GENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI

Transkript

1 GENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI INDUKOVANÉ PŮSOBENÍM ORGANICKÝCH LÁTEK Z PRACHOVÝCH ČÁSTIC V OVZDUŠÍ Kateřina Hanzalová Oddělení genetické ekotoxikologie Ústav experimentální medicíny AV ČR v.v.i. k.hanzalova@biomed.cas.cz

2 ÚVOD Prachové částice v ovzduší (PM) na povrchu nesou směs genotoxických látek, mj. PAU a jejich deriváty. Mechanismy působení těchto komplexních směsí látek v organismu nejsou přesně objasněny. Cíl studie: Zhodnocení genotoxicity org.látek z PM v ovzduší. Studium změn v genové expresi v odpovědi na působení těchto látek u dvou různých linií plicních buněk.

3 ODBĚRY PRACHOVÝCH ČÁSTIC Z OVZDUŠÍ Částice PM 2,5 (<2,5 μm) odebrány v lokalitách: Ostrava Bartovice, Ostrava Poruba, Karviná, Třeboň V lokalitě Praha Libuš odebrány z tech. důvodů PM 10 (<10 μm) Odběry velkoobjemovými čerpadly probíhaly po dnů (po 24h výměna filtrů) v zimním období 2008/2009 Odběrové zařízení

4 CHARAKTERISTIKY ODEBRANÝCH ČÁSTIC Lokalita Období odběru Objem vzduchu [m 3 ] PM 2,5 [μg/m 3 ] B[a]P [ng/m 3 ] k-pau [ng/m 3 ] Ostrava-Bartovice 03/ ,7 13,6 81,6 Ostrava-Poruba 03/ ,8 4,28 27,2 Karviná 04/ n.a. 1,88 12,1 Třeboň 11-12/ ,4 1,11 7,92 Praha-Libuš 02/ ,2* 1,57 9,26 * Odebrány PM 10. Filtr z Ostravy- Bartovic z ledna 2010 po cca 3 h expozice

5 EXTRAKCE ORG. LÁTEK Z FILTRŮ Extrakci org. hmoty z filtrů dichlormetanem a chemickou analýzu PAU provedla firma ALS Czech Republic s.r.o. Dichlormetan byl odpařen pod dusíkem Odparky rozpuštěny v DMSO v koncentraci 50 mg/ml a následně přidány do kultivačního média k buňkám

6 BUNĚČNÉ LINIE Buňky HEL lidské embryonální plicní fibroblasty Buňky A549 buňky lidského alveolárního adenokarcinomu

7 IN VITRO INKUBACE Obě buněčné linie inkubovány po 24 h se všemi 5 extrakty org.látek (EOM) v koncentracích: 10, 30 a 60 μg/ml Tyto koncentrace EOM = sub-toxické (až na Libuš 60 ug/ml) Po skončení inkubace buňky sklizeny a následně provedeny analýzy: stanovení genotoxicity (hladiny aduktů DNA) a analýza genové exprese na celogenomových čipech

8 % cytotoxicity CYTOTOXICITA TESTOVANÝCH EOM Cytotoxicita HEL 70,0 Cytotoxicita ~ 40% 60,0 50,0 40,0 10 ug/ml 30 ug/ml 60 ug/ml 30,0 100 ug/ml 20,0 10,0 0,0 Bartovice Poruba Karviná Libuš Třeboň

9 DNA adukty/m3 (reativní jednotky) GENOTOXICITA - DNA ADUKTY 7,00 3,57 HEL 7,00 A549 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 1,30 * * 10 ug/ml 30 ug/ml 60 ug/ml DNA adukty/m3 (relativní jednotky) 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 10 ug/ml 30 ug/ml 60 ug/ml 0,00 Bartovice Poruba Karviná Libuš Třeboň 0,00 Bartovice Poruba Karviná Libuš Třeboň * Cytotoxicita ~ 40% DNA adukty stanoveny metodou 32 P-postlabeling a vizualizovány autoradiograficky.

