POHLAVNÍ REFLEXY A CHOVÁNÍ BÝKA Reprodukční funkce samců - tvorba spermií, jejich dozrávání a dopravu do samičích pohlavních orgánů - spermie jsou tvořeny v semenotvorných kanálcích varlat a transportovány přes síť kanálků varlete do nadvarlete, kde jsou uloženy a dozrávají. - doprava spermií do samičích pohlavních orgánů - ztopořením pohlavního údu - řízeno hormony a autonomním nervovým systémem Spermatogeneze Produkce testosteronu Leydigovými buňkami - gonadotropin lutropin = luteinizační hormon (LH). folikulostimulační hormon (folikotropin - FSH) z předního laloku hypofýzy stimuluje produkci proteinu vázajícího androgeny v Sertoliho buňkách Sertoliho buňky zdrojem hormonu inhibinu, který inhibuje sekreci FSH předním lalokem hypofýzy LH je nutný nepřetržitě pro spermatogenezi FSH není nutný pro udržení spermatogeneze, jestliže již jednou začala. Začátek spermatogeneze při pubertě ale vyžaduje přítomnost FSH. Hormonální řízení samičích pohlavních funkcí Gonadotropní hormony hypofýzy (GnRH) zrání a uvolňování samičích pohlavních buněk, stimulace sekrece pohlavních steroidních hormonů ve vaječníku o FSH = folikuly stimulující hormon stimulace růstu folikulů, zrání folikulů, ovulace (FSH-LH), vývoj ovarií o LH = luteinizační hormon stimulace zrání folikulů, ovulace, tvorba žlutého tělíska, sekrece progesteronu, stimulace sekrece estrogenu o Steroidní hormony VAJEČNÍKU: vývoj sekundárních pohlavních znaků, sexuální chování, regulace estrálního cyklu a březosti o Estrogeny indukce a projevy říje, sekundární pohlavní znaky, vývin mléčné žlázy, růst reprodukčních orgánů, kontrakce děložní, pozitivní zpětná vazba produkce gonadotropinů o progesteron: zachování březosti, zabránění děložních kontrakcí, změny na endometriu, negativní zpětná vazba produkce gonadotropinů o inhibin: inhibice uvolňování FSH o prostaglandin F2 alfa luteolýza 1
Pohlavní reflexy o Lokomoční sbližovací reflex plemeník vyhledává plemenici v říji podle zrakových, zvukových a i pachových podnětů (feromonů o Objímací reflex se dostavuje u býčků již ve věku 5 6 měsíců.. Současně s objímacím reflexem probíhá i erekční reflex při kterém dochází k ztopoření pyje erekci, za účelem jeho snadnějšího vpravení do pohlavního ústrojí plemenice. U býků stačí k vybavení objímacího reflexu silueta plemenice, býka nebo neživého fantomu. Zvětšením pyje se zvyšuje citlivost recepčních tělísek uložených na povrchu konce pyje citlivá na teplotu. Ztopoření pyje, ke kterému dochází v době pohlavního vzrušení vede k jeho vysouvání z předkožky a současně dochází k odkapávání výměšků uretrálních žláz znak připravenosti plemeníka k procesu páření. o Kopulační reflex zasunutí pyje povrch pyje přijde do styku s dostatečně teplou, hladkou a zavlhlou sliznicí. U býků se tento reflex projevuje ve věku 6 8 měsíců. o Ejakulační reflex je u přežvýkavců krátký a vrcholí jednorázovou ejakulací trvající 2 4 s. o Plemenný býk ve stádě průběžně sleduje chování plemenic ve stádě, zrakem, čichem; sleduje i hlasové projevy plemenic. o Přibližuje se k močícím plemenícím a očichává místo močení. Zjistí - li nastupující říji u dané plemenice, tuto doprovází, očichává ve slabinách, očichává a olizuje moč. o Býk dále testuje připravenost plemenice k páření pokládáním hlavy na záď plemenice a pokouší se o vzeskok reflex objímací. Toto chování býka je doprovázeno tlumeným hrdelním bručením a tzv. flémováním, tj. zvedáním hlavy a odhrnováním horního pysku. o V optimální době uprostřed říje dojde k vlastnímu procesu páření, plemenice se zastaví a býk se zvedne na zadní končetiny zaklesne se za kyčelní hrboly plemenice zasune pyj do pochvy a po jednorázovém frikčním pohybu dojde k ejakulaci spermatu do míst růžice děložního krčku intenzívním dorazem doprovázeným přískokem. o 2
