10 Bioreaktor. I Základní vztahy a definice. Lenka Schreiberová, Milan Jahoda, Petr Kočí (revize )

Transkript

1 0 Boreaktor Lenka Schreberová, Mlan Jahoda, Petr Kočí (revze ) I Základní vztahy a defnce Chemcké reaktory jsou zařízení, v nchž probíhá chemcká přeměna surovn na produkty. Vsádkové reaktory jsou charakterzovány přetržtým provozem s perodckým vstupem a výstupem reakční směs. V průmyslu jsou využívány především př výrobě specálních chemkálí, např. léčv, barvv, pestcdů apod. Reakční rychlost složky r je defnována jako rychlost změny látkového množství složky n v jednotkovém objemu reakční směs V důsledkem chemcké reakce d n r, (0-) V d kde symbol označuje čas. Podělíme-l reakční rychlost složky jejím stechometrckým koefcentem υ, získáme rychlost chemcké reakce r r V d n. (0-2) d Jestlže se v průběhu reakce nemění objem reakční směs (V = konst.), můžeme dosazením za látkové množství n = c n V do rovnce (0-2) vyjádřt rychlost chemcké reakce vzhledem k molární koncentrac složky c n d c n r. (0-3) d Často používanou velčnou charakterzující změnu složení reakční směs je konverze složky, která je defnovaná jako podíl zreagovaného látkového množství složky a množství, které do reakce vstupovalo n 0. (0-4) n n 0 Boreaktorem nazýváme zařízení, ve kterém přeměna výchozích látek na produkty probíhá pomocí mkroorgansmů nebo bochemcky aktvních látek (např. enzymů), které byly těmto organsmy vyprodukovány. Knetka reakcí, v nchž vystupují klascké (bologcky neaktvní) látky, bývá často popsována tzv. mocnnovým tvarem r k A B c c k c n A n B n A,B,, (0-5) tedy jako součn rychlostní konstanty k a koncentrací reaktantů c umocněných koefcenty (řády reakce vůč jednotlvým složkám). Pro pops rychlost enzymatckých reakcí je třeba využít složtějších knetckých modelů. První významný posun v této oblast nabídl v roce 93 až Leonor Mchaels a Maud Mentenová, kteří svou teor vystavěl na několka klíčových předpokladech: () enzym (E) se na substrát (S) váže vratně za vznku enzym-

2 substrátového komplexu (ES), který poté nevratně dsocuje na produkt reakce (P) a enzym (vz schéma 0-6), () celková koncentrace enzymu a enzym-substrátového komplexu se během reakce nemění. E + S ES E + P (0-6) Aplkací výše uvedených prncpů odvodl rovnc popsující vztah mez počáteční rychlostí enzymatcké reakce v 0 na koncentrac substrátu [S]: V M [S ] max v, (0-7) 0 K [S ] kde V max je tzv. maxmální (lmtní) rychlost enzymatcké reakce a K M označuje Mchaelsovu konstantu. Knetka Mchaelse-Mentenové má obdobně jako například Langmurova adsorpční zoterma saturační charakter, jak je vdět na obr. 0-. v 0 V max 2 V max K M Obr. 0-. Závslost počáteční rychlost enzymatcké reakce na koncentrac substrátu podle knetky Mchaelse a Mentenové. [S] Mchaelse a Mentenovou vedly k formulac jejch modelu výsledky expermentů s hydrolýzou sacharózy, která se v přítomnost enzymu nvertázy (přesněj -Dfruktofuranosdázy) štěpí na glukózu a fruktózu. Ekvmolární směs těchto dvou monosachardů, obvykle nazývaná nvertní cukr, je významnou komodtou v cukrovarnctví. Štěpení sacharózy na nvertní cukr pomocí enzymu nvertázy je předmětem také této laboratorní úlohy. Protože aktvta enzymů obecně velm dramatcky závsí na teplotě a ph okolního prostředí, je třeba tyto velčny udržovat v průběhu reakce konstantní. Kapalný enzym nvertáza používaný v této prác například dosahuje nejvyšší aktvty v oblast okolo ph = 5. 2

