střední / silný metoclopramid prokinetikum střední moclobemid antidepresivum střední paroxetin antidepresivum silný propafenon antiarytmikum střední ritonavir virostatikum střední sertralin antidepresivum slabý terbinafin antimykotikum střední thioridazin antipsychotikum střední ticlopidin antitrombotikum střední Tabulka 1.3: Inhibitory CYP2D6 a jejich účinek na enzym Sestaveno dle Drug interaction table na stránkách Oddělení klinické farmakologie, Indiana University [31], údaje o metotrimeprazinu získány ze strany DrugBank.ca [34].

36 úvod 1.5.6 Možnosti vyšetřování fenotypu. Vzhledem k výše uvedenému - tedy možnosti ovlivnit funkci CYP2D6 jinými látkami - existuje možnost, že fenotyp odhadnutý pomocí genotypizace a skutečná aktivity enzymu se mohou lišit. V těchto situacích se jeví výhodná možnost stanovit fenotyp CYP2D6 přímo fenotypizací. Stanovením fenotypu je možné zjistit aktuální stav biotransformačních procesů - tedy sumu efektů vnitřního i zevního prostředí v konkrétním čase. Nejběžnějším způsobem zjištění metabolické aktivity vybrané isoformy CYP je sledování metabolizmu selektivního markeru, tj. látky, která se v ideálním případě metabolizuje výhradně danou izoformou. Způsob metabolizace léčiva neboli příslušnost k fenotypu je určena stanovením poměru koncentrací mateřského léčiva a jeho metabolitu v krvi nebo moči. Tento parametr se nazývá metabolický poměr ( metabolic ratio ). Ideální marker by měla být látka bezpečná s ohledem na její použití in vivo, měla by také být snadno dostupná a snadno stanovitelná v biologických vzorcích (včetně hlavních metabolitů). Farmakokinetika ideálního markeru je určena především jeho metabolizací (nikoli vylučováním látky v nezměněné podobě) [125]. Sledováním úbytku koncentrace mateřské látky a nárůstu koncentrace metabolitu tak můžeme usoudit na metabolickou aktivitu dané isoformy a případně příslušnosti jedince ke skupině fenotypu. Stejný princip je již také v současnosti využíván při vývoji léčiv, kde se rutinně provádí testování vlivu léčiva na isoformy CYP ještě před uvedením na trh [193]. Pro sledování fenotypu CYP2D6 je používána markerová reakce - O-demethylace dextromethorfanu na dextrorfan (tzv. dextromethorfanový test). Pacientům je podáno perorálně 30 mg dextromethorfanu a v séru pacientů 3 hodiny po podání pak jsou stanoveny koncentrace mateřské látky (dextromethorfanu, DEM) i metabolitu (dextrorfanu, DOR), načež je spočten metabolický poměr [192].

1.5 cyp2d6 37 1.5.7 Důsledky interindividuální variability metabolismu risperidonu 1.5.7.1 Rozdílné hladiny Laboratorně zjistitelným rozdílem mezi jednotlivými typy metabolizátorů jsou rozdílné hladiny risperidonu a 9-OHrisperidonu, resp. rozdílný poměr risperidon / 9-OH-risperidon [53, 87, 13]. Poměr je nejvyšší u PM a nejnižší u UM [87]. To znamená, že u pomalých metabolizátorů byla větší frakce risperidonu než u IM, EM i UM. Aktuální fenotyp predikoval poměr risperidon / 9-OH-risperidon daleko lépe než genotyp [13]. To znamená, že enviromentální faktory, v tomto případě podávání inhibitorů CYP2D6, měly svůj význam. Podání inhibitorů mělo nejmenší dopad u PM, zatímco u ostatních subjektů vzrostl poměr ve prospěch risperidonu výrazně - aktivita CYP2D6 se snížila [87]. Nejasný rovněž zůstává význam rozdílné aktivity CYP2D6 v metabolismu 9-OH-risperidonu. Ve studii na zdravých dobrovolnících bylo při současném užití paliperidonu a paroxetinu (inhibitor CYP2D6) patrno zvýšení koncentrace paliperidonu v průměru o 16 % [120]. 1.5.7.2 Teoretické klinické rozdíly Pokud je u pacientů s různým fenotypem CYP2D6 různý poměr risperidonu k 9-OH-risperidonu, a risperidon a paliperidon mají odlišné vlastnosti, lze předpokládat i rozdílnou účinnost risperidonu u různě rychlých metabolizátorů. U pomalých metabolizátorů lze teoreticky očekávat minimální metabolizaci a tedy i vyšší poměr risperidonu, který proniká hematoencefalickou bariérou snadněji než 9- OH-risperidon. Koncentrace aktivní látky by tak byla v mozku vyšší. Proto lze očekávat vyšší účinnost risperidonu při standardní dávce a vyšší tíži nežádoucích účinků. U PM bude rovněž metabolismus risperidonu pravděpodobně více závislý na alternativních cestách metabolizace, zejména na CYP3A4. To, co platí u PM, platí v menší míře také u IM. Dále je pak u intermediárních metabolizátorů nutno obezřetnosti při užívání potenciálních inhibitorů CYP2D6, které mohou IM změnit fenotypicky na PM se všemi důsledky z toho vyplývajícími.

38 úvod U ultra-rychlých metabolizátorů pak můžeme očekávat nižší poměr risperidon / 9-OH-risperidon. Velká část risperidonu bude tedy metabolizována na 9-OH-risperidon, který hůře prochází skrz hematoencefalickou bariéru. U UM lze tedy očekávat nižší účinnost risperidonu na příznaky schizofrenie. 1.5.7.3 Studie CYP2D6 při léčbě risperidonem V průběhu uplynulých let se mnoho autorů pokoušelo zjistit vztah mezi aktivitou CYP2D6 a terapeutickou odpovědí pacientů na léčbu risperidonem. Údaje z literatury jsou rozporné. Studie výrobce risperidonu předpokládaly, že risperidon a 9-OH-risperidon mají shodné farmakodynamické a farmakokinetické vlastnosti [101]. Toto tvrzení bylo postaveno na studii na zdravých dobrovolnících, kdy byl měřen nárůst hladin prolaktinu po jedné dávce risperidonu, v této studii bylo pouze 11 PM [53]. Účinnost risperidonu by dle tohoto předpokladu závisela na aktivní frakci, tedy součtu koncentrací risperidonu a 9-OH-risperidonu. Variabilita CYP2D6 by při léčbě risperidonem potom ztrácela na významu. Užití jedné dávky u zdravých dobrovolníků lze však jen obtížně srovnávat s běžnou klinickou praxí. V pilotní studii metabolismu risperidonu mělo všech 5 identifikovaných PM nežádoucí účinky risperidonu, zatímco poměr pacientů s NÚ byl u EM nižší [15]. V následujících letech bylo provedeno několik dalších studií, které nenalezly souvislost mezi aktivitou CYP2D6 a účinností nebo snášenlivostí risperidonu [118, 130, 147, 139], i když studie měřící hladiny risperidonu a jeho hlavního metabolitu vesměs potvrdily závislost tohoto poměru na aktivitě CYP2D6 [118, 147]. Rovněž japonská studie na 136 pacientech nenalezla vztah mezi alelami CYP2D6*4, CYP2D6*10 a klinickým výsledkem při léčbě risperidonem, u této studie však byl sledován pouze výskyt dvou výše zmíněných alel a nebyl sledován fenotyp [60]. Na druhou stranu mimo již zmiňované pilotní studie metabolismu risperidonu [15], existují i další zprávy, které prokazují význam variability CYP2D6 při léčbě risperidonem. Ve dvou kazuistických sděleních byla konstatována nutnost vyšší dávky pro udržení účinnosti risperidonu u UM [1, 49]. Rovněž existuje kazuistické sdělení, po-

1.5 cyp2d6 39 pisující vznik závažných EPS při léčbě risperidonem u PM [70]. V jedné studii na 35 pacientech bylo sledováno signifikantní prodloužení QTc u pacientů s jednou funkční alelou pro CYP2D6 na rozdíl od pacientů se 2 funkčními alelami [94]. Ve studii na 25 dětech s diagnózou pervazivních vývojových poruch léčených risperidonem byla nalezena pozitivní korelace počtu funkčních alel pro CYP2D6 a hladin prolaktinu [173]. Ve velké de Leonově studii zaměřené na účinnost a snášenlivost risperidonu v závislosti na variabilitě CYP2D6 bylo zařazeno 360 pacientů léčených risperidonem a 252 pacientů, kterým byl risperidon z nejrůznějších důvodů vysazen. PM měli v této studii více než trojnásobné riziko závažných nežádoucích účinků risperidonu (OR = 3,4) a až šestinásobné riziko (OR = 6,0) ukončení léčby risperidonem pro závažné nežádoucí účinky [86]. Dle jiných zdrojů je fenotyp PM příčinou 16% nežádoucích účinků při léčbě risperidonem a 9% všech ukončení léčby risperidonem[84]. Většina studií se zabývala pouze klinickým dopadem extrémních fenotypů (UM resp. PM) a problematika IM byla sledována zejména z farmakokinetického hlediska. Že to nemusí být přístup zcela opodstatněný ukázala studie Laiky z roku 2009 [73]. Do této studie byli zařazeni pacienti léčení pro psychotické i afektivní poruchy a užívající antidepresiva nebo antipsychotika. Výsledky této studie napovídají, že fenotyp IM může být klinicky významný, i když je vhodné podotknout, že jakákoliv generalizace je problematická, nebot se tato práce týkala léčbou jinými látkami než risperidonem. IM měli v této studii nižší pravděpodobnost odpovědi na léčbu substráty CYP2D6 a vyšší pravděpodobnost odpovědi na léčbu léky CYP2D6 nemetabolizovanými. IM léčení vyššími dávkami substrátů CYP2D6 měli signifikantně více NÚ než IM léčení nižšími dávkami, EM léčení substráty CYP2D6 i IM léčení léky nemetabolizovanými CYP2D6. A konečně u IM nižší dávka nesnižovala pravděpodobnost, že pacient bude respondér. Dle Laiky jsou tato zjištění o to závažnější, že v posledních letech se díky objevu alely CYP2D6*41 dle některých zdrojů předpokládá, že v evropské populaci může být IM asi 30-40% [73].

40 úvod 1.5.7.4 Farmakoekonomika a cost-effectiveness Naskýtá se otázka, jestli je testování aktivity CYP2D6 u pacientů se schizofrenií při současné ceně dostupných testů ekonomicky výhodné. V literatuře existuje pouze málo analýz na toto téma. Fleemanova metaanalýza a review [42]: Fleeman a kol. se ve své rozsáhlém přehledu a metaanalýze zabýval mimo jiné také otázkou klinické a ekonomické výhodnosti genotypizace CYP2D6. V literatuře do roku 2008 byla nalezena jen jediná farmakoekonomická studie, která se navíc týkala pouze testování CYP2D6 při užívání antidepresiv. Fleeman svou ekonomickou analýzu uzavírá tvrzením, že nedostatek údajů zatím neumožňuje jednoznačně určit ekonomickou výhodnost testování CYP2D6 u pacientů se schizofrenií, ani vůbec zkonstruovat ekonomický model potenciálního rutinního testování. Při současné ceně testů by však stačilo prokázat zisk 0,01 QUALY (Quality Adjusted Life Years 6 ), aby takové testování dosáhlo současně přijímaného standardu ekonomické výhodnosti. Fleeman proto doporučuje provést další studie, které by měly poskytovat údaje o senzitivitě a specificitě použitých testů a poskytnou úplná data ohledně genotypů pacientů. Zejména je pak nutné získat další důkazy, které by lépe objasnili vztah mezi genotypem a fenotypem CYP, další studie by dále měly vzít v potaz také enviromentální faktory jako je konkomitantní medikace a kouření. Studie Rodriguez-Antony 2009 [138]: Nejnovější studie Institutu Prospektivních Technologických Studií (JRC- IPTS) při Evropské Komisi, jež získala data od pacientů užívajících risperidon v Německu, Španělsku a USA, sice prokázala, že PM mají vyšší riziko výskytu závažných nežádoucích účinků, dále však bylo zjištěno, že k důkladné farmakoekonomické analýze testování CYP2D6 není dostatečné množství klinických a ekonomických dat týkajících se NÚ risperidonu a doporučuje další provádění zejména prospektivních studií. 6 QUALY (Quality Adjusted Life Years, nepřesně přeloženo jako ke kvalitě vztažené roky života ) je měřítko dopadu nemoci, které bere v úvahu jako kvalitu, tak kvantitu (počet let) života. Tato veličina je mezinárodně uznávanou jednotkou užívanou k hodnocení efektivity terapeutických postupů. Podrobnosti o tom, jak se tato jednotka počítá a jak se užívá ve zhodnocení finanční efektivity terapeutických postupů jsou dostupné na internetu na adrese uvedené v citacích [111].

1.6 p-gp 41 Z výše uvedeného vyplývá, že o ekonomické výhodnosti či nevýhodnosti testování CYP2D6 u pacientů se schizofrenií v současnosti není dostatečné množství údajů a bude třeba ještě dalšího výzkumu. 1.5.7.5 Doporučení pro praxi Přestože je na základě výsledků dostupných studií předčasné přisuzovat CYP2D6 jednoznačný vliv při terapii risperidonem, existují již první návrhy k modifikaci terapie na základě testování tohoto enzymu. Zejména na základě dat ze své největší studie [86] a na základě klinické zkušenosti de Leon navrhl doporučení pro praxi týkající se dávkování risperidonu. Obecně u prokázaných PM navrhuje snížit dávkování risperidonu na poloviční dávku - u průměrného dospělého PM by tak úvodní dávka byla 0,5-1 mg risperidonu pro die, průměrná dávka 2 mg a maximální 3 mg pro die. V případě současného podávání inhibitorů CYP2D6 navrhuje vydělit dávku koeficientem 1,3, u průměrného dospělého by pak při současném užívání inhibitorů byla úvodní dávka 0,75-1,5 mg pro die, průměrná dávka 3 mg pro die a maximální dávka 4 mg pro die. V případě současného podávání fluoxetinu pak navrhuje užívat dávkování, jakoby byl pac. PM. [81] Laika pak dle výsledků výše citované studie doporučuje rozdílnou strategii při nonresponzi na substráty CYP2D6 u EM a IM. U EM doporučuje navýšení dávky medikace, zatímco u IM doporučuje raději změnu medikace za lék CYP2D6 nemetabolizovaný. U IM totiž ani nízká dávka substrátu CYP2D6 nesnižovala pravděpodobnost pozitivní léčebné odpovědi. [73] 1.6 p-gp 1.6.1 Prostup látek skrz hemato-encefalickou bariéru (HEB) V biologických bariérách je exprimována řada proteinů, které regulují koncentrace látek na obou stranách takových bariér. Předpokládá se, že tyto proteiny vznikly jako ochrana organismů před působením xenobiotik [99]. Jejich funkce je dána směrem, kterým čerpají látky skrz cytoplasmatickou membránu a lokalizací; často fungují jako efluxní pumpy, které vyčerpávají látky z cytosolu buněk tvořících mem-

42 úvod bránu a pokud jsou exprimovány na luminální straně, pak snižují prostupnost skrz tuto bariéru [93]. Značný význam mají tyto proteiny v nádorových tkáních, kde snižují prostupnost bariéry krev-nádor pro chemoterapeutika, a tak se podílejí na rezistenci onemocnění na léčbu [140]. Tyto proteiny regulující prostup látek skrz bariéry jsou však exprimovány také ve fyziologických tkáňových bariérách - kupříkladu v bariéře krev-testes, v placentární bariéře, v bariéře krev-prsní žláza, v buňkách ledvinných tubulů, v játrech nebo v hemato-encefalické bariéře. Jako takové jsou tyto proteiny možným zdroje variability v odpovědi na léčbu farmaky, přičemž roli může hrát jednak jejich variabilita genetická, ale také je zde možnost ovlivnění jejich funkce jinými látkami. Jsou tudíž také možným zdrojem interakcí. Tak jako u enzymů metabolizujících xenobiotika, také zde se látky zvyšující aktivitu proteinu nazývají induktory a látky aktivitu snižující inhibitory. Jelikož se proteiny ovlivňující přestup látek skrz biologické bariéry nacházejí také v hemato-encefalické bariéře, začaly být zkoumány rovněž možnosti, že ovlivňují reaktivitu pacientů na antiepileptika a psychofarmaka [93]. V hematoencefalické bariéře bylo zatím zjištěno 15 transportních proteinů, které ovlivňují koncentraci xenobiotik v mozku; tyto proteiny jsou řazeny do několika podrodin: multidrug resistence protein (MDR, nazývaný rovněž P- glykoprotein), multidrug-associated protein (MPR), transportér organických aniontů (organic anion transporter OAT), polypeptid transportující organické anionty (organic anion transporting polypeptide OATP), transportér organických kationtů (organic kation transporter OCT), koncentrativní transportér nukleosidů (concentrative nucleosid transporer CNT), ekvilibrující nukleosidový transportér (equilibrative nucleoside transporter - ENT) [11]. Z hlediska psychofarmak nejlépe prozkoumaným proteinem je P-glykoprotein (P-gp). 1.6.2 Popis P-glykoproteinu P-gp je velký transmembránový protein (170 kda) [67], který byl objeven v roce 1976 v buňkách rezistentního ovariálního karcinomu čínského křečka [59]. P-gp má 1280 ami-

1.6 p-gp 43 nokyselin, 12 transmembránových domén a 2 místa pro vazbu ATP [155]. P-gp je pumpa, která vyčerpává látky z cytosolu buněk [93] a energii pro svou funkci získává hydrolýzou ATP. Bereme-li v úvahu biologické bariéry, P- gp vyčerpává látky z cytosolu buněk tvořících bariéru, a tak snižuje propustnost bariéry [93]. Zvýšená funkce P- gp tedy vede ke snížené koncentraci látek za membránou. Mechanismus, jakým P-gp transportuje látky není zcela znám, byly navrženy 2 modely - model hydrofobního vysavače (hydrophobic vacuum cleaner model) a model flippázy (flippase model). [2, 22, 149] První model předpokládá, že P-gp své substráty vysává z lipidové dvouvrstvy biologické membrány a transportuje je ven z buňky centrální dutinou. Druhý model tvrdí, že P-gp nejprve naváže hydrofobní afinní látky na vnitřní list lipidové dvojvrstvy a následně transportuje afinní látky tím, že vyměňuje fosfolipidy z vnitřní strany na vnější. Je vysoce pravděpodobné, že se na transportu podílejí oba tyto mechanismy [2, 36] Jednou z hlavních vlastností P-gp je jeho substrátová promiskuita, P-gp má afinitu k řadě látek s molekulovou hmotností od 250 Da (cimetidin) do 1850 Da (gramicidin D) [146]. Substráty P-gp mohou být tak odlišné, že zatím nebyla nalezena společná vlastnost, která by determinovala, zda bude látka k P-gp afinní nebo ne [117]. Mezi tyto látky patří jak xenobiotika, tak endogenní substance [177]. Zajímavou skutečností je fakt, že afinita látek k P-gp se z velké části kryje s afinitou látek k CYP3A4 [190]. Afinity psychofarmak a antiepileptik byly experimentálně zjišt ovány zejména in vivo a na zvířecích modelech za užití mdr-knokautovaných organismů a při užití inhibitorů P-gp. Výzkum je komplikován řadou inkonzistencích výsledků, přičemž se předpokládá, že afinity látek k P-gp se mohou mezi různými organismy lišit a mohou být ovlivněny mimo jiné i složením cytoplasmatické membrány [93]. Dle in vitro a zvířecích studií jsou jako substráty P-gp uváděny látky užívané v nejrůznějších medicínských oborech: cytostatika (doxorubicin, vinblastin, etoposid, paclitaxel), imunosupresiva (cyklosporin A) [142], srdeční glykosidy (digoxin) [12], antihelmintika (ivermectin) [12], inhibitory HIV proteázy [21] a také psychofarmaka (risperidon, nortriptilin, citalopram) [37, 93, 176, 175]. Jako prototyp

44 úvod Léčivo Skupina Vztah k P-gp amiodaron antiarytmikum inhibitor amitriptilin antidepresivum substrát amprenavir antivirotikum substrát citalopram antidepresivum substrát cimetidin H2-antihistaminikum substrát cetirizin histaminikum substrát cyklosporin imunosupresivum inhibitor desloratadin antihistaminikum substrát doxorubicin cytostatikum substrát digoxin kardiotonikum substrát domperidon prokinetikum substrát fluoxetin antidepresivum substrát fluvoxamin antidepresivum substrát imipramin antidepresivum substrát indinavir antivirotikum substrát ivermectin antihelmintikum substrát metotrrexát cytostatikum substrát nifedipin blokátor kalciových kanálů inhibitor nortriptilin antidepresivum substrát ondansetron antiemetikum substrát paclitaxel cytostatikum substrát paliperidon antipsychotikum slabý inhibitor paroxetin antidepresivum substrát ranitidin H2-antihistaminikum substrát rifampicin antibiotikum induktor risperidon antipsychotikum slabý inhibitor verapamil blokátor kalciových kanálů inhibitor venlafaxin antidepresivum substrát vinblastin cytostatikum substrát Tabulka 1.4: Příklady léčiv interagujících s P-gp s informací o způsobu jejich interakce [117, 65, 191]. látky působící coby inhibitor P-gp se uvádí cyklosporin A a verapamil [142, 43], zatímco rifampin je uváděn jako induktor P-gp [65]. Z uvedených údajů plyne, že tyto inhibitory mohou být využity ke zvýšení účinků substrátů P-gp. Příklady látek afinních k P-gp i s popisem jejich účinku na enzym se nachází v tabulce 1.4. 1.6.3 Lokalizace Jak již byl zmíněno P-gp má velký význam v HEB, kde se podílí na vyčerpávání xenobiotik z buněk bariéry zpět do krevního oběhu. Obdobnou funkci plní i v jiných bariérách, přičemž P-gp facilituje pohyb látek vždy ven z organismu. V hepatobiliárním systému se tedy podílí na ex-

1.6 p-gp 45 kreci látek z krve do žluči, v ledvinných tubulech na exkreci látek z krve do moči, ve střevech do střevního lumen [8, 100, 163] a podobně je tomu například i v placentární bariéře, kde se podílí na ochraně plodu před xenobiotiky [188]. 1.6.4 Gen MDR1 P-gp je produktem genu MDR1 (multiple-drug resistance) označovaného v některých zdrojích také jako ABCB1 (ATP binding cassete B 1) [93]. Gen MDR1 se nachází na 7. chromozomu (přesnější lokalizace je 7q21.1) a sestává z 28 exonů [20]. Tento gen je vysoce polymorfní, je popsáno více než 100 míst, kde se vyskytují polymorfismy [45]. Stejně jako v genu pro CYP2D6, tak i v genu MDR1 se výskyt jednotlivých polymorfismů liší u různých populací [155]. V tabulce 1.5 jsou shrnuty frekvence alel pro nejčastěji zkoumané polymorfismy MDR1 genu u některých populací. Následuje popis nejčastěji zkoumaných polymorfismů MDR1, seřazený dle umístění v genu, společně s jejich četností v české populaci (dle Pechandové a kol., [124]). exon 12 V exonu 12 se nachází polymorfismus C1236T (rs1128503, Gly412Gly), který nevede ke změně v exprimovaných proteinech [151] a jehož přesný význam, pokud je nějaký, zatím není jasný [155]. V české populaci je frekvence alely C1236T 0.447 [124]. exon 21 Jako první byl v genu MDR1 objeven polymorfismus G2677T, později byla ve stejném místě nalezena i jiná substituce (G2677A) [151]. Dohromady se označují jako 2677G>A/T (také G2677A/T, nebo rs2032582) [155]. Tyto polymorfismy vedou ke změně kódovaného proteinu záměnou alaninu za threonin respektive serin na pozici 893 (Ala893Thr/Ser) [151, 155]. Tento polymorfismus podle některých měření vede k největším změnám v aktivitě a afinitě proteinu k substrátům [143]. Podle některých studií vykazují subjekty s alelou 2677A vyšší aktivitu P-gp [186]. Alela 2677A je více exprimovaná v Japonské a Korejské populaci [66]. V české populaci je alela A poměrně vzácná její frekvence je 0.003, alela T je naopak relativně častá s frekvencí 0.458 [124].

46 úvod Polymorfismus C1236T G2677T/A C3435T Zdroj Alela T T A T Populace Česká 0,447 0,458 0,003 0,564 [124] Romská 0,551 0,454 0,020 0,482 [155] Polská 0,427 0,401 nezachycena 0,469 [56] Evropská populace 0,392 0,398 nezachycena 0,543 [108, 109, 107] Indická 0.609 0,540 0,064 0,546 [155] Čínská 0,638 0,364 0,114 0,347 [169] Tabulka 1.5: Četnosti alel u nejčastěji zkoumaných polymorfismů genu MDR1 u vybraných populací Literární zdroje jsou uvedeny v posledním sloupci tabulky. exon 26 Nejčastěji zkoumaným polymorfismem v MDR1 je polymorfismus C3435T (rs1045642, Ile1145Ile) ve 26. exonu [155]. Tento polymorfismus sice nevede ke změně exprimovaných proteinů, vede ale k nižší produkci mrna [151]. Jedinci homozygotní pro tento polymorfismus (TT) tedy vykazují sníženou expresi P-gp [154]. Recentně také bylo zjištěno, že protein vzniklý při polymorfismu C3435T má odlišnou terciární strukturu, což je pravděpodobně způsobeno jiným foldingem proteinu v důsledku užití vzácného kodonu; důsledkem pak může být jiná interakce se substráty a modulátory aktivity [151]. Distribuce tohoto polymorfismu je ovlivněna etnicitou, CC genotyp je nejčastější v africké populaci a nejméně častý v jihovýchodní Asii [4, 66, 144]. V české populaci se alela T vyskytuje s frekvencí 0.564 [124]. jiné polymorfismy Dalšími zkoumanými polymorfismy jsou rs28373093 (5 -flank), rs28656907 (5 -flank), rs2235027 (intron 1), rs13233308 (intron 1), rs2235036 (exon 15), rs2235039 (exon 20) [183]. Tyto polymorfismy byly v posledních letech zkoumány méně často.

1.6 p-gp 47 1.6.5 Studie významu P-gp u léčby risperidonem 1.6.5.1 Studie afinity Ris a 9-OH-Ris k P-gp Jak již bylo zmíněno afinita látek k P-gp je zkoumána několika možnými postupy in vitro, in vivo na organismech s defektní funkcí P-gp (kdy je srovnáván prostup látek skrz bariéry u organismů s plně funkčním P-gp s organismy MDR-knokautovanými) a konečně in vivo při užití inhibitorů P-gp. Pro účinek antipsychotik je nutné, aby tato prostoupila skrz HEB. Vztah P-gp a antipsychotik byl proto opakovaně zkoumán všemi zmíněnými metodami. V in vitro studiích se jako významný substrát P-gp jevil právě risperidon [16, 37], přičemž větší afinitu k P- gp mezi antipsychotiky vykazoval pouze quetiapin [16]. 9-OH-risperidon měl nižší afinitu k P-gp (K i = 177) než risperidon (K i = 36,1) [41]. Skutečnost, že prostupnost risperidonu a 9-OH-risperidonu skrz HEB je významně ovlivněna P-gp bylo prokázáno rovněž studiemi in vivo na zvířecích modelech [180, 33, 37, 68, 174]. Hlavním nálezem bylo, že u MDR-1 knokautovaných organismů dochází k výraznější kumulaci risperidonu než 9-OH-risperidonu ve tkáních chráněných biologickou bariérou [93, 180], což je výsledek kontraintuitivní vzhledem k zjištěné vyšší afinitě risperidonu k P-gp. Dále bylo zjištěno, že snížená funkce P-gp může mít rovněž klinicky významný vliv na účinek risperidonu [68, 122]. Tato skutečnost má důležité implikace také pro farmakogenetický výzkum enzymů metabolizujících risperidon, nebot znamená, že risperidon a 9-OH-risperidon se liší výrazně v rozdílné prostupnosti skrz HEB. 1.6.5.2 Studie na lidech inhibitory a induktory P-gp Z důvodů zmíněných výše zejména kvůli skutečnosti, že zjištěné afinity látek k P-gp se u různých druhů organismů mohou lišit je nutné ověřit afinitu substrátů k P-gp také ve studiích na lidech. Afinita risperidonu k P-gp byla ověřena v několika studiích na zdravých dobrovolnících: Nakagami a kol. potvrdil, že biologická dostupnost risperidonu je ovlivněna podáváním verapamilu inhibitoru P- gp [105]. Kim a kol. učinili podobný závěr u rifampinu induktoru P-gp [65].

48 úvod 1.6.5.3 Studie na lidech - SNP Jak již bylo zmíněno, MDR1 je gen vysoce polymorfní. Polymorfismy tohoto genu, které mění funkce exprimovaného proteinu by tedy mohly mít vliv na prostupnost látek skrz biologické bariéry, a tak i na účinnost a snášenlivost substrátů P-gp. Různé studie se soustředily na různé polymorfismy. Nejčastěji zkoumanými polymorfismy byly C1236T, C3435T a 2677G>T/A. V některých studiích byl nalezen vliv polymorfismů P-gp C1236T, C3435T a G2677T/A na plasmatické hladiny risperidonu a 9-OH-risperidonu [48, 58], výraznější zmírnění symptomů schizofrenie během léčby risperidonem u C1236T [183], vyšší přírůstek na váze při léčbě risperidonem u pacientů s polymorfismy C3435T a G2677T/A [72], vyšší riziko vzniku polydipsie u pacientů s polymorfismem C3435T [152], a více nosičů alely C3435T a haplotypu G2677T/A - C3435T ve skupině pacientů s EPS [58]. V jiné studii bylo nalezeno zvýšené riziko vzniku akatizie a dystonie u těchto polymorfismů [63]. Řada studií však žádný vliv na sledované parametry u různých polymorfismů nenalezla [184, 185, 86, 85]. Souhrn doposud provedených studií zkoumajících vliv polymorfismů MDR1 genu při léčbě risperidonem se nachází v tabulce 1.6. 1.6.6 Závěr Z výše uvedeného je zřejmé, že P-gp a enzymy exprimované ve tkáňových bariérách mohou, po enzymech metabolizujících xenobiotika, představovat další nadějný cíl farmakogenetického výzkumu. Z pohledu farmakogenetiky risperidonu je P-gp mnohem méně prozkoumaný než CYP2D6. Zatímco u CYP2D6 je v podstatě již jasně definovaný vztah jednotlivých polymorfismů k aktivitě enzymu (viz sekce 1.5.2) a někteří autoři již teoreticky uvažují o úpravě dávkování na základě genotypu CYP2D6 (viz sekce 1.5.7.5), u polymorfismů P- gp tomu tak ani zdaleka není. Prostor pro další výzkum je tedy značně rozsáhlý. Toto bylo jedno z východisek naší studie prezentované v experimentální části.

1.6 p-gp 49 Autor Rok n Předmět studie C1236T G2677T/A C3435T Yasui-Furukori a kol.[184] 2004 85 deleon a kol.[87] 2007 537 deleon a kol.[86] 2005 516 Xing a kol.[183] 2006 130 deleon a kol.[87] 2007 277 plasmatické koncentrace risperidonu a 9-OH-risperidonu plasmatické koncentrace risperidonu a 9-OH-risperidonu, responze na léčbu risperidonem výskyt tardivních dyskinéz responze na léčbu risperidonem koncentrace aktivní moiety a poměr risperidon / 9-OH-risperidon - žádný vliv žádný vliv - žádný vliv žádný vliv - - - výraznější zlepšení symptomů žádný vliv žádný vliv - - - Yasui-Furukori a kol.[185] 2007 175 koncentrace prolaktinu - žádný vliv žádný vliv Gunes a kol.[48] 2008 46 Kuzman a kol. [72] 2008 108 Shinkai a kol.[152] 2008 331 Jovanovic a kol.[58] 2010 83 Kastelic a kol.[63] 2010 59 hladiny risperidonu a 9-OH-risperidonu metabolické nežádoucí účinky výskyt polydipsie a hyponatremie koncentrace aktivní moiety, responze a nežádoucí účinky koncentrace aktivní moiety, responze a extrapyramidové NÚ nižší hladiny 9-OHrisperidonu - nižší hladiny 9-OHrisperidonu vyšší přírůstek na váze - - - - vyšší koncentrace aktivní moiety, vyšší pravděpodobnost vzniku EPS vyšší riziko vzniku akathisie a dystonie nižší hladiny 9-OHrisperidonu vyšší přírůstek na váze vyšší náchylnost k rozvoji polydipsie vyšší koncentrace aktivní moiety, větší pravděpodobnost vzniku EPS vyšší riziko akathisie a dystonie Kuzman a kol. [71] 2011 101 metabolické abnormity - žádný vliv žádný vliv Tabulka 1.6: Souhrn farmakogenetických studií zaměřených na vliv polymorfismů MDR1 při léčbě risperidonem Odkazy k literárním zdrojům jsou v prvním sloupci tabulky.