POHLAVNÍ CHOVÁNÍ BERANA Sexuální chování beranů (i kozlů) je ovlivněno přítomností říjících se samic a je charakterizované těmito projevy: o následování ovcí a přibližování k nim, očichávání o flémování o chození do kruhu okolo ovce o pokládání hlavy na záď ovce o vzeskok páření Učební texty doplňují prezentace a videozáznamy. 3
ODBĚR SPERMATU BÝKA Ošetřovatel do připouštědla býka atrapu, správně ji fixuje, dezinfikuje a pak osuší celou její záď. Dezinfekce zádě býka atrapy se provádí po každém odběru a před dalším odběrem.. Jako atrapy se vybírají býci klidného temperamentu a po čtyřech odběrech se střídají, jelikož jsou značně zatěžovány zadní končetiny, hlavně ve hlezenních kloubech. K odběru je možno použít fantomu různé konstrukce. Příprava umělé vagíny k odběru K odběru ejakulátu se používají různé typy umělých vagín. V současné době se používají umělé vagíny dlouhé 30 cm vybavené jednorázovým sběračem (jedna strana seříznutá do špičky kornoutový tvar) z polyetylénu. Příprava umělé pochvy k odběru o Příprava umělé pochvy k odběru se provádí ve zvláštní místnosti spojené s prostorem pro odběr. o Před každým odběrem se překontroluje těsnost mezistěny vagíny. Mezistěna vagíny se naplní asi 100 cm 3 teplé vody, aby při odběru uvnitř vagíny dosáhla 38 40 C. o Umělá vagína se opatří sběračem a připravené vagíny se před odběrem mohou dát do termostatu s teplotou 40 C. o Před použitím se umělá vagína vymaže sterilní vazelínou pomocí sterilní skleněné tyče. Před odběrem se dofoukne mezi stěny umělé vagíny vzduch tak, aby tlak činil přibližně 530 kpa. o Po odběru se drží vagína ústím dolů tak, aby se zabránilo stékání nečistot do spermatu. o V přípravné laboratoři se odstřihne obal sběrač se spermatem, který se předá do laboratoře k dalšímu zpracování. o Odběr spermatu u býků o K odběru jsou býci řádně vyčištěni s dokonale omytou předkožkou ve vlažné vodě a mýdlem. Bezprostředně před odběrem se býkům očistí předkožka a chvostek suchou buničitou vatou. Býk je přiváděn ošetřovatelem k atrapě nebo k fantomu a provádí se jeho vydražďování. Býk je náležitě připraven k odběru tehdy, je-li pyj vysunut a odkapávají-li výměšky přídatných žláz pohlavních. Při skoku býka na atrapu uchopí technik odběru předkožku, odkloní ji a usměrní pyj k ústí umělé pochvy a nechá býka dorazit. o Býci se odebírají v obvyklou předem stanovenou dobu, nejdříve 3 hodiny po nakrmení. Frekvence odběru se stanoví individuálně pro každého býka, optimální je 8 14 odběrů v měsíci. U býků do 2 let věku je frekvence odběrů nižší (1x za týden). o Odběr se provádí v připouštědle, tj. místnosti vybavené fixační klecí připouštědlem a bezpečnostními zábranami. Je dobré používat i venkovní připouštědlo (podle počasí), o ODBĚR SPERMATU BERANA Pro odběr spermatu se používá umělá vagína podobného typu jako u býka, je ale zkrácená na 20 cm. Sběrač může být skleněný nebo z PE.. Příprava berana, atrapy, umělé vagíny, hygienické zásady odběru i technika odběru spermatu jsou shodné jako při odběru býka. K fixaci atrapy se používá speciální připouštědlo. Jako atrapy se používá ovce v říji. Berani se odebírají 1 2 x za den, pětkrát za týden. U mladých beranů je frekvence odběru nižší. Učební texty doplňují prezentace a videozáznamy. 4
