EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY

Transkript

1 EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY Klára A. Mocová Laboratoř Ekotoxikologie a LCA Ústav chemie ochrany prostředí VŠCHT Praha

2 Toxikologie vs. ekotoxikologie Toxikologie zkoumá vlivy škodlivých látek na člověka testy na zvířatech příbuzných člověku (savci) Ekotoxikologie zkoumá vlivy škodlivin na veškeré organismy kromě člověka testy na mikroorganismech, rostlinách a zvířatech

3 Ekotoxikologický biotest Účastníci: zkoumaný vzorek (půda, voda, chemická látka) testovací organismus (bakterie, rostliny, živočichové)

4 Chemická analýza vs. biotest Chemická analýza určuje koncentraci látek (škodlivin) v prostředí (Kolik čeho) Biotest hodnotí reakci živých organismů na dané prostředí (jak a na koho působí.) Oba přístupy se doplňují

5 Kam ekotoxikologii zařadit? 1. Problém: havárie, stará zátěž, nové chem. látky, materiály a výrobky 2. Chemická analýza: (odběr vzorku vody, půdy, vzduchu; zjištění obsahu kovů a organických látek) 3. Ekotoxikologické biotesty: nasazení modelových organismů přímo do vzorků odebraných z prostředí nebo do média obsahujícího testovanou chemickou látku zjištění vlivu na organismy 4. Dekontaminační (sanační) práce: vyčištění lokality

6 Organismy v biotestech Producenti rostliny řasy, vodní rostliny, suchozemské rostliny Konzumenti živočichové vodní: perloočky, ryby suchozemští: roupice, žížaly, chvostoskoci Destruenti (rozkladači) baktérie, plísně vodní bakterie : Vibrio půdní enzymatická reakce

7 Ekotoxicita legislativa ČR Metodický pokyn odboru ke stanovení ekotoxicity odpadu (MŽP, 2007): pouze aquatické testy (vzorky vod či výluhy půd) testovací organismy: řasy hořčice perloočky ryby

8 Ekotoxicita mezinárodní Normované postupy (OECD, ISO atd.): aquatické a půdní testy krátkodobé i dlouhodobé speciální (genotoxické) všechny trofické úrovně (na rozdíl od ČR)

9 Testy na organismech - obecně Porovnávání růstu organismu ve vzorku s kontrolou inhibice růstu (0 100 %) stimulace růstu (záporné hodnoty %) Jak se hodnotí růst? - počet organismů, rychlost množení, rychlost růstu jednotlivců (např. délka kořene, hmotnost sušiny), úhyn organismů

10 (Eko)toxikologické indexy Toxikologie: LD50 dávka - koncentrace látky v organismu, při níž uhyne 50 % organismů Ekotoxikologie: LC50 koncentrace látky v prostředí, při níž uhyne 50 % organismů (obecně se v ekotoxikologii užívá indexu EC50 účinná (efektivní) koncentrace účinek látky je obecný, nemusí znamenat úhyn, ale inhibici růstu)

11 Problémy se vzorky Kontrola: vodné vzorky: roztok solí (kultivační voda) vs. výluh (vzorek) půdní vzorky: půda dobré kvality, nicméně se může velice lišit srovnatelnost??? nejjednodušší je test chemikálií Převádění půd na výluhy někde má smysl, ale použití vodních organismů vágní Ředění půd -???

12 Uspořádání biotestu Vzorek v koncentrační řadě např.: 0 (kontrola) - 0, (mg/l; mg/kg ) Kultivační podmínky (teplota, osvětlení, zálivka, krmení) Doba trvání: 1 24 hod bakterie 2-7 dnů řasy, rostliny, akutní - zvířata 3 4 týdny dlouhodobé - rostliny, rozmnožovací - zvířata Sledování organismů: průběžně / na konci testu

13 Bakterie Vibrio fisheri

14 Půdní enzymy dehydrogenasová aktivita

15 Vodní bezobratlí Daphnia magna, Artemia salina

16 Ryby pstruh duhový, akvarijní ryby danio pruhované

17 Půdní kroužkovci žížaly, roupice

18 Půdní bezobratlí chvostoskoci

19 Unitární vs. modulární organismy

20 Řasový test Desmodesmus subspicatus

21 Řasový test v baňkách - ukončení

22 Řasový test - mikrodestička

23 Lemna minor L.

24 Okřehek jak to dělají jinde

25 Sledování počtu stélek ( lístků )

26 Velikost listové plochy obrazová analýza A B C A = původní foto B = označení a změření plochy listů C = binární obraz

27 Rozpad chlorofylu, nekróza

28 Test klíčivosti jílek (Lolium perenne L.)

29 Test klíčivosti měření délky kořene

30 Půdní testy metodika, organismy

31 toxikant: Cd (NO3)2

32 toxikant: CdCl2

33 Obrazová analýza měření růstu kořene binární obraz zeleně vymezený objekt (jetel) původní foto s měřítkem binární obraz ke zpracování

34 Digitální analýza obrazu NIS Elements

35 Testy genotoxicity Zaměřené na sledování poškození DNA (genů) Amesův test (geny, bakterie) Mikrojaderné testy (rozpad chromosomů, rostl. a živ. buňky) Kometový test (rozpad chromosomů, živočišné buňky)

36 Mocová, 2013 Amesův test

37 STAVBA EUKARYOTICKÉHO CHROMOSOMU

38 CHROMOSOMÁLNÍ ABERACE delece inverze translokace Cytogenetické vyšetření pacienta: šipkou vyznačeny některé aberace

39 Mikrojaderné testy Test genotoxicity (mutace, tj. chyby na DNA) Mikrojádro = úlomky chromosomů, které se nemohou rozdělit a tudíž předat do další generace buněk Přítomnost mikrojader v buňkách znamená mutagenní účinky testované látky (vzorku) Provádí se na rostlinách i živočiších

40 Mikrojaderné testy

41 Kometový test hodnotí fragmentaci DNA elektroforéza, fluorescenční barvení DNA fragmenty DNA migrují ven z buněk a vytváří ocas komety nepoškozená DNA zůstává přichycena na místě v gelu a vypadá jako tělo komety. Buňky ve tvaru komety jsou poškozené.

42 Kometový test Mocová, 2013

43 Poděkování Ing. D. Červený, Ing. Květa Fišerová, Ing. Hana Palková, Ph.D., Ing. Tomáš Sopr

44