Část II E X P E R I M E N TÁ L N Í Č Á S T

K A Z U I S T I K A 2 2.1 úvod V této kazuistice jsou prezentovány možné dopady nestandardního genotypu CYP2D6 a inhibice tohoto enzymu na individuálního pacienta. Problematika CYP2D6 je podrobně popsaná v teoretické části této práce. Na tomto místě pouze budiž zopakováno, že CYP2D6 je izoenzym systému Cytochromu P- 450 (CYP). Jedná se o jeden z enzymů I. fáze metabolismu xenobiotik, který katalyzuje biotransformaci až 30 % léčiv metabolizovaných systémem CYP, mezi nimi i důležitá antipsychotika či antidepresiva. Tento enzym vykazuje největší interindividuální variabilitu ze všech cytochromů. Tato variabilita se může podílet na rozdílné účinnosti některých léčiv u různých pacientů [103]. Rozlišují se celkem 4 fenotypické varianty CYP2D6: ultra-rychlý metabolizátor (UM), extenzivní metabolizátor (EM), intermediární metabolizátor (IM) a pomalý metabolizátor (PM) [81]. Variabilita CYP2D6 závisí na genetických faktorech a na faktorech prostředí - zejména na podávání inhibitorů [81]. S tím souvisí, že aktivita CYP2D6 může být odvozena z genotypu nebo měřena fenotypizací. Na základě genotypizace lze pouze odvodit aktivitu enzymu nepřímo díky znalosti o vztahu mezi alelami genu CYP2D6 a aktivitou enzymu. Pouze fenotypizace ale odráží aktuální stav enzymu, protože bere v úvahu sumu temporálně stabilních determinant aktivity (genotyp) a vlivů prostředí [83]. Většina studií se soustředí na extrémní varianty PM a UM. Podle některých autorů je diferenciace IM neméně důležitá jednak z důvodu toho, že i u těchto pacientů může být účinnost a snášenlivost léčiv metabolizovaných CYP2D6 změněná a pak také proto, že jsou to právě IM, u nichž je třeba mít se na pozoru před potenciálními lékovými interakcemi s inhibitory CYP2D6 [73], které mohou vést k fenotypické konverzi intermediárního metabolizátora na fenotyp PM se všemi důsledky z toho vyplývajícími, zejména vyšším rizikem nežádoucích účinků [83]. 53

54 kazuistika V následujícím textu je popsán případ pacienta léčeného substrátem CYP2D6 risperidonem, u něhož došlo k rozvoji nežádoucích účinků při standardní dávce a jejich ústupu po převedení pacienta na paliperidon. U tohoto pacienta byla nalezena diskrepance genotypu a fenotypu CYP2D6 potenciálně z důvodu konkomitantní medikace inhibitorem. 2.2 popis případu Popisovaný pacient byl přijat na psychiatrickou kliniku a- kutně pro propuknutí psychotické symptomatologie doprovázené změnou chování. Pacient byl v době přijetí stár 40 let. V jeho osobní anamnéze nefigurovalo žádné závažné somatické onemocnění s výjimkou artrotických změn kolenních kloubů. Pacient v minulosti neprodělal žádný operační zákrok, epileptický záchvat, meningitis nebo encefalitis. Negoval užívání jakýchkoliv návykových látek, neužíval žádnou medikaci. Ranný psychomotorický vývoj pacienta byl rovněž bez nápadností. Pacient vystudoval střední zemědělskou školu s průměrným prospěchem, od ukončení školy pracoval v oboru svobodný, bezdětný, bydlel s rodiči. Dle dalších dostupných údajů bylo patrné, že pacientova osobnost byla již premorbidně uzavřená, až se schizoidními rysy. K hospitalizaci vedly asi 2 týdny se rozvíjející psychotické symptomy charakteru zrakových a sluchových halucinací doprovázených behaviorálními projevy. Dále byla patrna paranoidní bludná produkce, difusní paranoidita, anxieta, insomnie a formální poruchy myšlení. Ihned po přijetí byla provedena baterie vyšetření (základní biochemický screening, krevní obraz, serologické vyšetření, vyšetření očního pozadí, CT mozku, neurologické vyšetření). Provedená vyšetření neprokázala závažnou somatickou příčinu potíží. Byl zjištěn pouze zvýšený titr IgM protilátek pro virus parotitidy, který byl infekcionistou zhodnocen jako falešně pozitivní, nijak nesouvisející s probíhající psychotickou atakou. Byla tedy stanovena pracovní diagnóza akutní schizoformní psychotické poruchy a byla zahájena terapie risperidonem. Vzhledem k nespolupráci pacienta, masivní psychotické produkci a riziku raptu byla tato medikace po jed-

2.3 diskuze 55 nom dni změněna; nejprve byl pacientovi aplikován jednou injekční olanzapin a posléze dvakrát s odstupem jednoho dne zuclopenthixol acetát (100 mg při jedné aplikaci) s metotrimeprazinem (150 mg pro die) jako konkomitantní medikací. Pacientovi byl během prvního týdne hospitalizace provedena fenotypizace CYP2D6 dextromethorfanovým testem z krve a odběr krve na genetické vyšetření genu CYP2D6. Výsledky těchto vyšetření nebyly během hospitalizace dostupné. Při výše zmíněné medikaci došlo ke zmírnění nejvýraznějšího neklidu a zlepšení spolupráce. Pacientovi byl nadále podáván perorální risperidon (4 mg pro die) a metotrimeprazin v dávce 200 mg pro die, která se v průběhu týdne snížila na 100 miligramů za den a za další týden se metotrimeprazin zcela vysadil. Během tohoto období došlo k ústupu pozitivní psychotické symptomatologie. Při dávce risperidonu 4 mg za den se ale rozvinuly extrapyramidové příznaky ve formě hypokineze a bradykineze. Proto byl risperidon zaměněn za paliperidon (Invega) v dávce 9 mg pro die; pacientovi byl podáván biperiden. Extrapyramidová symptomatologie na této medikaci zcela u- stoupila. Po týdnu pak byl biperiden vysazen a dávka paliperidonu byla snížena na 6 mg pro die. Pacient nadále již nevykazoval produktivní psychotickou symptomatologii ani extrapyramidové příznaky. V klinickém obraze byly dominující pouze pacientovy akcentované osobnostní rysy přítomné již premorbidně. Teprve po pacientově propuštění byly k dispozici výsledky dextromethorfanového testu a genetického vyšetření CYP2D6. U pacienta byl zjištěn genotyp *10A / *5A, tedy jedna alela podmiňující enzym se sníženou funkcí a jedna s nulovou funkcí, což je genotyp intermediárního metabolizátora. Metabolický poměr dextromethorfanu k jeho metabolitu dextrorfanu byl ale 1.04435, což odpovídá fenotypu pomalého metabolizátora a je teoreticky zcela v souladu s vyšším rizikem nežádoucích účinků substrátů CYP2D6. 2.3 diskuze U prezentovaného pacienta došlo při medikaci risperidonem k ústupu psychotické symptomatologie, ale také k rozvoji nežádoucích účinků ve formě extrapyramidového syn-

56 kazuistika dromu. Tyto nežádoucí účinky ustoupily po změně medikace za paliperidon, přičemž nedošlo k návratu psychotických příznaků. Paliperidon, neboli 9-OH-risperidon, je aktivní metabolit risperidonu, který není metabolizován CYP2D6 [88]. Zachování antipsychotického efektu a ústup nežádoucích účinků po změně medikace ze substrátu CYP2D6 za lék CYP2D6 nemetabolizovaný by napovídalo, že u prezentovaného pacienta měla významný vliv aktivita CYP2D6. Tuto teorii potvrzuje i skutečnost, že u pacienta byl zjištěn fenotyp PM CYP2D6. U pomalých metabolizátorů několik autorů popsalo vyšší riziko nežádoucích účinků při léčbě risperidonem [86, 70, 173, 94] a někteří autoři došli dokonce tak daleko, že navrhují úpravu dávkování u prokázaných PM [83]. Obdobná situace je pak pravděpodobný také u zuclopenthixolu, který také pacient užíval a který je rovněž substrátem CYP2D6. Jelikož je EM nejčastější fenotyp CYP2D6, je standardní dávkování léčiv nastaveno právě pro tento fenotyp. Předpokládá se, že PM vykazují během léčby substráty CYP2D6 vyšší plasmatické hladiny těchto léčiv než extenzivní metabolizátoři. U léčiva jako je risperidon, který je považován za lék s úzkým terapeutickým rozmezím [82], to pak potenciálně vede k vyššímu výskytu nežádoucích účinků. Další zajímavostí v prezentovaném případě je diskrepance mezi genotypem a fenotypem CYP2D6. Genotypicky byl pacient IM, měl jednu částečně funkční a jednu nefunkční alelu pro gen CYP2D6. Fenotyp, stanovený dextromethorfanovým testem, ale odpovídal PM. Mimo chybu měření existuje jediná možnost, která by vedla k fenotypické konverzi IM na PM a tou jsou inhibitory CYP2D6. Existují studie, které nalezly, že u IM se po podání inhibitoru poměr risperidon / 9-OH-risperidon podobá poměru těchto látek u PM a tedy dochází k fenotypické konverzi [83]. V prezentovaném případě pacient užíval současně s risperidonem metotrimeprazin. Toto antipsychotikum je některými autory považováno za inhibitor CYP2D6 [34]. Existuje jedna studie, v níž sice nebyl prokázán efekt metotrimeprazinu na plasmatické hladiny risperidonu, v této studii ale pacienti užívali malé dávky metotrimeprazinu a nebyl zjišt ován genotyp ani fenotyp CYP2D6 [187]. Vzhledem k četnosti jednotlivých fenotypů CYP2D6 je pravdě-

2.4 závěr kazuistiky 57 podobné, že většina pacientů ze zmíněné studie byla EM. V prezentovaném případě pacient užíval vyšší dávky metotrimeprazinu a jednalo se o pacienta s fenotypem IM. V literatuře není zmínka o výzkumu inhibice CYP2D6 vysokými dávkami metotrimeprazinu u pacientů s IM genotypem. Možnost fenotypické konverze CYP2D6 metotrimeprazinem tak zůstává i nadále otevřená. K rozvoji nežádoucích účinků došlo několik dní po vysazení metotrimeprazinu. V prezentovaném případě chybí informace o fenotypu CYP2D6 ve chvíli rozvoje extrapyramidového syndromu. Dextromethorfanový test, který prokázal fenotypickou konverzi, byl proveden v prvním týdnu hospitalizace, kdy pacient užíval ještě vysoké dávky inhibitoru. Je možné, že inhibice CYP2D6 přetrvává i jistou dobu po vysazení metotrimeprazinu. Délka trvání inhibice CYP2D6 metotrimeprazinem rovněž zatím nebyla extenzivně zkoumána. 2.4 závěr kazuistiky Aktivita CYP2D6 může mít v některých případech vliv na snášenlivost léčiv-substrátů tohoto enzymu. Aktuální aktivita CYP2D6 závisí nejen na genetické informaci, ale také na enviromentálních faktorech, zejména na podávání komedikace, která může působit jako inhibitor zmíněného cytochromu. Tyto interakce mohou být významnější u některých pacientů, u nichž je aktivita enzymu snížena již před podáním inhibitoru. Účinek některých inhibitorů může přetrvávat nějakou dobu i po jejich vysazení. Na příkladu pacienta, intermediárního metabolizátora CYP2D6, byla prezentována možnost fenotypické konverze na pomalého metabolizátora pravděpodobně v důsledku podávání metotrimeprazinu. Následně došlo k rozvoji extrapyramidového syndromu při medikaci substráty CYP2D6 zuclopenthixolem a risperidonem, která přetrvávala i po vysazení metotrimeprazinu. Nežádoucí účinky ustoupily po změně antipsychotika za jiné, nemetabolizované CYP2D6. Při podávání více léků je nutné zohlednit potenciální interakce mezi léčivy na úrovní enzymů metabolizujících xenobiotika, to, že někteří pacienti mohou být k těmto interakcím více náchylní a také to, že inhibice může jistou dobu přetrvávat. V takovém případě je vhodné plánovat

58 kazuistika další léčbu látkami neinteragujícími s danými enzymatickými systémy.

S T U D I E 3 3.1 úvod I přes značné úsilí vynaložené do farmakogenetického výzkumu zůstává efekt zkoumaných genů na reaktivitu na léčiva v mnoha ohledech nejasný. Toto se týká genu CYP2D6 a o mnoho více také MDR1 genu, u něhož začal farmakogenetický výzkum později. Výsledky studií zkoumajících variabilitu CYP2D6 a MDR1 při léčbě risperidonem jsou stále rozporné. Jedním ze závěrů rozsáhlého přehledu a metaanalýzy Institutu Prospektivních Technologických Studií při Evropské Komisi [138] týkající se farmakogenetiky risperidonu a CYP2D6 bylo, že před tím, než bude možno farmakogenetické testování zavést do praxe, je třeba dalších zejména prospektivních studií. Význam MDR1 genu je pro terapii risperidonem ještě méně prozkoumaný než CYP2D6, provádění dalších studií u tohoto genu je proto více než vhodné. Aby se zvýšila výpovědní hodnota výsledků a snížilo riziko náhodných vlivů jiných genů, je vhodné provádět studie na homogenních populacích. Je totiž možné, že se míra, jakou jednotlivé geny ovlivňují reaktivitu na léčbu se u různých populací liší. Studie prezentovaná v následujícím textu se pokouší vycházet z výše zmíněných požadavků. Jedná se o prospektivní studii na poměrně homogenní populaci. Dle dostupných zdrojů se jedná o jednu z prvních studií zkoumající vliv CYP2D6 a MDR1 na léčbu risperidonem u pacientů s první epizodou psychotické poruchy středoevropské, české, populace. Tato studie zároveň zkoumá, zda je v našich podmínkách farmakogenetický výzkum na pacientech s psychotickými poruchami proveditelný. 3.2 cíle studie Cílem této prospektivní, naturalistické studie bylo zhodnotit vliv rozdílného genotypu pro gen CYP2D6 a dvou poly- 59

60 studie morfismů genu MDR1 (2677G>A/T a C3435T) na léčebnou odpověd, výskyt, tíži nežádoucích účinků, subjektivní toleranci a komedikaci u pacientů středoevropské populace s první psychotickou epizodou léčených risperidonem. 3.3 zkoumané hypotézy Hlavní hypotéza naší studie byla, že pacienti s první epizodou psychotické poruchy budou vykazovat rozdíly v reaktivitě na risperidon a že tyto rozdíly budou podmíněny rozdílnými genotypy genu CYP2D6 resp. MDR1. V souladu s teoretickými východisky popsanými výše jsme předpokládali, že skupina pacientů s defektním metabolismem CYP2D6, zejména pomalí metabolizátoři, budou vykazovat vyšší účinnost risperidonu, vyšší incidenci nežádoucích účinků, horší subjektivní snášení léčby, nižší dávky risperidonu, vyšší frekvenci užívání komedikace zaměřené ke zvládání nežádoucích účinků (antiparkinsonika) a nižší frekvenci užívání jiných antipsychotik či sedující medikace. U MDR1 byl předpoklad komplikován omezenými teoretickými znalostmi o vlivu jednotlivých alel tohoto genu na afinitu P-gp k risperidonu a jeho aktivitu. Jedinci s polymorfismem C3435T dle některých autorů vykazují nižší expresi P-gp [154]. Tito pacienti by tedy hypoteticky vykazovali podobnou reaktivitu na risperidon jako pacienti se sníženým metabolismem CYP2D6. Některé informace z literatury napovídají, že polymorfismus G2677A podmiňuje enzym s vyšší aktivitou, pacienti s tímto polymorfismem by tak hypoteticky vykazovali opačnou reaktivitu než CYP2D6 PM nebo nositelé alely C3435T (tedy nižší účinnost risperidonu, nižší incidenci nežádoucích účinků, vyšší dávky risperidonu, nižší poměr pacientů užívajících komedikaci zaměřenou ke zvládání nežádoucích účinků a vyšší frekvenci užívání jiných antipsychotika a také vyšší spotřebu sedující komedikace). 3.4 metody 3.4.0.1 Pacienti Vstupní kritéria byla: diagnóza schizofrenie (F20) nebo a- kutní schizoformní psychotická porucha (F23.2), dle dia-

3.4 metody 61 gnostických kritérií Mezinárodní klasifikace nemocí 10. edice pro výzkum 1, diagnostikovaná poprvé v pacientově životě, věk 18-60 let, podpis informovaného souhlasu, žádná předchozí psychofarmakologická léčba, zahájení terapie risperidonem. Diagnóza byla stanovena dvěma kvalifikovanými psychiatry na základě komplexního psychiatrického vyšetření. Všichni pacienti podstoupili další vyšetření v rámci diferenciální diagnostiky (toxikologické vyšetření z moči, vyšetření očního pozadí, EEG, magnetickou rezonanci nebo CT mozku) za účelem vyloučení organických příčin psychotických symptomů. Vylučovací kritéria byla: hospitalizace proti vůli pacienta, předchozí zbavení způsobilosti k právním úkonům nebo její omezení, kontraindikace terapie risperidonem. Celá studie byla schválena místní etickou komisí. 3.4.0.2 Průběh Všichni pacienti byli sledovaní po 1-7 týdnů. Sledování bylo zahájeno přijetím pacienta, uzavřením diagnózy a iniciací léčby risperidonem. Sledování bylo zastaveno při ukončení terapie risperidonem (a většinou změnou podávaného antipsychotika) nebo při propuštění pacienta. Při zařazení pacienta do studie, každý následující týden a na konci sledování byl zhodnocen stav pacienta - tíže příznaků a nežádoucích účinků, hmotnost, dávky risperidonu a komedikace. Na počátku sledování pacienti vyplňovali dotazníky ke zhodnocení iniciální dysforické reakce a dotazníky ke zhodnocení subjektivního vnímání léčby, druhé jmenované pacienti vyplňovali rovněž při ukončení studie. Kdykoliv v průběhu sledování byl proveden odběr krve ke genetickému vyšetření. Před tímto odběrem museli pacienti podepsat další informovaný souhlas s genetickým vyšetřením. Výsledky genetického vyšetření nebyly ošetřujícímu lékaři ani hodnotícímu lékaři známé a léčba tak nebyla informacemi o genotypu sledovaných genů nijak ovlivněna. 1 Všichni pacienti tedy museli vykazovat příznaky prvního řádu schizofrenie. Do studie pak byli zařazeni všichni takoví pacienti bez ohledu na délku trvání příznaků. Podrobnější diskuzi na toto téma je věnována stat v sekci o limitacích studie (viz 88).

62 studie 3.4.0.3 Hodnocení klinického stavu V průběhu sledování byly užity následující škály: Škála pozitivního a negativního syndromu (Positive and negative syndrome scale, PANSS) [64] ke zhodnocení tíže symptomů, Udvalg for Kliniske Undersøgelser (UKU) [92] k určení tíže nežádoucích účinků. Dále byla sledována hmotnost pacientů, farmakoterapie (dávky risperidonu, dávky jiné medikace, změny medikace) a frekvence responze a remise a příčiny ukončení sledování pacientů (drop-outy pro neúčinnost risperidonu, nežádoucí účinky, předčasné ukončení hospitalizace na reverz). Ústup symptomů byl měřen jako frakce (procento) úvodní hodnoty PANSS. Responze byla definována jako 30% redukce symptomů dle škály PANSS. Symptomatická remise byla definována v souladu s Pracovní skupinou pro remisi u schizofrenie (Remission in Schizofrenia Working Group) jako snížení skóre pod 3 v položkách P1, P2, P3, N1, N4, N6, G5 a G9 škály PANSS [5]. Dalším vypočteným parametrem bylo procento pacientů se závažnými nežádoucími účinky. Závažné nežádoucí účinky byly definovány jako takové nežádoucí účinky, jejichž tíže měřená škálou UKU, je vyšší než medián UKU skóre pro všechny pacienty v průběhu všech týdnů sledování. Tento výpočet byl proveden jak pro celkové skóre UKU, tak pro jednotlivé podškály. Dávky risperidonu byly měřeny v miligramech. Vzhledem k nutnosti porovnat dávky ostatních antipsychotik byly jejich dávky převedeny na chlorpromazinové ekvivalenty. 3.4.0.4 Hodnocení subjektivní snášenlivosti léčby Iniciální dysforická reakce byla hodnocena dotazníkem Neuroleptic Dysphoria Scale (NDS), subjektivní snášení léčby pak dotazníkem Drug Attitude Inventory (DAI-10). NDS (Neuroleptic Dysphoria Scale) je čtyřpoložková, sebeposuzovací škála, která měří přítomnost iniciální dysforické reakce při léčbě antipsychotiky [145]. Vyšší hodnota znamená menší dysforickou reakci. Tento dotazník pacienti vyplňovali jednou, po iniciálním podání risperidonu. DAI-10 (Drug Attitude Inventory) je desetipoložková sebeposuzovací škála, která vznikla zkrácením škály DAI- 30 a je užívaná ke zhodnocení jednak nežádoucích účinků

3.4 metody 63 psychofarmakologické léčby a také ke zhodnocení kompliance při dlouhodobé antipsychotické léčbě [9]. Vyšší hodnota škály odpovídá lepšímu subjektivnímu přístupu k medikaci. Tento dotazník pacienti vyplňovali dvakrát - poprvé v prvním týdnu léčby risperidonem a podruhé při ukončení sledování (ukončení léčby risperidonem, propuštění). Při konečném zhodnocení byly sledovány absolutní skóre v NDS, DAI-10 na začátku a na konci léčby a dále četnost pacientů, u kterých došlo ke snížení skóre DAI-10 při měření na konci léčby. 3.4.0.5 Genotypizace cyp2d6 Genotypizace genu CYP2D6 byla prováděna na Oddělení lékařské genetiky FN Brno. Genomická DNA byla extrahována z leukocytů periferní krve pacientů. K prevenci nespecifické amplifikace pseudogenů CYP2D7 a a CYP2D8 byla jako první provedena preamplifikace za užití specifických primerů [156]. Výsledné preamplikony byly užity jako materiál pro následnou PCR. Z těchto preamplikonů byly amplifikovány všechny exony. Produkty PCR byly vizualizovány na NAT gelu a purifikovány. Vyčištěné produkty byly využity k dalším sekvenčním analýzám. Bidirekcionální sekvenování bylo provedeno s využitím BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) na přístroji ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems). Nalezené polymorfismy byly popsány pomocí nomenklatury alel CYP2D6 [170]. K detekci delece a duplikace celých alel bylo užito long-range PCR [28]. Užitím výše zmíněné metody mohla být zachycena jakákoliv známá a popsaná mutace v genu pro CYP2D6. Pacienti byli kategorizovaní do skupin dle očekávaného fenotypu na základě nejčastěji užívaného schématu popsaného v kapitole 1.5.2 [80]. mdr-1 Stanovení přítomnosti polymorfismů MDR-1 bylo provedeno v laboratořích Ústavu patologické fyziologie Lékařské fakulty Masarykovy Univerzity. K určení genotypu MDR1 byla užita modifikovaná metoda popsaná Cascorbim a kol. [18]. DNA získaná z lymfocytů periferní krve byla amplifikována. Produkty PCR

64 studie pak byly štěpeny restrikčními enzymy BseNI, BshNI a Bsp1431. Výsledné DNA fragmenty byly separovány na agarozovém gelu a obarveny ethidium-bromidem. Pomocí této metody byly zjištěny pouze polymorfismy G2677A/T a C3435T. 3.4.0.6 Statistické hodnocení Hlavní statistickou hypotézou bylo, že pacienti s různým odvozeným CYP2D6 fenotypem a s rozdílným genotypem v genu MDR1 vykazují odlišnosti v alespoň některých sledovaných proměnných. Rozdíly v poměrech pacientů dosahujících responze, remise, v poměrech drop-outů, v poměrech pacientů se závažnými nežádoucími účinky a užívajících různou komedikaci byly analyzovány Fisherovým exaktním testem (Fisher s exact test). Distribuce kontinuálních proměnných (PANSS skóre, ústup symptomů, dávky risperidonu a antipsychotik) byla testována pomocí Shapiro-Wilkovým testem. Vzhledem k tomu, že normální rozložení nebylo prokázáno, byly další analýzy provedeny pomocí Kruskall-Wallisova testu a posthoc Wilcoxonova rank-sum testu. Statistická analýza byla provedena využitím knihovny R [131]. 3.5 výsledky 3.5.1 Základní charakteristika Základní charakteristika souboru je shrnuta v tabulce 3.1. Do studie bylo zařazeno 35 pacientů. 21 z nich (60 %) byli muži, 14 (40 %) ženy. Průměrný věk byl 29,2 roků (SD = 11.36). Medián doby sledování ve studii byly 4 týdny pro celý soubor. Minimální doba sledování byla 1 týden, maximální byla 7 týdnů. Mezi jednotlivými skupinami pacientů, at už dle genotypu CYP2D6 nebo MDR-1, nebyly statisticky významné rozdíly v délce sledování.

3.5 výsledky 65 Velikost souboru 35 Pohlaví Muži Ženy 60 % 40 % Diagnóza F20 F23.2 74.3 % 25.7 % Věk průměr s 29,2 11,35 CYP2D6 UM EM IM PM 2,63 % 57,89 % 18,42 % 13,56 % G2677T G / G A / G T / G T / T 17,14 % 8,6 % 54,29 % 20 % C3435T C / C C / T T / T 11,43 % 45,71 % 42,85 % Tabulka 3.1: Základní charakteristiky studovaného souboru 3.5.2 CYP2D6 3.5.2.1 Genotyp Nejčastější alelou v celém souboru byla alela 4*, která kóduje nefunkční enzym (frekvence alely 0,2286 %). Druhou a třetí nejčastější alelou byly alely kódující plně funkční enzym 2* (0,20) a 1* (0,1857). Frekvence všech zachycených alel jsou shrnuty v tabulce 3.2. Z 35 pacientů, byl 1 pacient (přibližně 2.86 %) UM, 22 pacientů (62.86 %) byli EM, 7 pacientů (20 %) IM a 5 pacientů (14,29 %) PM. Kvůli relativně malé velikosti souboru byly pro potřeby dalších analýz sloučeny skupiny EM a IM a všechny analýzy byly provedeny jako srovnání skupiny extrémních případů pacientů bez funkční alely (PM) se skupinou zahrnující pacienty s alespoň jednou částečně funkční alelou (skupiny EM a IM, dále v textu označována jako EM + IM). Druhý extrémní případ pacient s multiplikací plně funkční alely (UM) byl vyloučen z dalších analýz, jelikož počet pozorování vylučoval další smysluplnou analýzu.

66 studie Alela Frekvence Očekávaná frekvence 1* 18,57 34,4 1*xn 1,43 0,6 2* 20 28,7 4* 22,86 18,2 5* 2,86 3,2 6* 1,43 0,6 9* 4,29 2,5 10* 8,56 2,5 41* 7,14 7 Tabulka 3.2: Frekvence alel ve sledovaném souboru V posledním sloupci tabulky jsou očekávané frekvence v Evropské populaci dle Sistonena [157]. 3.5.2.2 Symptomy Úplné PANSS skóre na začátku a na konci sledování, stejně jako skóre všech subškál PANSS, jsou shrnuty v tabulce 3.3 a obrázku 3.1. V tíži symptomů na začátku sledování nebyly nalezeny žádné statisticky významné rozdíly, nicméně PM skupina vykazovala statisticky významně vyšší hodnoty v subškálách negativních symptomů a obecných symptomů na konci sledování (Wilcoxon rank-sum test, p = 0.04569 respektive p = 0.0171). Pacienti s genotypem odpovídajícím PM vykazovali rovněž trend k vyššímu skóre v pozitivní subškále PANSS (p = 0.05811). Skupina PM vykazovala také nižší úbytek psychotických symptomů měřených jako procentuální úbytek PANSS skóre. Tento výsledek byl statisticky významný (Wilcoxon rank-sum test, p = 0.01715). 3.5.2.3 Nežádoucí účinky Výskyt nežádoucích účinků je shrnut v tabulce 3.3, změna hmotnosti pak v obrázku 3.4. Skupina PM vykazovala o- becně vyšší poměr pacientů se závažnějšími nežádoucími účinky. Nicméně statistické významnosti se přiblížil pouze rozdíl v subškále UKU pro autonomní nežádoucí účinky (poruchy akomodace, zvýšená nebo snížená salivace, nauzea a zvracení, průjem nebo zácpa, polyurie a polydipsie,

3.5 výsledky 67 Obrázek 3.1: PANSS skóre včetně subškál a pokles PANSS v průběhu studie v závislosti na různém genotypu CYP2D6 CYP2D6 EM + IM PM PANSS Medián IQR Medián IQR Začátek Pozitivní 22 10 23 12 Negativní 19 12 24 7 Obecné 39 24 52 20 Celkem 79 33 85 32 Konec Pozitivní 9 a 7 a 15 a 9 a Negativní 11 b 11 b 21 b 11 b Obecné 25 c 10 c 35 c 11 c Celkem 48 d 26 d 66 d 33 d Procento redukce PANSS 39,76 e 50 e 9,84 e 20,5 e Nežádoucí účinky Procento Procento Psychické 65,52 % 80 % Neurologické 41,38 % 60% Autonomní 51,72 % f 100% f Jiné 41,38 % 60 % Celkem 58,62 % 100 % Změna hmotnosti Medián IQR Medián IQR 3,51 5,88 1,63 1,68 Tabulka 3.3: Tíže symptomů schizofrenie, jejich ústup a nežádoucí účinky při léčbě risperidonem v závislosti na různém genotypu CYP2D6 Statisticky významné hodnoty jsou zvýrazněny (Wilcoxon rank-sum test): a p = 0,058, b p = 0,046, c p = 0,01, d p = 0,017, e p = 0,017; (Fisher s exact test): f p = 0,063.

68 studie CYP2D6 EM + IM PM Výsledek léčby Procento Procento Remise 68,97 % 40 % Drop-outy 55,17 % 80 % Drop-outy pro nedostatečný účinek 37,93 % 60 % Drop-outy pro nežádoucí účinky 24,14 % 0% Tabulka 3.4: Výsledek léčby ve sledovaném souboru v závislosti na genotypu CYP2D6 V zobrazených parametrech nebyl nalezen statisticky signifikantní rozdíl. ortostatické kolapsy, palpitace a tachykardie, zvýšené pocení, Fisher s exact test, p = 0.06291). V přírůstcích hmotnosti při léčbě risperidonem nebyly sledovány statisticky významné rozdíly. 3.5.2.4 Výsledek léčby Souhrn poměrů pacientů dosahujících remise a předčasně ukončujících léčbu risperidonem z různých důvodů (dropout) se nachází v tabulce 3.9. V uvedených veličinách nebyl nalezen statisticky významný rozdíl. 3.5.2.5 Medikace Dávky všech antipsychotik jsou shrnuty v tabulce 3.5. Pacienti s PM genotypem obecně užívali vyšší dávky všech antipsychotik (p = 0.05746), zejména pak dávky antipsychotik nemetabolizovaných CYP2D6 (p = 0.01465). Rozdíly v dávkách risperidonu nebyly statisticky významné. V tabulce 3.6 se nachází souhrn všech léků, které užívali pacienti jako komedikaci, společně s informací o potenciálním ovlivnění aktivity CYP2D6. V PM skupině byl vyšší poměr pacientů užívajících antiparkinsonika a benzodiazepiny. Tento výsledek však nebyl statisticky významný. 3.5.2.6 Subjektivní snášenlivost léčby Mezi skupinami pacientů s rozdílnou předpokládanou aktivitou CYP2D6 nebyl nalezen statisticky signifikantní rozdíl ve skóre NDS, DAI-10 ani v četnosti pacientů, u nichž došlo k poklesu skóre DAI-10 během léčby. Veličiny měřící subjektivní snášení léčby jsou shrnuty v tabulce 3.7.

3.5 výsledky 69 CYP2D6 EM + IM PM Dávky Medián IQR Medián IQR Risperidon 21,33 21 20,75 7,25 Všechna AP 2567 g 2133 g 4130,9 g 2200 g CYP2D6-dependentní AP 2250 2150 2075 725 CYP2D6-independentní AP 60 h 1201 h 1917 h 2100 h Komedikace Procento Procento Antiparkinsonika 34,48 % 80 % Benzodiazepiny 82,76 % 100 % Betablokátory 6,9 % 0 % Tabulka 3.5: Souhrn sledovaných veličin týkající se užívané medikace v průběhu studie v závislosti na genotypu CYP2D6 Dávky risperidonu jsou v miligramech, ostatní údaje o dávkách antipsychotik jsou v chlorpromazinových ekvivalentech. Statisticky významné hodnoty jsou zvýrazněny (Wilcoxon rank-sum test): g p = 0,058, h p = 0,014. Medikace Vztah k CYP2D6 Vztah k P-gp amantadin - inhibitor biperiden - inhibitor clonazepam - - diazepam - substrát haloperidol substrát / střední inhibitor substrát / inhibitor chlorprothixen - inhibitor levocetirizin - substrát metoprolol substrát substrát / inhibitor metotrimeprazin substrát / střední inhibitor pravděpodobný inhibitor [snižuje eflux] olanzapin - substrát oxazepam - - paliperidon - substrát / slabý inhibitor promethazin substrát substrát / inhibitor ramipril - - risperidon substrát substrát / slabý inhibitor zolpidem - substrát [od firmy] zuclopenthixol substrát - Tabulka 3.6: Medikace užívaná pacienty v průběhu studie s údajem o vztahu léku k CYP2D6 [54, 31] a P-gp [127, 46, 123]

70 studie CYP2D6 EM + IM PM Subjektivní prožívání léčby Medián IQR Medián IQR NDS 3 4,5 5 3,5 DAI-10 na začátku -2 6 2 2,5 DAI-10 na konci 0 2 2 5,5 Pacienti s poklesem DAI-10 17,24 % 25 % Tabulka 3.7: Subjektivní prožívání léčby v závislosti na genotypu CYP2D6 Ve sledovaných parametrech nebyl nalezen statisticky signifikantní rozdíl. 3.5.3 P-gp 3.5.3.1 Genotyp 2677g>t/a (exon 21) V souboru pacientů byly nalezeny všechny popsané varianty tohoto polymorfismu. Nejčastější byla nemutovaná wild-type alela 2677G (frekvence 0,49), následovala alela 2677T (frekvence 0.47) a nejméně častá byla alela 2677A (frekvence 0,04). Alela 2677A se vyskytovala pouze u 3 heterozygotů společně s alelou 2677G (8,6 % pacientů). Ze zbylých pacientů bylo 6 homozygotních pro wild-type alelu 2677G (17,14 %), 7 (20 %) bylo homozygotních pro alelu 2677T a 19 pacientů (54,29 %) bylo heterozygotních. V dalších analýzách byly alely 2677A a 2677T společně označovány jako mutované alely (Mut) a alela 2677G jako alela wild-type (Wt). Toto spojení bylo z důvodu snížení celkového množství skupin pro potřeby statistické analýzy. V dalších analýzách tedy byly užity skupiny 3 - homozygoti Wt/Wt, Mut/Mut a heterozygoti Wt/Mut. c3435t (exon 26) Wild-type alela 3435C byla v souboru méně častá (frekvence 0,34) než mutovaná alela 3435T (frekvence 0.66). 4 pacienti (11,43 %) byli homozygotní pro alelu 3435C, 15 pacientů (42,85 %) bylo homozygotních pro alelu 3435T a 16 pacientů (45,71 %) bylo heterozygotních. Následné analýzy byly provedeny se 3 skupinami - homozygoti C/C respektive T/T a heterozygoti C/T.