HODNOCENÍ SPERMATU A VÝROBA INSEMINAČNÍCH DÁVEK METODY HODNOCENÍ SPERMATU BÝKŮ o Odebraný ejakulát se hodnotí a zpracovává ve specializované laboratoři při teplotě v místnosti 20 25 o C. o Základní vyšetření ejakulátu musí být zahájeno do 10 minut po odběru. o Pro stanovení oplozovací schopnosti býka, resp. spermatu se používá řada zkoušek pro komplexní vyšetření a posouzení vhodnosti k dalšímu zpracování. Laboratorní metody určené k vyšetření čerstvého ejakulátu Základní charakteristiky ejakulátu u býků odebíraných na inseminační stanici objem ejakulátu 4 12 cm³, koncentrace spermií 0,8 2 x 10 6 v mm 3, celková produkce spermií v ejakulátu 5 15 x 10 9, aktivita - progresivní pohyb vpřed za hlavičkou 60 75 % i více, ph 6,4 7, patologické spermie do 5 výjimečně až do 20 %. Makroskopické hodnocení ejakulátu o Objem ejakulátu se zjišťuje vážením na laboratorní automatické váze (v gramech). o Konzistence, zrnitost se posuzuje u každého ejakulátu ve sběrači. Husté sperma je neprůhledná vazká tekutina, zpravidla smetanového mírně zrnitého vzhledu, zrnité shluky spermatu se pomalu pohybují. Řídké sperma je vodnaté, průsvitné, bez zrnitosti. o Barva se posuzuje proti světlu. Dobré sperma je barvy bělavé, v některých případech šedobílé, nebo mírně nažloutlé. o Pach se posuzuje čichem ve sběrači, sperma má slabý specifický pach, připomínající pach kravského mléka. o Cizí přimíseniny jsou nejčastěji chlupy, vazelína, nečistoty z předkožky. Při odběru venku to může být prach nebo písek. Dobré sperma má být prosté přimísenin. Mikroskopické hodnocení ejakulátu Hodnocení aktivity Progresivní pohyb spermií je znakem jejich funkční plnohodnotnosti a vyjadřuje se v procentech. U ejakulátů určených k inseminaci, ke konzervaci se požaduje minimální aktivita 70%. Ze sběrače se odebere kapka spermatu, ta se promíchá v 1,5 cm 3 citrátu sodného zahřátého na teplotu 39 o C+1 o C, přikryje se krycím sklíčkem a posuzuje při 200 až 300 násobném zvětšení. Hodnotí se minimálně 3 (lépe 5) zorná pole a odhadem se stanoví procentické zastoupení spermií pohybujících se vpřed za hlavičkou na stolku mikroskopu musí být vyhřívací destička pro udržení teploty 39 o C+1 o C. Vedle pohybu přímočarého vpřed za hlavičkou je třeba sledovat i ostatní druhy pohybu, které jsou nefyziologické a hodnotí se jako závadné (kolébavý, kruhový, na místě, zpětný). Nežádoucí je i shlukování spermií, tzv. aglutinace. Stanovení hustoty koncentrace ejakulátu Fotometricky Na principu změření stupně zakalení standardního roztoku rozředěného spermatu se zjistí jeho hustota a po přepočtu se stanoví v 1 mm 3. Pro kontrolu přesnosti měření přístroje se jedenkrát měsíčně porovnávají výsledky s hodnotami zjištěnými počítáním v Bűrkerově komůrce. Rozdíl nesmí být vyšší než 15%. 5
Hematocytometricky v Bűrkerově komůrce Sperma se ředí v melanžéru 3% roztokem NaCl a kápne se pod krycí sklíčko do počítací komůrky (hematocytometru), přitiskne se krycí sklíčko a rotíracími pohyby sklíčka vpravíme spermie do celé plochy čtverečků. Pod mikroskopem při zvětšení 300-400 násobném počítáme spermie. Počítají se vždy všechny spermie ležící uvnitř čtverečku o a všechny spermie, jejichž hlavičky se dotýkají nebo leží na levé a horní straně čtverečku. Počítají se permie v 10 čtverečcích o velikosti 1/16 mm 2 a v 10 čtverečcích o velikosti 1/25 mm 2. Počet spermií v 1 mm 3 se zjistí tak, že součet počtu spermií z 10 čtverečků 1/16 se násobí 3200a ve čtverečcích 1/25 násobením průměrného počtu spermií v 1 čtverečku číslem 50 000. Počítání s další kapkou ze stejného