3 Chceme-l získat nformace o průběhu (bo)chemcké reakce, je zapotřebí měřt v průběhu expermentu koncentrac reaktantů, resp. produktů. Vzhledem k tomu, že sachardy jsou optcky aktvní látky, tj. jejch molekuly stáčí rovnu procházejícího polarzovaného světla, používá se na určení jejch koncentrace v roztoku nejčastěj technka zvaná polarmetre. Polarmetr je přístroj měřící úhel, o nějž se otočla rovna polarzovaného světla př průchodu optcky aktvním látkam nebo jejch roztoky. Úhel stočení měřený př C závsí na délce vzorku (resp. kyvety) a hmotnostní koncentrac optcky aktvní látky c podle vztahu c, (0-8) D, kde symbol označuje tzv. měrnou otáčvost (specfckou rotac) charakterstckou pro D, danou optcky aktvní látku, určenou př C za použtí světelného dubletu o vlnové délce 589 nm ze sodíkové výbojky. Významným a v polarmetr hojně využívaným poznatkem je Botovo pravdlo o adtvtě: roztok dvou optcky aktvních látek A a B o hmotnostních koncentracích c A a c B vykazuje otáčvost danou algebrackým součtem příspěvků obou optcky aktvních složek II Cíle práce c c. (0-9) D, A A D, B B. Naměření optcké otáčvost reakční směs v průběhu enzymatcké reakce. 2. Výpočet koncentrace sacharózy z naměřených hodnot optcké otáčvost roztoku. 3. Sestrojení grafu závslost konverze sacharózy na čase. III Pops zařízení Expermentální zařízení je schématcky nakresleno na obr Skleněný válcový boreaktor s temperačním pláštěm 4 je v horní část opatřen otvory. Levý otvor 3 slouží k zasazení skleněné nálevky a následný vstup jednotlvých složek do reakčního prostoru. V pravém otvoru 2 je zasazen dgtální snímač teploty pro kontrolu teploty reakční směs. Snímaná hodnota teploty je aktuálně zobrazována na dsplej umístěném na zd nalevo od reaktoru. Reakční směs je míchána rotačním lopatkovým míchadlem. Spodní část reaktoru je opatřena otočným ventlem 6 sloužícím k odebrání vzorku a vypuštění obsahu reaktoru. Teplota reakční směs je udržována termostatem, proud temperované vody prochází pláštěm reakční cely. Panel termostatu je blíže zobrazen a popsán na obr Součástí aparatury je rovněž automatcký dgtální polarmetr a polarmetrckou trubcí (kyvetou) o délce = dm, sada kádnek (skleněné a plastové), plastová nálevka, odměrné válce, střčka, dva pětltrové kanstry s destlovanou vodu, papírové ubrousky, dgtální phmetr a požadované chemkále (sacharóza, enzym nvertáza a roztok kyselny octové). 3

4 ovládací panel míchadla 2 teploměr 3 vstupní otvor 4 plášť reaktoru napojený na termostat 5 výtokový otvor 6 ventl pro ovládání výtokového otvoru Obr Vsádkový boreaktor IV Postup práce IV. Příprava práce Na počátku práce je nutné se ujstt, jestl jsou síťové přívody míchačky, termostatu a polarmetru přpojeny do zásuvek a zdal je zavřený otočný ventl 6 ve spodní část reaktoru. Polarmetr zapneme mechanckým spínačem umístěným na zadní straně přístroje poblíž napájecího kabelu a necháme jej mnmálně 5 mnut stablzovat. Zapneme termostat pomocí zeleného spínače s podsvícením a crkulac vody do pláště reaktoru pomocí sousedního černého spínače. Dsplej na panelu termostatu zobrazuje aktuální hodnotu teploty vody v plášt reaktoru. Na termostatu je standardně přednastavena požadovaná teplota 50 C, po zapnutí by tedy mělo automatcky docházet k postupnému ohřevu až na tuto teplotu. V případě potřeby je po konzultac s asstentem možné změnt nastavení termostatu pomocí křížového ovladače u dspleje. Vypočteme hmotnost sacharózy tak, aby po smíchání se zadaným objemem destlované vody vznkl roztok sacharózy o požadovaném hmotnostním zlomku (vz zadání v protokolu). Vypočítané množství sacharózy necháme zkontrolovat asstentem. Sacharózu navážíme do plastové kádnky a za stálého míchání přpravíme požadovaný vodný roztok sacharózy. Roztok vljeme přes nálevku otvorem 3 do reaktoru. Př nulových otáčkách spustíme míchadlo a poté nastavíme otáčky na zadanou hodnotu. V průběhu celé přípravné fáze sledujeme na samostatném dsplej teplotu v reaktoru (pozor, teplota v reaktoru reaguje na změnu teploty pláště se zpožděním). Vlastní experment je možné začít po zmenšení odchylky teploty v reaktoru od požadované hodnoty na,5 C nebo méně. Během čekání na ustálení teploty se budeme věnovat úpravám ph roztoku, nastavení polarmetru a přípravě roztoku enzymu, jak je popsáno v následujících odstavcích. 4