3.5 výsledky 71 Obrázek 3.2: PANSS skóre včetně subškál a pokles PANSS v průběhu studie v závislosti na různém genotypu 2677G>T/A 3.5.3.2 Symptomy Výsledky PANSS skóre včetně subškál jsou shrnuty v tabulce 3.8 a v obrázcích 3.2 a 3.3. 2677g>t/a (exon 21) Mezi jednotlivými skupinami pacientů nebyl nalezen signifikantní rozdíl ani v symptomech na začátku léčby, ani na konci léčby a to jak v celkovém PANSS skóre, tak v jednotlivých podškálách. Skupiny se nelišily ani v úbytku symptomů. c3435t (exon 26) Homozygoti pro alelu C (C/C) vykazovali signifikantně vyšší úbytek symptomů než heterozygoti C/T (Wilcoxon rank-sum test, p = 0,01) a nesignifikantně vyšší úbytek než homozygoti T/T (Wilcoxon ranksum test, p = 0,07). V souladu s tímto měli homozygoti C/C nejnižší PANSS skóre na konci léčby a to významně ve srovnání s heterozygoty C/T (Wilcoxon rank-sum test, p = 0,018) a téměř signifikantně ve srovnání s heterozygot T/T (Wilcoxon rank-sum test, p = 0,063). Tento výsledek byl dán zejména rozdílem v subškále negativních příznaků, kde homozygoti C/C vykazovali statisticky významně méně symptomů na konci léčby oproti heterozygotům C/T (Wilcoxon rank-sum test, p = 0,001) i homozy-

72 studie Obrázek 3.3: PANSS skóre včetně subškál a pokles PANSS v průběhu studie v závislosi na různém genotypu C3435T gotům T/T (Wilcoxon rank-sum test, p = 0,0056). Další signifikantní rozdíly mezi skupinami nebyly nalezeny. I přes výše uvedené však Kruskal-Wallisova analýza variance neprokázala žádný signifikantní rozdíl mezi skupinami. 3.5.3.3 Nežádoucí účinky Výskyt nežádoucích účinků u jednotlivých skupin pacientů rozdělených dle polymorfismů MDR1 jsou shrnuty v tabulce 3.8, změna hmotnosti je pak graficky znázorněna v obrázku 3.4. 2677g>t/a (exon 21) Co se týče výskytu závažných nežádoucích účinků měřených škálou UKU, nebyl nalezen žádný signifikantní rozdíl. Byl však nalezen signifikantní rozdíl v přírůstku na váze (Kruskal-Wallisův test, p = 0,027). Heterozygoti Wt/Mut vykazovali signifikantně vyšší přírůstek na váze než homozygoti s oběma mutovanými alelami (Wilcoxon rank-sum test, p = 0,01). c3435t (exon 26) Jediný nalezený signifikantní rozdíl byl nižší výskyt psychických nežádoucích účinků u pacientů homozygotních pro wild-type alelu C. Rozdíl byl signifikantní, jak ve srovnání s heterozygoty C/T (Fisher s

3.5 výsledky 73 G2677T/A C3435T Wt / Wt Wt / Mut Mut / Mut C / C C / T T / T PANSS Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR Začátek Pozitivní 22 2,75 22 4,75 17 6,5 21 0,25 22,50 5,5 22 7,5 Negativní 22 10,75 18 7,5 22 4 19,5 6,5 18,50 7,5 20 8 Obecné 38,5 10,75 41 16,75 40 18 39,5 7 38,5 14,5 45 17,5 Celkem 81 26,75 84 25 82 24 80 13,75 82 21,25 83 26,5 Konec Pozitivní 9 2,75 9,5 8 10 6,5 8,5 2 10 9,5 10 6,5 Negativní 16 8,25 13,5 10,5 11 9,5 9,5 k,l 1,5 k,l 16,5 l 12,5 l 15 k 6,5 k Obecné 26 5 25,5 12,5 26 7,5 24 2,25 25,5 15,5 27 8 Celkem 51,5 15,5 50 25,5 50 21 42m 4,25m 55,5m 39,25m 52 19,5 Procento redukce PANSS 36,84 20,77 35,95 29,44 38,71 25,64 45,68n 4,68n 26,78n 32,07n 38,71 29,74 Nežádoucí účinky Procento Procento Procento Procento Procento Procento Psychické 50 % 72,73 % 71,43 % 0 % o,p 75 % p 80 % o Neurologické 50 % 50 % 28,57 % 0 % 56,25 % 46,67 % Autonomní 83,33 % 54,55 % 57,14 % 50 % 50 % 73,33 % Jiné 66,67 % 45,45 % 28,57 % 50 % 56,25 % 33,33 % Celkem 83,33 % 68,18 % 42,86 % 25 % 75 % 66,67 % Změna hmotnosti Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR 0,94 i 5,10 i 4,5 i,j 6,2 i,j 0 i,j 3,32 i,j 3,26 3,9 5,62 7,68 1,63 3,75 Tabulka 3.8: Tíže symptomů schizofrenie, jejich ústup a nežádoucí účinky při léčbě risperidonem v závislosti na různém genotypu MDR1 Statisticky významné hodnoty jsou zvýrazněny (Krukal-Wallis test): i - p = 0,027, (Wilcoxon ranksum test): j - p = 0,01, k - p = 0,006, l - p = 0,001, m - p = 0,02, n - p = 0,01, (Fisher s exact test): o - p = 0,009, p - p = 0,01 exact test, p = 0.14), tak homozygoty T/T (Fisher s exact test, p = 0.009). Navíc je patrné postupné zvyšování četnosti výskytu závažných psychických nežádoucích účinků v řadě homozygoti C/C - heterozygoti C/T - homozygoti T/T (0 % - 75 % - 80 %). 3.5.3.4 Výsledek léčby Výše uvedené rozdíly nenalezly svůj odraz v tom, že by se skupiny s rozdílnými genotypy pro oba polymorfismy lišily v četnosti pacientů-remitérů nebo pacientů předčasně ukončující léčbu risperidonem. Shrnutí těchto sledovaných veličin je v tabulce 3.9. 3.5.3.5 Medikace 2677g>t/a (exon 21) Mezi pacienty s různými genotypy v exonu 26 nebyl nalezen statisticky významný rozdíl v užívaných dávkách risperidonu, antipsychotik a ani v četnosti pacientů užívajících komedikaci. Dávky antipsycho-

74 studie Obrázek 3.4: Změna hmotnosti (v procentech hmotnosti) v průběhu léčby risperidonem u všech sledovaných skupin G2677T/A C3435T Wt / Wt Wt / Mut Mut / Mut C / C C / T T / T Výsledek léčby Procento Procento Procento Procento Procento Procento Remise 83,33 % 63,64 % 57,14 % 75 % 62,5 % 66,67 % Drop-outy 66,67 % 54,55 % 57,14 % 50 % 62,5 % 53,33 % Drop-outy pro nedostatečný účinek 16,67 % 45,45 % 42,86 % 0 % 50 % 40 % Drop-outy pro nežádoucí účinky 50,00 % 18,18 % 0,00 % 25 % 25 % 13,33 % Tabulka 3.9: Výsledek léčby ve sledovaném souboru v závislosti na genotypu MDR1 V zobrazených parametrech nebyl nalezen statisticky signifikantní rozdíl.

3.5 výsledky 75 G2677T/A C3435T Wt / Wt Wt / Mut Mut / Mut C / C C / T T / T Dávky Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR Risperidon 20,88 3,24 23,31 9,17 16,50 6,78 19,62 4,37 22,48 8,05 19,80 8,9 Všechna AP 2205 1121 2879 1365 2550 1600 1962 437 2658 1315 3400 1232 CYP2D6-dependentní AP 2175 341 2331 836 1650 678 1962 437 2331 581 2250 890 CYP2D6-independentní AP 30,0 540 237 1556 925 1675 0 0 237 900 1201 1775 Komedikace Procento Procento Procento Procento Procento Procento Antiparkinsonika 33,33 % 45,45 % 28,57 % 0 % 50 % 40 % Benzodiazepiny 83,33 % 86,36 % 85,71 % 100 % 87,5 % 80 % Betablokátory 16,67 % 4,55 % 0,00 % 0 % 6,25 % 6,67 % Tabulka 3.10: Souhrn sledovaných veličin týkající se užívané medikace v průběhu studie v závislosti na genotypu MDR1 Dávky risperidonu jsou v miligramech, ostatní údaje o dávkách antipsychotik jsou v chlorpromazinových ekvivalentech. V zobrazených parametrech nebyl nalezen statisticky signifikantní rozdíl. tik a frekvence užívání komedikace jsou shrnuty v tabulce 3.10. c3435t (exon 26) Užitím Kruskal-Wallisovy analýzy variance nebyl nalezen signifikantní rozdíl v dávkách risperidonu nebo antipsychotik. Pacienti homozygotní pro alelu C ale vykazovali signifikantně nižší dávky antipsychotik než heterozygoti C/T (Wilcoxon rank-sum test, p = 0,015) i homozygoti T/T (Wilcoxon rank-sum test, p = 0,0056). Co se týče frekvencí pacientů užívajících různou komedikaci, nebyl nalezen statisticky významný rozdíl. 3.5.3.6 Subjektivní snášenlivost léčby Veličiny měřící subjektivní snášení léčby u jednotlivých skupin dle polymorfismů MDR1 jsou znázorněny v tabulce 3.11. 2677g>t/a (exon 21) Pacienti homozygotní pro mutovanou alelu (Mut/Mut) vykazovali statisticky významně vyšší skóre NDS (to znamená nižší dysforickou reakci) než pacienti homozygotní pro wild-type alelu (Wilcoxon ranksum test 0,04). V absolutním skóre DAI-10 ani ve frekvenci pacientů, u kterých došlo ke snížení tohoto skóre, nebyl nalezen významný rozdíl.

76 studie G2677T/A C3435T Wt / Wt Wt / Mut Mut / Mut C / C C / T T / T Subjektivní prožívání léčby Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR NDS 2,5 q 3 q 3 5 8 q 5 q 3,5 2,5 3 4,25 5 5 DAI-10 na začátku 1 11 0 4-2 4-1 5 0 6-1 4 DAI-10 na konci 2 13,5 0 2 0 1 0 3,5 0 2,5 0 3,5 Pacienti s poklesem DAI-10 16,67 % 19,04 % 28,57 % 0 % 18,75 % 28,57 % Tabulka 3.11: Subjektivní prožívání léčby v závislosti na genotypu MDR1 Statisticky významné hodnoty jsou zvýrazněny (Wilcoxon rank-sum test): q - p = 0.04. c3435t (exon 26) Mezi skupinami pacientů rozdělených dle polymorfismu v exonu 26 nebyl nalezen statisticky signifikantní rozdíl v žádném ze sledovaných parametrů.

Část III D I S K U Z E

V Ý S L E D K Y S T U D I E 4 Bylo provedeno 1 7 týdenní prospektivní, naturalistické sledování pacientů s první epizodou psychotické poruchy ke zhodnocení vlivu aktivity CYP2D6 a polymofismů v MDR1 genu na účinnost a snášenlivost risperidonu. 4.0.4 CYP2D6 4.0.4.1 Účinnost Pomalí metabolizátoři vykazovali v našem souboru statisticky signifikantně nižší redukci psychotických symptomů než skupina sestávající z extenzivních a intermediárních metabolizátorů. Vzhledem k tomu, že nebyly nalezeny žádné statisticky významné rozdíly v tíži symptomů na začátku sledování, není překvapující, že PM vykazovali vyšší PANSS skóre na konci sledování, zejména pak statisticky významně vyšší skóre v podškále negativních a obecných symptomů. Teoreticky se dá předpokládat, že u pacientů s deficitem v metabolismu CYP2D6, bude vyšší poměr risperidon / 9-OH-risperidon vést k větší účinnosti risperidonu, jelikož risperidon dle dostupných údajů prostupuje skrz hematoencefalickou bariéru (HEB) snadněji [93, 180]. V našem souboru tomu však tak nebylo a naše výsledky jsou v souladu s výsledky Laiky a kol., v jehož studii byla nalezena pozitivní korelace odpovědi na léčbu s počtem plně funkčních alel genu pro CYP2D6 [73]. Vysvětlení může spočívat v přítomnosti 9-OH-risperidonu během léčby risperidonem. Obě zmíněné látky vykazují antipsychotickou účinnost. 9-OH-risperidon vykazuje pak delší biologický poločas [88] a jeho krevní hladiny jsou při léčbě risperidonem obecně vyšší než hladiny mateřské látky [6, 136]. Zvážíme-li tyto vlastnosti 9-OH-risperidonu při léčbě risperidonem a skutečnost, že u PM je poměr risperidon / 9-OH-risperidon změněný ve prospěch risperidonu, je možné, že nižší hladiny 9-OH-risperidonu mohou vést k nižší odpovědi na léčbu pozorované v našem souboru. 79

80 výsledky studie Obě látky také vykazují antagonismus na několika receptorových systémech (5HT2, alfa 1, alfa 2 adrenergní, H1 histaminergní a v menší míře, 5HT1C, 5HT1D, 5HT1A, D1), přičemž mají k různým receptorům různé afinity [112]. Přestože je antagonismus na D2 receptorech pro antipsychotický účinek bezesporu důležitý, není jediný. Kupříkladu u klozapinu ani relativně nízké obsazení D2 receptorů nezabraňuje tomu, aby byl klozapin jedno z nejúčinnějších antipsychotik [62, 116]. Bylo zvažováno, že antipsychotický účinek a výskyt nežádoucích účinků je ovlivňován působením na jiné receptorové systémy, kupříkladu serotoninergní a adrenergní [168, 172]. Risperidon a 9-OH-risperidon vskutku vykazují rozdíly v afinitách právě na těchto zmíněných receptorových systémech [112]. Sledované rozdíly v ústupu psychotických symptomů při léčbě risperidonem pak může být důsledkem interakce různých množství risperidonu a jeho metabolitu na několika různých druzích receptorů. Dále je také možné, že samotný průběh psychózy je modifikován různou aktivitou CYP2D6. Jako bylo prokázáno, CYP2D6 je exprimován v mozku, kde se podílí na metabolismu nejen léčiv, ale také endogenních aminů [35]. Jistý efekt na průběh schizofrenie byl zjištěn v jedné slovinské studii, kde byl fenotyp PM spojen s výraznější perzistující negativní symptomatologií [130]. V naší studii byl patrný obdobný nález PM skupina vykazovala výraznější negativní symptomatologii po léčbě risperidonem. 4.0.4.2 Snášenlivost a subjektivní vnímání léčby Přestože v našem souboru vykazovali PM trend k vyšší frekvenci výskytu autonomních nežádoucích účinků risperidonu, nebyl nalezen žádný statisticky významný rozdíl. Žádný významný rozdíl nebyl nalezen ani v subjektivním vnímání léčby. Tento nález zjevně stojí v rozporu s výsledky několika předchozích studií [15, 73, 85] a také v rozporu s teoretickým předpokladem, že defektní metabolismus CYP2D6 vede k vyšším hladinám risperidonu, který prochází HEB snadněji než jeho metabolit 9-OH-risperidon, což následně vede k vyššímu výskytu nežádoucích účinků. Náš soubor mohl být jednoduše příliš malý než aby bylo možno zachytit statisticky významný rozdíl ve výskytu

výsledky studie 81 nežádoucích účinků. To je pravděpodobné, nebot PM o- pravdu vykazovali vyšší frekvenci nežádoucích účinků, a- však statisticky nevýznamně. Nicméně je zde další možná hypotéza: Některé nežádoucí účinky mohly být omylem považovány za symptomy psychózy, které jsou měřeny škálou psychotických symptomů. Srovnáním užitých škál (PANSS a UKU) je možno nalézt řadu podobných symptomů. Podobnost s některými psychotickými symptomy vykazuje řada položek v podškálách psychických, autonomních a neurologických nežádoucích účinků ve škále UKU a podškále negativních a obecných symptomů škály PANSS (srovnání UKU - PANSS škál: 1.1 obtíže s koncentrací - G11 poruchy pozornosti, 1.5 deprese - G6 deprese a G3 pocity viny, 1.6 neklid - G2 úzkost a G4 napětí, 1.10 emocionální odtažitost - N2 emocionální stažení, většina položek v podškále autonomních nežádoucích účinků může vést k symptomům G1 zabývání se tělesným stavem, 1.2 astenie, malátnost, zvýšená únavnost a 1.3 spavost, sedace může vést k G7 zpomalení psychomotorického tempa ). Takové chybné přiřazení symptomů by pak mohlo vést k chybnému dojmu zvýšení závažnosti symptomů psychózy a snížení výskytu nežádoucích účinků. 4.0.4.3 Genotyp Proporce PM a IM variant byla lehce vyšší, než je běžně uváděno ve zdravé Evropské populaci. Například dle Sistonena je v Evropské populaci přibližně 8 % pomalých metabolizátorů [157], zatímco v našem souboru bylo procento PM 14,29 %. Vyšší procento subjektů s defektním metabolismem CYP2D6 bylo doprovázeno vyšší frekvencí alel podmiňujících expresi nefunkčního nebo částečně funkčního enzymu. Nejčastější alelou v našem souboru byla alela *4 (17,2 %), který kóduje nefunkční protein, zatímco alely *2 (20 %) a *1 (18,57 %) kódující plně aktivní enzym, byly nalezeny s menší četností. Zajímavá je také relativně vysoká frekvence alely *10 (8,57 %) podmiňující expresi částečně funkčního enzymu. Pro srovnání - Sistonen nalezl následující frekvence alel: *4 17.2 %, *1 34.4 %, *2 28.7 %, *10 2.5 % [157].

82 výsledky studie Několik údajů z literatury naznačuje, že CYP2D6 by mohl být jedním z genů náchylnosti ke schizofrenii a že se liší poměry jednotlivých alel genu CYP2D6 mezi běžnou populací a populací pacientů se schizofrenií. Dle některých autorů vede nižší aktivita enzymu CYP2D6 k vyššímu riziku rozvoje schizofrenie [32], což podporuje i nález v nedávné studii [58]. Jiní autoři nalezli nižší frekvenci pomalých metabolizátorů mezi pacienty se schizofrenií [95, 130]. V našem souboru byla frekvence PM a IM vyšší než v běžné populaci, což bylo doprovázeno již zmíněnou vyšší frekvencí alely *4 a *10. Vzhledem k prokázané expresi CYP2D6 v mozku a předpokládanou funkcí tohoto enzymu v metabolismu některých endogenních substancí, je spekulace o možném vztahu mezi CYP2D6 a rozvojem schizofrenie lákavá. Nicméně takové spojení nebylo ve studiích přímo zaměřených na tuto otázku nalezeno [3, 29, 30, 69]. Z našeho omezeného souboru je prakticky nemožné odvozovat jakékoliv závěry o rozdílech v aktivitě CYP2D6 mezi pacienty se schizofrenií a zdravou populací. Tato studie navíc nebyla navržena, aby zkoumala tuto otázku. Je tak pravděpodobnější, že při aktuální velikosti souboru množství pacientů PM neodpovídalo skutečné četnosti této varianty v populaci se schizofrenií a při větším souboru by bylo nalezeno obdobné množství pomalých metabolizátorů jako v běžné populaci. 4.0.5 P-gp 4.0.5.1 2677G>T/A (Exon 21) účinnost V této studii nebyl nalezen signifikantní vliv polymorfismu 2677G>T/A na účinnost risperidonu. Jednotlivé skupiny pacientů se nelišily ani v úbytku symptomů, ani v psychopatologii na konci sledování, ani v četnosti pacientů reagujících na léčbu. Tento nález je v souladu s výsledky již provedených studií [58, 63], kteří rovněž nenalezli souvislost mezi tímto polymorfismem a účinností risperidonu. Tento nyní již opakovaně nalezený výsledek naznačuje, že polymorfismus 2677G>T/A, i když vede k modifikaci samotného P-gp [151], nepředstavuje vzhledem k účinnosti léčby klinicky významný vliv.

výsledky studie 83 snášenlivost a subjektivní hodnocení léčby Polymorfismus 2677G>T/A neměl vliv na výskyt nežádoucích účinků měřených škálou UKU ani na četnost ukončování terapie risperidonem v důsledku NÚ. Zajímavý je nález vyššího přírůstku na váze u heterozygotů s tímto polymorfismem. Zajímavé je to vzhledem k tomu, že nebyl nalezen vztah mezi dávkou mutované alely a přírůstkem na váze. Zvláštní postavení heterozygotů bylo nalezeno rovněž ve studii na 59 Slovinských pacientech, kdy heterozygotní nosiči G2677T/A vykazovali větší tíži extrapyramidových NÚ. Význam polymorfismu G2677T/A pro přírůstek na váze při léčbě risperidonem byl nalezen ve studii Kuzmana a kol. [72]. Otázkou zůstává, proč byl v naší studii tento výsledek signifikantní pouze u heterozygotů. Možné vysvětlení tkví v rozdílné afinitě P-gp k risperidonu a k jeho metabolitu 9-OH risperidonu [88, 93]. Je možné, že přítomnost polymorfismu mění jinak afinitu k risperidonu a jinak k 9-OH-risperidonu. V tom případě by se mezi pacienty s různou náloží nemutované alely lišil i poměr risperidon / 9-OH-risperidon. Zajímavý je v tomto kontextu nález v již citované studii [58], kdy heterozygoti 2677G / 2677T vykazovali nejvyšší poměr risperidon / 9-OH-risperidon [58]. V tomto kontextu je vhodné připomenout, že dle některých srovnání se při léčbě risperidonem vyskytuje přírůstek na váze s vyšší pravděpodobností než při léčbě paliperidonem [61]. U pacientů homozygotních pro wild-type alelu 2677G byla zjištěna výraznější iniciální dysforická reakce. Výraznější nežádoucí účinek (přibírání na váze) u heterozygotů (1 wild-type alela, 1 mutovaná alela) a výraznější nežádoucí účinek ve formě iniciální dysforické reakce u homozygotů s wild-type alelou (2 wild-type kopie) by mohlo naznačovat, že důležitější než přítomnost mutované alely je přítomnost wild-type alely, která vede k vyšší pravděpodobnosti některých NÚ. O potenciálním mechanismu jakým způsobem se tak děje je možno pouze spekulovat. Logická se jeví možnost, že P-gp ovlivňuje střevní absorpci risperidonu a narušená funkčnost této pumpy tedy vede k k nižší dostupnosti risperidonu a méně nežádoucím účinkům. Z literatury však plyne, že P-gp je sice exprimován ve střevním epitelu, ale účinkuje zde jako efluxní pumpa [93, 151] - plně funkční enzym vede k nižší resorpci a naopak nižší dostupnosti risperidonu; je to tedy situace

84 výsledky studie obdobná jako v HEB. Proti výše zmíněné spekulaci také stojí nález vlivu polymorfismů na koncentraci aktivní moiety, která byla v recentní studii vyšší u pacientů s polymorfismem [58]. Dalším z možných vysvětlení nižšího výskytu dysforické reakce u pacientů s mutovanou alelou by tak mohl být efekt alely A. Tento nález by pak byl v souladu s údajem z literatury. Dle některých zdrojů se alela A totiž pojí s vyšší aktivitou P-glykoproteinu [186]. Vyšší aktivita P- gp u pacientů s touto alelou by tedy vedla k omezené permeabilitě HEB a tudíž nižším hladinám aktivní moiety v mozku a menší dysforické reakci. Proti tomuto vysvětlení ale stojí to, že statisticky významný rozdíl v dysforické reakci byl mezi homozygoty s wild-type alelou a homozygoty s mutovanou alelou, mezi kterými nebyl ani jeden pacient s alelou A. Vyvstává otázka, zda je sledovaný efekt polymorfismu 2677G>T/A na hmotnost doprovázený i jinými metabolickými změnami a zda je významný i při dlouhodobé léčbě risperidonem. Vzhledem k tomu, že podobný efekt tohoto polymorfismu na hmotnost nebyl sledován poprvé, jeví se jako vhodný kandidát pro výzkum jeho vlivu na rozvoj metabolických NÚ. Samozřejmě je možné, že nalezený výsledek představuje pouze náhodné zjištění a při rozšíření souboru by efekt nalezen nebyl. Tomu napovídá také již zmíněná nepřítomnost vlivu polymorfismu 2677G>T/A na ú- činnost risperidonu. 4.0.5.2 C3435T (Exon 26) účinnost Největší úbytek symptomů byl zaznamenán u pacientů homozygotních pro nemutovanou alelu C. Nejnižší účinnost pak u heterozygotů C/T. Nejmenší tíže symptomů byla patrná u homozygotů C/C a nejvyšší u heterozygotů C/T. Na konci léčby perzistovaly zejména negativní symptomy. Jinými slovy - pacienti s mutovanou alelou vykazovali nižší účinnost risperidonu. Ve výsledku léčby a tedy množstvím remitujících pacientů, eventuálně pacientů ukončujících léčbu pro neúčinnost, se tento rozdíl neprojevil. Zjištěný výsledek je v rozporu s nálezy recentní studie, která nalezla naopak vyšší účinnost risperidonu u pacientů s mutovanou alelou 3435T [183].

výsledky studie 85 Zajímavé je v tomto ohledu srovnání tíže perzistujících symptomů na konci léčby, resp. úbytku symptomů mezi homozygoty C/C, heterozygoty C/T a homozygoty T/T, kdy nejvyšší tíží perzistujících symptomů, resp. nejmenší ústup symptomů, vykazovali heterozygoti C/T. Mezi účinností a počtem mutovaných alel tedy není jasně patrný vztah. Podobný výsledek má i nedávná Slovinská studie, kdy pacienti heterozygotní pro alelu 3435T měli také nejvyšší tíži symptomů na konci léčby. V tomto ohledu jsou nálezy naší a citované slovinské studie zajímavé ve srovnání s poměrem risperidon / 9-OH-risperidon, které poskytl Jovanovic a kol. (2010) [58]. Ač rozdíly nejsou statisticky významné, je zřejmé, že heterozygoti C/T mají nejvyšší relativní poměr risperidonu k jeho metabolitu. Jak již bylo zmíněno v části o polymorfismu 2677G>T/A, je možné, že polymorfismy nemění afinitu P-gp ke všem substrátům stejně. Dlužno dále podotknout, že k výše zmíněným výsledkům je nutno přistupovat obezřetně, protože byl sice nalezen signifikantní rozdíl při srovnání 2 skupin, nicméně celkový rozdíl mezi skupinami v úbytku symptomů nebyl dle adekvátního testu (Kruskal-Wallis) statisticky významný. Výše uvedený rozdíl tedy nemusí odrážet skutečný vliv polymorfismu C3435T na účinnost risperidonu. snášenlivost Pacienti homozygotní pro wild-type alelu C vykazovali nejnižší frekvenci výskytu psychických nežádoucích účinků (poruchy soustředění, zvýšená únavnost, sedace, poruchy paměti, deprese, tenze, změna doby spánku, změna snové aktivity, emoční apatie), přičemž výskyt těchto NÚ rostl s množstvím alel T. Nejmenší snášenlivost risperidonu tedy vykazovali homozygoti s mutovanou alelou T. Tento výsledek je zcela v souladu s teoretickou představou, že mutace C3435T vede ke snížené expresi aktivního proteinu [151, 154], to vede k lepší prostupnosti léčiva do mozku a tudíž k více NÚ. Je rovněž v souladu s výsledky některých studií nacházejících vyšší výskyt různých NÚ u pacientů s alelou C3435T [71, 152, 58]. Z výsledků je dále patrné zvláštní postavení homozygotů pro wild-type alelu, kteří se ve výskytu psychických nežádoucích účinků (a také ve snášenlivosti léčby) vydělují od ostatních pacientů byt i s jednou alelou T. Dle literatury lze uvažovat o signifikantním ovlivnění aktivity P-gp jen u homozygotů

86 výsledky studie pro nefunkční alelu T [151]. Z našich výsledků ale plyne, že signifikantní efekt může mít již přítomnost jedné mutované alely. Dále je možné že P-gp hraje při léčbě risperidonem důležitou roli i mimo HEB - pravděpodobně při resorpci (je exprimován v epitelu střev), tak ve vylučování (je exprimován v ledvinných tubulech). Nižší funkce P-gp vede ke sníženému pohybu léčiva ven z těla a teoreticky tak vede ke zvýšené hladině léčiva v krvi. Toto bylo experimentálně skutečně prokázáno v jedné z recentních studií, ve které pacienti monozygotní pro alelu T vykazovali nejvyšší hladinu aktivní moiety [58]. Jak již bylo zmíněno v diskuzi o nalezeném efektu CYP2D6 na výsledek léčby, i u polymorfismu C3435T se potýkáme s kontraintuitivním výsledkem. Genetická varianta, která by teoreticky měla vést k vyšší účinnosti (u PM CYP2D6 kvůli defektnímu metabolismu a u C3435T kvůli zvýšené permeabilitě HEB) se ve sledovaném souboru projevuje opačně - pacienti s mutovanou variantou vykazují nižší účinnost risperidonu, přičemž po léčbě přetrvávají zejména negativní symptomy. Pozoruhodné rovněž je, že v obou případech - jak ve skupině PM u CYP2D6, tak u pacientů s alelou 3435T se přitom mutovaná varianta pojí s vyšším výskytem nežádoucích účinků. Jak již bylo diskutováno v části o CYP2D6, je možné, že diskrepance mezi vyšším výskytem NÚ a zjevnou nižší účinnosti může být ve skutečnosti důsledkem podobnosti některých nežádoucích účinků léčby, které jsou mylně škálovány použitou škálou jako příznaky poruchy. Primární by pak byl v případě C3435T vyšší výskyt psychických nežádoucích účinků, které jsou falešně atribuovány jako negativní příznaky. Podrobně je podobnost některých položek PANSS a UKU demonstrována výše (viz 4.0.4.2). Vzhledem k nízkému množství homozygotů pro alelu C je ale rovněž pravděpodobné, že zmíněné výsledky jsou falešně pozitivní a po rozšíření souboru by již nadále nebyly patrné. dávky antipsychotik a komedikace Z výsledků plyne, že pacienti homozygotní pro wild-type alelu užívali průměrně nižší dávky antipsychotik. Tento nález tak podporuje výše popsanou spekulaci o vyšší účinnosti risperidonu u pacientů homozygotních pro nemutovanou alelu

výsledky studie 87 a jistým způsobem také může poskytnout vysvětlení pro vyšší výskyt nežádoucích účinků u pacientů s alelou T. Kauzální souvislost vysvětlující zjištěné výsledky by tak mohla být následující: U homozygotů pro wild-type alelu C je léčba antipsychotiky účinnější než u ostatních, a tudíž tito pacienti užívali nižší dávku antipsychotik. Vyšší dávky antipsychotik u pacientů s alelou T pak vedly k vyššímu rozvoji psychických nežádoucích účinků. I přes vyšší výskyt některých NÚ u pacientů s alelou T nebyly patrny rozdíly ve frekvenci užívané komedikace. V tomto ohledu je tak efekt polymorfismu C3435T omezený. 4.0.5.3 Genotyp, frekvence alel Frekvence alel polymorfismu 2677G>T/A se ve zkoumaném souboru nelišila podstatně od očekávaných frekvencí; stejně tak nebyl nalezen podstatný rozdíl mezi očekávanými frekvencemi alel polymorfismu C3534T [124]. Přestože naše studie nebyla vytvořena za účelem posouzení MDR1 jako genu ovlivňující riziko rozvoje psychotické poruchy, lze tvrdit, že naše výsledky jsou v souladu s dosavadními informacemi [110], které neprokázaly, že by se polymorfismy MDR1 uplatňovaly jako geny náchylnosti ke schizofrenii. 4.0.6 Možné interakce mezi CYP2D6 a MDR1 Při zpracování dat byly analýzy provedeny zvlášt pro CYP2D6 a pro každý z polymorfismů MDR1. S dostupnou velikostí souboru nebylo možno provést analýzy, které by braly v úvahu různé konfigurace sledovaných alel a tím umožňovaly nahlédnout na možné interakce mezi jednotlivými geny. Inkonzistentní výsledky dostupných studií napovídají, že neexistuje jeden gen, který by měl masivní efekt na účinnost nebo snášenlivost risperidonu. Roli pravděpodobně hraje více genů a jejich vzájemné interakce. Autoři recentní studie kupříkladu referovali o tom, že koncentrace aktivní moiety nezávisí pouze na aktivitě CYP2D6, ale také na přítomnosti polymorfismu C3435T [58]. Vzhledem k rozdílnému poměru risperidon / 9-OH-risperidon u pacientů s různou aktivitou CYP2D6 [13, 53, 87] a rozdílné afinitě P-gp k risperidonu a 9-OH-risperidonu [41] je

88 výsledky studie rovněž pravděpodobné, že u různých CYP2D6 metabolizátorů mají polymorfismy MDR1 genu různý význam. K podrobnému výzkumu těchto možností ale bude třeba studií na mnohem větším množství subjektů. 4.0.7 Limitace studie velikost souboru Nejvýznamnější limitace je malá velikost souboru. Mnoho výsledků dosáhlo pouze hraniční statistické významnosti a mohou představovat pouze náhodný nález. Žádoucí by bylo rozšíření souboru, což je v prostředí jediného pracoviště obtížné. farmakokinetické parametry Během studie nebyly sledovány farmakokinetické parametry jako hladina risperidonu a jeho metabolitu, což je u studie zaměřené na variabilitu faktorů ovlivňujících farmakokinetiku léčiv, vnímano jako výrazná nevýhoda. Nepřítomnost údajů o hladinách léčiva značně komplikuje potenciální interpretaci klinických nálezů. pacienti Do studie byli zařazeni pacienti s prvním propuknutím psychotické symptomatologie. U řady z nich byla diagnostikována akutní schizoformní psychotická porucha. Na místě je tedy výtka, zda výsledky studie nejsou ovlivněny selekčním bias. K tomuto problému je však třeba dodat, že u všech pacientů se vyskytovaly příznaky prvního řádu schizofrenie. Pacienti, u kterých byla diagnostikována akutní schizoformní porucha, byli diagnostikováni zcela v souladu s diagnostickými kritérii, nebot u nich došlo k ústupu symptomů do 4 týdnů od propuknutí poruchy. K ústupu symptomů však došlo při léčbě risperidonem a je pravděpodobné, že bez terapie by symptomy trvaly déle a i tito pacienti by splnili diagnostická kritéria pro schizofrenii. omezená kontrola faktorů prostředí Tato studie byla naturalistická, probíhala za nezměněného léčebného režimu. Kontrola enviromentálních faktorů byla omezená. U pacientů také byla relativně často podávána komedikace. Jiná léčiva podávána během sledování mohla vést k nespecifickým interakcím a modifikacím efektu risperi-

4.1 výsledky studie - závěr 89 donu. Rozdíly v dávkách risperidonu a užívané komedikace také znesnadňovaly další statistickou analýzu dat a generalizaci výsledků. omezená délka sledování Pacienti byli sledovaní pouze po dobu léčby risperidonem za akutní hospitalizace. Jakékoliv zjištěné výsledky je tak možno zobecnit pouze na toto období. Jejich vztažení na dlouhodobou léčbu schizofrenie je z těchto důvodů sporné. 4.1 výsledky studie - závěr V naší studii vykazovali pacienti s předpokládaným defektním CYP2D6 metabolismem léčení risperidonem signifikantně nižší redukci příznaků schizofrenie, vyšší tíži psychotických symptomů, zejména negativních a obecných, na konci léčby a vyšší dávky antipsychotik nemetabolizovaných CYP2D6. Na základě těchto výsledku se pomalí metabolizátoři s první epizodou psychotické poruchy nejeví být optimálními k nasazení risperidonu. Je pravděpodobné, že u těchto pacientů by léčba antipsychotiky nemetabolizovanými CYP2D6 vedla k příznivějším výsledkům. Ze zkoumaných polymorfismů genu MDR1 se jako významnější faktor jeví být polymorfismus C3435T. U pacientů bez mutované alely došlo k výraznějšímu ústupu psychotických symptomů a k méně psychickým nežádoucím účinkům. Naproti tomu polymorfismus 2677G>T/A měl v naší studii pouze omezený vliv na rozvoj iniciální dysforické reakce a přírůstek na váze. Tento polymorfismus tak může být slibný zejména pro výzkum rozvoje metabolických nežádoucích účinků. Ze sledovaných faktorů tedy měly největší vliv na účinnost a snášenlivost risperidonu mutace v genu CYP2D6 a polymorfismus C3435T. Jako optimální recipienti terapie risperidonem se jeví být pacienti bez defektního metabolismu CYP2D6 a bez polymorfismu C3435T. K nálezům této studie je však nutno přistupovat opatrně; mnoho výsledků dosáhlo pouze hraniční statistické významnosti, velikost souboru nebyla dostatečná a neumožňovala komplexnější analýzy, které by braly v úvahu i rozdílné konfigurace sledovaných genetických variant. Problémem byla rovněž nízká kontrola enviromentálních faktorů a komedikace, která mohla výsledky

90 výsledky studie ovlivnit. Důležitým nedostatkem také bylo to, že v průběhu studie nebyly měřeny hladiny risperidonu a jeho metabolitu, což komplikovalo interpretaci výsledků. Bude tak nutná replikace na větším souboru a za lépe kontrolovaných podmínek, aby bylo možno skutečně posoudit vliv variability CYP2D6 a MDR1 na účinnost a snášenlivost terapie risperidonem u pacientů s první epizodou schizofrenie. 4.2 farmakogenetické testování v psychiatrii v širším kontextu S narůstajícími znalostmi o lidském genomu se zvyšovala také naděje, že tyto informace povedou k rychlé změně v lékařské péči [23]. Jednou z takovýchto změn měla být právě personalizovaná léčba na základě genetických informací [38]. Psychiatrie se jevila jako optimální obor k implementaci farmakogenetického testování [80]. Vyhlídky, že zmapování lidského genomu povede k okamžitým změnám, nebo alespoň změnám v krátkém horizontu, se ale ukázaly být lichými [78]. Projekt lidského genomu sice znamenal revoluci, ukázal se však být pouze prvním krokem na daleko delší cestě. To lze demonstrovat právě na farmakogenetickém výzkumu, který konkrétně v psychiatrii přinesl zatím rozporné výsledky, jak bylo ukázáno při srovnání výsledků dostupných studií týkajících se CYP2D6 a MDR1 (viz str. 38 resp. str. 48). Jak lze demonstrovat na stati věnované limitacím naší studie (viz sekce 4.0.7) značným problémem farmakogenetických studií je velikost souboru. Z dosavadních studií se nejeví, že by zkoumané polymorfismy většinou vykazovaly natolik výrazný efekt na účinnost nebo snášenlivost psychofarmak, aby bylo v možnostech jednoho pracoviště získat dostatečně velký soubor k průkazu jejich efektu v akceptovatelném čase. 1 To se týká studií kandidátních genů a o to více i studií GWAS, kde jsou požadavky na veli- 1 Jako příklad vezměme hodnoty ústupu PANSS při léčbě antipsychotiky z naší studie. Pokud bychom měli dosáhnout akceptovatelné síly studie (0.8) při použití parametrických testů (t-testu) při 2 skupinách pacientů, musela by každá skupina obsahovat minimálně 64 pacientů, celkem tedy 128 pacientů. Z jiného úhlu pohledu: Pokud jako příklad vezmeme CYP2D6 data za naší studie, pak při počtu pacientů, které jsme byli schopni rekrutovat na jednom pracovišti za 3 roky (n = 35), kdy bylo zachyceno 5 pacientů PM, jsme schopni dosáhnout akcepto-

4.2 farmakogenetické testování v psychiatrii v širším kontextu 91 kost souborů ještě větší [181]. Jednou z možností, jak tento problém řešit, je širší spolupráce více pracovišt, jako příklad mezinárodní spolupráce více pracovišt na solitárním úkolu v oboru neurověd lze uvést příklad konzorcia ENIGMA zaměřené na hledání souvislostí mezi výsledky zobrazovacích a genetických metod [39]. I přesto, že počet genů v lidském genomu se ukázal být menší než se předpokládalo (30 000 genů oproti předpokládaným 100 000) [167] farmakogenetický výzkum tím není výrazně usnadněn. Tento počet totiž znamená několik miliónů možných variací včetně 9 milionů SNP [134]. Další komplikací, zejména přístupu kandidátních genů je, že funkce velké části genů je zatím neznámá [133]. Mnoho genů navíc může ovlivňovat funkce jiných genů nebo mít různý význam v přítomnosti odlišných genetických variant, což může nadále snižovat výpovědní hodnotu studií kandidátních genů. Některé z těchto problémů, zejména množství možných genetických variant, mají řešit GWAS studie, které si ale nesou své vlastní metodologické výzvy (viz sekce 1.3.2.1). Dále může být pro farmakogenetický výzkum omezující současné soustředění se na SNP a jisté zanedbávání jiných druhů genetických variant jako copy number variations (CNV) [132] s možným vlivem na reaktivitu na léčbu psychofarmaky [121, 55] a další jako například polymorfismy mikrosatelitů, translokace, inverze, substituce [25]. A konečně - nedávné výsledky naznačují, že význam pro reaktivitu na léčbu může mít i epigenetika [182]. Další generace farmakogenetických studií by měly zohlednit všechny výše zmíněné komplikace. Farmakogenetika tedy nemůže být považován za obor bez budoucnosti a výzkum v tomto odvětví poskytuje dostatečný prostor pro různé metodologické inovace. vatelné síly studie pouze pokud bude rozdíl mezi skupinami v ústupu PANSS větší než 22.27.