melanžéru, rozdíl by neměl být větší než 15 % a pak se vypočítá průměrný počet spermií. Biologické zkoušky ejakulátu V biologických testech se sleduje odolnost spermií vůči různým vnějším vlivům. Testy přežitelnosti spermatu jsou důležité pro posouzení biologické hodnoty a oplozovací schopnosti spermií. Mezi jejich výsledky a skutečnou plodností byla zjištěny vysoká korelace. Krátkodobý tepelný test přežitelnosti Zkumavky 0,5 1 cm 3 spermatu (ředěného nebo neředěného) vložíme do vodní lázně a postupně zahřejeme na 38 o C.V hodinových intervalech odebíráme ze zkumavky vzorky a provádíme posouzení aktivity spermií. Doba trvání testu nebývá delší než 6 hodin, spermie se v teplém prostředí rychle vyžívají a ztrácejí aktivitu. Ejakuláty s větší absolutní délkou životnosti jsou biologicky hodnotnější a mají vyšší oplozovací schopnost. Dlouhodobý chladový test přežitelnosti Zkumavky se 3 cm 3 naředěného spermatu vložíme do chladničky (teplota 1 3 o C) a každý den ve stejnou dobu sledujeme aktivitu spermií pod mikroskopem s vyhřívací destičkou. Dobré ejakuláty si zachovávají po dobu 96 hodin od odběru aktivitu alespoň 50%. Zkouška rezistence spermatu Rezistence spermatu je ukazatelem odolnosti spermií vůči působení 1% roztoku NaCl. Vyjadřuje se stupněm zředění zkoušeného spermatu tímto roztokem (metoda vzestupného ředění) nebo časem v minutách (metoda konstantního ředění do okamžiku, kdy ustane přímočarý pohyb spermií vpřed za hlavičkou. Stanovení procenta živých a mrtvých spermií barvením Touto zkouškou se získá obraz o kvalitě ejakulátu. Je založena na rozdílné afinitě živých a mrtvých spermií k barvivům (eosín). Mrtvé nebo oslabené spermie přijímají barvivo, živé spermie nepropouštějí semipermeabilní membránou barvivo a zůstávají bílé. Málo životaschopné spermie se značně sníženým metabolismem se barví bledě růžově až červeně. Stanovení koncentrace vodíkových iontů ph spermatu Kyselost spermatu je výrazem činnosti a zdravotního stavu přídatných pohlavních žláz. Má být stanovena do 15 minut po odběru, jelikož se životní pochody spermií mění, zejména u přežvýkavců. Ejakulát býků s ph pod 6,4 a nebo nad 7,5 má sníženou oplozovací schopnost a k inseminaci se nesmí používat. Používají se buď nitrazínové papírky, ale přesnější způsob stanovení ph je pomocí ph-metru (elektrometricky). 6
Biochemické zkoušky spermatu Podle stupně anaerobního nebo aerobního metabolismu spermií se odhaduje jejich životnost a oplozovací schopnost. Podstatou zkoušky je rychlost anaerobního rozkladu fruktózy obsažené v semenné plazmě. Dehydrogenační zkouška Při dehydrogenační zkoušce se sleduje rychlost fruktolýzy jako znak počtu pohyblivých spermií. Methylenová modř má v této zkoušce úlohu akceptoru vodíku uvolněného při anaerobním štěpení cukru a touto redukcí se mění v bezbarvou leukoformu. Do kapiláry se nasaje roztok metylénové modři a vyšetřovaného spermatu, kapilára se uzavře plastelínou a ponoří se do vodní lázně o teplotě 40 o C. Měří se čas v minutách, který je třeba k odbarvení a podle tabulky určíme počet živých spermií ve vyšetřovaném spermat Morfologické metody vyšetření spermatu Hodnocení o morfologie spermií a o morfologických abnormalit mohou přispět ke zjištění příčin neplodnosti plemeníků. Využívá se při tom zdokonalené mikroskopické techniky a různých způsobů barvení. Sperma se ředí na předehřátém hodinovém sklíčku v poměru 1:1 až 1:20 podle hustoty spermatu. A po promíchání se provede roztěr. Na okraj předehřátého podložního sklíčka se nanese 1 kapka zředěného spermatu