10 HEL - extrakty I. zima 09 expozice 72h HEL buňky AUTORADIOGRAMY A549 buňky A549 - extrakty I. zima 09 expozice 72h Trebon 30 ug/ul Libuš 30 ug/ul Karvina 30 ug/ul Trebon 30 ug/ul Libuš 30 ug/ul Karvina 30 ug/ul Bartovice 30 ug/ul Poruba 30 ug/ul Bartovice 30 ug/ul Poruba 30 ug/ul Poruba 10 ug/ul Poruba 60 ug/ul Poruba 10 ug/ul Poruba 60 ug/ul Blank DMSO Blank DMSO STD BPDE

11 GENOVÁ EXPRESE Izolace RNA Z buněk vyizolována celková RNA pomocí kolonek Kvalita RNA ověřena: spektrofotometricky míra čistoty RNA dána poměry vlnových délek 260/280 a 260/230 Stanovením RIN (RNA integrity number) na Agilent 2100 Bioanalyzeru. RIN nabývá hodnot 0-10.

12 INTEGRITA RNA Mikrofluidní elektroforéza RIN 10.0 RIN 7.7 Vzorky RNA RINy v rozmezí Naprostá většina v rozmezí S rrna 18S rrna RNA čip

13 IN VITRO TRANSKRIPCE (IVT) 1. Reverzní transkripce Přepis mrna do cdna (Ambion kit) - syntéza 1. vlákna oligo(d)t primery + reverzní transkriptáza 2. IVT - syntéza 2. vlákna DNA polymeráza, RNáza H Přepis cdna do crna + zabudování biotinem značených UTP

14 HYBRIDIZACE NA ČIPY Hybridizace crna vzorků na čipy Human HT 12 v3 Expression Bead Chips 12 vzorků na čip celogenomová expresní analýza: přes dobře anotovaných genů prób (NCBI & UniGene databáze) Fluorescenční značení streptavidin-cy3 Skenování Illumina Bead Array Reader Analýza dat

15 POČTY DEREGULOVANÝCH GENŮ BARTOVICE VS. PORUBA 10 μg/ml HEL buňky 30 μg/ml Bartovice Poruba Bartovice Poruba 60 μg/ml Bartovice Poruba

16 POČTY DEREGULOVANÝCH GENŮ BARTOVICE VS. PORUBA HEL buňky Bartovice Poruba 10 μg/ml 30 μg/ml 10 μg/ml 30 μg/ml 60 μg/ml 60 μg/ml

17 Počet deregulovaných genů Počet deregulovaných genů POČTY DEREGULOVANÝCH GENŮ Před korekcí Po korekci na dostatečnou změnu hladin exprese ( 100%) HEL HEL * * ug/ml ug/ml ug/ml 60 ug/ml ug/ml 60 ug/ml * Cytotoxicita ~ 40%

18 Počet deregulovaných genů Počet deregulovaných genů POČTY DEREGULOVANÝCH GENŮ PO KOREKCI NA ± 100% ZMĚNU EXPRESE HEL A * ug/ml 30 ug/ml ug/ml 30 ug/ml 60 ug/ml ug/ml Bartovice Poruba Karviná Libuš Třeboň 0 Bartovice Poruba Karviná Libuš Třeboň * Cytotoxicita ~ 40%

19 ZÁVĚRY Testy genotoxicity ukázaly dávkovou závislost hladin DNA aduktů na koncentraci EOM u obou linií plicních buněk EOM z Bartovic několikanásobně vyšší genotox.potenciál než EOM z Poruby a ostatních lokalit odpovídá několikanásobně vyššímu obsahu B[a]P a k-pau v ovzduší Bartovic Podobně předběžné výsledky analýzy genové exprese ukazují zvýšený počet deregulovaných genů se zvyšující se koncentrací EOM Další analýzy budou následovat: identifikace deregulovaných biologických drah, ověření hladin vybraných deregulovaných genů pomocí qpcr, analýza oxidačního poškození lipidů a proteinů a především detailní porovnání lokalit hl. Bartovic a Poruby

20 PODĚKOVÁNÍ H. Líbalová E. Tulupova A. Milcová J. Schmuczerová V. Stránecký J. Topinka R.J. Šrám Projekt financován Granty MŠMT (2B08005) a AV ČR (AVOZ )

21 DĚKUJI VÁM ZA POZORNOST!