S H R N U T Í A Z ÁV Ě R 5 Vize personalizované farmakoterapie se v posledních letech těší značnému zájmu. Personalizace farmakoterapie by mohla vést k větší úspěšnosti léčby, snížení incidence a tíže nežádoucích účinků, ke zkrácení hospitalizace a v širším měřítku ke snížení nákladů na léčbu. Vzhledem k tomu, že farmakoterapie je hlavní modalitou léčby v psychiatrii, představuje personalizovaná psychofarmakoterapie nadějný předmět zájmu. Hlavní proud výzkumu se v této oblasti zaměřuje na výzkum genetických prediktorů odpovědi na léčbu. Tento obor, farmakogenetika, vznikl na konci 50. let 20. století jako obor zkoumající dědičnost reakce na léčiva, v té době na podkladě variability v enzymech metabolizujících xenobiotika. Technologie té doby totiž umožňovala měřit hladiny léčiv a jejich metabolitů. Teprve později, s rozvojem metod molekulární genetiky, se výzkum začal soustředit také na jiné geny, zejména geny pro cílové terapeutické struktury. Cílem farmakogenetiky je nalézt takové genetické markery, které by predikovaly výsledek léčby a tyto informace by pak umožnily adekvátně změnit terapeutický plán. V současném farmakogenetickém výzkumu jednoznačně dominují metody molekulární genetiky - genotypizace. Kromě metody kandidátních genů, který zkoumá vliv omezeného množství genů, se v posledních letech rozvíjejí i celo-genomové asociační studie, které umožňují zkoumat až tisíce možných genetických variant. Přímá fenotypizace, kterou byl farmakogenetický výzkum v minulém století nastartován, je v současnosti minoritní. Fenotypizace enzymů metabolizujících xenobiotika však stále může mít svůj význam, nebot umožňuje vzít v úvahu také některé vlivy prostředí, zejména vliv užívané komedikace, která potenciálně interferuje s metabolismem podávaného léku, a tak ovlivňuje jeho účinnost. Pravděpodobný příklad takové fenotypické konverze s klinickými důsledky byl prezentován výše v kazuistice. 93

94 literatura Psychofarmakon musí od místa své resorpce k místu svého terapeutického působení překonat několik překážek: lék je metabolizován, musí prostupovat skrz tkáňové bariéry, zejména pak musí prostoupit do sekvestrované oblasti - do mozku - která je chráněná hematoencefalickou bariérou. Je zde tedy řada faktorů, které mohou ovlivňovat účinnost a snášenlivost psychofarmaka a každý z těchto faktorů může být cílem farmakogenetického výzkumu. V současnosti se tedy výzkum soustředí na geny kódující enzymy metabolizující léčiva (zejména systém Cytochromu P-450), proteiny ovlivňující prostupnost skrz tkáňové bariéry (zejména P-glykoprotein) a terapeutické cílové struktury (zejména receptory). V naší studii jsme se zaměřili na 2 geny, jejichž produkty mají vliv na farmakokinetiku risperidonu - CYP2D6 kódující enzym metabolizující risperidon a MDR1 kódující P-gp, který je důležitý v permeaci některých xenobiotik skrz tkáňové bariéry, mimo jiné i skrz hematoencefalickou bariéru. Konkrétněji bylo cílem studie prozkoumat vliv aktivity CYP2D6 odvozené z genotypu a dvou polymorfismů genu MDR1 (2677G>T/A a C3435T) na účinnost a snášenlivost risperidonu v terapii prvních epizod psychóz. Dle výsledků naší studie se jako důležitější faktor ovlivňující účinnost a snášenlivost risperidonu jeví CYP2D6. Pomalí metabolizátoři CYP2D6 podle výsledků nejsou optimálními kandidáty pro léčbu risperidonem, nebot vykazují menší ústup symptomů při léčbě risperidonem a větší incidenci nežádoucích účinků. Podobně menší účinnost a více nežádoucích účinků vykazují také pacienti s mutovanou alelou C3435T. Polymorfismus 2677G>T/A se pak jeví jako faktor, který může být důležitý v rozvoji přírůstku na váze. Závěrem lze říci, že geny pro CYP2D6 a MDR1 jsou možné potenciální faktory ovlivňující výsledek léčby risperidonem u pacientů s první epizodou schizofrenie. Rozhodně ale nejsou jedinými faktory, které vysvětlují plný rozsah variability odpovědi na léčbu antipsychotiky. Studie ukázala, že farmakogenetický výzkum schizofrenie je v našich podmínkách sice proveditelný, ale zároveň poukázala na metodologické problémy, které by měly být v následujících studiích řešeny, zejména se to týká velikosti souboru, měření hladin léčiv a kontroly enviromentálních faktorů a komedikace.

L I T E R AT U R A [1] A. Albrecht, P. G. Morena, P. Baumann, and C. B. Eap. High dose of depot risperidone in a nonresponder schizophrenic patient. J Clin Psychopharmacol, 24(6):673 4, 2004. (Citováno na straně 38.) [2] S. G. Aller, J. Yu, A. Ward, Y. Weng, S. Chittaboina, R. Zhuo, P. M. Harrell, Y. T. Trinh, Q. Zhang, I. L. Urbatsch, and G. Chang. Structure of p-glycoprotein reveals a molecular basis for poly-specific drug binding. Science, 323(5922):1718 1722, Mar 2009. (Citováno na straně 43.) [3] S. Alvarez, S. Mas, P. Gasso, M. Bernardo, E. Parellada, and A. Lafuente. Lack of association between schizophrenia and polymorphisms in dopamine metabolism and transport genes. Fundam Clin Pharmacol, 24(6):741 747, Dec 2010. (Citováno na straně 82.) [4] M. M. Ameyaw, F. Regateiro, T. Li, X. Liu, M. Tariq, A. Mobarek, N. Thornton, G. O. Folayan, J. Githang a, A. Indalo, D. Ofori-Adjei, D. A. Price- Evans, and H. L. McLeod. Mdr1 pharmacogenetics: frequency of the c3435t mutation in exon 26 is significantly influenced by ethnicity. Pharmacogenetics, 11(3):217 221, Apr 2001. (Citováno na straně 46.) [5] N. C. Andreasen, W. T. Carpenter, J. M. Kane, R.t A. Lasser, S. R. Marder, and D. R. Weinberger. Remission in schizophrenia: proposed criteria and rationale for consensus. Am J Psychiatry, 162(3):441 449, Mar 2005. (Citováno na straně 62.) [6] M. Aravagiri, S. R. Marder, K. H. Nuechterlein, and M. J. Gitlin. Intra- and interindividual variations in steady-state plasma concentrations of risperidone and 9-hydroxyrisperidone in schizophrenic patients treated chronically with various doses of risperidone. Ther Drug Monit, 25(6):657 664, Dec 2003. (Citováno na straně 79.) 95

96 literatura [7] M. J. Arranz and J. de Leon. Pharmacogenetics and pharmacogenomics of schizophrenia: a review of last decade of research. Mol Psychiatry, 12(8):707 747, Aug 2007. (Citováno na stranách 7, 8, 15, 16, and 31.) [8] J. van Asperen, O. van Tellingen, A. Sparreboom, A. H. Schinkel, P. Borst, W. J. Nooijen, and J. H. Beijnen. Enhanced oral bioavailability of paclitaxel in mice treated with the p-glycoprotein blocker sdz psc 833. Br J Cancer, 76(9):1181 1183, 1997. (Citováno na straně 45.) [9] A. G. Awad. Subjective response to neuroleptics in schizophrenia. Schizophr Bull, 19(3):609 618, 1993. (Citováno na straně 63.) [10] R. Barteček. Scientologie a psychiatrie. Psychiatr. praxi (Print), 11(1):3 3, 2010. (Citováno na straně 4.) [11] B. Bauer, A. M. S. Hartz, G. Fricker, and D. S. Miller. Modulation of p-glycoprotein transport function at the blood-brain barrier. Exp Biol Med (Maywood), 230(2):118 127, Feb 2005. (Citováno na straně 42.) [12] D. J. Begley. Abc transporters and the blood-brain barrier. Curr Pharm Des, 10(12):1295 1312, 2004. (Citováno na straně 43.) [13] R. Berecz, A. LLerena, A. de la Rubia, J. Gomez, M. Kellermann, P. Dorado, and I. Degrell. Relationship between risperidone and 9-hydroxy-risperidone plasma concentrations and CYP2D6 enzyme activity in psychiatric patients. Pharmacopsychiatry, 35(6):231 4, 2002. (Citováno na stranách 37 and 87.) [14] S. Borges, L. Li, M. A. Hamman, D. R. Jones, S. D. Hall, and J. C. Gorski. Dextromethorphan to dextrorphan urinary metabolic ratio does not reflect dextromethorphan oral clearance. Drug Metab Dispos, 33(7):1052 5, 2005. (Citováno na straně 12.) [15] J. A. Bork, T. Rogers, P. J. Wedlund, and J. de Leon. A pilot study on risperidone metabolism: the role of cytochromes P450 2D6 and 3A. J Clin Psychiatry, 60(7):469 76, 1999. (Citováno na stranách 38 and 80.)

literatura 97 [16] D. W. Boulton, C. L. DeVane, H. L. Liston, and J. S. Markowitz. In vitro p-glycoprotein affinity for atypical and conventional antipsychotics. Life Sci, 71(2):163 169, May 2002. in vitro study. (Citováno na straně 47.) [17] F. Broly, D. Marez, N. Sabbagh, M. Legrand, S. Millecamps, J. M. Lo Guidice, P. Boone, and U. A. Meyer. An efficient strategy for detection of known and new mutations of the CYP2D6 gene using single strand conformation polymorphism analysis. Pharmacogenetics, 5(6):373 84, 1995. (Citováno na straně 34.) [18] I. Cascorbi, T. Gerloff, A. Johne, C. Meisel, S. Hoffmeyer, M. Schwab, E. Schaeffeler, M. Eichelbaum, U. Brinkmann, and I. Roots. Frequency of single nucleotide polymorphisms in the p-glycoprotein drug transporter mdr1 gene in white subjects. Clin Pharmacol Ther, 69(3):169 174, Mar 2001. (Citováno na straně 63.) [19] S. Chainuvati, A. N. Nafziger, J. S. Leeder, A. G., G. L Kearns, E. Sellers, Y. Zhang, A. D. M. Kashuba, E. Rowland, and J. S. Bertino. Combined phenotypic assessment of cytochrome p450 1a2, 2c9, 2c19, 2d6, and 3a, n-acetyltransferase-2, and xanthine oxidase activities with the "cooperstown 5+1 cocktail". Clin Pharmacol Ther, 74(5):437 447, Nov 2003. (Citováno na stranách 12 and 15.) [20] C. J. Chen, D. Clark, K. Ueda, I. Pastan, M. M. Gottesman, and I. B. Roninson. Genomic organization of the human multidrug resistance (mdr1) gene and origin of p-glycoproteins. J Biol Chem, 265(1):506 514, Jan 1990. (Citováno na straně 45.) [21] E. F. Choo, B. Leake, C. Wandel, H. Imamura, A. J. Wood, G. R. Wilkinson, and R. B. Kim. Pharmacological inhibition of p-glycoprotein transport enhances the distribution of hiv-1 protease inhibitors into brain and testes. Drug Metab Dispos, 28(6):655 660, Jun 2000. (Citováno na straně 43.) [22] N. A. Colabufo, F. Berardi, M. Cantore, M. Contino, C. Inglese, M. Niso, and R. Perrone. Perspecti-

98 literatura ves of p-glycoprotein modulating agents in oncology and neurodegenerative diseases: pharmaceutical, biological, and diagnostic potentials. J Med Chem, 53(5):1883 1897, Mar 2010. (Citováno na straně 43.) [23] F. S. Collins, E. D. Green, A. E. Guttmacher, M. S. Guyer, and U. S. National Human Genome Research Institute. A vision for the future of genomics research. Nature, 422(6934):835 847, Apr 2003. (Citováno na straně 90.) [24] R. R. Conley and R. W. Buchanan. Evaluation of treatment-resistant schizophrenia. Schizophr Bull, 23(4):663 674, 1997. (Citováno na straně 20.) [25] M. H. Court. A pharmacogenomics primer. J Clin Pharmacol, 47(9):1087 1103, Sep 2007. (Citováno na straně 91.) [26] W. H. Crown, S. Finkelstein, E. R. Berndt, D. Ling, A. W. Poret, A. J. Rush, and J. M. Russell. The impact of treatment-resistant depression on health care utilization and costs. J Clin Psychiatry, 63(11):963 971, Nov 2002. (Citováno na straně 20.) [27] M. L. Dahl. Cytochrome p450 phenotyping/genotyping in patients receiving antipsychotics: useful aid to prescribing? Clin Pharmacokinet, 41(7):453 70, 2002. (Citováno na straně 11.) [28] A. Daly, A.K. Steward. Use of the expand long template pcr system in genotyping for polymorphisms in the human cytochrome p450 cyp2d6 gene. Biochemica, 4:31 32, 1995. (Citováno na straně 63.) [29] J. Daniels, J. Williams, P. Asherson, P. McGuffin, and M. Owen. No association between schizophrenia and polymorphisms within the genes for debrisoquine 4- hydroxylase (CYP2D6) and the dopamine transporter (DAT). Am J Med Genet, 60(1):85 7, 1995. (Citováno na straně 82.) [30] E. Dawson, J. F. Powell, M. M. Nothen, M. A. Crocq, M. Lanczik, J. Korner, M. Rietschel, J. van Os, P. Wright, and M. Gill. An association study of debrisoquine hydroxylase (CYP2D6) polymorphisms in

literatura 99 schizophrenia. Psychiatr Genet, 4(4):215 8, 1994. (Citováno na straně 82.) [31] Division of Clinical Pharmacology, Indiana University Department of Medicine. Drug interaction table. http://medicine.iupui.edu/clinpharm/ddis/table.aspx. (Citováno na stranách 34, 35, and 69.) [32] P. Dorado, E. M. Penas-Lledo, and A. Llerena. Cyp2d6 polymorphism: implications for antipsychotic drug response, schizophrenia and personality traits. Pharmacogenomics, 8(11):1597 1608, Nov 2007. (Citováno na straně 82.) [33] A. Doran, R. S. Obach, B. J. Smith, N. A. Hosea, and S. Becker et al. The impact of p-glycoprotein on the disposition of drugs targeted for indications of the central nervous system: evaluation using the mdr1a/1b knockout mouse model. Drug Metab Dispos, 33(1):165 174, Jan 2005. animal study. (Citováno na straně 47.) [34] DrugBank. Methotrimeprazine (DB01403). http://www.drugbank.ca/drugs/db01403. (Citováno na stranách 35 and 56.) [35] Fabien Dutheil, Philippe Beaune, and Marie-Anne Loriot. Xenobiotic metabolizing enzymes in the central nervous system: Contribution of cytochrome p450 enzymes in normal and pathological human brain. Biochimie, 90(3):426 436, Mar 2008. (Citováno na straně 80.) [36] P. D. W. Eckford and F. J. Sharom. Abc efflux pumpbased resistance to chemotherapy drugs. Chem Rev, 109(7):2989 3011, Jul 2009. (Citováno na straně 43.) [37] T. B. Ejsing, A. D. Pedersen, and K. Linnet. P- glycoprotein interaction with risperidone and 9-ohrisperidone studied in vitro, in knock-out mice and in drug-drug interaction experiments. Hum Psychopharmacol, 20(7):493 500, Oct 2005. in vitro and animal study. (Citováno na stranách 43 and 47.) [38] J. Emery and S. Hayflick. The challenge of integrating genetic medicine into primary care. BMJ,

100 literatura 322(7293):1027 1030, Apr 2001. (Citováno na stranách 8 and 90.) [39] Enigma Consortium. Enigma. http://enigma.loni.ucla.edu/. (Citováno na straně 91.) [40] S. M. Essock, W. A. Hargreaves, N. H. Covell, and J. Goethe. Clozapine s effectiveness for patients in state hospitals: results from a randomized trial. Psychopharmacol Bull, 32(4):683 697, 1996. (Citováno na straně 20.) [41] B. Feng, J. B. Mills, R. E. Davidson, R. J. Mireles, J. S. Janiszewski, M. D. Troutman, and S. M. de Morais. In vitro p-glycoprotein assays to predict the in vivo interactions of p-glycoprotein with drugs in the central nervous system. Drug Metab Dispos, 36(2):268 275, Feb 2008. in vitro study. (Citováno na stranách 30, 47, and 87.) [42] N. Fleeman, C. McLeod, A. Bagust, S. Beale, A. Boland, Y. Dundar, A. Jorgensen, K. Payne, M. Pirmohamed, S. Pushpakom, T. Walley, P. de Warren-Penny, and R. Dickson. The clinical effectiveness and costeffectiveness of testing for cytochrome P450 polymorphisms in patients with schizophrenia treated with antipsychotics: a systematic review and economic evaluation. Health Technol Assess, 14(3):1 157, iii, 2010. (Citováno na stranách 15, 22, 23, 28, 31, 32, 33, and 40.) [43] J. M. Ford and W. N. Hait. Pharmacology of drugs that alter multidrug resistance in cancer. Pharmacol Rev, 42(3):155 199, Sep 1990. (Citováno na straně 44.) [44] K. N. Fountoulakis. Refractoriness in bipolar disorder: definitions and evidence-based treatment. CNS Neurosci Ther, 18(3):227 237, Mar 2012. (Citováno na straně 20.) [45] M. F. Fromm. Genetically determined differences in p-glycoprotein function: implications for disease risk. Toxicology, 181-182:299 303, Dec 2002. (Citováno na straně 45.)

literatura 101 [46] Genelex. P-glycoprotein (PGP) table - drug metabolism. http://www.genemedrx.com/pgptable.php. (Citováno na straně 69.) [47] Inc. Genomas. Genomas, inc. http://www.genomas.net/phyziotype-hilomet.php, 7 2012. (Citováno na straně 26.) [48] A. Gunes, E. Spina, M. Dahl, and M. G. Scordo. Abcb1 polymorphisms influence steady-state plasma levels of 9-hydroxyrisperidone and risperidone active moiety. Ther Drug Monit, 30(5):628 633, Oct 2008. study. (Citováno na stranách 48 and 49.) [49] C. Guzey, T. Aamo, and O. Spigset. Risperidone metabolism and the impact of being a cytochrome p450 2d6 ultrarapid metabolizer. J Clin Psychiatry, 61(8):600 601, Aug 2000. (Citováno na straně 38.) [50] M. Heim and U. A. Meyer. Genotyping of poor metabolisers of debrisoquine by allele-specific PCR amplification. Lancet, 336(8714):529 32, 1990. (Citováno na straně 34.) [51] G. Honigfeld, F. Arellano, J. Sethi, A. Bianchini, and J. Schein. Reducing clozapine-related morbidity and mortality: 5 years of experience with the clozaril national registry. J Clin Psychiatry, 59 Suppl 3:3 7, 1998. (Citováno na straně 26.) [52] O. Y. Hu, H. S. Tang, H. Y. Lane, W. H. Chang, and T. M. Hu. Novel single-point plasma or saliva dextromethorphan method for determining cyp2d6 activity. J Pharmacol Exp Ther, 285(3):955 960, Jun 1998. (Citováno na straně 12.) [53] M. L. Huang, A. Van Peer, R. Woestenborghs, R. De Coster, J. Heykants, A. A. Jansen, Z. Zylicz, H. W. Visscher, and J. H. Jonkman. Pharmacokinetics of the novel antipsychotic agent risperidone and the prolactin response in healthy subjects. Clin Pharmacol Ther, 54(3):257 68, 1993. (Citováno na stranách 37, 38, and 87.)

102 literatura [54] M. Ingelman-Sundberg. Genetic polymorphisms of cytochrome p450 2d6 (cyp2d6): clinical consequences, evolutionary aspects and functional diversity. Pharmacogenomics J, 5(1):6 13, 2005. (Citováno na straně 69.) [55] M. Ingelman-Sundberg, S. C. Sim, A. Gomez, and C. Rodriguez-Antona. Influence of cytochrome p450 polymorphisms on drug therapies: pharmacogenetic, pharmacoepigenetic and clinical aspects. Pharmacol Ther, 116(3):496 526, Dec 2007. (Citováno na straně 91.) [56] K. Jamroziak, E. Balcerczak, K. Calka, S. Piaskowski, H. Urbanska-Rys, A. Salagacka, M. Mirowski, and T. Robak. Polymorphisms and haplotypes in the multidrug resistance 1 gene (mdr1/abcb1) and risk of multiple myeloma. Leuk Res, 33(2):332 335, Feb 2009. (Citováno na straně 46.) [57] Janssen Pharmaceuticals. Risperdal, 2003. Prescribing information. (Citováno na stranách 28 and 29.) [58] N. Jovanovic, N. Bozina, M. Lovric, V. Medved, M. Jakovljevic, and A. M. Peles. The role of cyp2d6 and abcb1 pharmacogenetics in drug-naăżve patients with first-episode schizophrenia treated with risperidone. Eur J Clin Pharmacol, 66(11):1109 1117, Nov 2010. study. (Citováno na stranách 48, 49, 82, 83, 84, 85, 86, and 87.) [59] R. L. Juliano and V. Ling. A surface glycoprotein modulating drug permeability in chinese hamster ovary cell mutants. Biochim Biophys Acta, 455(1):152 162, Nov 1976. (Citováno na straně 42.) [60] S. Kakihara, R. Yoshimura, K. Shinkai, C. Matsumoto, M. Goto, K. Kaji, Y. Yamada, N. Ueda, O. Ohmori, and J. Nakamura. Prediction of response to risperidone treatment with respect to plasma concencentrations of risperidone, catecholamine metabolites, and polymorphism of cytochrome P450 2D6. Int Clin Psychopharmacol, 20(2):71 8, 2005. (Citováno na straně 38.)

literatura 103 [61] J. Kantrowitz and L. Citrome. Paliperidone: the evidence of its therapeutic value in schizophrenia. Core Evid, 2(4):261 271, 2008. (Citováno na straně 83.) [62] S. Kapur, R. B. Zipursky, and G. Remington. Clinical and theoretical implications of 5-ht2 and d2 receptor occupancy of clozapine, risperidone, and olanzapine in schizophrenia. Am J Psychiatry, 156(2):286 293, Feb 1999. (Citováno na straně 80.) [63] M. Kastelic, J. Koprivsek, B. K. Plesnicar, A. Serretti, L. Mandelli, I. Locatelli, I. Grabnar, and V. Dolzan. Mdr1 gene polymorphisms and response to acute risperidone treatment. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 34(2):387 392, Mar 2010. study. (Citováno na stranách 48, 49, and 82.) [64] S. R. Kay, A. Fiszbein, and L. A. Opler. The positive and negative syndrome scale (panss) for schizophrenia. Schizophr Bull, 13(2):261 276, 1987. (Citováno na straně 62.) [65] K. A. Kim, P. W. Park, K. H. Liu, K. B. Kim, H. J. Lee, J. G. Shin, and J. Y. Park. Effect of rifampin, an inducer of cyp3a and p-glycoprotein, on the pharmacokinetics of risperidone. J Clin Pharmacol, 48(1):66 72, Jan 2008. study on volunteers. (Citováno na stranách 44 and 47.) [66] R. B. Kim, B. F. Leake, E. F. Choo, G. K. Dresser, S. V. Kubba, U. I. Schwarz, A. Taylor, H. G. Xie, J. McKinsey, S. Zhou, L. B. Lan, J. D. Schuetz, E. G. Schuetz, and G. R. Wilkinson. Identification of functionally variant mdr1 alleles among european americans and african americans. Clin Pharmacol Ther, 70(2):189 199, Aug 2001. (Citováno na stranách 45 and 46.) [67] C. Kimchi-Sarfaty, J. Mi Oh, I. W. Kim, Z. E. Sauna, A. M. Calcagno, S. V. Ambudkar, and M. M. Gottesman. A "silent"polymorphism in the mdr1 gene changes substrate specificity. Science, 315(5811):525 528, Jan 2007. (Citováno na straně 42.) [68] K. M. Kirschbaum, S. Henken, C. Hiemke, and U. Schmitt. Pharmacodynamic consequences of p-

104 literatura glycoprotein-dependent pharmacokinetics of risperidone and haloperidol in mice. Behav Brain Res, 188(2):298 303, Apr 2008. animal study. (Citováno na straně 47.) [69] F. B. Kohlrausch, C. S Gama, M. I. Lobato, P. Belmonte de Abreu, A. Gesteira, F. Barros, A. Carracedo, and M. H. Hutz. Molecular diversity at the cyp2d6 locus in healthy and schizophrenic southern brazilians. Pharmacogenomics, 10(9):1457 1466, Sep 2009. (Citováno na straně 82.) [70] M. D. Kohnke, E. U. Griese, D. Stosser, I. Gaertner, and G. Barth. Cytochrome P450 2D6 deficiency and its clinical relevance in a patient treated with risperidone. Pharmacopsychiatry, 35(3):116 8, 2002. (Citováno na stranách 39 and 56.) [71] M. R. Kuzman, V. Medved, N. Bozina, J. GrubiĹAin, N. Jovanovic, and J. Sertic. Association study of mdr1 and 5-ht2c genetic polymorphisms and antipsychotic-induced metabolic disturbances in female patients with schizophrenia. Pharmacogenomics J, 11(1):35 44, Feb 2011. study. (Citováno na stranách 49 and 85.) [72] M. R. Kuzman, V. Medved, N. Bozina, L. Hotujac, I. Sain, and H. Bilusic. The influence of 5-ht(2c) and mdr1 genetic polymorphisms on antipsychoticinduced weight gain in female schizophrenic patients. Psychiatry Res, 160(3):308 315, Sep 2008. study. (Citováno na stranách 48, 49, and 83.) [73] B. Laika, S. Leucht, S. Heres, and W. Steimer. Intermediate metabolizer: increased side effects in psychoactive drug therapy. The key to cost-effectiveness of pretreatment CYP2D6 screening? Pharmacogenomics J, 9(6):395 403, 2009. (Citováno na stranách 33, 39, 41, 53, 79, and 80.) [74] G. Laje and F. J. McMahon. Genome-wide association studies of antidepressant outcome: a brief review. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 35(7):1553 1557, Aug 2011. (Citováno na stranách 11 and 19.)

literatura 105 [75] C. Lavedan, L. Licamele, S. Volpi, J. Hamilton, C. Heaton, K. Mack, R. Lannan, A. Thompson, C. D. Wolfgang, and M. H. Polymeropoulos. Association of the npas3 gene and five other loci with response to the antipsychotic iloperidone identified in a whole genome association study. Mol Psychiatry, 14(8):804 819, Aug 2009. (Citováno na straně 27.) [76] C. Lavedan, S. Volpi, M. H. Polymeropoulos, and C. D. Wolfgang. Effect of a ciliary neurotrophic factor polymorphism on schizophrenia symptom improvement in an iloperidone clinical trial. Pharmacogenomics, 9(3):289 301, Mar 2008. (Citováno na straně 27.) [77] H. E. Lehmann and T. A. Ban. The history of the psychopharmacology of schizophrenia. Can J Psychiatry, 42(2):152 162, Mar 1997. (Citováno na straně 3.) [78] J. de Leon. The future (or lack of future) of personalized prescription in psychiatry. Pharmacol Res, 59(2):81 89, Feb 2009. (Citováno na stranách 23, 24, and 90.) [79] J. de Leon. Pharmacogenomics: the promise of personalized medicine for cns disorders. Neuropsychopharmacology, 34(1):159 172, Jan 2009. (Citováno na stranách 8, 24, 25, 26, 27, 28, and 34.) [80] J. de Leon, S. C. Armstrong, and K. L. Cozza. Clinical guidelines for psychiatrists for the use of pharmacogenetic testing for cyp450 2d6 and cyp450 2c19. Psychosomatics, 47(1):75 85, 2006. (Citováno na stranách 7, 32, 63, and 90.) [81] J. de Leon, N. B. Sandson, and K. L. Cozza. A preliminary attempt to personalize risperidone dosing using drug-drug interactions and genetics: part ii. Psychosomatics, 49(4):347 361, 2008. (Citováno na stranách 16, 25, 28, 29, 30, 32, 34, 41, and 53.) [82] J. de Leon, N. B. Sandson, and K. L. Cozza. A preliminary attempt to personalize risperidone dosing using drug-drug interactions and genetics: part I. Psychosomatics, 49(3):258 70, 2008. (Citováno na straně 56.)

106 literatura [83] J. de Leon, N. B. Sandson, and K. L. Cozza. A preliminary attempt to personalize risperidone dosing using drug-drug interactions and genetics: part II. Psychosomatics, 49(4):347 61, 2008. (Citováno na stranách 53 and 56.) [84] J. de Leon, M. T. Susce, and E. Murray-Carmichael. The AmpliChip CYP450 genotyping test: Integrating a new clinical tool. Mol Diagn Ther, 10(3):135 51, 2006. (Citováno na stranách 25 and 39.) [85] J. de Leon, M. T. Susce, R. M. Pan, M. Fairchild, W. H. Koch, and P. J. Wedlund. The cyp2d6 poor metabolizer phenotype may be associated with risperidone adverse drug reactions and discontinuation. J Clin Psychiatry, 66(1):15 27, Jan 2005. study. (Citováno na stranách 48 and 80.) [86] J. de Leon, M. T. Susce, R. M. Pan, W. H. Koch, and P. J. Wedlund. Polymorphic variations in gstm1, gstt1, pgp, cyp2d6, cyp3a5, and dopamine d2 and d3 receptors and their association with tardive dyskinesia in severe mental illness. J Clin Psychopharmacol, 25(5):448 456, Oct 2005. study. (Citováno na stranách 39, 41, 48, 49, and 56.) [87] J. de Leon, M. T. Susce, R-M. Pan, P. J. Wedlund, M. L. Orrego, and F. J. Diaz. A study of genetic (cyp2d6 and abcb1) and environmental (drug inhibitors and inducers) variables that may influence plasma risperidone levels. Pharmacopsychiatry, 40(3):93 102, May 2007. study. (Citováno na stranách 37, 49, and 87.) [88] J. de Leon, G. Wynn, and N. B. Sandson. The pharmacokinetics of paliperidone versus risperidone. Psychosomatics, 51(1):80 88, Jan 2010. (Citováno na stranách 31, 56, 79, and 83.) [89] J. Libiger. Psychiatrie, chapter Schizofrenní poruchy, pages 351 412. TIGIS spol. s. r.o., 2004. (Citováno na straně 4.) [90] J. A. Lieberman, J. Yunis, E. Egea, R. T. Canoso, J. M. Kane, and E. J. Yunis. Hla-b38, dr4, dqw3 and clozapine-induced agranulocytosis in jewish patients

literatura 107 with schizophrenia. Arch Gen Psychiatry, 47(10):945 948, Oct 1990. (Citováno na straně 26.) [91] Liga proti rakovině Praha. Amplichip cyp450. http://www.lpr.cz/index.php/amplichip-cyp450, 7 2012. (Citováno na straně 25.) [92] O. Lingjaerde, U. G. Ahlfors, P. Bech, S. J. Dencker, and K. Elgen. The uku side effect rating scale. a new comprehensive rating scale for psychotropic drugs and a cross-sectional study of side effects in neuroleptic-treated patients. Acta Psychiatr Scand Suppl, 334:1 100, 1987. (Citováno na straně 62.) [93] K. Linnet and T. B. Ejsing. A review on the impact of p-glycoprotein on the penetration of drugs into the brain. focus on psychotropic drugs. Eur Neuropsychopharmacol, 18(3):157 169, Mar 2008. review. (Citováno na stranách 30, 42, 43, 45, 47, 79, and 83.) [94] Adrian Llerena, Roland Berecz, Pedro Dorado, and Alfredo de la Rubia. Qtc interval, cyp2d6 and cyp2c9 genotypes and risperidone plasma concentrations. J Psychopharmacol, 18(2):189 193, Jun 2004. (Citováno na stranách 39 and 56.) [95] A. Llerena, P. Dorado, E. M. Penas-Lledo, M. C. Caceres, and A. De la Rubia. Low frequency of cyp2d6 poor metabolizers among schizophrenia patients. Pharmacogenomics J, 7(6):408 410, Dec 2007. (Citováno na straně 82.) [96] U. Müller, P. C. Fletcher, and H. Steinberg. The origin of pharmacopsychology: Emil kraepelin s experiments in leipzig, dorpat and heidelberg (1882-1892). Psychopharmacology (Berl), 184(2):131 138, Jan 2006. (Citováno na straně 3.) [97] A.K. Malhotra, M. Athanasiou, C.R. Reed, B. Dain, J. Carr, and H. Whalen. Discovery of genetic markers associated with clozapine induced agranulocytosis. Am J Med Gen Part B Neuropsychiatr Genet, 138b:22, 2005. (Citováno na straně 26.) [98] A. K. Malhotra, G. M. Murphy, and J. L. Kennedy. Pharmacogenetics of psychotropic drug response.