a roztěrovým sklíčkem se provede roztěr tahem kapky hranou sklíčka v úhlu 45 o tak, že tah roztěrovým sklíčkem musí být plynulý, aby se vytvořila tenká, nepřerušovaná vrstva. Roztěry musí zaschnout ve vodorovné poloze při laboratorní teplotě nebo v termostatu při teplotě 35 39 o C za 1 3 minuty. Další postup závisí na barvicí metodě a typu použitého mikroskopu. Při vzniku patologických spermií se uplatňuje řada vlivů genetických a negenetických (vliv výživy, infekce, vliv věku atd.). Podle místa vzniku se změny spermií rozdělují na primární a sekundární. Primární změny spermií Vznikají v průběhu spermatogenního cyklu - degenerativní formy spermií, změny tvaru hlavičky, změny v nukleoplazmě, změny na akrozómu, tvarové změny bičíku a další vývojové anomálie. Sekundární změny spermií Vznikají při dlouhém pobytu spermií v ocasu nadvarlete, v průběhu ejakulace, špatnou manipulací s odebraným spermatem, nesprávné přípravě preparátů (změny hlavičky, změny akrozómu, torze bičíku) Nezralé spermie Jsou to spermie se zadrženou protoplazmatickou kapkou na krčku (proximální) nebo v průběhu spojovací části (distální). V ejakulátu býka nesmí být více než 2 % nezralých spermií. Při vyšším výskytu nezralých spermií v ejakulátu je třeba sledovat výskyt dalších vývojových vad, ale také může jít i o přetěžování plemeník a- častý odběr spermatu. 7
KONZERVACE BÝČÍHO EJAKULÁTU Ředěním se vytváří podmínky pro přežívání spermií mimo organismus. Životními projevy - dýcháním spermií, vznikají v ejakulátu produkty látkové výměny kyselina mléčná. Kyselina mléčná postupně okyseluje prostředí, zpomaluje pohyb spermií, navozuje anabiózu a jejich odumření. Ředidlo má mít tyto vlastnosti: být energetickým zdrojem pro spermie mít dobrou pufrovací schopnost malý obsah elektrolytu zajišťovat požadovaný osmotický tlak ph odpovídající požadavkům býčího ejakulátu (6,4-6,8) nesmí být toxické musí být sterilní musí být ekonomicky dostupné. Ředění musí být zahájeno do 15 minut po odběru a po makroskopickém a mikroskopickém posouzení. Teplota ředidla i ředěného ejakulátu musí být stejná. Ředidlo se vždy přidává do ejakulátu určeného k ředění postupně za neustálého míchání. Dlouhodobá konzervace ejakulátu býků Nejrozšířenější metodou dlouhodobé konzervace spermatu ve světě je metoda francouzská při které se semeno mrazí a uchovává v pejetách (dutinkách, slámkách) s objemem 0,25 a 0,50 cm 3 spermatu. Každá pejeta obsahuje identifikační údaje o býkovi, jeho zdravotním stavu i inseminační stanici, zemi původu. Během zpracování spermatu se teplota laboratoře udržuje na 20 25 0 C. Veškeré předměty přicházející do styku se spermatem musí být sterilní. Sperma zpracovávají jen pracovníci k tomu určení a vyškolení. Postup ředění Odebrané sperma se ve sběrači, odstřiženém podle šablony, předá do laboratoře. Zvážením na automatických vahách se stanoví množství odebraného spermatu. Po vložení průtokového korálku a odběru vzorků na zjištění aktivity, hustoty, případně morfologického vyšetření, se sběrač uzavře svařením fólie. Připravený sběrač se semenem se nasune hadičkou přes korálek na konec nálevky oscilačního stolku. Svorkou se sevře hadička, přidá potřebné množství ředidla, pomalu uvolní svorka a ředí se. Ředidlo se přidává ke spermatu rovnoměrně za neustálého míchání na oscilačním stolku. Celková doba ředění je asi 10 minut. Během této doby dochází současně s ředěním k ochlazování ředidla i ředěného spermatu na laboratorní teplotu. Po naředění spermatu se stáhne hadička z nálevky oscilačního stolku, na hadičku se nasadí svorka s olivkou a sperma připraveno k plnění dutinek. Zchlazování spermatu Naplněné dutinky se rozprostřou na jednotlivé rampy a uloží do chladícího boxu při teplotě 3 4 0 C. Doba od odběru spermatu po uložení v chladícím boxu nesmí přesáhnout 20 minut. Ekvilibrace probíhá po dobu 2 3 hodin. 8