108 literatura Am J Psychiatry, 161(5):780 796, May 2004. (Citováno na straně 18.) [99] F. Mayer, N. Mayer, L. Chinn, R. L. Pinsonneault, D. Kroetz, and R. J. Bainton. Evolutionary conservation of vertebrate blood-brain barrier chemoprotective mechanisms in drosophila. J Neurosci, 29(11):3538 3550, Mar 2009. (Citováno na straně 41.) [100] U. Mayer, E. Wagenaar, J. H. Beijnen, J. W. Smit, D. K. Meijer, J. van Asperen, P. Borst, and A. H. Schinkel. Substantial excretion of digoxin via the intestinal mucosa and prevention of long-term digoxin accumulation in the brain by the mdr 1a p-glycoprotein. Br J Pharmacol, 119(5):1038 1044, Nov 1996. (Citováno na straně 45.) [101] A. A. Megens, F. H. Awouters, A. Schotte, T. F. Meert, C. Dugovic, C. J. Niemegeers, and J. E. Leysen. Survey on the pharmacodynamics of the new antipsychotic risperidone. Psychopharmacology (Berl), 114(1):9 23, 1994. (Citováno na straně 38.) [102] H. Y. Meltzer. Treatment of the neurolepticnonresponsive schizophrenic patient. Schizophr Bull, 18(3):515 542, 1992. (Citováno na straně 20.) [103] M. Hacker K. Bachmann W. Messer. Pharmacology - Principles and Practice. Elsevier Inc., 2009. (Citováno na stranách 13, 15, 17, 18, 31, 33, and 53.) [104] M. Mroziewicz and R. F. Tyndale. Pharmacogenetics: a tool for identifying genetic factors in drug dependence and response to treatment. Addict Sci Clin Pract, 5(2):17 29, Dec 2010. (Citováno na stranách 10, 11, and 19.) [105] T. Nakagami, N. Yasui-Furukori, M. Saito, T. Tateishi, and S. Kaneo. Effect of verapamil on pharmacokinetics and pharmacodynamics of risperidone: in vivo evidence of involvement of p-glycoprotein in risperidone disposition. Clin Pharmacol Ther, 78(1):43 51, Jul 2005. study on volunteers. (Citováno na straně 47.)

literatura 109 [106] H. A. Nasrallah and R. F. White. Treatment-resistant schizophrenia. http://www.medscape.org/viewarticle/533040. (Citováno na stranách 20 and 21.) [107] National Center for Biotechnology Information. Reference SNP(refSNP) cluster report: rs1045642. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/snp /snp_ref.cgi?rs=1045642. (Citováno na straně 46.) [108] National Center for Biotechnology Information. Reference SNP(refSNP) cluster report: rs1128503. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/snp /snp_ref.cgi?rs=1128503. (Citováno na straně 46.) [109] National Center for Biotechnology Information. Reference SNP(refSNP) cluster report: rs2032582. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects /SNP/snp_ref.cgi?rs=2032582. (Citováno na straně 46.) [110] National Center for Biotechnology Information. ABCB1 ATP-binding cassette, sub-family b (MDR/TAP), member 1 [Homo sapiens] - gene - NCBI. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene &cmd=retrieve&dopt=full_report&list_uids=5243. (Citováno na straně 87.) [111] National Institute for Health and Clinical Excellence. Measuring effectiveness and cost effectiveness: the qaly. http://www.nice.org.uk/newsroom/features /measuringeffectivenessandcosteffectivenesstheqaly.jsp, April 2010. (Citováno na straně 40.) [112] National Institute of Mental Health s Psychoactive Drug Screening. PDSP - home page. http://pdsp.med.unc.edu/, 3 November 2009. (Citováno na stranách 29 and 80.) [113] D. W. Nebert, G. Zhang, and E. S. Vesell. From human genetics and genomics to pharmacogenetics and pharmacogenomics: past lessons, future directions. Drug Metab Rev, 40(2):187 224, 2008. (Citováno na straně 11.)

110 literatura [114] NIMH Psychoactive Drug Screening Program. Pdsp - home page. http://pdsp.med.unc.edu/, 2011. (Citováno na straně 30.) [115] C. U. Nnadi and A. K. Malhotra. Individualizing antipsychotic drug therapy in schizophrenia: the promise of pharmacogenetics. Curr Psychiatry Rep, 9(4):313 318, Aug 2007. (Citováno na straně 27.) [116] M. Nord and L. Farde. Antipsychotic occupancy of dopamine receptors in schizophrenia. CNS Neurosci Ther, 17(2):97 103, Apr 2011. (Citováno na straně 80.) [117] F. E. O Brien, T. G. Dinan, B. T. Griffin, and J. F. Cryan. Interactions between antidepressants and p- glycoprotein at the blood-brain barrier: clinical significance of in vitro and in vivo findings. Br J Pharmacol, 165(2):289 312, Jan 2012. (Citováno na stranách 43 and 44.) [118] O. V. Olesen, R. W. Licht, E. Thomsen, T. Bruun, J. E. Viftrup, and K. Linnet. Serum concentrations and side effects in psychiatric patients during risperidone therapy. Ther Drug Monit, 20(4):380 4, 1998. (Citováno na straně 38.) [119] World Health Organisation. The Global Burden of Disease: 2004 Update. World Health Organisation, 2008. (Citováno na straně 6.) [120] Inc. Ortho-McNeil-Janssen Pharmaceuticals. Invega, highlights of prescribing information, 2007. (Citováno na stranách 29 and 37.) [121] K. Ouahchi, N. Lindeman, and C. Lee. Copy number variants and pharmacogenomics. Pharmacogenomics, 7(1):25 29, Jan 2006. (Citováno na straně 91.) [122] A. M. Pacchioni, A. Gabriele, J. L. Donovan, C. L. DeVane, and R. E. See. P-glycoprotein inhibition potentiates the behavioural and neurochemical actions of risperidone in rats. Int J Neuropsychopharmacol, 13(8):1067 1077, Sep 2010. animal study. (Citováno na straně 47.)

literatura 111 [123] B. Pajak, J. Molnar, H. Engi, and A. Orzechowski. Preliminary studies on phenothiazine-mediated reversal of multidrug resistance in mouse lymphoma and colo 320 cells. In Vivo, 19(6):1101 1104, 2005. (Citováno na straně 69.) [124] K. Pechandová, H. Buzková, O. Slanař, and F. Perlík. Polymorphisms of the mdr1 gene in the czech population. Folia Biol (Praha), 52(6):184 189, 2006. (Citováno na stranách 45, 46, and 87.) [125] O. Pelkonen, J. Maenpaa, P. Taavitsainen, A. Rautio, and H. Raunio. Inhibition and induction of human cytochrome P450 (CYP) enzymes. Xenobiotica, 28(12):1203 53, 1998. (Citováno na straně 36.) [126] D. O. Perkins, H. Gu, K. Boteva, and J. A. Lieberman. Relationship between duration of untreated psychosis and outcome in first-episode schizophrenia: a critical review and meta-analysis. Am J Psychiatry, 162(10):1785 1804, Oct 2005. (Citováno na stranách 5 and 21.) [127] Pharmacology Weekly s. Comprehensive drug table of substrates, inhibitors, and inducers of CYP450, UGT, and transporters: O-r. http://www.pharmacologyweekly.com/content/pages/drugreference-table-cyp-p450-ugt-enzymes-transportersor. (Citováno na straně 69.) [128] K. A. Phillips, D. L. Veenstra, E. Oren, J. K. Lee, and W. Sadee. Potential role of pharmacogenomics in reducing adverse drug reactions: a systematic review. JAMA, 286(18):2270 2279, Nov 2001. (Citováno na straně 8.) [129] M. Pirmohamed. Pharmacogenetics and pharmacogenomics. Br J Clin Pharmacol, 52(4):345 347, Oct 2001. (Citováno na straně 8.) [130] B. K. Plesnicar, B. Zalar, K. Breskvar, and V. Dolzan. The influence of the CYP2D6 polymorphism on psychopathological and extrapyramidal symptoms in the patients on long-term antipsychotic treatment. J Psychopharmacol, 20(6):829 33, 2006. (Citováno na stranách 38, 80, and 82.)

112 literatura [131] R Development Core Team. R: a language and environment for statistical computing. http://www.rproject.org/, 2011. ISBN 3-900051-07-0. (Citováno na straně 64.) [132] R. Redon, S. Ishikawa, K. R. Fitch, L. Feuk, and G. H. Perry et al. Global variation in copy number in the human genome. Nature, 444(7118):444 454, Nov 2006. (Citováno na straně 91.) [133] J. K. V. Reichardt. Realizing the full potential of the sequenced human genome. Trends Genet, 24(5):219 220, May 2008. (Citováno na straně 91.) [134] J. K. V. Reichardt. Quo vadis, genoma? a call to pipettes for biochemists. Trends Biochem Sci, 32(12):529 530, Dec 2007. (Citováno na straně 91.) [135] José A Riancho. Genome-wide association studies (gwas) in complex diseases: advantages and limitations. Reumatol Clin, 8(2):56 57, 2012. (Citováno na stranách 9 and 10.) [136] M. Riedel, M. J. Schwarz, M. Strassnig, I. Spellmann, and A. Mueller-Arends et al. Risperidone plasma levels, clinical response and side-effects. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci, 255(4):261 268, Aug 2005. (Citováno na straně 79.) [137] Roche Molecular Systems Inc. Amplichip cyp450 test. http://molecular.roche.com/assays /Pages/AmpliChipCYP450Test.aspx, 7 2012. (Citováno na straně 25.) [138] C. Rodriguez-Antona, D. Gurwitz, J. de Leon, A. Llerena, J. Kirchheiner, E. G. de Mesa, and D. Ibarreta. CYP2D6 genotyping for psychiatric patients treated with risperidone: considerations for costeffectiveness studies. Pharmacogenomics, 10(4):685 99, 2009. (Citováno na stranách 40 and 59.) [139] H. K. Roh, C. E. Kim, W. G. Chung, C. S. Park, J. O. Svensson, and L. Bertilsson. Risperidone metabolism in relation to cyp2d6*10 allele in korean schizophrenic patients. Eur J Clin Pharmacol, 57(9):671 675, Nov 2001. (Citováno na straně 38.)

literatura 113 [140] M. J. Ruiz-Gómez, A. Souviron, M. Martínez-Morillo, and L. Gil. P-glycoprotein, glutathione and glutathione s-transferase increase in a colon carcinoma cell line by colchicine. J Physiol Biochem, 56(4):307 312, Dec 2000. (Citováno na straně 42.) [141] C. Sachse, J. Brockmoller, S. Bauer, and I. Roots. Cytochrome P450 2D6 variants in a Caucasian population: allele frequencies and phenotypic consequences. Am J Hum Genet, 60(2):284 95, 1997. (Citováno na straně 34.) [142] T. Saeki, K. Ueda, Y. Tanigawara, R. Hori, and T. Komano. Human p-glycoprotein transports cyclosporin a and fk506. J Biol Chem, 268(9):6077 6080, Mar 1993. (Citováno na stranách 43 and 44.) [143] A. Sakurai, Y. Onishi, H. Hirano, M. Seigneuret, and K. Obanayama et al. Quantitative structure activity relationship analysis and molecular dynamics simulation to functionally validate nonsynonymous polymorphisms of human abc transporter abcb1 (pglycoprotein/mdr1). Biochemistry, 46(26):7678 7693, Jul 2007. (Citováno na straně 45.) [144] E. Schaeffeler, M. Eichelbaum, U. Brinkmann, A. Penger, S. Asante-Poku, U. M. Zanger, and M. Schwab. Frequency of c3435t polymorphism of mdr1 gene in african people. Lancet, 358(9279):383 384, Aug 2001. (Citováno na straně 46.) [145] B. Graf Schimmelmann, M. Schacht, C. Perro, and M. Lambert. [the initial dysphoric reaction (idr) to the first dose of neuroleptics]. Nervenarzt, 75(1):36 43, Jan 2004. (Citováno na straně 62.) [146] A. H. Schinkel, U. Mayer, E. Wagenaar, C. A. Mol, and L. van Deemter et al. Normal viability and altered pharmacokinetics in mice lacking mdr1-type (drug-transporting) p-glycoproteins. Proc Natl Acad Sci U S A, 94(8):4028 4033, Apr 1997. (Citováno na straně 43.) [147] M. G. Scordo, E. Spina, G. Facciola, A. Avenoso, I. Johansson, and M. L. Dahl. Cytochrome P450 2D6 genotype and steady state plasma levels of risperidone

114 literatura and 9-hydroxyrisperidone. Psychopharmacology (Berl), 147(3):300 5, 1999. (Citováno na straně 38.) [148] S. A. Scott, L. Edelmann, R. Kornreich, M. Erazo, and R. J. Desnick. Cyp2c9, cyp2c19 and cyp2d6 allele frequencies in the ashkenazi jewish population. Pharmacogenomics, 8(7):721 730, Jul 2007. (Citováno na straně 25.) [149] A. B. Shapiro and V. Ling. Positively cooperative sites for drug transport by p-glycoprotein with distinct drug specificities. Eur J Biochem, 250(1):130 137, Nov 1997. (Citováno na straně 43.) [150] R. P. Sharma, C. Rosen, S. Kartan, Al. Guidotti, and E. Costa et al. Valproic acid and chromatin remodeling in schizophrenia and bipolar disorder: preliminary results from a clinical population. Schizophr Res, 88(1-3):227 231, Dec 2006. (Citováno na straně 9.) [151] Frances J Sharom. Abc multidrug transporters: structure, function and role in chemoresistance. Pharmacogenomics, 9(1):105 127, Jan 2008. (Citováno na stranách 45, 46, 82, 83, 85, and 86.) [152] T. Shinkai, V. De Luca, K. Utsunomiya, S. Sakata, and Y. Inoue et al. Functional polymorphism of the human multidrug resistance gene (mdr1) and polydipsia-hyponatremia in schizophrenia. Neuromolecular Med, 10(4):362 367, 2008. study. (Citováno na stranách 48, 49, and 85.) [153] K. L. Shirley, Y. Y. Hon, S. R. Penzak, Y. W. Lam, V. Spratlin, and M. W. Jann. Correlation of cytochrome P450 (CYP) 1A2 activity using caffeine phenotyping and olanzapine disposition in healthy volunteers. Neuropsychopharmacology, 28(5):961 6, 2003. (Citováno na straně 12.) [154] A. Siddiqui, R. Kerb, M. E. Weale, U. Brinkmann, and A. Smith et al. Association of multidrug resistance in epilepsy with a polymorphism in the drugtransporter gene abcb1. N Engl J Med, 348(15):1442 1448, Apr 2003. (Citováno na stranách 46, 60, and 85.)

literatura 115 [155] C. Sipeky, V. Csongei, L. Jaromi, E. Safrany, and A. Maasz et al. Genetic variability and haplotype profile of mdr1 (abcb1) in roma and hungarian population samples with a review of the literature. Drug Metab Pharmacokinet, 26(2):206 215, 2011. (Citováno na stranách 43, 45, and 46.) [156] J. Sistonen, S. Fuselli, A. Levo, and A. Sajantila. Cyp2d6 genotyping by a multiplex primer extension reaction. Clin Chem, 51(7):1291 1295, Jul 2005. (Citováno na straně 63.) [157] J. Sistonen, A. Sajantila, O. Lao, J. Corander, G. Barbujani, and S. Fuselli. Cyp2d6 worldwide genetic variation shows high frequency of altered activity variants and no continental structure. Pharmacogenet Genomics, 17(2):93 101, Feb 2007. (Citováno na stranách 66 and 81.) [158] R. C. Skoda, F. J. Gonzalez, A. Demierre, and U. A. Meyer. Two mutant alleles of the human cytochrome P-450db1 gene (P450C2D1) associated with genetically deficient metabolism of debrisoquine and other drugs. Proc Natl Acad Sci U S A, 85(14):5240 3, 1988. (Citováno na straně 34.) [159] Petr Smolík. Psychiatrie, chapter Klasifikace duševních poruch, pages 339 349. Tigis, 2004. (Citováno na straně 3.) [160] D. A. Solomon, A. C. Leon, T. I. Mueller, W. Coryell, and J. J. Teres et al. Tachyphylaxis in unipolar major depressive disorder. J Clin Psychiatry, 66(3):283 290, Mar 2005. (Citováno na straně 21.) [161] D. Souery, G. I. Papakostas, and M. H. Trivedi. Treatment-resistant depression. J Clin Psychiatry, 67 Suppl 6:16 22, 2006. (Citováno na stranách 20 and 21.) [162] R. P. Souza, V. de Luca, H. Y. Meltzer, J. A. Lieberman, and J. L. Kennedy. Schizophrenia severity and clozapine treatment outcome association with oxytocinergic genes. Int J Neuropsychopharmacol, 13(6):793 798, Jul 2010. (Citováno na stranách 9 and 19.)

116 literatura [163] A. Sparreboom, J. van Asperen, U. Mayer, A. H. Schinkel, J. W. Smit, D. K. Meijer, P. Borst, W. J. Nooijen, J. H. Beijnen, and O. van Tellingen. Limited oral bioavailability and active epithelial excretion of paclitaxel (taxol) caused by p-glycoprotein in the intestine. Proc Natl Acad Sci U S A, 94(5):2031 2035, Mar 1997. (Citováno na straně 45.) [164] U. M. Stamer, B. Bayerer, S. Wolf, A. Hoeft, and F. Stuber. Rapid and reliable method for cytochrome P450 2D6 genotyping. Clin Chem, 48(9):1412 7, 2002. (Citováno na straně 34.) [165] I. P. Stolerman. Encyclopedia of Psychopharmacology. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2010. (Citováno na straně 18.) [166] T. Sc. Stroup, J. A. Lieberman, J. P. McEvoy, M. S. Swartz, and S. M. Davis et al. Effectiveness of olanzapine, quetiapine, and risperidone in patients with chronic schizophrenia after discontinuing perphenazine: a catie study. Am J Psychiatry, 164(3):415 427, Mar 2007. (Citováno na straně 5.) [167] G. Subramanian, M. D. Adams, J. C. Venter, and S. Broder. Implications of the human genome for understanding human biology and medicine. JAMA, 286(18):2296 2307, Nov 2001. (Citováno na straně 91.) [168] T. H. Svensson. Alpha-adrenoceptor modulation hypothesis of antipsychotic atypicality. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 27(7):1145 1158, Oct 2003. (Citováno na straně 80.) [169] E. K. Tan, D. K. Y. Chan, P. W. Ng, J. Woo, and Y. Y. Teo et al. Effect of mdr1 haplotype on risk of parkinson disease. Arch Neurol, 62(3):460 464, Mar 2005. (Citováno na straně 46.) [170] The Human Cytochrome P450 (CYP) Allele Nomenclature Committee. CYP2D6 allele nomenclature. http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm, October 2012. (Citováno na straně 63.)

literatura 117 [171] A. Thompson, C. Lavedan, and S. Volpi. Absence of weight gain association with the htr2c -759c/t polymorphism in patients with schizophrenia treated with iloperidone. Psychiatry Res, 175(3):271 273, Feb 2010. (Citováno na straně 27.) [172] M. J. Travis, G. F. Busatto, L. S. Pilowsky, R. Mulligan, P. D. Acton, S. Gacinovic, J. Mertens, D. Terriere, D. C. Costa, P. J. Ell, and R. W. Kerwin. 5-ht2a receptor blockade in patients with schizophrenia treated with risperidone or clozapine. a spet study using the novel 5-ht2a ligand 123i-5-i-r-91150. Br J Psychiatry, 173:236 241, Sep 1998. (Citováno na straně 80.) [173] Pieter W Troost, Bertine E Lahuis, Mirjam H Hermans, Jan K Buitelaar, Herman van Engeland, Lawrence Scahill, Ruud B Minderaa, and Pieter J Hoekstra. Prolactin release in children treated with risperidone: impact and role of cyp2d6 metabolism. J Clin Psychopharmacol, 27(1):52 57, Feb 2007. (Citováno na stranách 39 and 56.) [174] Y. Uchida, S. Ohtsuki, J. Kamiie, and T. Terasaki. Blood-brain barrier (bbb) pharmacoproteomics: reconstruction of in vivo brain distribution of 11 p- glycoprotein substrates based on the bbb transporter protein concentration, in vitro intrinsic transport activity, and unbound fraction in plasma and brain in mice. J Pharmacol Exp Ther, 339(2):579 588, Nov 2011. animal study. (Citováno na straně 47.) [175] M. Uhr and M. T. Grauer. abcb1ab p-glycoprotein is involved in the uptake of citalopram and trimipramine into the brain of mice. J Psychiatr Res, 37(3):179 185, 2003. (Citováno na straně 43.) [176] M. Uhr, M. T. Grauer, and F. Holsboer. Differential enhancement of antidepressant penetration into the brain in mice with abcb1ab (mdr1ab) p-glycoprotein gene disruption. Biol Psychiatry, 54(8):840 846, Oct 2003. (Citováno na straně 43.) [177] M. Uhr, F. Holsboer, and M. B. Müller. Penetration of endogenous steroid hormones corticosterone, cortisol, aldosterone and progesterone into the brain

118 literatura is enhanced in mice deficient for both mdr1a and mdr1b p-glycoproteins. J Neuroendocrinol, 14(9):753 759, Sep 2002. (Citováno na straně 43.) [178] J. Vácha. Patologicka fyziologie I. Masarykova Univerzita v Brne, 2001. (Citováno na straně 3.) [179] S. Volpi, C. Heaton, K. Mack, J. B. Hamilton, R. Lannan, C. D. Wolfgang, L. Licamele, M. H. Polymeropoulos, and C. Lavedan. Whole genome association study identifies polymorphisms associated with qt prolongation during iloperidone treatment of schizophrenia. Mol Psychiatry, 14(11):1024 1031, Nov 2009. (Citováno na straně 28.) [180] J. S. Wang, Y. Ruan, R. M. Taylor, J. L. Donovan, J. S. Markowitz, and C. L. DeVane. The brain entry of risperidone and 9-hydroxyrisperidone is greatly limited by p-glycoprotein. Int J Neuropsychopharmacol, 7(4):415 419, Dec 2004. animal study. (Citováno na stranách 29, 30, 47, and 79.) [181] T. H. Wang and H. S. Wang. A genome-wide association study primer for clinicians. Taiwan J Obstet Gynecol, 48(2):89 95, Jun 2009. (Citováno na stranách 10, 11, and 91.) [182] Y.n Wang, H. R. Krishnan, A. Ghezzi, J. C. P. Yin, and N. S. Atkinson. Drug-induced epigenetic changes produce drug tolerance. PLoS Biol, 5(10):e265, Oct 2007. (Citováno na straně 91.) [183] Q. Xing, R. Gao, H. Li, G. Feng, and M. Xu et al. Polymorphisms of the abcb1 gene are associated with the therapeutic response to risperidone in chinese schizophrenia patients. Pharmacogenomics, 7(7):987 993, Oct 2006. study. (Citováno na stranách 46, 48, 49, and 84.) [184] N. Yasui-Furukori, K. Mihara, T. Takahata, A. Suzuki, and T. Nakagami et al. Effects of various factors on steady-state plasma concentrations of risperidone and 9-hydroxyrisperidone: lack of impact of mdr-1 genotypes. Br J Clin Pharmacol, 57(5):569 575, May 2004. study. (Citováno na stranách 48 and 49.)

literatura 119 [185] Norio Yasui-Furukori, Shoko Tsuchimine, Manabu Saito, Taku Nakagami, Yasushi Sato, and Sunao Kaneko. Association between major multidrug resistance 1 (mdr1) gene polymorphisms and plasma concentration of prolactin during risperidone treatment in schizophrenic patients. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 31(6):1230 1234, Aug 2007. study. (Citováno na stranách 48 and 49.) [186] S. Y. Yi, K. S. Hong, H. S. Lim, J. Y. Chung, and D. S. Oh et al. A variant 2677a allele of the mdr1 gene affects fexofenadine disposition. Clin Pharmacol Ther, 76(5):418 427, Nov 2004. (Citováno na stranách 45 and 84.) [187] R. Yoshimura, K. Shinkai, S. Kakihara, M. Goto, Y. Yamada, K. Kaji, N. Ueda, and J. Nakamura. Little effects of low dosage of levomepromazine on plasma risperidone levels. Pharmacopsychiatry, 38(2):98 100, Mar 2005. (Citováno na straně 56.) [188] A. M. Young, C. E. Allen, and K. L. Audus. Efflux transporters of the human placenta. Adv Drug Deliv Rev, 55(1):125 132, Jan 2003. (Citováno na straně 45.) [189] A. L. Zackrisson and B. Lindblom. Identification of CYP2D6 alleles by single nucleotide polymorphism analysis using pyrosequencing. Eur J Clin Pharmacol, 59(7):521 6, 2003. (Citováno na straně 34.) [190] Y Zhang, X Guo, E. T. Lin, and L. Z. Benet. Overlapping substrate specificities of cytochrome p450 3a and p-glycoprotein for a novel cysteine protease inhibitors. Drug metabolism and disposition, 26(4):360 366, 1997. (Citováno na straně 43.) [191] H. J. Zhu, J. S. Wang, J. S. Markowitz, J. L. Donovan, B. B. Gibson, and C. L. DeVane. Risperidone and paliperidone inhibit p-glycoprotein activity in vitro. Neuropsychopharmacology, 32(4):757 764, Apr 2007. in vitro study. (Citováno na straně 44.) [192] G. Zimová, J. Chládek, J. Martínková, and M. Beránek. Hplc determination of dextromethorphan and its metabolites in urine. Chemicke listy, 94:2, 2000. (Citováno na stranách 12 and 36.)

120 literatura [193] G. Zlokarnik, P. D. Grootenhuis, and J. B. Watson. High throughput P450 inhibition screens in early drug discovery. Drug Discov Today, 10(21):1443 50, 2005. (Citováno na straně 36.)

Část IV P Ř Í L O H Y

P Ř Í L O H A A Souhrnná tabulka

EM + IM CYP2D6 PM PANSS Medián IQR Medián IQR Začátek Pozitivní 22 10 23 12 Negativní 19 12 24 7 Obecné 39 24 52 20 Celkem 79 33 85 32 Konec Pozitivní 9 a 7 a 15 a 9 a Negativní 11 b 11 b 21 b 11 b Obecné 25 c 10 c 35 c 11 c Celkem 48 d 26 d 66 d 33 d Procento redukce PANSS 39,76 e 50 e 9,84 e 20,5 e Nežádoucí účinky Procento Procento Psychické 65,52 % 80 % Neurologické 41,38 % 60% Autonomní 51,72 % f 100% f Jiné 41,38 % 60 % Celkem 58,62 % 100 % Změna hmotnost Medián IQR Medián IQR 3,51 5,88 1,63 1,68 Subjektivní prožívání léčby Medián IQR Medián IQR NDS 3 4,5 5 3,5 DAI-10 na začátku -2 6 2 2,5 DAI-10 na konci 0 2 2 5,5 Pacienti s poklesem DAI-10 17,24 % 25 % Výsledek léčby Procento Procento Remise 68,97 % 40 % Drop-outy 55,17 % 80 % Drop-outy pro nedostatečný účinek 37,93 % 60 % Drop-outy pro nežádoucí účinky 24,14 % 0% Dávky Medián IQR Medián IQR Risperidon 21,33 21 20,75 7,25 Všechna AP 2567 g 2133 g 4130,9 g 2200 g CYP2D6-dependentní AP 2250 2150 2075 725 CYP2D6-independentní AP 60 h 1201 h 1917 h 2100 h Komedikace Procento Procento Antiparkinsonika 34,48 % 80 % Benzodiazepiny 82,76 % 100 % Betablokátory 6,9 % 0 % Souhrn sledovaných klinických proměnných v závislosti na variabilitě CYP2D6 a P-gp Dávky risperidonu jsou v miligramech, ostatní údaje o dávkách antipsychotik jsou v chlorpromazinových ekvivalentech. Statisticky významné hodnoty jsou zvýrazněny (Wilcoxon rank-sum test): a p = 0,058, b p = 0,046, c p = 0,01, d p = 0,017, e p = 0,017, (Fisher s exact test): f p = 0,063, (Wilcoxon rank-sum test): g p = 0,058, h p = 0,014, (Krukal-Wallis test): i - p = 0,027, (Wilcoxon rank-sum test): j - p = 0,01, k - p = 0,006, l - p = 0,001, m - p = 0,02, n - p = 0,01, (Fisher s exact test): o - p = 0,009, p - p = 0,01. (Wilcoxon rank-sum test): q - p = 0.04. 124

přílohy 125 G2677T/A C3435T Wt / Wt Wt / Mut Mut / Mut C / C C / T T / T Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR 22 2,75 22 4,75 17 6,5 21 0,25 22,50 5,5 22 7,5 22 10,75 18 7,5 22 4 19,5 6,5 18,50 7,5 20 8 38,5 10,75 41 16,75 40 18 39,5 7 38,5 14,5 45 17,5 81 26,75 84 25 82 24 80 13,75 82 21,25 83 26,5 9 2,75 9,5 8 10 6,5 8,5 2 10 9,5 10 6,5 16 8,25 13,5 10,5 11 9,5 9,5 k,l 1,5 k,l 16,5 l 12,5 l 15 k 6,5 k 26 5 25,5 12,5 26 7,5 24 2,25 25,5 15,5 27 8 51,5 15,5 50 25,5 50 21 42 m 4,25 m 55,5 m 39,25 m 52 19,5 36,84 20,77 35,95 29,44 38,71 25,64 45,68 n 4,68 n 26,78 n 32,07 n 38,71 29,74 Procento Procento Procento Procento Procento Procento 50 % 72,73 % 71,43 % 0 % o,p 75 % p 80 % o 50 % 50 % 28,57 % 0 % 56,25 % 46,67 % 83,33 % 54,55 % 57,14 % 50 % 50 % 73,33 % 66,67 % 45,45 % 28,57 % 50 % 56,25 % 33,33 % 83,33 % 68,18 % 42,86 % 25 % 75 % 66,67 % Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR 0,94 i 5,10 i 4,5 i,j 6,2 i,j 0 i,j 3,32 i,j 3,26 3,9 5,62 7,68 1,63 3,75 Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR 2,5 q 3 q 3 5 8 q 5 q 3,5 2,5 3 4,25 5 5 1 11 0 4-2 4-1 5 0 6-1 4 2 13,5 0 2 0 1 0 3,5 0 2,5 0 3,5 16,67 % 19,04 % 28,57 % 0 % 18,75 % 28,57 % Procento Procento Procento Procento Procento Procento 83,33 % 63,64 % 57,14 % 75 % 62,5 % 66,67 % 66,67 % 54,55 % 57,14 % 50 % 62,5 % 53,33 % 16,67 % 45,45 % 42,86 % 0 % 50 % 40 % 50,00 % 18,18 % 0,00 % 25 % 25 % 13,33 % Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR Medián IQR 20,88 3,24 23,31 9,17 16,50 6,78 19,62 4,37 22,48 8,05 19,80 8,9 2205 1121 2879 1365 2550 1600 1962 437 2658 1315 3400 1232 2175 341 2331 836 1650 678 1962 437 2331 581 2250 890 30,0 540 237 1556 925 1675 0 0 237 900 1201 1775 Procento Procento Procento Procento Procento Procento 33,33 % 45,45 % 28,57 % 0 % 50 % 40 % 83,33 % 86,36 % 85,71 % 100 % 87,5 % 80 % 16,67 % 4,55 % 0,00 % 0 % 6,25 % 6,67 %

P Ř Í L O H A B Výběr z autorových publikací

Cent. Eur. J. Med. 6(5) 2011 662-664 DOI: 10.2478/s11536-011-0055-8 Central European Journal of Medicine Withdrawal related adverse effects of antipsychotic medication in a patient with first-episode schizophrenia Case Report Richard Barteček, Tomáš Kašpárek, Eva Češková University Hospital Brno, Department of Psychiatry Jihlavská 20, 625 00 Brno, Czech Republic Received 27 September 2010; Accepted 2 May 2011 Abstract: Withdrawal-emergent adverse effects of antipsychotics are an infrequently identified condition which can appear during antipsychotic dose reduction and medication change. In this paper, we present the case of severe extrapyramidal symptoms after a dose reduction of risperidone is presented. A patient, 23 years of age, was admitted to a health care facility due to an unexpected change in his behavior, with paranoid delusions, incoherent thinking, and significant anxiety. An initial risperidone treatment was soon changed to zuclopenhixol. Subsequently, severe extrapyramidal symptoms appeared, after which the medication was switched back to resperidone. Following this treatment, the patient left the health care facility and stopped the medication of his own volition. Psychotic symptoms and massive extrapyramidal symptoms again occurred. These symptoms subsided only slowly during a subsequent treatment with olanzapine. The development of adverse neurological effects together with a worsening of productive psychotic symptomatology may be explained by withdrawal of antipsychotic medication. These symptoms are often attributed to new medications, which are prematurely discontinued after the appearance of an adverse effect, but which are potentially beneficial to a patient, provided that enough time for a spontaneous subsidence of withdrawal-emergent effects is given. Any change in antipsychotic treatment should be carefully considered and thoroughly planned. Keywords: Schizophrenia Antipsychotics Withdrawal-related adverse effects Versita Sp. z o.o. 1. Introduction Withdrawal-emergent adverse effects represent a significant barrier to a successful medication change during routine treatment. It is important to be aware of the potential development of adverse effects during discontinuation of antipsychotic drugs. An extrapyramidal syndrome (EPS) which follows a discontinuation of antipsychotic drugs can be associated with a supersensitive (rebound) psychosis [1]. One of the first cases of EPS related to a decreased dose of risperidone, was reported in 1996 [2] and other cases quickly followed, ranging from dyskinesias, similar to the tardive dyskinesias [3,4], to potentially fatal dyskinesia of the respiratory muscles [5]. 2. Presentation of the case The presented case relates to a 23 years old patient without any previous psychiatric history. The patient history included neither head injury with loss of consciousness nor any paroxysmal conditions; 4 years prior admission he was examined for hyperthyroidism, however, thyroid gland function was found to be normal. School attendance started with a one-year delay. Despite the delay, the patient went through school with excellent grades and graduated from university with a degree in computer technology. Before admission to hospital he had been working as a computer technician. In the family history there was a single case of psychiatric hospitalization involving his mother s sibling with the diagnosis of an acute psychotic disorder. In the winter of 2008 the patient was admitted to a department of psychiatry due to a sudden change in his behavior, which included para- 662

R. Barteček et al. noid delusions, incoherent speech, insomnia, tension, and anxiety persisting for several days. Upon admission, the patient did not show any signs of somatic disease nor was he taking any medications. However, he reported recent use of LSD, cannabis, and psilocybin. The toxicological examination of urine and examinations carried out to exclude somatic causes of symptoms (examination of fundus oculi, biochemical screening) were negative, therefore an acute schizophreniform psychotic disorder according to ICD-10 criteria was operationally diagnosed, and treatment with risperidone (4-6 mg daily), methotrimeprazine (75-175 mg daily) and promethazine (100-175 mg daily) begun. After 6 days of treatment, psychotic symptoms further increased and it was decided to change the patient s medication: risperidone was discontinued completely and, a dose of 100 mg of zuclopenthixol acetate was administered three times by injection with 48-hour intervals between administrations. After the third dose (12th day after admission) paranoid delusions and anxiety subsided but massive adverse effects in the form of acute dystonia, followed by hypokinesia, hypomimia, and tremor occurred. As a response, biperiden (2-4 mg daily) and, again, peroral risperidone (4 mg daily) were introduced. However, during following 6 days, hypokinesia and tremor grew more severe and anxiety together with psychotic symptoms began to appear again in a form of paranoid and hypochondric delusions, which were not previously seen. EPS (repeated dystonia, hypokinesia and tremor) and psychotic symptomatology reached a peak and became more severe than the original symptomatology 18-days after initial admission when the patient left the health care facility and discontinued the therapy completely for two days. When the patient returned, olanzapine (10 mg daily) was initiated and amantadine (100 mg daily) and clonazepam (1,5 mg daily) were used as adjuvant medication. Over the next 10 days, all of the adverse extrapyramidal effects declined, and after increasing the olanzapine dose to 15 mg daily, an improvement of psychotic symptoms appeared. 3. Discussion and conclusion Spontaneous movements related to dose reduction of antipsychotics, in patients who are not diagnosed with tardive dyskinesia, are termed withdrawal dyskinesia [2]. Literature reports cases of dyskinesia appearing during the process of risperidone dose reductions [2,4]. In the present case, the increased manifestation of EPS symptoms occurred several days after the discontinuation of risperidone or zuclopenthixol. There were two peaks of EPS. The first one could be ascribed to zuclopenthixol injection, however the possibility that these symptoms could have been caused by risperidone withdrawal cannot be overlooked. The withdrawal-related effects may be mixed with adverse effects of a newly introduced antipsychotic. This should be always taken into account if adverse effects of the treatment occur shortly after discontinuation of one medication and the introduction of a new antipsychotic agent [6]. The second peak of EPS worsening appeared after discontinuation of all antipsychotics and was combined with the rapid deterioration in a psychotic symptomatology with a slightly different symptom profile and higher severity of psychotic symptoms. Patients who suffer from withdrawal-emergent EPS may also be more likely to manifest other withdrawal-related effects such as increased plasma prolactin levels [7] and so-called supersensitive psychosis [8]. According to one of the theories explaining the development of withdrawal dyskinesia, the blockade of dopamine receptors, induced by antipsychotic agents, results in up-regulation of receptors. When treatment with dopamine antagonists is discontinued, or the dose is reduced, the patient may be prone to an increased sensitivity to endogenous dopamine supersensitive psychosis [8] and withdrawal EPS [9]. The growing number of cases of supersensitivity psychosis after clozapine withdrawal suggest that others mechanisms, namely the supersensitivity of cholinergic, serotonergic and GABAergic system or their interaction can be the cause as well [10]. Adverse effects related to the discontinuation of antipsychotics may appear rapidly and show a tendency toward spontaneous subsidence. The adverse effects which arise during a medication change are often ascribed to the newly administered drug and may lead to a premature discontinuation of a new drug, which might otherwise be helpful to the patient [1]. Therefore the possibility of withdrawal-emergent extrapyramidal symptoms should be kept in mind; any changes in antipsychotic medication should be carefully considered and potential change of medication should be thoroughly planned. 663