Zmrazování spermatu Inseminační dávky se zmrazují v automatických zmrazovačích. Rychlost zmrazování a průběh zmrazovací křivky je řízen počítačem. Výchozí teplota pro zmrazování je -70 0 C, doba zmrazování 8 10 minut. V parách kapalného dusíku (teplota nesmí vystoupit nad -130 0 C) se pejety sesypávají do kontejnerů (do kanystrů rozdělených gobletami s kapacitou podle tvaru a velikosti od asi 12 do 80 pejet). Při skladování inseminačních dávek nesmí hladina tekutého dusíku klesnout pod horní okraj kanystru. Maximální doba pro manipulaci s dutinkami - pejetami mimo kontejner je 5 sekund. Příprava inseminační dávky a provedení inseminace při inseminaci spermatem v dutinkách (pejetách) Před inseminací se inseminační dávka rozmrazí ponořením dutinky do vodní lázně o teplotě 38 0 C až 40 0 C po dobu asi 25 sekund. Dutinka pejeta se vyjme a osuší buničitou vatou. Konec pejety s vatovou zátkou se promne mezi prsty, aby se zátka uvolnila a usnadnilo se její posunování při inseminaci, drží se svisle, vatovou zátkou dolů a mírným poklepem se případná bublina vzduchu přemístí do horní části dutinky, čímž se obsah promíchá. Pejeta se zasune do inseminační aparatury, konec bez vatové zátky se nůžkami odstřihne tak, aby dutinka přesahovala kovový konec aparatury o asi1,5 cm. Nasadí se jednorázová krycí pipeta na aparaturu - katetr s pejetou a na rozšířeném konci aparatury se zajistí proti skluzu těsnícím kroužkem. Jemným zatlačením na píst se odlepí PVA zátka a sperma se vytlačí do hrotu krycí pipety tak, aby se hladina spermatu dostala až k vyústění krycí pipety. Takto připravenou aparaturou se vytlačením obsahu pejet inseminuje. HODNOCENÍ KVALITY SPERMATU BERANA Kvalita spermatu berana je závislá na ročním období, na podzim bývá nejlepší Požadavky: Barva smetanová, konzistence zrnitá, pach typický, ale nevýrazný, nesmí obsahovat přimíseniny Hustota je minimálně 2 x 10 6 v mm3 (pro krátkodobé uchovávání) nebo 2,8 x 10 6 v mm 3 pro dlouhodobou konzervaci. Objem má být minimálně 0,5 cm 3 Aktivita minimálně 70% Patologických spermií maximálně. 15% ph 6,2 6,9 (pokud je nad 7, dá se očekávat snížená koncentrace spermií) Makroskopické hodnocení Posuzuje se barva, zrnitost, pach, obsah přimíšenin, objem Mikroskopické hodnocení Aktivita se posuzuje u každého ejakulátu Princip jejího zjišťování je podobný jako u býka, teplota vyhřívací destičky je 40 o C. Stanovení koncentrace Koncentrace se hodnotí pomocí Bürkerovy komůrky je obdobné jako u býčího semene. Používá se však nižšího ředění 250 x až 350 x (do melanžéru na červené krvinky se nasaje semeno jen ke značce 0,3 (u býka po značku 0,5) a doplní se 3% roztokem NaCl ke značce 101). Průměrný počet spermií spočítaný ve čtverečcích 1/25 se násobí 83250 a vypočítá se celkový počet spermií v 1 mm3 spermatu. Stanovení rezistence se provádí stejně jako u býčího semene. 9
Dehydrogenační zkouška se provádí podobně jako u býčího spermatu, ředění metylénovou modří. je vyšší Tepelný test přežitelnosti Dělá se 1 x za měsíc. 0,1 cm 3 semene se zředí s 1 cm 3 fyziologického roztoku a inkubuje ve vodní lázni o teplotě 47,5 o C,po dobu 10 minut. Po této době se opět posoudí aktivita. Morfologické hodnocení Stanovení patologických spermií se provádí stejně jako u býčího spermatu KONZERVACE SPERMATU BERANA Krátkodobá konzervace spermatu Ředidla pro krátkodobé uchovávání (tj. po dobu 8-12 hod) jsou např.žloutko-citrátové ředidlo, ředidlo složené z fosforečnanu sodného, fosforečnanu draselného, glukózy, vaječného žloutku, redestilované vody nebo mléčné ředidlo (mléko, žloutek, glukóza, fosforečnan draselný). Ředí se přímo ve sběrači okamžitě po odběru. Teplota ředidla má být stejná jako semene. Ředí se do takového stupně, aby počet spermií v inseminační dávce byl minimálně 00-360x10 6, (ředění 1 : 3 až 1 : 5). Naředěného sperma se uchovává při 15 o C po dobu 5 6 hodin, při zchlazení v ledničce (musí se provádět opatrně, spermie jsou citlivé na chladový šok) na 3-5 o C, lze použít k inseminaci do 12 hodin (maximálně do 24 hod.). Dlouhodobá konzervace spermatu Po rozmražení je často i při dobré aktivitě spermatu oplozovací schopnost spermií velmi špatná nebo žádná, až 50 % mražených ejakulátů bývá vyřazeno pro nízkou oplozovací schopnost. Používají se ředidla pro ředění ejakulátu (podobná či stejná jako u býků) jako jsou TRIS, žloutko-laktózové, Triladyl, Optidyl. Mrazí se také do pejet o objemu 0,25 nebo 0,50 cm 3. KVALITA SPERMATU KOZLA A JEHO KONZERVACE Objem ejakulátu je asi 0,4 3 cm 3, průměrně 1 cm 3 Barva je bílá nebo šedobílá, příp. nažloutlá, ph 6,2 7,5, Koncentrace spermií 0,7 5 x 10 6 (pro inseminaci min 0,7x10 6 ) Aktivita spermií by měla pro dlouhodobou konzervaci minimálně 85 % Podíl patologických spermií maximálně15 % Krátkodobá konzervace: Stupeň ředění závisí na koncentraci (max 1 : 15). Ejakulát se před ředěním může promývá (obsahuje enzym, který rozkládá molekuly lecitinu), k ředění se používají fyziologický roztok, vaječný žloutek, mléčná ředidla, glukózo-fosfátové ředidlo. Dlouhodobá konzervace Nejčastěji se používá ředidlo TRIS. Inseminační dávka musí obsahovat 100 x 10 6 spermií s progresivním pohybem. Během ředění se musí dodržovat stejná teplota ředidla a spermatu, doba. Zmrazuje se v pejetách (0,25 nebo 0,5cm 3 )nebo peletách (0,1cm 3 ). Učební texty doplňují prezentace a videozáznamy. 10
METODY INSEMINACE KRAV Inseminuje se do kanálku děložního krčku, který vytváří nejvhodnější prostředí pro spermie. Cervikální hlen působí jako fyziologický filtr a do dělohy propouští pouze spermie s aktivním pohybem. Rektální metoda Ukazováčkem a prostředníkem levé ruky se rozevřou stydké pysky a po prohlédnutí sliznice poševní předsíně se do vytvořeného nálevkovitého otvoru ve štěrbině stydké zavede pravou rukou inseminační katetr zdola nahoru pod úhlem asi 45 0 přes předsíň poševní. Po proniknutí hrotu pipety z poševní předsíně do pochvy (asi 10 15 cm) je pipeta dále zaváděna téměř ve vodorovné poloze do blízkosti krčku děložního. Teprve když je pipeta dobře zasunuta do pochvy, uvolní se oba stydké pysky a levá ruka chráněná rukavicí se zasune do konečníku plemenice. Z konečníku se odstraní nahromaděné výkaly a vyšetří se pohmatem pohlavní orgány. Přes stěnu rekta se uchopí krček v blízkosti čípku tak, že palec ho svírá z pravé strany a volný malíček usnadňuje vyhledání zevní branky krčku děložního Druhou rukou je posunována pipeta k malíčku, který její další pohyb k zevní brance usměrňuje. Děložní krček se opatrně a navlékne na pipetu katetr. Jeho hrot má proniknout asi do poloviny krčku děložního (tj.3-5 cm). Pomalým stiskem pístu za současného pomalého, plynulého vysouvání pipety se vytlačuje sperma a deponuje po větší ploše sliznice kanálku děložního