Withdrawal related adverse effects of antipsychotic medication in a patient with first-episode schizophrenia References [1] T. J. Lambert, J Clin Psychiatry, 68 Suppl 6, 10 (2007) [2] V. S. Anand, M. J. Dewan, Ann Clin Psychiatry 8, 179 (1996) [3] M. Urbano, D. Spiegel, A. Rai, J Clin Psychopharmacol 27, 705 (2007) [4] K. Nishimura, M. Tsuka, N. Horikawa, Eur Neuropsychopharmacol 11, 323 (2001) [5] S. Komatsu, E. Kirino, Y. Inoue, H. Arai, Clin Neuropharmacol 28, 90 (2005) [6] P.J. Weiden, P. F. Buckley, J Clin Psychiatry 68 Suppl 6, 14 (2007) [7] R. L. Borison, Clin Ther 18, 592 (1996) [8] G. Chouinard, B. D. Jones, L. Annable, Am J Psychiatry 135, 1409 (1978) [9] K. L. Davis, G. S. Rosenberg, Biol Psychiatry 14, 699 (1979) [10] J. Moncrieff, Acta Psychiat Scand 114, 3 (2006) 664

Čes a slov Psychiat 2011; 107(6): 577 583 Aktivita CYP2D6 u pacientů léčených risperidonem souborný článek Richard Barteček 1 Jan Juřica 2 Jana Zrůstová 3 Eva Pindurová 1 Tomáš Kašpárek 1 Alexandra Žourková 1 1 Psychiatrická klinika LF MU a FN Brno 2 Farmakologický ústav LF MU Brno 3 Oddělení lékařské genetiky FN Brno Kontaktní adresa: MUDr. Richard Barteček Psychiatrická klinika LF MU a FN Brno Jihlavská 20 625 00 Brno e-mail: rbartecek@gmail.com Práce byla podpořena grantem NS 9676-4/2008 SOUHRN Barteček R, Juřica J, Zrůstová J, Pindurová E, Kašpárek T, Žourková A. Aktivita CYP2D6 u pacientů léčených risperidonem V reaktivitě pacientů na psychofarmaka existuje značná interindividuální variabilita. Farmakogenetika zkoumá možnost predikce odpovědi pacienta na léčbu. Jedním z kandidátů pro farmakogenetické testování je enzym CYP2D6, který metabolizuje několik psychofarmak včetně antipsychotika risperidonu. Risperidon a jeho metabolit 9OH-risperidon vykazují nezanedbatelné rozdíly, z nichž nejdůležitější je snížená prostupnost 9OH-risperidonu přes hematoencefalickou bariéru. Aktivitu CYP2D6 lze odhadnout genotypizací a určit fenotypizací např. dextromethorfanovým testem. Fenotypizace dokáže určit aktuální aktivitu enzymu, tedy sumu genetických vlivů i vlivů prostředí, včetně možného inhibičního vlivu některých léčiv nebo xenobiotik. CYP2D6 se může vyskytovat ve 4 fenotypických variantách, nejčastější je rychlý metabolizátor. Intermediární metabolizátor a pomalý metabolizátor mají sníženou, resp. nulovou aktivitu CYP2D6 a dle celé řady studií u nich lze očekávat vyšší výskyt a tíži nežádoucích účinků léčby. Čtvrtou variantou je ultrarychlý metabolizátor, u něhož lze očekávat nižší účinnost risperidonu. Vedle studií, které prokázaly výše zmíněný vliv rozdílných fenotypů CYP2D6 při léčbě risperidonem, existují studie, který takový vliv neprokázaly. Přesný dopad rozdílných fenotypů CYP2D6 proto zůstává nejasný a bude třeba dalších, zejména SUMMARY Barteček R, Juřica J, Zrůstová J, Pindurová E, Kašpárek T, Žourková A. CYP2D6 testing in patients treated with risperidone There is significant interindividual variability in patient reactivity to psychopharmacological treatment. Possibility to predict patient s response to pharmacological treatment is the focus of pharmacogenetics. One of the promising candidates for pharmacogenetic testing is CYP2D6, enzyme metabolising several psychoactive drugs including antipsychotic risperidone. Risperidone and its metabolite 9OH-risperidone show considerable differences, one of which is poorer blood-brain barrier permeability of 9OH-risperidone. CYP2D6 activity can be estimated by genotypization and phenotypization. Phenotypization is able to determine actual level of enzyme activity even if the CYP2D6 activity has been reduced by CYP2D6 inhibitors. Four CYP2D6 phenotypic variants exist. The most frequent is extensive metaboliser. Intermediate metaboliser and poor metaboliser have reduced CY- P2D6 activity and according to number of studies there is higher possibility and severity of risperidone adverse effects. The last variety of CYP2D6 phenotype is ultra-rapid metaboliser with possible lower risperidone efficacy. Besides the high number of studies demonstrating effect of CYP2D6 variability, there are studies which did not show its significant impact. Exact amount of CYP2D6 variability effect is therefore still unclear and further studies has to be conducted strana 327

Čes a slov Psychiat 2011; 107(6): 233 243 prospektivních studií, aby bylo možno určit, jestli má farmakogenetické testování CYP2D6 při léčbě risperidonem své místo v klinické praxi. Klíčová slova: farmakogenetika, cytochrom P450, CYP2D6, risperidon, 9OHrisperidon. to find out whether CYP2D6 pharmacological testing has its place in clinical setting. Key words: pharmacogenetics, cytochrome P450, CYP2D6, risperidone, 9-hydroxy-risperidone. ÚVOD Základní terapeutickou modalitou u psychotických poruch je farmakoterapie. Z klinické zkušenosti je patrné, že mezi pacienty existuje výrazná interindividuální variabilita v reaktivitě na užitá léčiva. Někteří pacienti dosáhnou při užívání zvolené medikace remise, u jiných se dosáhne jen částečného zlepšení a existují i takoví, u nichž nelze sledovat účinek léku vůbec. U některých pacientů se navíc projevují nezanedbatelné nežádoucí účinky. Možnost predikovat reaktivitu pacienta na různá léčiva na základě objektivních, dobře měřitelných veličin se tudíž jeví jako žádoucí postup, který by mohl vést k individualizaci léčby. Jednou z možností, jak nahlédnout na heterogenitu odpovědi na léčbu psychofarmaky, jsou genetické přístupy. V r. 1959 použil Vogel poprvé termín farmakogenetika, 1 mnohem později se objevil termín farmakogenomika. 2 Základní hypotézou těchto oborů je, že interindividuální variabilita v odpovědi na léčiva je podmíněna genetickými faktory. Farmakogenetika zkoumá vliv jednotlivých mutací konkrétního genu na efekt léčiva, farmakogenomika pak tuto souvislost zkoumá z pohledu celého genomu. Sledován pak může být přímo genotyp, nebo mohou být sledovány produkty exprese jednotlivých genů fenotyp. Výzkum variability na úrovni fenotypu se objevil již v 50. letech minulého století, kdy technologie umožnila identifikaci rozdílů v enzymech metabolizujících léčiva a detekci rozdílných metabolitů užívaných látek. 1 Byl to tedy vliv farmakokinetických faktorů na terapeutickou odpověď, který byl zkoumán jako první. Nejdůležitější rodinou enzymů metabolizujících léčiva je cytochrom- P450-oxidoreduktasa s celou plejádou isoenzymů. Enzymy mohou být zkoumány jednak z hlediska fenotypu stanovováním aktivity enzymu podáním testovací látky a následným stanovením metabolického poměru této látky a jejího metabolitu, 3 jednak z hlediska genotypu porovnáním se zdravou kontrolou. Teprve mnohem později začal výzkum variability farmakodynamických faktorů a jejího vlivu na odpověď na léčbu. Tento výzkum začal zprvu jako způsob zhodnocení terapeutických cílových struktur receptorových systémů, které jsou cílem působení antipsychotik. 1 Většina moderních antipsychotik vykazuje afinitu k široké paletě receptorů různých neurotransmiterů včetně dopaminu, serotoninu, histaminu, acetylcholinu, glutamátu, noradrenalinu. Pokud zvážíme rozsah genetické variability v kombinaci s velkým množstvím vzájemně se ovlivňujících potenciálních cílů léčiva, rozsah variability na farmakodynamické úrovni pravděpodobně značně převyšuje variabilitu na úrovni farmakokinetické. Faktem zůstává, že variabilita metabolismu léčiv je mnohem lépe prozkoumaná. Kupř. u CYP2D6 bylo identifikováno více než 70 SNP (jedno-nukleotidových polymorfismů single-nucleotid polymorphism) s dobře definovaným dopadem na aktivitu enzymu, zatímco u nejnadějnějšího cíle léčiva D2 dopaminového receptoru bylo nalezeno pouze několik SNP bez jasně definovaného funkčního dopadu. 2 Možnost individualizace léčby s přihlédnutím k farmakokinetickým faktorům je tak mnohem blíž praktickému využití než individualizace na základě faktorů farmakodynamických. Tento článek se zabývá modelovým příkladem možného vztahu mezi genem, produktem genu a terapeutickou odpovědí na léčivo. Zmíněným modelovým příkladem je vztah mezi variabilitou genu pro CYP2D6, aktivitou enzymu CYP2D6 a efektem risperidonu, který je CYP2D6 preferenčně metabolizován. Protože CYP2D6 metabolizuje velké množství látek užívaných v psychiatrii, stala se psychiatrie jednou z prvních oblastí medicíny vhodnou pro klinické farmakogenetické testování. 2 V následujícím textu budou na modelovém příkladě popsána teoretická východiska farmakogenetického výzkumu, použité metody, studie zkoumající klinický dopad interindividuální variability a rovněž možné přenesení takto získaných poznatků do praxe. CYP2D6 CYP jako I. fáze metabolismu xenobiotik Cytochrom P450 (CYP) představuje hlavní metabolickou cestu mnoha léčiv a významný zdroj interindividuální variability odpovědi pacientů na léčbu. Systém CYP obsahuje strana 328

Čes a slov Psychiat 2011; 107(6): 577 583 nejvýznamnější enzymy I. fáze metabolismu xenobiotik. Ve vysokém množství jsou obsaženy mimo jiné v membránách endoplasmatického retikula jater, ale také v buňkách střevní stěny, v menší míře pak v buňkách ledvin, plic a mozku. V lidském genomu je 57 genů pro různé isoformy CYP. Každý gen je pojmenován zkratkou CYP, číslem, které udává rodinu, do níž patří (40% shoda v sekvenci aminokyselin), písmenem, které určuje podrodinu (55% shoda v sekvenci aminokyselin), a konečně číslem, které určuje konkrétní enzym. V posledních letech byla identifikována celá řada konkrétních isoforem, z nichž každá vykazuje specifitu pro určité substráty. Z těchto enzymů jsou nejdůležitější CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 a CYP3A4, které metabolizují 90 % všech léčiv metabolizovaných systémem CYP. Mnoho z léků metabolizovaných CYP patří mezi antidepresiva a antipsychotika. 4 S ohledem na metabolismus antipsychotik je nejvýznamnější isoforma CYP2D6 (metabolizuje risperidon, chlorpromazin, haloperidol, aripiprazol), CYP3A4 (metabolizuje quetiapin, v malé míře také klozapin, risperidon, ziprasidon), CYP1A2 (metabolizuje chlorpromazin, klozapin a olanzapin) a CYP2C19 (metabolizuje v malé míře klozapin). 1 CYP2D6 a jeho variabilita fenotypická, genotypická, jejich vzájemný vztah CYP2D6 je isoenzym, jenž biotransformuje až 30 % léčiv metabolizovaných CYPy. CYP2D6 vykazuje největší interindividuální variabilitu ze všech cytochromů. Za to mohou faktory genetické, k široké variabilitě však přispívá možnost ovlivnění aktivity CYP2D6 jinými látkami inhibitory jeho aktivity. Gen pro CYP2D6 se nachází na dlouhém raménku 22. chromosomu. 2 Jednotlivé alely tohoto genu mohou podmiňovat expresi plně funkčního enzymu, částečně funkčního enzymu, nebo zcela nefunkčního enzymu. Nejčastější alelou v naší populaci je CYP2D6*1 podmiňuje expresi plně funkční formy, nejčastějšími dysfunkčními alelami jsou CYP2D6*3, *4 a *5. 4 Čtyři hlavní fenotypické varianty jsou: ultra-rychlý metabolizátor (ultra-rapid metaboliser, UM), jenž vykazuje vyšší než trojnásobnou aktivitu oproti nejčastější variantě, kterou je rychlý metabolizátor (extensive metaboliser, EM). Pomalý metabolizátor (poor metaboliser, PM) vykazuje nulovou aktivitu CYP2D6. Aktivita intermediárního metabolizátora (intermediate metaboliser, IM) je v oblasti mezi EM a PM. 5 EM má dvě plně funkční alely genu pro CYP2D6, IM má jednu alelu podmiňující enzym s nulovou aktivitou a jednu alelu s částečnou aktivitou. PM má obě alely podmiňující zcela nefunkční enzym; výše zmiňované alely CYP2D6*3, *4 a *5 odpovídají za 98 % všech PM v populaci. 4 UM pak má více kopií plně funkční alely, se zvýšenou aktivitou se pojí pouze přítomnost multiplikací alel podmiňující expresi aktivního enzymu 2D6*1XN, *2XN a *35XN; existují však i jedinci, kteří jsou fenotypicky UM, ale bez duplikace nebo multiplikace plně funkční alely. Přesný mechanismus zvýšení aktivity CYP2D6 u těchto jedinců není znám. 2 Různý výskyt v populaci Zastoupení jednotlivých fenotypů se v různých populacích liší. Dle de Leona je v americké populaci fenotyp UM zastoupen v 1,5 %, přičemž v populaci bílých Američanů je to 1,4 % a v populaci Afroameričanů 2,7 %; IM jsou mnohem častější ve východoasijské populaci než v evropské. 5 U Evropanů se vyskytuje 7 % PM, zatímco u Asiatů a Afričanů asi 1 3 %. 5 Udávaná procenta se však dle různých zdrojů mohou lišit. Pro srovnání zastoupení některých alel pro gen CYP2D6 v různých populacích v tab. 1. Inhibitory a induktory CYP2D6 metabolizuje velké množství substrátů, a tak je zde velký potenciál pro nejrůznější lékové interakce. Pacienti se schizofrenií mohou užívat léky v nejrůznějších kombinacích, avšak u těchto jedinců je vyšší riziko nežádoucích důsledků polypragmazie. Aktivita CYP2D6 může být snížena inhibitory. Inhibice CYP může být reverzibilní nebo ireverzibilní. V případě reverzibilní inhibice je funkce daného CYP okamžitě po vyloučení inhibitoru obnovena, ale v případě ireverzibilní inhibice musí být syntetizován nový enzym, aby se obnovila aktivita CYP. Reverzibilní inhibice je závislá na dávce, vlastnostech molekuly a vylučovacím poločase daného inhibitoru, přičemž při metabolizaci inhibitoru mohou vzniknout látky s odlišným typem inhibice i polo- Tab. 1. Aktivita enzymu CYP2D6 a frekvence u vybraných alel a populací. Sestaveno dle Fleemana 4 a Laiky 34 Alela Funkce Evropa Švédsko USA (Kavkazská pop.) USA (Afroameričani) *1 Normální 33 36 % 36,7 % 27 40 % 29 35 % *2 Normální 22 33 % 32,4 % 26 34 % 18 27 % *3 Ztráta 1 4 % 1,4 % 1 1,4 % < 1 % *4 Ztráta 12 23 % 24,4 % 18 23 % 6 9 % *5 Ztráta 2 7 % 4,3 % 2 4 % 6 7 % *6 Ztráta 1 1,4 % 0,9 % 1 % < 1 % *9 Snížená 0 2,6 % - 2 3 % < 1 % *10 Snížená 1,4 2 % - 2 8 % 3 8 % *17 Snížená < 1% - < 1 % 15 26 % *41 Snížená 30 40 % - - - *1XN Zvýšená < 1 % - < 1 % 1,3 % *2XN Zvýšená 1,5 % - < 1 % 1,3 % *4XN Ztráta < 1 % - < 1 % 2,3 % strana 329

Čes a slov Psychiat 2011; 107(6): 233 243 časem vylučování. Ireverzibilní inhibice je navíc závislá na čase nutném pro syntézu nového enzymu. Mezi inhibitory CYP2D6 patří látky, které se při léčbě s risperidonem občas kombinují, některá antipsychotika (kupř. chlorpromazin, haloperidol), antidepresiva (fluoxetin, paroxetin, bupropion, klomipramin, imipramin, citalopram a fluvoxamin poslední dva jmenované jako slabé inhibitory), ale i jiné látky. Podrobnější seznam inhibitorů CYP2D6 včetně jejich účinku je uveden v tab. 2. Dle většiny zdrojů není možné, na rozdíl od některých jiných isoenzymů CYP, aktivitu CYP2D6 zvýšit induktory, 5 výjimečně se uvádí možná indukce rifampicinem a dextromethorfanem. 6 Možnosti vyšetřování genotypu Tab. 2. Inhibitory CYP2D6 a jejich účinek na enzym, dle Drug interaction table na stránkách Oddělení klinické farmakologie, Indiana University 7 Látka Skupina Účinek jako inhibitor amiodaron antiarytmikum střední amitriptilin antidepresivum slabý bupropion antidepresivum střední celecoxib NSAID střední chlorpheniramin antihistaminikum střední chlorpromazin antipsychotikum střední cimetidin H2-antihistaminikum střední cinacalcet kalcimimetikum silný citalopram antidepresivum slabý clomipramin antidepresivum střední desipramin antidepresivum slabý diphenhydramin antihistaminikum střední doxepin antidepresivum střední duloxetin antidepresivum střední fluvoxamin antidepresivum slabý fluoxetin antidepresivum silný halofantrin antimalarikum střední haloperidol antipsychotikum střední hydroxyzin antihistaminikum slabý imipramin antidepresivum střední methadon opioid střední metoclopramid prokinetikum střední moclobemid antidepresivum střední paroxetin antidepresivum silný pimozid antipsychotikum střední propafenon antiarytmikum střední chinin/chinidin antimalarikum silný ritonavir virostatikum střední sertralin antidepresivum slabý terbinafin antimykotikum střední thioridazin antipsychotikum střední ticlopidin antitrombotikum střední Díky znalostem o vztahu genotypu a fenotypu CYP2D6 lze funkci enzymu odhadnout genotypizací. V minulosti užívané metody analýza restrikčních fragmentů (RFLP) s následným Southernovým přenosem a metoda jednovláknového konformačního polymorfismu (SSCP) jsou v současnosti nedostatečně specifické. Pro rychlou identifikaci lze použít alelově specifickou polymerázovou reakci (AS-PCR), jejíž výhodou je minimální riziko kontaminace a vyloučení falešně negativních výsledků. 7 Pro detekci velkých genových delecí a duplikací a pro detekci hybridních genů a strukturních přestaveb slouží long range PCR. 8 Mezi moderní metody DNA diagnostiky patří PCR v reálném čase, při níž jsou detekovány významné polymorfismy nulových alel *3, *4, *6, *7 a *8 pomocí fluorescenčně značených sond. 9 Nejvýznamnější detekční metodou je sekvenování, které zachytí všechny sekvenční změny ve sledovaných úsecích díky jeho vysoké spolehlivosti a citlivosti. Sekvenování je považováno za referenční metodu, která již nevyžaduje kontrolní materiál. Jinou obdobou sekvenování je pyrosekvenování založené na detekci uvolňovaného pyrofosfátu. 10 V posledních letech se stává genetické testování dostupnější díky novým technologiím, jako jsou DNA mikročipy (DNA microarrays), kupř. CYP450 GeneChip a novější AmpliChip CYP450, jejichž podstatou je hybridizace na skleněném mikročipu s fluorescenčním značením a které umožňují testování tisíců vzorků současně. 11 Jedním z prvních kandidátů pro využití této technologie v praxi je právě gen pro CYP2D6. 12 Výhodou je rychlost a spolehlivost metody, nevýhodou její finanční náročnost. V současnosti užívané DNA mikročipy jsou schopny testovat stovky SNP z mnoha genů. AmpliChip CYP450 je první takový mikročip, který byl schválen FDA pro klinické využití v USA v lednu 2005. 11 Při úrovni současných znalostí o dopadu polymorfismů různých genů však zatím není možné na základě genetického testování přistoupit k předepisování léků pacientovi na míru. Tato technologie může nalézt své uplatnění v identifikaci pacientů, pro něž může být daný lék nebezpečný, nebo může vést k úpravě dávkování. 2 Možnosti vyšetřování fenotypu Vzhledem k výše uvedenému tedy možnosti ovlivnit funkci CYP2D6 jinými látkami existuje možnost, že fenotyp odhadnutý pomocí genotypizace a skutečná aktivita enzymu se mohou lišit. V těchto situacích se jeví výhodná možnost stanovit fenotyp CYP2D6 přímo. Stanovením fenotypu je možné zjistit aktuální stav biotransformačních procesů tedy sumu efektů vnitřního i zevního prostředí v konkrétním čase. Nejběžnějším způsobem zjištění metabolické aktivity vybrané isoformy CYP je sledování metabolismu selektivního markeru, tj. látky, která se v ideálním případě metabolizuje výhradně danou isoformou. Způsob metabolizace léčiva neboli příslušnost k fenotypu je určena stanovením poměru koncentrací mateřského léčiva a jeho metabolitu v krvi nebo moči. Tento parametr se nazývá metabolický poměr ( metabolic ratio ). Ideální marker by měla být látka bezpečná s ohledem na její použití in vivo, měla by také být snadno dostupná a snadno stanovitelná v biologických vzorcích (včetně hlavních metabolitů). Farmakokinetika ideálního markeru je určena především jeho metabolizací (nikoli vylučováním látky v nezměněné podobě). 13 Sledováním úbytku koncentrace mateřské látky a nárůstu koncentrace metabolitu tak můžeme usoudit na metabolickou aktivitu dané isoformy a případně příslušnosti jedince ke skupině fenotypu (PM, IM, EM, UM). Stejný princip je již strana 330

Čes a slov Psychiat 2011; 107(6): 577 583 také v současnosti využíván při vývoji léčiv, kde se rutinně provádí testování vlivu léčiva na isoformy CYP ještě před uvedením na trh. 3 Pro sledování fenotypu CYP2D6 je používána markerová reakce O-demethylace dextromethorfanu na dextrorfan (tzv. dextromethorfanový test). Pacientům je podáno perorálně 30 mg dextromethorfanu a v séru pacientů 3 hodiny po podání pak jsou stanoveny koncentrace mateřské látky (dextromethorfanu, DEM) i metabolitu (dextrorfanu, DOR). RISPERIDON A JEHO METABOLIT Tab. 3. Hodnoty K i risperidonu a paliperidonu na vybraných receptorech dle screeningu psychoaktivních látek NIMH 16 Receptor Risperidon (K i ) Paliperidon (K i ) D1 460 41 D2 4 2,8 D3 10 6,9 D4 9 54,3 5HT1A 210 480 5HT2A 0,5 1,2 5HT2C 25 48 Alfa1 0,7 10,1 H1 20 3,4 M1 > 10 000 > 10 000 Obecně o risperidonu Risperidon je dle současných vodítek lékem první volby u schizofrenie. Jedná se o antipsychotikum patřící mezi deriváty benzisoxazolu. Risperidon je selektivní monoaminergní antagonista s vysokou afinitou k 5HT2, D2, alfa1, alfa2 adrenergním a H1 histaminergním receptorům. Risperidon je rovněž antagonistou jiných receptorů, na které se však váže s nižší afinitou; má nízkou až střední afinitu k 5HT1C a 5HT1D a 5HT1A receptorům a nízkou afinitu k D1 dopaminergním receptorům. Risperidon vykazuje nulovou afinitu k muskarinovým a beta1 a beta2 adrenergním receptorům. 14 Risperidon je rovněž substrátem pro p-glykoprotein, 5 což je membránový transportní protein ovlivňující prostup xenobiotik skrz hematoencefalickou bariéru (viz níže). Metabolismus risperidonu Hlavní cestou metabolizace risperidonu je 9-hydroxylace odehrávající se především v játrech. Minoritní cestou je N-dealkylace. 14 9-hydroxylaci risperidonu katalyzuje predominantně CYP2D6, přičemž vznikají dva enantiomery (+)-9OH-risperidon a ( )-9OH-risperidon. 5 Existují údaje napovídající, že na tvorbě 9OH-risperidonu se podílí rovněž CYP3A4; usuzuje se tak pro změny v koncentraci risperidonu a 9OH-risperidonu po podání inhibitorů a induktorů CYP3A4. 5 Risperidon neinhibuje CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19 ani CYP3A4, jeho mírná inhibice CYP2D6 je při terapeutických dávkách risperidonu pravděpodobně klinicky nevýznamná. 14 Risperidon a jeho metabolity jsou eliminovány močí a v malé míře faeces. 14 Rozdíly mezi risperidonem a jeho metabolitem Hlavní metabolit risperidonu 9OH-risperidon dal vznik samostatně užívanému antipsychotiku paliperidonu. Přípravek Invega obsahuje směs obou enantiomerů, které mají shodné vlastnosti a shodnou farmakodynamickou aktivitu. 15 Dle údaje výrobce je paliperidon antagonistou D2 a 5HT2A receptorů, stejně jako antagonista alfa1 a alfa2 adrenergních receptorů a H1 receptorů, přičemž nemá afinitu k cholinergním ani beta adrenergním receptorům. 15 Takto popsaný farmakodynamický profil se výrazně neliší od farmakodynamického profilu risperidonu. Existují však údaje o tom, že se tyto dvě látky ve svém účinku přece jen liší. Údaje v databázi Programu screeningu psychoaktivních léků NIMH napovídají, že risperidon má vyšší afinitu k 5HT2A, alfa1 a alfa2 adrenergním receptorům. 16 V tab. 3 jsou hodnoty Ki risperidonu a paliperidonu na některých receptorech. Z dalších zdrojů je pak patrné, že paliperidon má delší biologický poločas a podstupuje pouze omezenou jaterní metabolizaci CYP2D6 a 3A4, 59 % dávky paliperidonu je vyloučeno v nezměněné formě ledvinami. 15 Jedním z nejdůležitějších rozdílů 9-OH-risperidonu oproti risperidonu je prostup skrz hematoencefalickou bariéru. Dle provedených analýz se jeví, že risperidon prostupuje hematoencefalickou bariérou snadněji než 9OH-risperidon. 17 Tento fakt lze vysvětlit odlišnou afinitou obou látek k p-glykoproteinu. P-glykoprotein je ATPdependentní efluxní pumpa, která se vyvinula v různých tkáních jako mechanismus protekce před xenobiotiky. P-glykoprotein se za fyziologických podmínek nachází v tenkém střevě, ledvinách a rovněž v hematoencefalické bariéře. 5 V hematoencefalické bariéře se tento transportér uplatňuje v regulaci prostupu látek skrz bariéru. P-glykoprotein má vyšší afinitu k 9OH-risperidonu než k risperidonu, 17 to znamená, že je přečerpáván skrz hematoencefalickou bariéru zpět do krevního oběhu intenzivněji. Díky zmíněným údajům je zřejmé, že risperidon a 9OHrisperidon nejsou shodné molekuly s jediným rozdílem v přítomnosti či nepřítomnosti významné jaterní metabolizace, ale že se obě látky liší jak ve svých farmakokinetických, tak farmakodynamických vlastnostech, a tedy pravděpodobně i v účinnosti a profilu nežádoucích účinků. 18 DŮSLEDKY INTERINDIVIDUÁLNÍ VARIABILITY Jak již bylo řečeno hlavní enzym metabolizující risperidon je vysoce polymorfní a podmiňuje tak interindividuální variabilitu v metabolismu risperidonu. Tato skutečnost má několik důsledků: Rozdílné plazmatické hladiny Laboratorně zjistitelným důsledkem rozdílného fenotypu CYP2D6 jsou rozdílné plazmatické hladiny risperidonu a 9OH-risperidonu, resp. rozdílný poměr risperidon/9-oh risperidon. 19,20,21 Poměr je nejvyšší u PM a nejnižší u UM. 20 strana 331

Čes a slov Psychiat 2011; 107(6): 233 243 To znamená, že u pomalých metabolizátorů byla větší frakce risperidonu než u IM, EM a UM. Aktuální fenotyp predikoval poměr risperidon/9-oh risperidon daleko lépe než genotyp. 21 To znamená, že environmentální faktory, v tomto případě podávání inhibitorů CYP2D6, měly svůj význam. Podání inhibitorů mělo nejmenší dopad u PM, zatímco u ostatních subjektů vzrostl poměr ve prospěch risperidonu výrazně aktivita CYP2D6 se snížila. 20 CYP2D6 se pravděpodobně podílí také na metabolizaci 9OH-risperidonu. Ve studii na zdravých dobrovolnících bylo při současném užití paliperidonu a paroxetinu (inhibitor CYP2D6) patrné zvýšení plazmatické hladiny paliperidonu v průměru o 16 %. 15 Teoretické klinické rozdíly Pokud je u pacientů s různým fenotypem CYP2D6 různý poměr risperidonu a 9OH-risperidonu při terapii risperidonem, a risperidon a paliperidon mají odlišné vlastnosti, lze předpokládat i rozdílnou účinnost risperidonu u různých metabolizátorů. U pomalých metabolizátorů lze teoreticky očekávat minimální metabolizaci, a tedy i vyšší poměr risperidonu, který proniká hematoencefalickou bariérou snadněji než 9OHrisperidon. Hladina aktivní látky by tak byla v mozku vyšší. Proto lze očekávat vyšší účinnost risperidonu při standardní dávce a vyšší závažnost nežádoucích účinků. U PM bude rovněž metabolismus risperidonu pravděpodobně více závislý na alternativních cestách metabolizace, zejména na CYP3A4. Tento efekt se v menší míře projevuje také u IM. Dále je pak u intermediárních metabolizátorů nutná obezřetnost při užívání inhibitorů CYP2D6, které mohou IM změnit fenotypicky na PM se všemi důsledky z toho vyplývajícími. U ultra-rychlých metabolizátorů pak můžeme očekávat nižší poměr risperidon/9oh-risperidon. Velká část risperidonu bude tedy metabolizována na 9OH-risperidon, který hůře prochází skrz hematoencefalickou bariéru, a lze tedy očekávat nižší účinnost risperidonu na příznaky schizofrenie. Studie CYP2D6 při léčbě risperidonem V průběhu uplynulých let se mnoho autorů pokoušelo zjistit vztah mezi aktivitou CYP2D6 a terapeutickou odpovědí pacientů na léčbu risperidonem. Údaje z literatury jsou rozporné. Studie výrobce risperidonu předpokládaly, že risperidon a 9OH-risperidon mají shodné farmakodynamické a farmakokinetické vlastnosti. 22 Toto tvrzení vycházelo ze studie, ve které byl měřen nárůst prolaktinu po jedné dávce risperidonu u zdravých dobrovolníků zahrnujících pouze 11 PM. 19 Účinnost risperidonu by dle tohoto předpokladu závisela na aktivní frakci, tedy součtu koncentrací risperidonu a 9OH-risperidonu. Variabilita CYP2D6 by při léčbě risperidonem potom ztrácela na významu. Užití jedné dávky u zdravých dobrovolníků lze však jen obtížně srovnávat s běžnou klinickou praxí. V pilotní studii metabolismu risperidonu mělo všech pět identifikovaných PM nežádoucí účinky risperidonu, zatímco poměr pacientů s nežádoucími účinky byl u EM nižší. 23 V následujících letech bylo provedeno několik dalších studií, které nenalezly souvislost mezi aktivitou CYP2D6 a účinností a snášenlivostí risperidonu, 24,25,26,27 i když studie měřící plazmatické hladiny risperidonu a jeho hlavního metabolitu vesměs potvrdily závislost tohoto poměru na aktivitě CYP2D6. 24,25 Rovněž japonská studie na 136 pacientech nenalezla vztah mezi alelami CYP2D6*4, CYP2D6*10 a klinickým výsledkem při léčbě risperidonem, u této studie však byl sledován pouze výskyt dvou výše zmíněných alel a nebyl sledován fenotyp. 28 Na druhou stranu mimo již zmiňované pilotní studie metabolismu risperidonu 23 existují i další zprávy, které prokazují význam variability CYP2D6 při léčbě risperidonem. Ve dvou kazuistických sděleních byla konstatována nutnost vyšší dávky pro udržení účinnosti risperidonu u UM. 29,30 Rovněž existuje kazuistické sdělení, popisující vznik závažných extrapyramidových nežádoucích účinků při léčbě risperidonem u PM. 31 V jedné studii na 35 pacientech bylo sledováno signifikantní prodloužení QTc u pacientů s jednou funkční alelou pro CYP2D6 na rozdíl od pacientů se dvěma funkčními alelami. 32 Ve studii na 25 dětech s diagnózou pervazivních vývojových poruch léčených risperidonem byla nalezena pozitivní korelace počtu funkčních alel pro CYP2D6 a plazmatických koncentrací prolaktinu. 33 Ve velké deleonově studii zaměřené na účinnost a snášenlivost risperidonu v závislosti na variabilitě CYP2D6 bylo zařazeno 360 pacientů léčených risperidonem a 252 pacientů, kterým byl risperidon z nejrůznějších důvodů vysazen. PM měli v této studii více než trojnásobné riziko závažných nežádoucích účinků risperidonu (OR = 3,4) a až šestinásobné riziko (OR = 6,0) ukončení léčby risperidonem pro závažné nežádoucí účinky. 12 Dle jiných zdrojů je fenotyp PM příčinou 16 % nežádoucích účinků při léčbě risperidonem a 9 % všech ukončení léčby risperidonem. 11 Většina studií se zabývala pouze klinickým dopadem extrémních fenotypů (UM, resp. PM) a problematika IM byla sledována zejména z farmakokinetického hlediska. Že to nemusí být přístup zcela opodstatněný, ukázala studie Laiky z roku 2009. 34 Do této studie byli zařazeni pacienti léčení pro psychotické i afektivní poruchy, užívající antidepresiva nebo antipsychotika. Bohužel ani jeden pacient neužíval risperidon. Výsledky této studie však napovídají, že fenotyp IM může být klinicky významný, proto je zmiňován i na tomto místě. IM měli v této studii nižší pravděpodobnost odpovědi na léčbu substráty CYP2D6 a vyšší pravděpodobnost odpovědi na léčbu léky CYP2D6 nemetabolizovanými. IM léčení vyššími dávkami substrátů CYP2D6 měli signifikantně více NÚ než IM léčení nižšími dávkami, EM léčení substráty CYP2D6 i IM léčení léky nemetabolizovanými CYP2D6. A konečně u IM nižší dávka nesnižovala pravděpodobnost, že pacient bude respondér. Dle Laiky jsou tato zjištění o to závažnější, že v posledních letech se díky objevu alely CYP2D6*41 dle některých zdrojů předpokládá, že v evropské populaci je IM asi 30 40 %. 34 Farmakoekonomika a cost-effectiveness Naskýtá se otázka, jestli je testování aktivity CYP2D6 u pacientů se schizofrenií při současné ceně dostupných strana 332

Čes a slov Psychiat 2011; 107(6): 577 583 testů ekonomicky výhodné. V literatuře existuje pouze málo analýz na toto téma. Fleemanova metaanalýza a review: 4 Fleeman et al. se ve svém rozsáhlém přehledu a metaanalýze zabývali rovněž otázkou klinické a ekonomické výhodnosti genotypizace CYP2D6. V literatuře do roku 2008 byla nalezena jen jediná farmakoekonomická studie, která se navíc týkala pouze testování CYP2D6 při užívání antidepresiv. Fleeman svou ekonomickou analýzu uzavírá tvrzením, že nedostatek údajů zatím neumožňuje jednoznačně určit ekonomickou výhodnost testování CYP2D6 u pacientů trpících schizofrenií ani vůbec zkonstruovat ekonomický model potenciálního rutinního testování. Při současné ceně testů by však stačilo prokázat zisk 0,01 QUALY (Quality Adjusted Life Years), aby takové testování dosáhlo současně přijímaného standardu ekonomické výhodnosti. Fleeman proto doporučuje provést další studie, které by měly poskytovat údaje o senzitivitě a specificitě použitých testů a poskytnout úplná data ohledně genotypů pacientů. Zejména je pak nutné získat další důkazy, které by lépe objasnily vztah mezi genotypem a fenotypem CYP, další studie by dále měly brát v potaz také environmentální faktory, jako je konkomitantní medikace a kouření. Studie Rodriguez-Antony 2009: 35 Nejnovější studie Institutu prospektivních technologických studií (JRC- IPTS) při Evropské komisi, jež získala data od pacientů užívajících risperidon v Německu, Španělsku a USA, sice prokázala, že PM mají vyšší riziko výskytu závažných nežádoucích účinků, dále však bylo zjištěno, že k důkladné farmakoekonomické analýze testování CYP2D6 není dostatečné množství klinických a ekonomických dat týkajících se nežádoucích účinků risperidonu, a doporučuje se další provádění zejména prospektivních studií. Z výše uvedeného vyplývá, že o ekonomické výhodnosti či nevýhodnosti testování CYP2D6 u pacientů se schizofrenií v současnosti není dostatečné množství údajů a bude třeba ještě dalšího výzkumu. Doporučení pro praxi V současné době neexistuje dostatek údajů, které by ospravedlnily rutinní užívání testování CYP2D6 u všech pacientů před nasazením risperidonu. Toto testování může nalézt své místo u pacientů s výraznými nežádoucími účinky nebo nedostatečnou účinností risperidonu. Nelze také pominout fakt, že s narůstající dostupností genetického testování může být u některých pacientů genotyp genu pro CYP2D6 znám díky vyšetření provedenému v minulosti z indikace lékaře jiné odbornosti. Zejména na základě dat ze své největší studie 12 a na základě klinické zkušenosti deleon navrhl doporučení pro praxi týkající se dávkování risperidonu. Obecně u prokázaných PM navrhuje snížit dávkování risperidonu na poloviční dávku u průměrného dospělého PM by tak úvodní dávka byla 0,5 1 mg risperidonu pro die, průměrná dávka 2 mg a maximální 3 mg pro die. V případě současného podávání inhibitorů CYP2D6 navrhuje vydělit dávku koeficientem 1,3. U průměrného dospělého by pak při současném užívání inhibitorů byla úvodní dávka 0,75 1,5 mg pro die, průměrná dávka 3 mg pro die a maximální dávka 4 mg pro die. V případě současného podávání fluoxetinu pak navrhuje užívat dávkování, jako by byl pacient PM. 5 Laika pak dle výsledků výše citované studie doporučuje rozdílnou strategii při nonresponzi na substráty CYP2D6 u EM a IM. U EM doporučuje navýšení dávky medikace, zatímco u IM doporučuje raději změnu medikace za lék CYP2D6 nemetabolizovaný. U IM totiž ani nízká dávka substrátu CYP2D6 nesnižovala pravděpodobnost pozitivní léčebné odpovědi. 34 Naskýtá se otázka, proč u pacientů neužít místo risperidonu přímo paliperidon a minimalizovat tak dopad variability CYP2D6. Jak bylo zmíněno, mezi risperidonem a paliperidonem existuje více rozdílů než jen rozsah, v jakém jsou tyto látky metabolizovány CYP2D6, a není vyloučeno, že jejich účinnost a profil nežádoucích účinků bude jiný. Účinnost a snášenlivost risperidonu je lépe prozkoumaná díky tomu, že je tato látka na trhu mnohem déle než paliperidon. Je rovněž pravděpodobné, že léčebná odpověď na paliperidon je díky vyšší afinitě 90H-risperidonu k p-glykoproteinu mnohem více ovlivněna interindividuální variabilitou p-glykoproteinu, o níž existuje ještě méně údajů než o variabilitě v CYP2D6. Užití paliperidonu místo risperidonu dále komplikují v současnosti jasně definovaná preskripční omezení. Paliperidon tedy nemůže být vnímán jako náhrada risperidonu s výhodou obcházení jaterního metabolismu, ale jako odlišné antipsychotikum. ZÁVĚR Farmakogenetika představuje nadějnou cestu, jak predikovat odpověď pacientů na léčbu, a je tedy prvním krokem k preskripci léků pacientovi na míru. Testování genotypu a fenotypu je mnohem lépe prozkoumáno na úrovni farmakokinetické to znamená na úrovni enzymů metabolizujících léčiva. Jak bylo ukázáno na příkladu CYP2D6 a risperidonu, k tomu, aby bylo farmakogenetické testování enzymů metabolizujících léčiva možné, musí být nejprve identifikován vztah mezi genotypem a fenotypem, musí být prokázáno, že se zvažované léčivo a jeho metabolit ve svých vlastnostech liší a že se liší jejich plazmatické hladiny u jedinců s různým fenotypem. Tyto předpoklady je pak nutno ověřit v řadě klinických studií. Jako poslední krok musejí být vyvinuty dostatečně levné a efektivní metody ke stanovení genotypu, jež umožní zavedení farmakogenetického testování do praxe. U CYP2D6 a risperidonu již existuje dobře definovaný vztah mezi genotypem a fenotypem. Bylo rovněž prokázáno, že se u různých jedinců liší poměr risperidonu a jeho metabolitu 9OH-risperidonu v krvi. Přes prvotní opačné zprávy bylo později prokázáno, že risperidon a jeho metabolit mají odlišné vlastnosti, a pravděpodobně tedy i účinnost a profil nežádoucích účinků. Studie, které měly potvrdit předpoklad, že se účinnost a snášenlivost risperidonu u jedinců s různým fenotypem liší, přinesly zatím rozporuplné výsledky. Předložené důkazy však již vedly k prvním doporučením k úpravě dávkování léčiv u pacientů s různým fenotypem CYP2D6. Farmakogenetické testování se v poslední době stává finančně mnohem dostupnějším díky zavádění technologií, jako jsou DNA strana 333

Čes a slov Psychiat 2011; 107(6): 233 243 mikročipy. Díky tomu se rovněž snižuje nutný benefit, aby bylo ekonomicky přínosné jej plošně zavést do praxe. Bude však nutno provést další, zejména prospektivní a farmakoekonomické studie, než bude možné farmakogenetické testování CYP2D6 u pacientů léčených risperidonem zavést do rutinní praxe. Literatura 1. Arranz MJ, de Leon J. Pharmacogenetics and pharmacogenomics of schizophrenia: a review of last decade of research. Mol Psychiatry 2007; 12 (8): 707 747. 2. de Leon J, Armstrong SC, Cozza KL. Clinical guidelines for psychiatrists for the use of pharmacogenetic testing for CYP450 2D6 and CYP450 2C19. Psychosomatics 2006; 47 (1): 75 85. 3. Zlokarnik G, Grootenhuis PD, Watson JB, High throughput P450 inhibition screens in early drug discovery. Drug Discov Today 2005; 10 (21): 1443 1450. 4. Fleeman N, McLeod C, Bagust A et al. The clinical effectiveness and costeffectiveness of testing for cytochrome P450 polymorphisms in patients with schizophrenia treated with antipsychotics: a systematic review and economic evaluation. Health Technol Assess 2010; 14 (3): 1 157. 5. de Leon J, Sandson NB, Cozza KL. A preliminary attempt to personalize risperidone dosing using drug-drug interactions and genetics: part II. Psychosomatics 2008; 49 (4): 347 361. 6. Indiana University Department of Medicine: Division of Clinical Pharmacology [online]. 2010 [cit. 2010-09-12]. P450 Drug interaction table. Dostupné z WWW: <http://medicine.iupui.edu/ clinpharm/ddis/table.asp>. 7. Heim M, Meyer UA. Genotyping of poor metabolisers of debrisoquine by allele-specific PCR amplification. Lancet 1990; 336 (8714): 529 532. 8. Sachse C, Brockmoller J, Bauer S, Roots I. Cytochrome P450 2D6 variants in a Caucasian population: allele frequencies and phenotypic consequences. Am J Hum Genet 1997; 60 (2): 284 295. 9. Stamer UM, Bayerer B, Wolf A, Hoeft A, Stuber F. Rapid and reliable method for cytochrome P450 2D6 genotyping. Clin Chem 2002; 48 (9): 1412 1417. 10. L. Zackrisson and B. Lindblom. Identification of CYP2D6 alleles by single nucleotide polymorphism analysis using pyrosequencing. Eur J Clin Pharmacol 2003; 59 (7): 521 526. 11. de Leon J, Susce MT, Murray-Carmichael E. The AmpliChip CYP450 genotyping test: Integrating a new clinical tool. Mol Diagn Ther 2006; 10 (3): 135 151. 12. de Leon J, Susce MT, Pan RM et al. The CYP2D6 poor metabolizer phenotype may be associated with risperidone adverse drug reactions and discontinuation. J Clin Psychiatry 2005; 66 (1): 15 27. 13. Pelkonen O, Maenpaa J, Taavitsainen P, Rautio A, Raunio H. Inhibition and induction of human cytochrome P450 (CYP) enzymes. Xenobiotica 1998; 28 (12): 1203 1253. 14. Janssen Pharmaceuticals. Risperdal. Prescribing information, 2003. 15. Ortho-McNeil-Janssen Pharmaceuticals. Invega, highlights of prescribing information, 2007. 16. NIMH Psychoactive Drug Screening Program [online]. 2009 [cit. 2010-09- 12]. Dostupné z WWW: <http://pdsp. med.unc.edu>. 17. Wang JS, Ruan Y, Taylor RM et al. The brain entry of risperidone and 9-hydroxyrisperidone is greatly limited by P-glycoprotein. Int J Neuropsychopharmacol 2004; 7 (4): 415 419. 18. de Leon J, Wynn G, Sandson NB. The pharmacokinetics of paliperidone versus risperidone. Psychosomatics 2010; 51 (1): 80 88. 19. Huang ML, Van Peer A, Woestenborghs R et al. Pharmacokinetics of the novel antipsychotic agent risperidone and the prolactin response in healthy subjects. Clin Pharmacol 1993; Ther, 54 (3): 257 268. 20. de Leon J, Susce MT, Pan RM, Wedlund PJ, Orrego ML, Diaz FJ. A study of genetic (CYP2D6 and ABCB1) and environmental (drug inhibitors and inducers) variables that may influence plasma risperidone levels. Pharmacopsychiatry 2007; 40 (3): 93 102. 21. Berecz R, Llerena A, de la Rubia A et al. Relationship between risperidone and 9-hydroxy-risperidone plasma concentrations and CYP2D6 enzyme activity in psychiatric patients. Pharmacopsychiatry 2002; 35 (6): 231 234. 22. Megens AA, Awouters FH, Schotte A et al. Survey on the pharmacodynamics of the new antipsychotic risperidone. Psychopharmacology (Berl) 1994; 114 (1): 9 23. 23. Bork JA, Rogers T, Wedlund PJ, de Leon J. A pilot study on risperidone metabolism: the role of cytochromes P450 2D6 and 3A. J Clin Psychiatry 1999; 60 (7): 469 476. 24. Olesen OV, Licht RW, Thomsen E et al. Serum concentrations and side effects in psychiatric patients during risperidone therapy. Ther Drug Monit 1998; 20 (4): 380 384. 25. Scordo MG, Spina E, Facciola G et al. Cytochrome P450 2D6 genotype and steady state plasma levels of risperidone and 9-hydroxyrisperidone. Psychopharmacology (Berl) 1999; 147 (3): 300 305. 26. Plesnicar BK, Zalar B, Breskvar K, Dolzan V. The influence of the CYP2D6 polymorphism on psychopathological and extrapyramidal symptoms in the patients on long-term antipsychotic treatment. J Psychopharmacol 2006; 20 (6): 829 833. 27. Roh HK, Kim CE, Chung WG, Park CS, Svensson JO, Bertilsson L. Risperidone metabolism in relation to CYP2D6*10 allele in Korean schizophrenic patients. Eur J Clin Pharmacol 2001; 57 (9): 671 675. 28. Kakihara S, Yoshimura R, Shinkai K et al. Prediction of response to risperidone treatment with respect to plasma concencentrations of risperidone, catecholamine metabolites, and polymorphism of cytochrome P450 2D6. Int Clin Psychopharmacol 2005; 20 (2): 71 78. 29. Albrecht A, Morena PG, Baumann P, Eap CB. High dose of depot risperidone in a nonresponder schizophrenic patient. J Clin Psychopharmacol 2004; 24 (6): 673 674. 30. Guzey C, Aamo T, Spigset O. Risperidone metabolism and the impact of being a cytochrome P450 2D6 ultrarapid metabolizer. J Clin Psychiatry 2000; 61 (8): 600 601. 31. Kohnke D, Griese EU, Stosser D, Gaertner I, Barth G. Cytochrome P450 2D6 deficiency and its clinical relevance in a patient treated with risperidone. Pharmacopsychiatry 2002; 35 (3): 116 118. 32. Llerena A, Berecz R, Dorado P, de la Rubia A. QTc interval, CYP2D6 and CYP2C9 genotypes and risperidone plasma concentrations. J Psychopharmacol 2004; 18 (2): 189 193. 33. Troost PW, Lahuis BE, Hermans MH et al. Prolactin release in children treated with risperidone: impact and role of CYP2D6 metabolism. J Clin Psychopharmacol 2007; 27 (1): 52 57. 34. Laika B, Leucht S, Heres S, Steimer W. Intermediate metabolizer: increased side effects in psychoactive drug therapy. The key to cost-effectiveness of pretreatment CYP2D6 screening? Pharmacogenomics J 2009; 9 (6): 395 403. 35. Rodriguez-Antona C, Gurwitz D, de Leon J et al. CYP2D6 genotyping for psychiatric patients treated with risperidone: considerations for cost-effectiveness studies. Pharmacogenomics 2009; 10 (4): 685 99. strana 334

Neuroendocrinology Letters Volume 33 No. 2 2012 Relevance of CYP2D6 variability in first-episode schizophrenia patients treated with risperidone O R I G I N A L A R T I C L E Richard Barteček 1,2, Jan Juřica 3, Jana Zrůstová 4, Tomáš Kašpárek 1,2, Eva Pindurová 2, Alexandra Žourková 2 1 Behavioral and Social Neuroscience Research Group, Central European Institute of Technology (CEITEC), Masaryk University 2 Department of Psychiatry, University Hospital Brno, Czech Republic 3 Department of Pharmacology, Masaryk University, Brno, Czech Republic 4 Department of Medical Genetics, University Hospital Brno, Czech Republic Correspondence to: Richard Barteček, M.D. Department of Psychiatry, University Hospital Brno, Jihlavská 20, 625 00 Brno, Czech Republic. tel: +420 532 23 2069; fax: +420 532 23 3706; e-mail: rbartecek@gmail.com Submitted: 2011-11-22 Accepted: 2012-02-13 Published online: 2012-04-25 Key words:cytochrome P-450; CYP2D6; pharmacogenetics; CYP2D6 analysis; schizophrenia; risperidone Neuroendocrinol Lett 2012; 33(2):236 244 PMID: 22592207 NEL330212A16 2012 Neuroendocrinology Letters www.nel.edu Abstract OBJECTIVE: The objective of this prospective, naturalistic study, conducted in first-episode psychosis patients from a Central-European population, was to assess the utility of Cytochrome P-450 2D6 (CYP2D6) genotype testing under normal clinical setting. METHODS: A total of 35 patients diagnosed for the first time with schizophrenia or acute schizophrenia-like psychotic disorder and treated with risperidone were enrolled in the study. These patients underwent sequentiation of the CYP2D6 gene and evaluations of symptoms and severity of adverse effects using the PANSS and UKU scales, respectively. Doses of antipsychotics and other co-medication were monitored as well. In statistical analysis, Fisher s exact test was used to compare ratios and the Wilcoxon rank-sum test was used in the comparison of continual variables. RESULTS: PM patients showed a significantly lower reduction in psychotic symptoms and a greater severity of psychotic symptoms following risperidone treatment and higher doses of antipsychotics not metabolized by CYP2D6, which were used as co-medication. CONCLUSIONS: Based on these results, patients with the PM genotype experiencing first-episode schizophrenia don t appear to be optimal recipients of risperidone treatment. However, as the main limitation of this study was the relatively small sample-size, replication with a larger scale study is needed to confirm these findings. To cite this article: Neuroendocrinol Lett 2012; 33(2):236 244

CYP2D6 variability in patients treated with risperidone Abbreviations: AP - Antipsychotic AUC - Area under the curve BBB - blood-brain barrier CYP - Cytochrome P-450 CYP2D6 - Isoenzyme 2D6 of the Cytochrome P450 DNA - Deoxyribonucleic acid EEG - Electroencephalography EM - Extensive-metabolizer ICD-10 - International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems, 10th Revision IM - Intermediate-metabolizer IQR - Inter-quartile range MRI - Magnetic resonance imaging PANSS - Positive and negative syndrome scale, scale for assessment schizophrenia symptoms PM - Poor metabolizer SD - Standard deviation UKU - Udvalg for Kliniske Undersøgelser, scale for assessment of drug adverse effects UM - Ultra-rapid metabolizer INTRODUCTION Cytochrome P-450 (CYP), a large family of xenobioticmetabolizing enzymes, has, in recent years, been hinted as a potential source of inter-individual variability of treatment response (Zhang & Malhotra 2011). One member of this family, CYP2D6, has drawn special attention: it metabolizes approximately 30% of all CYP targets including risperidone, haloperidol, chlorpromazine and aripiprazole (Arranz & de Leon 2007) and shows the greatest variability among all Cytochrome P450 isoenzymes (Zhang & Malhotra 2011). There are 4 basic phenotypical variants of CYP2D6 activity. The ultra-rapid metabolizer (UM) shows a greater than two-fold increase in CYP2D6 function than the most common variant, which is the extensive metabolizer (EM); the intermediate metabolizer s (IM) CYP2D6 activity is impaired, while the poor metabolizer (PM) shows minimal or no CYP2D6 activity at all (Zhang & Malhotra 2011). This variability has a partially genetic basis. In total, more than 100 alleles of CYP2D6 have been described, whose expression can result in molecules with different levels of enzymatic function fully, partially functioning enzyme, or an enzyme with no function at all. For example, CYP2D6*1 produces a fully functioning enzyme, while the product of alleles CYP2D6*3, *4 and *5 show negligible activity (Fleeman et al. 2010). According to de Leon, the UM has three or more copies of the active CYP2D6 gene; EM has one or two functional copies; IM has one non-functional CYP2D6 allele and one low-activity allele; and PM have two non-functional CYP2D6 alleles (de Leon et al. 2005). Several other definitions of IMs have been proposed, and in such cases definitions of EMs and PMs differ as well. (Kirchheiner et al. 2004) Genetic determinants serve as a basis for CYP2D6 activity, which is then modified by environmental factors. The best-described factors influencing CYP2D6 activity are compounds reducing CYP2D6 function. Many of these inhibitors are drugs that are widely used in many psychiatric disorders: antipsychotics (chlorpromazine, haloperidol, methotrimeprazine), antidepressants (fluoxetine, paroxetine, bupropion, clomipramine, imipramine, citalopram, fluvoxamine). (Ingelman-Sundberg 2005) In recent years, a relatively large degree of attention has been given to the possible interaction of variability in CYP2D6 and risperidone treatment response. This possibility is justified by several recently described differences between risperidone and 9OH-risperidone, especially the different affinities to several receptors (risperidone has higher activity at 5HT3, alpha1 and alpha2 adrenergic receptors (NIMH Psychoactive Drug Screening Program 2011)) and differences in blood-brain-barrier (BBB) permeation (it appears that risperidone permeates the BBB more easily, possibly because of a lower affinity for p-glycoprotein) (de Leon et al. 2010). The fact that variability in CYP2D6 activity has an effect on the 9OH-risperidone/risperidone blood level ratio has been repeatedly proved (Berecz et al. 2002; Laika et al. 2009; Scordo et al. 1999; Olesen et al. 1998), but no indisputable, straightforward connection between the variability of CYP2D6 and treatment response has been found. Despite the studies (Bork et al. 1999; Laika et al. 2009; de Leon et al. 2005; Llerena et al. 2004; Troost et al. 2007) and case reports (Albrecht et al. 2004; Koehnke et al. 2002) in which there was at least some effect of CYP2D6 variability in the subject s response to risperidone, there are many negative reports (Kakihara et al. 2005; Olesen et al. 1998; Plesnicar et al. 2006; Roh et al. 2001; Scordo et al. 1999; Jovanovic et al. 2010) that fail to show a connection. OBJECTIVES The objective of this prospective, naturalistic study conducted in first-episode psychosis patients of Central- European population was to asses the utility of CYP2D6 genotype testing under conditions of normal clinical setting. METHODS Patients All patients enrolled in the study were hospitalized in the Department of Psychiatry, University Hospital, Brno between 2007 and 2010. Inclusion criteria were: diagnosis of schizophrenia (F20) or acute schizophrenia-like psychotic disorder (F23.2), in accordance with ICD-10 diagnostic criteria for research concluded for the first time in patient s life; an age range of 18 65 years; signed informed consent; and no prior history of psychopharmacological treatment and initial treatment Neuroendocrinology Letters Vol. 33 No. 2 2012 Article available online: http://node.nel.edu 237

Richard Barteček, Jan Juřica, Jana Zrůstová, Tomáš Kašpárek, Eva Pindurová, Alexandra Žourková with risperidone. Diagnosis was concluded by a consensus of at least 2 trained psychiatrists after a mental status examination. All patients underwent further examinations (toxicological examination, fundus oculi examination, EEG, MR imaging) to exclude other possible causes of psychotic symptoms. Exclusion criteria included: any other psychiatric disorder diagnosed before or during index hospitalization; hospitalization against a patient s will; deprivation of legal capacity and contraindication for risperidone. The entire study was approved by the local ethics committee and all patients provided a signed, informed consent for the study. Time-course All patients were observed for 1 7 weeks. Observation started with admission of the patient, followed by a diagnosis and the initiation of risperidone treatment. The endpoint of observation was the cessation of risperidone treatment; change of the antipsychotic agent; or the patient s release. Clinical evaluation using specific scales for symptom and adverse effect severity was conducted at the start of observation, at one-week intervals throughout the time-course of the study, and at the endpoint. The study was performed in a naturalistic setting and did not interfere with normal clinical procedures, therefore, there weren t strict regulations with regard to possible co-medication use. Antiparkinsonics, benzodiazepines, antihistaminics and beta-blockers). Antipsychotics other then risperidone were allowed as long as they were only used a limited number of times and only as a sedative during acute agitation. Doses of comedication were monitored at one-week intervals. A CYP2D6 genotype examination was carried out once during hospitalization. Before the genotype examination, patients signed an informed consent for the genetic examination. The results of this exam were not available to the physician or the person rating effects, during hospitalization, and therefore the course of treatment was not influenced by any knowledge of a patient s CYP2D6 activity status. Clinical evaluation The following scales were used during patient observation in the study: The Positive and negative syndrome scale (PANSS) (Kay et al. 1987) to evaluate the clinical state of patients, and the Udvalg for Kliniske Undersøgelser (UKU) scale (Lingjaerde et al. 1987) to evaluate adverse effects severity. Pharmacotherapy risperidone dosage, adjuvant medication administration and dosage, change in medication was observed, as well as the frequency and causes of drop-outs (risperidone treatment cessation due to insufficient or adverse effects). The percentage of the PANSS score reduction was computed as a fraction (percentage) of the baseline PANSS score. Symptomatic remission was defined according to the Remission in Schizophrenia Working Group as the reduction to a value less than, or equal to, 3 in P1, P2, P3, N1, N4, N6, G5, G9 PANSS items (Andreasen et al. 2005). In the assessment of adverse effects, the medians of the total UKU score, and all UKU sub-scores using data from all patients, were computed. Percentages of patients in each CYP2D6 activity group having UKU scores higher than the aforementioned medians were then used as a measure of adverse effect severity. Risperidone doses were described in milligrams. Doses of all utilized antipsychotics were converted into chlorpromazine equivalents. Genotypization in detail The genomic DNA used for analyses was extracted from the peripheral blood of patients. To prevent an unspecific amplification of pseudo-genes CYP2D7 and CYP2D8, pre-amplification was performed using specific primers (Sistonen et al. 2005). The resulting pre-amplicons were used as a template for continuous PCR. All exons were amplified from these pre-amplicons. The PCR products were visualized on NAT gel and purified. These purified products were used for further sequencing analyses. Bi-directional sequencing was performed with BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) on ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems). Any polymorphisms found were described using CYP2D6 allele nomenclature, which also included information about the expected phenotype (Human Cytochrome P450 Allele Nomenclature Committee 2011). To detect entire allele deletion and duplication, long-range PCR was used (Daly 1995). Basically, by using these methods, any known and described CYP2D6 polymorphism could have been observed. Patients were categorized into different CYP2D6 activity groups in accordance to de Leon (de Leon et al. 2005) on basis of a configuration of their CYP2D6 alleles as was described in the Introduction. Statistical evaluation The main hypothesis was that groups of patients with a different CYP2D6 activity differ in at least some monitored measures. To analyze group differences in remission, drop-out, frequency of adverse effects, and frequency of patients using different co-medication, Fisher s exact test was used. Between-group differences in continual variables were tested by the Wilcoxon rank-sum test. All statistical evaluations were conducted using the R software library (R Development Core Team 2011). RESULTS The basic sample characteristic is summarized in Table 1. In total, 35 patients were enrolled in the study. 21 (60%) of these patients were male and 14 (40%) were female. The mean age was 29.2 years (SD = 11.36). The median of the time of observation was 4 weeks for the 238 Copyright 2012 Neuroendocrinology Letters ISSN 0172 780X www.nel.edu

CYP2D6 variability in patients treated with risperidone entire sample. The minimal time of observation was 1 week, while the maximum was 7 weeks. There were no statistically significant differences in length of observation between the different groups. Genotype The most frequent allele in the entire sample was allele 4* coding a non-functional enzyme (allele frequency 22.86%). The second and third most common alleles were those coding the fully functional enzyme 2* (20%) and 1* (18.57%). The frequency of all observed alleles is summarized in Table 2. Out of 35 genotyped patients, 1 patient (approx. 2.86%) was UM, 22 patients (62.86%) were EMs, 7 patients (20%) were IMs and 5 patients were (14.29%) Tab. 1. Basic sample characteristics. Gender Males Females Percentage 60% 40% Diagnosis F20 F23.2 Percentage 74.3% 25.7% Age mean SD 29.2 11.35 Genotype UM EM IM PM Percentage 2.63% 57.89% 18.42% 13.56% Sample size = 35 Tab. 2. Alleles observed in the sample, corresponding predicted activity of CYP2D6, allele frequency and comparison with a frequency in the European population according to Sistonen (Sistonen et al. 2007). Allele frequency Allele CYP2D6 activity Frequency in European population 1* normal 17.10526 34.4 1*xn increased (multiplication) 1.31579 0.6 2* normal 18.42106 28.7 4* none 21.05264 17.2 5* none (deletion) 2.63158 3.2 6A* none 1.31579 0.6 9* decreased 3.94737 2.5 10A* decreased 7.89474 2.5 27* normal 1.31579 unknown 33* normal 1.31579 unknown 41* decreased 6.57895 7 PMs. Due to the relatively small sample size, EM and IM group were merged and all analyses were conducted by comparing extreme cases patients with no functional allele (PM) against patients with at least one partially functional allele (EM and IM, further designated as EM + IM). The other extreme case a patient with multiplication of a functional allele (UM) was removed from all subsequent analyses. Symptoms The total baseline and endpoint PANSS scores, as well as the scores of all the PANSS sub-scales, are summarized in Table 3 and Figure 1. No statistically significant differences in baseline symptom severity were found. However, PM showed a statistically significantly higher score in endpoint negative (Wilcoxon rank-sum test, p=0.04569) and general PANSS sub-scale (p=0.01053) as well as a higher endpoint total PANSS score (p=0.0171). Patients with PM genotype showed a trend toward having a higher score in the endpoint positive PANSS sub-scale, as well (p=0.05811). Lower symptom reduction, measured as a percentage of PANSS score reduction, was found in the PM genotype group (see Table 3). This result was statistically significant (Wilcoxon rank-sum test, p=0.01715). Adverse effects The PM genotype group generally showed higher rates of patients with severe adverse effects. However, only the difference in the autonomic UKU sub-scale (accommodation disturbances, increased or reduced salivation, nausea and vomiting, diarrhea, constipation, polyuria and polydipsia, orthostatic dizziness, palpitations and tachycardia, increased tendency to sweat) showed a trend to be statistically significant (Fisher s exact test, p=0.06291). Treatment outcome For rates of patients achieving remission, and rates of drop-outs due to different causes, see Table 3. There were no statistically significant results in any of these parameters. Medication The doses of all antipsychotics are summarized in Table 3. The PM genotype group generally used higher doses of all antipsychotics (p=0.05746), especially higher doses of antipsychotics not metabolized by CYP2D6 (p=0.01465). With regard to risperidone doses and doses of antipsychotics metabolized by CYP2D6, no significant result was found. Observed co-medication and its possible effect on CYP2D6 activity is summarized in Table 4. When comparing co-medication use between different genotype groups, a higher usage of antiparkinsonics and benzodiazepines by the PM group was found. However, this result did not reach statistical significance. Neuroendocrinology Letters Vol. 33 No. 2 2012 Article available online: http://node.nel.edu 239

Richard Barteček, Jan Juřica, Jana Zrůstová, Tomáš Kašpárek, Eva Pindurová, Alexandra Žourková Fig. 1. Baseline and endpoint PANSS values in patients with different CYP2D6 genotypes. Selected p-value (Wilcoxon rank-sum test) are highlighted. DISCUSSION We have conducted 1 7 week long prospective observation of first-episode psychosis patients in a naturalistic study to assess the effect of CYP2D6 activity on risperidone efficacy and safety. Efficacy In our sample, the PM genotype group showed statistically significant lower symptom reduction than the group comprised of EM and IM genotypes. With no statistically significant difference in the baseline symptom profile measured by sub-scales of PANSS, it is not surprising that PM group showed a higher endpoint PANSS score, with a significantly higher value in total PANSS, negative and general symptom sub-scales. Theoretically, one would assume that in patients with a deficit in CYP2D6 metabolism, a higher risperidone/ 9-OH-risperidone ratio would result in greater treatment effects, because risperidone has a lower affinity for p-glycoprotein and permeates the blood-brain barrier more easily (de Leon et al. 2010). In our sample, this was not the case and it was similar to the findings of Laika et al. who reported a positive correlation of treatment response and a number of fully functional CYP2D6 alleles in patients obtaining higher-than-median doses of CYP2D6 substrates (Laika et al. 2009). One possible explanation lies in the presence of 9-OH-risperidone during risperidone treatment. Both of these substances have their own antipsychotic action. 9-OH-risperidone has a longer biological half-life (de Leon et al. 2010) and its blood levels during risperidone treatment are generally higher than those of risperidone (Aravagiri et al. 2003; Riedel et al. 2005). Considering this important role of 9-OH-risperidone in risperidone treatment, and the fact that in PM the risperidone/9-oh-risperidone 240 Copyright 2012 Neuroendocrinology Letters ISSN 0172 780X www.nel.edu

CYP2D6 variability in patients treated with risperidone ratio is shifted in favor of risperidone, it is possible that low levels of 9-OH-risperidone could have caused the lower treatment response observed in our sample. We hypothesize that this effect was not reversed by greater availability of risperidone moiety behind the BBB. Moreover, both compounds show antagonism toward several receptor systems with different affinities to different receptors (5HT2, alpha 1, alpha 2 adrenergic, H1 histaminergic and, to a lesser extent, 5HT1C, 5HT1D, 5HT1A, D1) (NIMH Psychoactive Drug Screening Program 2011). While D2 receptor antagonism is indeed important for antipsychotic action, it is not the only one. This is, for example, reported in clozapine, where lower D2 receptor occupancy does not prevent a powerful antipsychotic action (Kapur et al. 1999; Nord & Farde 2011). Other receptor systems, Tab. 3. Summary of observed variables - the baseline and endpoint score of PANSS sub-scales, total PANSS score and percentage PANSS decline, adverse effects incidence, outcome of the treatment, daily doses of risperidone (in mg per day) and other antipsychotics (AP, in chlorpromazine equivalents) and co-medication usage. p-values are highlighted: (Wilcoxon rank-sum test): * p=0.058, p=0.046, p=0.01, p=0.017, p=0.017, p=0.058, ** p=0.014, (Fisher s exact test): p=0.063. Genotype PANSS Baseline EM + IM PM Median IQR Median IQR Positive 22 10 23 12 Negative 19 12 24 7 General 39 24 42 20 Total 79 33 85 32 Positive 9* 7* 15* 9* Endpoint Negative 11 11 21 11 General 25 10 35 11 Total 48 26 66 33 Percentage reduction 39.76 50 9.84 20.5 Co-medication Dosages Outcome Adverse Effects Percentage Percentage Psychic 65.52% 80% Neurological 41.38% 60% Autonomous 51.72% 100% Other 41.38% 60% All adverse effects 58.62% 100% Remission 68.97% 40% Drop-out All 55.17% 80% Due to insufficient treatment effect 37.93% 60% Due to adverse effects 24.14% 0% Median IQR Median IQR Risperidone 21.33 21 20.75 7.25 All AP 2567 2133 4130.9 2200 CYP2D6 dependent AP 2250 2150 2075 725 non-cyp2d6 dependent AP 60 ** 1201** 1917** 2100** Percentage Percentage Antiparkinsonics 34.48% 80% Benzodiazepines 82.76% 100% Beta-blockers 6.9% 0% Neuroendocrinology Letters Vol. 33 No. 2 2012 Article available online: http://node.nel.edu 241