krčku. Po vytlačení spermatu se pustí děložní krček, vysune se ruka z konečníku a současně se vysunuje katetr. Hodnocení výsledků inseminace zabřezávání Mezi základní ukazatele plodnosti lze zařadit: interval servis perioda (SP) inseminační index mezidobí březost po I.inseminaci březost po všech inseminacích. Pomocné ukazatele plodnosti jsou: % zabřezlých plemenic ze stavu krav hrubá natalita čistá natalita úhyn telat embryonální mortalita. Ale jsou ukazatele, které dávají reálnou odpověď oproti tradičním? V jakém poměru březnou krávy během jednotky času? Ukazatel: Procento zabřezlých Jak efektivně březnou krávy po připuštění? Ukazatel: Procento březosti Inseminujeme vhodném krávy dostatečně rychle? Ukazatel : Procento inseminovaných Je počet krav které zabřeznou za jednotku času dostatečný pro udržení počtu zvířat ve stádě? Ukazatel: Základní reprodukční souhrn 11
Vhodné ukazatele výsledků plodnosti Procento vhodných krav které zabřeznou každých 21 dní procento zabřezlých = úspěšné výsledky (březosti) vydělené celkovým počtem možných časových jednotek, ve kterých jsou vhodné krávy v riziku, že zabřeznou (21 denní reprodukční cykly) Procento inseminovaných = % vhodných krav, které jsou připuštěné každých 21 dnů Procento inseminovaných je ekvivalentem procentu vyhledaných říjí pokud jsou krávy inseminovány při každé vyhledané říji, kdy na sebe nechá kráva skákat Výpočet základního reprodukčního souhrnu Celková velikost stáda (dojené + suché) např. 1000 kusů Procento obměny (brakace) (35%) -350 Ztráty březosti (8%) + 80 Celkový počet březostí 730 Cíl pro mezidobí (měsíce) 14 Potřeba březostí / cíl mezidobí = 730 / 14 52 březostí potřeba každý měsíc a 13 březostí potřeba každý týden Procento zabřezlých = úspěšné výsledky (březosti) vydělené celkovým počtem možných časových jednotek ve kterých jsou vhodné krávy v předpokladu, že zabřeznou (21 denní reprodukční cykly) Je tedy 350 cyklů po 21 dnech, ve kterých byly vhodné krávy Pokud zabřezlo celkem 35 krav během tohoto času, je procento březosti = 10% TODY INSEMINACE OVCÍ A KOZ Metody inseminace ovcí a koz jsou podobné. Intracervikální metoda (u prvniček intravaginální) 0,2 0,5cm 3 ředěného semene Fixace v připouštědle, používá se jednorázová pipeta, pomocí poševního zrcadla se světelným zdrojem se inseminační dávky vpraví do děložního krčku. Intravaginální metoda: bez zrcadla, do horní části poševní klenby Intrauterinní metoda se používá zřídka, inseminační dávka se zavádí na kraj dělohy za pomoci poševního zrcadla Laparoskopická metoda pomocí laparoskopu (mikrochirurgická metoda), vedou se dva malé řezy na břiše zvířete okolí linea alba abdominis (ovce, koza fixovány na zádech a používá se lokální anestézie). Inseminační dávka do děložního rohu (podobně i ET). 12
Hodnocení plodnosti ovcí Za nejdůležitější ukazatele plodnosti každého stáda ovcí, podobně jako koz, se považuje o procento říjích se ovcí o procento zapuštěných a zabřezlých ovcí o procento obahněných ovcí v dobrých stádech více než 90 % o počet všech narozených jehňat živých i mrtvých (hrubá a čistá natalita) o průměrný počet jehňat na vrh o živou hmotnost narozených jehňat o mateřské schopnosti matky = mléčnost matky lze sledovat kontrolou mléčné produkce nebo kontrolou živé hmotnosti jehňat o plodnost beranů připouštěných ve stádě vyjadřuje se inseminačním indexem, NRT 35 dní (non return test), podle počtu ovcí u kterých se opakuje říje. Hodnota v dobrých podmínkách zabřezávání činí 70 75%. Učební texty doplňují prezentace a videozáznamy. 13