Richard Barteček, Jan Juřica, Jana Zrůstová, Tomáš Kašpárek, Eva Pindurová, Alexandra Žourková including serotoninergic and adrenergic, were suggested to modify antipsychotic action and the severity of adverse effect (Svensson 2003; Travis et al. 1998). In fact, risperidone and 9-OH-risperidone show slight differences in affinities to receptors in these exact systems (NIMH Psychoactive Drug Screening Program 2011). The cause of the differences observed between CYP2D6 genotype group might be the interactions of different ratios of risperidone and 9-OH-risperidone on several receptor systems. It may also be that the course of the psychosis itself is modified by different CYP2D6 activity. CYP2D6 is present in the brain and affects the metabolism of not only antipsychotics, but of endogenous amines, too (Dutheil et al. 2008). For example, some effect on the course of schizophrenia was reported in a Slovenian study where the PM phenotype was associated with more persistent, negative symptomatology (Plesnicar et al. 2006). In our study, a similar finding is apparent PM group showed a higher negative symptomatology after risperidone treatment. Safety Even though in our sample the PM group showed trend toward a higher frequency of autonomic adverse effects, no statistically significant difference between the PM group and other genotypes was observed. Such findings contradict the results of several studies (Bork et al. 1999; de Leon et al. 2005; Laika et al. 2009) and the hypothesis that defective CYP2D6 metabolism leads to higher levels of risperidone which permeates the blood-brain barrier more easily than 9-OH-risperidone, and which leads to more adverse effects. Our sample might have been too small to capture a statistically significant difference in adverse effect severity. This is probable, because the PM genotype group indeed showed higher frequency of patients with more severe adverse effects, albeit insignificantly. However, there is another hypothesis to consider: Some adverse effects might have been wrongly attributed as symptoms of the psychotic disorder measured by the scale of psychotic symptoms. Indeed, comparing the scales used (PANSS and UKU) might lead to discoveries of several similar symptoms. This is especially the case not only for several items in psychic and autonomic sub-scales of the UKU, but also the neurological, as well as some items of the negative and general subscales of the PANSS (UKU PANSS scales compared: 1.1 concentration difficulties G11 poor attention, 1.5 depression G6 depression and G3 feelings of guilt, 1.6 tension, inner unrest G2 anxiety and G4 tension, 1.10 emotional indifference N2 emotional withdrawal, most of the autonomous items can lead to symptom G1 somatic concern, 1.2 asthenia, increased fatigability and 1.3 sleepiness, sedation can lead to G7 motor retardation ). The PM group, in fact, showed higher rates of adverse effects in several UKU sub-scales. Tab. 4. Medication used during the observation with the notion about possibility of influence on CYP2D6 activity according to Ingelman-Sundberg (Ingelman-Sundberg 2005). Compound CYP2D6 status amantadine biperiden clonazepam diazepam haloperidol chlorprothixene levocetirizine metoprolol metotrimeprazine olanzapine oxazepam paliperidone promethazine ramipril risperidone zolpidem zuclopenthixol none none none none substrate/medium inhibitor none none substrate substrate/medium inhibitor none none none substrate none substrate none substrate Doses of antipsychotics and co-medication use The PMs received significantly higher doses of antipsychotics not metabolized by CYP2D6 than the EMs. This finding appears to support the observation of a lower response to risperidone in the PM group. One should keep in mind that in the present study, the usage of other antipsychotics was limited to antipsychotics in the management of acute agitation. The insufficient treatment response in PMs might have lead to a decision to use more sedative medication, sedative antipsychotics being among them. Limitations of the study The most obvious limitation of this study was the small sample size. Diagnostic bias might have been present as well. In the observed sample, there were a significant number of patients with acute schizophrenia-like disorder, and it should be kept in mind that in these patients, all diagnostic criteria of schizophrenia were met with the exception of the duration of symptoms. Another limitation is lack of data with regard to patients with the UM genotype. Had it been possible to gather more patients of this rare genotype, the sample size would have been extended significantly. During the current study, no measurements of risperidone and 9-OHrisperidone blood levels were conducted. In this type of pharmacokinetic study, that might be considered a serious drawback; however, as stated before, the effect 242 Copyright 2012 Neuroendocrinology Letters ISSN 0172 780X www.nel.edu

CYP2D6 variability in patients treated with risperidone of different CYP2D6 activity on the 9-OH-risperidone/ risperidone ratio had already been repeatedly demonstrated (Berecz et al. 2002; Laika et al. 2009; Scordo et al. 1999; Olesen et al. 1998). This was a naturalistic study and control of different factors especially co-medication and other antipsychotic use were limited. This could have lead to unspecific interactions and modifications of risperidone effects. Differences in risperidone and co-medication dosage made any subsequent analysis more difficult to be conducted and generalized. Patients were only observed for a limited time period. These results, therefore, do not relate to long-term schizophrenia treatment. CONCLUSIONS In this study, CYP2D6 poor metabolizers treated with risperidone showed a significantly lower reduction in psychotic symptoms, a higher severity of psychotic symptoms after risperidone treatment, especially in negative and general symptoms, and a higher dose of antipsychotics not metabolized by CYP2D6. Based on these results, patients with the PM genotype, with first-episode schizophrenia, don t appear to be optimal recipients of risperidone treatment. It may be that in PM patients, treatment with antipsychotics not metabolized by CYP2D6 could yield a more favorable outcome. All the above-mentioned findings and recommendations should be taken with caution. Replication on a larger scale and under more controlled conditions is needed. ACKNOWLEDGEMENTS This work was supported by the project CEITEC Central European Institute of Technology (CZ.1.05/1.1.00/02.0068) from the European Regional Development Fund and by research grant NS9676-4/2008 from the Ministry of Health of the Czech Republic, which provided financial support for genotype analysis and covered material expenses of the study. REFERENCES 1 Albrecht A, Morena PG, Baumann P, Eap CB, (2004). High dose of depot risperidone in a nonresponder schizophrenic patient. J Clin Psychopharmacol 24: 673 674. 2 Andreasen NC, Carpenter WT, Kane JM, Lasser RA, Marder SR, Weinberger DR (2005). Remission in schizophrenia: proposed criteria and rationale for consensus. Am J Psychiatry 162: 441 449. 3 Aravagiri, M, Marder SR, Nuechterlein KH, Gitlin MJ, (2003). Intraand interindividual variations in steady-state plasma concentrations of risperidone and 9-hydroxyrisperidone in schizophrenic patients treated chronically with various doses of risperidone. Ther Drug Monit 25: 657 664. 4 Arranz MJ, de Leon J (2007). Pharmacogenetics and pharmacogenomics of schizophrenia: a review of last decade of research. Mol Psychiatry 12: 707 747. 5 Berecz R, LLerena A, de la Rubia A, Gomez J, Kellermann M, Dorado P, et al (2002). Relationship between risperidone and 9-hydroxy-risperidone plasma concentrations and cyp2d6 enzyme activity in psychiatric patients. Pharmacopsychiatry 35: 231 234. 6 Bork JA, Rogers T, Wedlund PJ, de Leon J (1999). A pilot study on risperidone metabolism: the role of cytochromes p450 2d6 and 3a. J Clin Psychiatry 60: 469 476. 7 Daly AK, Steward A (1995). Use of the expand long template pcr system in genotyping for polymorphisms in the human cytochrome p450 cyp2d6 gene. Biochemica 4: 31 32. 8 de Leon J, Susce MT, Pan RM, Fairchild M, Koch WH, Wedlund PJ, et al (2005). The cyp2d6 poor metabolizer phenotype may be associated with risperidone adverse drug reactions and discontinuation. J Clin Psychiatry 66: 15 27. 9 de Leon J, Wynn G, Sandson NB (2010). The pharmacokinetics of paliperidone versus risperidone. Psychosomatics 51: 80 88. 10 Dutheil F, Beaune P, Loriot MA (2008). Xenobiotic metabolizing enzymes in the central nervous system: Contribution of cytochrome p450 enzymes in normal and pathological human brain. Biochimie 90: 426 436. 11 Fleeman N, McLeod C, Bagust A, Beale S, Boland A, Dundar Y, et al. (2010). The clinical effectiveness and cost-effectiveness of testing for cytochrome p450 polymorphisms in patients with schizophrenia treated with antipsychotics: a systematic review and economic evaluation. Health Technol Assess 14: 1 157. 12 Human Cytochrome P450 Allele Nomenclature Committee (2011). CYP2D6 allele nomenclature. http://www.cypalleles. ki.se/cyp2d6.htm. 13 Ingelman-Sundberg M (2005). Genetic polymorphisms of cytochrome p450 2d6 (cyp2d6): clinical consequences, evolutionary aspects and functional diversity. Pharmacogenomics J 5: 6 13. 14 Jovanovic N, Bozina N, Lovric M, Medved V, Jakovljevic M, Peles AM (2010). The role of cyp2d6 and abcb1 pharmacogenetics in drug-naïve patients with first-episode schizophrenia treated with risperidone. Eur J Clin Pharmacol 66: 1109 1117. 15 Kakihara S, Yoshimura R, Shinkai K, Matsumoto C, Goto M, Kaji K, et al (2005). Prediction of response to risperidone treatment with respect to plasma concencentrations of risperidone, catecholamine metabolites, and polymorphism of cytochrome p450 2d6. Int Clin Psychopharmacol 20: 71 78. 16 Kapur S, Zipursky RB, Remington G (1999). Clinical and theoretical implications of 5-ht2 and d2 receptor occupancy of clozapine, risperidone, and olanzapine in schizophrenia. Am J Psychiatry 156: 286 293. 17 Kay SR, Fiszbein A, Opler LA (1987). The positive and negative syndrome scale (panss) for schizophrenia. Schizophr Bull 13: 261 276. 18 Kirchheiner J, Nickchen K, Bauer M, Wong ML, Licinio J, Roots I, et al. (2004). Pharmacogenetics of antidepressants and antipsychotics: the contribution of allelic variations to the phenotype of drug response. Mol Psychiatry 9: 442 473. 19 Koehnke MD, Griese EU, Stoesser D, Gaertner I, Barth G (2002). Cytochrome p450 2d6 deficiency and its clinical relevance in a patient treated with risperidone. Pharmacopsychiatry 35: 116 118. 20 Laika B, Leucht S, Heres S, Steimer W (2009). Intermediate metabolizer: increased side effects in psychoactive drug therapy. the key to cost-effectiveness of pretreatment cyp2d6 screening? Pharmacogenomics J 9: 395 403. 21 Lingjaerde O, Ahlfors UG, Bech P, Dencker SJ, Elgen K (1987). The uku side effect rating scale. a new comprehensive rating scale for psychotropic drugs and a cross-sectional study of side effects in neuroleptic-treated patients. Acta Psychiatr Scand Suppl 334: 1 100. 22 Llerena A, Berecz R, Dorado P, de la Rubia A (2004). Qtc interval, cyp2d6 and cyp2c9 genotypes and risperidone plasma concentrations. J Psychopharmacol 18: 189 193. 23 NIMH Psychoactive Drug Screening Program (2011). Pdsp - home page. http://pdsp.med.unc.edu/. 24 Nord M, Farde L (2011). Antipsychotic occupancy of dopamine receptors in schizophrenia. CNS Neurosci Ther 17: 97 103. Neuroendocrinology Letters Vol. 33 No. 2 2012 Article available online: http://node.nel.edu 243

Richard Barteček, Jan Juřica, Jana Zrůstová, Tomáš Kašpárek, Eva Pindurová, Alexandra Žourková 25 Olesen OV, Licht RW, Thomsen E, Bruun T, Viftrup JE, Linnet K (1998). Serum concentrations and side effects in psychiatric patients during risperidone therapy. Ther Drug Monit 20: 380 384. 26 Plesnicar BK, Zalar B, Breskvar K, Dolzan V (2006). The influence of the cyp2d6 polymorphism on psychopathological and extrapyramidal symptoms in the patients on long-term antipsychotic treatment. J Psychopharmacol 20: 829 833. 27 R Development Core Team (2011). R: a language and environment for statistical computing. http://www.r-project.org/. 28 Riedel M, Schwarz MJ, Strassnig M, Spellmann I, Mueller-Arends A, Weber K, et al (2005). Risperidone plasma levels, clinical response and side-effects. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci 255: 261 268. 29 Roh HK, Kim CE, Chung WG, Park CS, Svensson JO, Bertilsson L (2001). Risperidone metabolism in relation to cyp2d6*10 allele in korean schizophrenic patients. Eur J Clin Pharmacol 57: 671 675. 30 Scordo MG, Spina E, Facciola G, Avenoso A, Johansson I, Dahl ML (1999). Cytochrome p450 2d6 genotype and steady state plasma levels of risperidone and 9-hydroxyrisperidone. Psychopharmacology (Berl) 147: 300 305. 31 Sistonen J, Fuselli S, Levo A, Sajantila A, (2005). Cyp2d6 genotyping by a multiplex primer extension reaction. Clin Chem 51: 1291 1295. 32 Svensson TH (2003). Alpha-adrenoceptor modulation hypothesis of antipsychotic atypicality. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 27: 1145 1158. 33 Travis MJ, Busatto GF, Pilowsky LS, Mulligan R, Acton PD, Gacinovic S, et al. (1998). 5-ht2a receptor blockade in patients with schizophrenia treated with risperidone or clozapine. a spet study using the novel 5-ht2a ligand 123i-5-i-r-91150. Br J Psychiatry 173: 236 241. 34 Troost PW, Lahuis BE, Hermans MH, Buitelaar JK, van Engeland H, Scahill L, et al. (2007). Prolactin release in children treated with risperidone: impact and role of cyp2d6 metabolism. J Clin Psychopharmacol 27: 52 57. 35 Zhang JP, Malhotra AK (2011). Pharmacogenetics and antipsychotics: therapeutic efficacy and side effects prediction. Expert Opin Drug Metab Toxicol 7: 9 37. 244 Copyright 2012 Neuroendocrinology Letters ISSN 0172 780X www.nel.edu

l e t t e r s Identification of common variants associated with human hippocampal and intracranial volumes 2012 Nature America, Inc. All rights reserved. Identifying genetic variants influencing human brain structures may reveal new biological mechanisms underlying cognition and neuropsychiatric illness. The volume of the hippocampus is a biomarker of incipient Alzheimer s disease 1,2 and is reduced in schizophrenia 3, major depression 4 and mesial temporal lobe epilepsy 5. Whereas many brain imaging phenotypes are highly heritable 6,7, identifying and replicating genetic influences has been difficult, as small effects and the high costs of magnetic resonance imaging (MRI) have led to underpowered studies. Here we report genome-wide association meta-analyses and replication for mean bilateral hippocampal, total brain and intracranial volumes from a large multinational consortium. The intergenic variant rs7294919 was associated with hippocampal volume (12q24.22; N = 21,151; P = 6.70 10 16 ) and the expression levels of the positional candidate gene TESC in brain tissue. Additionally, rs10784502, located within HMGA2, was associated with intracranial volume (12q14.3; N = 15,782; P = 1.12 10 12 ). We also identified a suggestive association with total brain volume at rs10494373 within DDR2 (1q23.3; N = 6,500; P = 5.81 10 7 ). The hippocampal formation is a key brain structure for learning, memory 8,9 and stress regulation 10 and is implicated in many neuropsychiatric disorders. Further, overall brain and head sizes are altered in many disorders and are significantly correlated with general cognitive ability 11 13. Hippocampal, total brain and intracranial volumes are highly heritable in non-human primates 14,15 and in humans 6,7. Finding loci that influence these measures may lead to the identification of genes underlying susceptibility for neuropsychiatric diseases. Here we sought to identify common genetic polymorphisms influencing hippocampal, total brain and intracranial volumes in a large multinational consortium. Our discovery sample comprised 17 cohorts of European ancestry from whom genome-wide SNPs and structural MRI data were collected (Supplementary Tables 1 3). Unselected population samples and case-control studies were included, with cases ascertained for neuropsychiatric disorders including depression, anxiety, Alzheimer s disease and schizophrenia. To distinguish whether putative effects at these loci varied with disease status, analyses were run in the full sample (N = 7,795) and in a healthy subsample (N = 5,775). To help disentangle overall brain size effects from those specific to hippocampal volume, associations were assessed with and without controlling for total brain and intracranial volumes (Online Methods). As the initial goal of the study was to explore associations with hippocampal volume, total brain and intracranial volumes were analyzed in healthy subjects only. Phenotypes were computed from three-dimensional anatomical T 1 -weighted magnetic resonance images, using validated automated segmentation programs 16 18 (Supplementary Fig. 1 and Supplementary Tables 4 and 5). Extensive quality control analysis of segmentation was performed on sample outliers; subjects with poorly delineated brain volume phenotypes were removed (Supplementary Figs. 2 6). The mean bilateral hippocampal volume across the discovery cohorts was 3,917.4 mm 3 (s.d. = 441.0 mm 3 ). Heritability of structural brain phenotypes was estimated in a sample of Australian monozygotic and dizygotic twins and their siblings (Queensland Twin Imaging (QTIM) study; N = 646, including ungenotyped participants; age range = 20 30 years) for hippocampal volume (h 2 = 0.62), total brain volume (h 2 = 0.89) and intracranial volume (h 2 = 0.78). Hippocampal volume was also highly heritable in an extended pedigree cohort of Mexican-Americans from the United States (Genetics of Brain Structure and Function (GOBS); N = 605; age range = 18 85; h 2 = 0.74), as were total brain volume (h 2 = 0.77) and intracranial volume (h 2 = 0.84). All heritability estimates were highly significant (P < 0.001). To enable consortium-wide comparison of ancestry and to adjust appropriately for population stratification, each site conducted multidimensional scaling (MDS) analyses comparing their data to the HapMap 3 reference populations (Supplementary Fig. 7). All subsequent analyses included the following covariates: sex, linear and quadratic effects of age, interactions of sex with age covariates, MDS components and dummy covariates for different magnetic resonance acquisitions. Analyses were filtered for genotyping and imputation quality (Supplementary Fig. 8 and Supplementary Table 6); distributions of test statistics were examined at the cohort level through Manhattan and quantile-quantile plots (Supplementary Figs. 9 24). We conducted fixed-effects meta-analysis with METAL, applying genomic control 19 (Supplementary Figs. 25 32). For completeness and to account for heterogeneity across sites, a randomeffects meta-analysis was also performed 20 (Supplementary Figs. 33 40). We attempted in silico replication of the top five loci for each trait within the combined CHARGE Consortium discovery set and 3C replication sample 21 (N = 10,779), as well as in two cohorts of European ancestry (imputed to the Utah residents of Northern and Western European ancestry (CEU) and/or Toscani in Italy (TSI) HapMap cohorts; N = 449) and in two additional cohorts (imputed to combined CEU and Yoruba in Ibadan, Nigeria (YRI), and to A full list of authors and affiliations appears at the end of the paper. Received 6 September 2011; accepted 19 March 2012; published online 15 April 2012; doi:10.1038/ng.2250 Nature Genetics ADVANCE ONLINE PUBLICATION

l e t t e r s 2012 Nature America, Inc. All rights reserved. Figure 1 Association results and meta-analysis of effects in individual and combined analyses. (a) The strongest association with hippocampal volume was found for rs7294919. Fixedeffects meta-analysis P values are shown 41 after controlling for intracranial volume using all subjects in the discovery sample. (b) The strongest association with intracranial volume was found for rs10784502. Fixed-effects metaanalysis P values are shown in healthy subjects only. (c,d) The effect within each sample contributing to the meta-analysis is shown in forest plots for hippocampal volume (c) and intracranial volume (d). Association data using intracranial volume as a phenotype were not available for the EPIGEN sample. Head size was not controlled for in the CHARGE Consortium association analyses. Mexican ancestry in Los Angeles, California (MEX); N = 842). We also undertook custom genotyping of the two most promising SNPs in two additional samples of European ancestry (BIG replication and Trinity College Dublin/National University of Ireland, Galway (TCD/NUIG); N = 1,286). In general, previously identified polymorphisms associated with hippocampal volume showed little association in our metaanalysis (BDNF, TOMM40, CLU, PICALM, ZNF804A, COMT, DISC1, NRG1, DTNBP1; Supplementary Table 7), nor did SNPs previously associated with schizophrenia 22 and bipolar disorder 23 (Supplementary Table 8). The most significant SNPs in each analysis from the discovery sample (P 5 10 5 ) are listed (Supplementary Tables 9 16). No markers reached genome-wide significance (P < 1.25 10 8 ; Online Methods) in the discovery sample alone. However, the strongest associations for hippocampal and intracranial volumes were replicated, yielding results at genome-wide significance (Fig. 1 and Table 1; see Supplementary Tables 17 25 for additional results and gene-based tests 24 ). In our discovery sample, two SNPs in the same linkage disequilibrium (LD) block showed strong associations with hippocampal volume after controlling for intracranial volume (rs7294919 and rs7315280; r 2 = 0.81, CEU 1000 Genomes Pilot 1). A random-effects analysis of the discovery sample, conducted to examine heterogeneity between cohorts, reduced significance only slightly for rs7294919 (P = 4.43 10 7 ) compared to the primary fixed-effects analysis (P = 2.42 10 7 ). The association was consistent, although stronger, in the full sample compared to the healthy subset (Fig. 2). Notably, the association was robust to the effects of head and brain size (Fig. 2), and the locus was not significantly associated with intracranial volume (P = 0.54) or total brain volume (P = 0.41). This suggests an effect at the level of the hippocampus rather than on brain size in general. The direction of the effect was consistent across samples and ages (Fig. 1). Haplotype analysis of directly genotyped variants near rs7294919 in two samples confirmed that the association was present across the haplotype and that the causal variant was well marked by rs7294919 (Supplementary Note). rs7294919 was also significantly associated with hippocampal volume in the cohorts from the CHARGE Consortium, which are a c Hippocampal volume Plotted Plotted SNPs SNPs 10 r 2 100 10 r 2 log 10 (P value) 8 6 4 2 0 0.8 0.6 0.4 0.2 NCRNA00173 MAP1LC3B2 ADNI BFS BIG fbirn IMAGEN ImaGene LBC1936 MooDs MPIP NCNG QTIM SHIP SHIP TREND SuperStruct SYS TOP UMCU ENIGMA discovery CHARGE BIG replication EPIGEN NESDA TCD/NUIG GOBS NIMH IRP Combined C12orf49 RNFT2 rs7294919 HRK FBXW8 115.6 115.8 116.0 116.2 Position on chr. 12 (Mb) rs7294919 Hippocampal volume TESC FBXO21 NOS1 80 60 40 20 Recombination rate (cm/mb) b log 10 (P value) d 8 6 4 2 0 Intracranial volume rs10784502 rs10784502 Intracranial volume 200 100 0 100 200 300 400 500 100,000 50,000 0 50,000 100,000 Effect in mm 3 per allele (standard error) Effect allele: C 0 0.8 0.6 0.4 0.2 ADNI BFS BIG fbirn IMAGEN ImaGene LBC1936 MooDs MPIP NCNG QTIM SHIP SHIP TREND SuperStruct SYS TOP UMCU ENIGMA discovery CHARGE BIG replication NESDA TCD/NUIG GOBS NIMH IRP Combined RPSAP52 HMGA2 LLPH IRAK3 HELB TMBIM4 GRIP1 64.4 64.6 64.8 65.0 Position on chr. 12 (Mb) Effect in mm 3 per allele (standard error) Effect allele: C composed of elderly subjects. Meta-analysis of the Enhancing Neuro Imaging Genetics through Meta-Analysis (ENIGMA) discovery and replication samples with those from the CHARGE Consortium yielded a highly significant association for rs7294919 (P = 6.70 10 16 ; N = 21,151). rs7294919 lies between HRK and FBXW8 (12q24.22; Fig. 1) and is not in LD with any SNPs within coding sequences, UTRs or splice sites within 500 kb (r 2 > 0.4) in the CEU sample from the 1000 Genomes Project Phase 1. To determine whether the observed association is related to a regulatory mechanism, we examined potential cis effects of this variant on expression levels of genes within a 1-Mb region. In temporal lobe tissue resected from 71 individuals with mesial temporal lobe epilepsy and hippocampal sclerosis in the University College London (UCL) epilepsy cohort, we examined association between rs4767492 (a proxy for rs7294919, which was not directly genotyped; r 2 = 0.636 in 1000 Genomes Project Phase 1) and expression levels. This analysis suggested an association (P = 0.006, controlling for age) with expression of the TESC gene, which lies 3 to FBXW8 (149 kb; Fig. 3). To corroborate this finding, we used the publicly available SNPExpress database (see URLs), which includes data on gene expression in post-mortem frontal cortex from 93 subjects. In this independent sample, expression levels of TESC 100 80 60 40 20 0 Recombination rate (cm/mb) 2 advance ONLINE PUBLICATION Nature Genetics

l e t t e r s 2012 Nature America, Inc. All rights reserved. Table 1 Results from the genome-wide association meta-analyses of mean hippocampal, intracranial and total brain volumes Sample Mean bilateral hippocampal volume a rs7294919 b again significantly differed by genotype (rs4767492; P = 0.0021). Additional replication came from the UK Brain Expression Database, where TESC expression in post-mortem brain tissues from 134 individuals free from neurological disorders showed a strong difference by genotype in temporal cortex (rs7294919; P = 9.7 10 4 for gene and 4.8 10 5 for exon 8). Given the small sample sizes and low minor allele frequency of this SNP (MAF = 0.099), no homozygotes for the minor allele were observed in any brain tissue sample, limiting the inferences we can draw regarding mode of action. Expression of HRK showed little evidence of association with the proxy genotype N Freq. of the effect allele β (mm 3 ) S.E. (mm 3 ) P value Heterogeneity P value Variance explained (%) h Discovery Fixed-effects model 7,795 0.104 50.27 9.71 2.42 10 7 0.913 0.242 Random-effects model 50.12 9.65 4.43 10 7 0.910 0.241 ENIGMA CEU and TSI replication 1,735 0.101 22.05 19.00 0.246 0.924 0.042 ENIGMA CEU and YRI or MEX replication 842 0.125 27.77 25.96 0.285 0.127 0.095 Discovery and replication 10,372 0.106 42.74 8.22 1.99 10 7 0.347 0.177 CHARGE in silico replication 10,779 0.093 52.70 8.45 3.40 10 10 0.442 0.458 ENIGMA and CHARGE 21,151 0.099 47.58 5.89 6.70 10 16 0.419 0.265 Intracranial volume c rs10784502 d Discovery Fixed-effects model 5,778 0.488 11860.73 2319.00 3.14 10 7 0.783 0.281 Random-effects model 11841.80 2270.07 3.93 10 7 0.771 0.280 ENIGMA CEU and TSI replication e 1,130 0.525 15758.59 5244.69 0.003 0.065 0.468 ENIGMA CEU and YRI or MEX replication 699 0.348 1928.43 6215.31 0.756 0.710 0.008 Discovery and replication 7,607 0.479 11395.74 2007.27 1.37 10 8 0.217 0.261 CHARGE in silico replication 8,175 0.501 7429.56 1630.92 5.23 10 6 NA 0.110 ENIGMA and CHARGE 15,782 0.491 9006.71 1265.78 1.12 10 12 0.145 0.166 Total brain volume f rs10494373 g Discovery Fixed-effects model 5,778 0.082 13693.29 3187.51 1.74 10 5 0.688 0.198 Random-effects model 13562.00 3114.17 2.69 10 5 0.728 0.194 ENIGMA CEU and TSI replication 117 0.107 8435.89 20256.09 0.678 NA 0.001 ENIGMA MEX replication 605 0.097 26883.36 8608.20 0.001 NA 0.964 Discovery and replication 6,500 0.085 14778.23 2957.14 5.81 10 7 0.182 0.240 Freq., frequency. CEU, TSI YRI and MEX refer to the HapMap 3 reference panels most representative of the sample and used for imputation; NA, not applicable. a Mean bilateral hippocampal volume association results were corrected for intracranial volume, sex, age, age 2, sex age, sex age 2 and four MDS components, and individuals with disease were included in the analysis. b rs7294919 is located at 12q24.22: position 115,811,975. Effect allele, C; non-effect allele, T. Genomic positions are based on the NCBI36/hg18 (March 2006) genome assembly. c Association results for intracranial volume were corrected for sex, age, age 2, sex age, sex age 2 and four MDS components, and individuals with disease were excluded from this analysis. d rs10784502 is at 12q14.3: position 64,630,077. Effect allele, C; non-effect allele, T. e Intracranial volume and total brain volume were available for two participants in MPIP and one participant in the BIG cohort who did not have hippocampal volume measures. The proxy SNP rs8756 was genotyped in the TDC/NUIG cohort. f Analysis for total brain volume was corrected for sex, age, age 2, sex age, sex age 2 and four MDS components, and individuals with disease were excluded. Total brain volume was not available for the ENIGMA replication cohorts. Within the CHARGE Consortium, a normalized version of total brain volume was analyzed and defined as total brain volume intracranial volume, and, because of this, the results are not comparable between consortia. g rs10494373 is at 1q23.3: position 160,885,986. Effect allele, C; non-effect allele, A. h Calculated as 2pq β 2 / (s.d.) 2, where p and q are the minor and major allele frequencies, β is the unstandardized regression coefficient and s.d. is from the phenotype in the absence of covariate corrections. Intracranial volume phenotypic variance from the ENIGMA discovery sample was used to calculate percent variance explained in the CHARGE in silico replications, as this information was not available from the CHARGE consortium. Hippocampal I ICV; healthy only (P = 9.2 10 5 ) Hippocampal I ICV; all subjects (P = 2.4 10 7 ) Hippocampal I TBV; healthy only (P = 0.00022) Hippocampal I TBV; all subjects (P = 5.8 10 7 ) Hippocampal I Other; healthy only (P = 0.00012) rs7294919 in the UCL epilepsy cohort (P = 0.11) or SNPExpress (P = 0.16) but was associated with rs7294919 in temporal cortex within the UK Brain Expression Database (P = 0.0051). Additional associations were observed in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs; Supplementary Note). The expression results in brain tissue suggest that TESC is a primary positional candidate for our quantitative trait locus (QTL). Studies of mouse and chicken embryos show that TESC is expressed throughout the brain during development, with the strongest expression in the developing telencephalon and mesencephalon and near the developing ventricles 25. TESC also has moderate expression in the human hippocampus during adulthood (Allen Institute Brain Atlas, see URLs; Fig. 3). Its protein product, tescalcin, interacts with the Na + /H + exchanger (NHE1) 26, which is involved in the regulation of intracellular ph 21, cell volume and cytoskeletal organization 27. TESC expression is strongly regulated during cell differentiation in a cell lineage specific fashion 28,29. Our data suggest that this role in cell proliferation and differentiation is relevant for hippocampal volume and brain development. Hippocampal I Other; all subjects (P = 2.2 10 7 ) 40 20 0 20 40 60 80 100 Effect in mm 3 per allele (standard error) Effect allele: C Figure 2 Association of rs7294919 with hippocampal volume stratified by disease and covariates. Effects are consistent in the discovery sample regardless of whether individuals with disease (N = 7,795) or only healthy subjects (N = 5,775) were included. The effect is also consistent whether accounting for intracranial volume (ICV), total brain volume (TBV) or without a measure of head size (Other). Nature Genetics ADVANCE ONLINE PUBLICATION 3

l e t t e r s 2012 Nature America, Inc. All rights reserved. a rs4767492 b rs4767492 c rs4767492 7.40 7.24 7.08 6.92 6.76 6.60 6.44 6.28 6.12 5.96 5.80 e 6.10 5.83 208.12 361.75 162.56 117.00 71.45 25.89 AA GA AA GA GG P = 0.0057 Temporal cortex P = 0.0021 Frontal cortex 5.56 5.29 5.02 4.75 4.48 4.21 3.94 3.67 3.40 CBLM DLPFC HIPP MPFC Fetal human TESC expression MS OCC 295.56 229.37 163.17 96.98 AA GA GG P = 0.4532 Peripheral blood Figure 3 Regulatory effects of hippocampal-associated variant and expression of TESC within the hippocampus. (a d) The locus most associated with hippocampal volume was also associated with mrna expression of the TESC gene in brain in three independent samples, the UCL epilepsy cohort (a), the SNPExpress database (b), where a proxy SNP was used, and the UK Brain Expression Database (d), where differences in TESC expression of the directly genotyped hippocampal variant (rs7294919) were strongest in the temporal cortex (TCTX) (red box) but also found in the average expression of all cortex (AvgCTX) and average expression of all brain structures tested (AvgALL). Symbol color represents genotype in a and d. These regional gradients in expression support the hypothesis that the SNP may associate with hippocampal but not total brain volume. No effects were detected in PBMCs from the SNPExpress database (c). CRBL, cerebellar cortex; FCTX, frontal cortex; HIPP, hippocampus; MEDU, medulla (specifically the inferior olivary nucleus); OCTX, occipital cortex; PUTM, putamen; SNIG, substantia nigra; THAL, thalamus; WHMT, intralobular white matter. (e) TESC is differentially expressed within the fetal human brain OFC PAS STRIAT TAC TAU THAL VLPFC f d TESC expression values 10 8 6 4 2 Adult human TESC expression Brain (Br) Gray matter (GM) Telencephalon (Tel) Cerebral cortex (Cx) Limbic lobe (LL) H0351.2001 H0351.2002 Hippocampal formation (HiF) FL HiF OL PL TL Str TESC - A_23_P76538 rs7294919 CT TT CT TT CT TT CT TT CT TT CT TT CT TT CT TT CT TT CT TT CT TT CT TT AvgALL AvgCTX CRBL FCTX HIPP MEDU OCTX PUTM SNIG TCTX THAL WHMT 4.8 P value 0.014 2.9 0.78 0.031 0.43 0.49 0.47 0.50 0.88 0.93 0.68 10 5 10 3 DT MES PTg MY CbCx FL HiF OL PL TL Str DT MES PTg MY TESC - A_23_P76538 2.5 2.5 (P = 1.33 10 12 ), with the highest expression in striatum (STRIAT) and hippocampus (HIPP) 42. Box plots represent median and 25th to 75th percentiles. Upper and lower lines show minimum and maximum values, respectively. CBLM, cerebellum; DLPFC, dorsolateral prefrontal neocortex; MPFC, medial prefrontal neocortex; MS, motor-somatosensory neocortex; OCC, occipital visual neocortex; OFC, orbital prefrontal neocortex; PAS, parietal association neocortex; TAC, temporal association neocortex; TAU, temporal auditory neocortex; THAL, mediodorsal thalamus; VLPFC, ventrolateral prefrontal neocortex. (f) TESC has moderate to high gene expression throughout the adult human hippocampus (shown in green), as visualized in the Allen Institute Human Brain Atlas using Brain Explorer 2 software. An inferior view of the brain is shown in two subjects; the anterior portion of the brain is at the top. The colors of spheres within the hippocampus indicate the Z-scores of TESC expression normalized within each subject across brain structures. Heat maps show that expression of TESC is higher in the hippocampus (HiF) and striatum (Str) than in other brain structures. The strongest association with intracranial volume was observed at rs10784502 (Table 1), an intronic SNP near the 3 UTR of the HMGA2 gene (12q14.3; Fig. 1). This locus was associated with intracranial volume across lifespan, as shown by the strong replication in samples from healthy elderly individuals in the CHARGE Consortium. The combined analysis resulted in the identification of a highly significant association (P = 1.12 10 12 ). Of note, rs10784502 has been reliably associated with increased adult height (P = 3.636 10 32 ; effect allele: C) 30. The genetic correlation between height and intracranial volume within the QTIM sample was significant (r g = 0.31; P = 1.34 10 7 ), as was that observed in the GOBS sample (r g = 0.20; P = 0.026), suggesting modest overlap of shared genetic determinants. rs10784502 also had an effect on total brain volume in the discovery sample (P = 9.49 10 5 ). When considering the results from the intracranial volume metaanalysis in SNPs previously associated with height 31 33 (N SNPs = 175; Supplementary Fig. 41), a clear inflation of the test statistic was observed (λ = 1.44), indicating that SNPs associated with height are also associated with intracranial volume. This enrichment, which was not observed for hippocampal volume (Supplementary Figs. 42 and 43), was due to a systematically higher degree of association throughout the candidate SNP set rather than a small number of large effects. Structural equation modeling showed that the effect of rs10784502 on intracranial volume could not completely be accounted for by the indirect effects of this SNP on height or by the correlation between height and intracranial volume (Supplementary Fig. 44). Examining correlations between rs10784502 and expression levels of genes within a 1-Mb region, we identified a significant effect on the expression of HMGA2 (P = 0.0077) as the single significant result in the GOBS transcriptional profile data. Additionally, HMGA2 expression levels in PBMCs were significantly negatively genetically 4 advance ONLINE PUBLICATION Nature Genetics