5 Pro optmální aktvtu enzymu je třeba nastavt kyselost roztoku sacharózy v reaktoru na hodnotu okolo ph = 5. Nejprve otvorem 5 odebereme malé množství vzorku reakční směs. Uchopíme ruční ph-metr, sejmeme plastovou krytku na jeho špčce a střčkou tuto špčku opláchneme. Dgtální ph-metr zapneme a špčku ponoříme do kádnky s odebraným vzorkem. Jemným kroužvým pohybem ponořené špčky ph-metru promícháváme roztok vzorku a zároveň na dsplej ph-metru sledujeme hodnotu ph. Destlovaná voda běžně používaná v laboratoř bývá většnou slabě kyselá (okolo ph=6), lze tedy očekávat výsledek okolo této hodnoty. V případě potřeby ověříme funkčnost a kalbrac ph-metru přeměřením přložených pufrovacích roztoků o defnovaném ph=4 a ph=7 (mez každým použtím je nutné opláchnout špčku ph-metru kádnky destlovanou vodou. Naměřenou hodnotu ph reakční směs nahlásíme asstentov, s kterým domluvíme množství přdávané 0,3% kyselny octové (je-l potřeba snížení ph) případně NaOH (je-l potřeba zvýšení ph). Po úpravě ph necháme reakční směs pár mnut promíchat. Znovu odebereme vzorek, změříme jeho hodnotu ph a v případě potřeby opět upravíme přdáním dalšího malého množství kyselny octové nebo NaOH. V deálním případě bychom měl dosáhnout ustálenou hodnotu ph = 5,0 ± 0,. Pokud se nám an po několka přídavcích nepodaří dosáhnout takto přesnou hodnotu, spokojíme se s odchylkou ph do 0,5. Větší odchylka povede k nžší aktvtě enzymu, tedy reakce bude probíhat o něco pomalej, ale jnak bude mít experment shodný průběh. Dosažené ph zapíšeme do protokolu. Pak ph-metr vypneme, jeho špčku opláchneme destlovanou vodou, usušíme a zasuneme do plastové krytky. Před vlastním expermentem je ještě vhodné nakalbrovat pozadí polarmetru na nulu. V kyvetovém prostoru zařízení se nachází prázdná polarmetrcká trubce. Trubc vyjmeme z kyvetového prostoru a několkrát vypláchneme destlovanou vodou pro odstranění případných nečstot. Poté trubc naplníme destlovanou vodou tak, aby se v ní nenacházely bublny a kapalna vyplňovala celou hlavní část s okénky, kudy prochází optcká dráha polarmetru. Bublny lze vypudt nakláněním trubce ze strany na stranu. Polarmetrckou trubc umístíme do kyvetového prostoru polarmetru a zavřeme víko. Na dotykovém dsplej stskneme tlačítko (vlevo dole), čímž se dostaneme k nabídkám nastavení polarmetru. Vybereme volbu Blank a potvrdíme tlačítkem Start na dotykovém dsplej. Po několka sekundách se zobrazí naměřená hodnota pozadí. Pokud se hodnota výrazně lší od nuly, konzultujeme stuac s asstentem. V případě hodnoty blízké nule můžeme potvrdt měření pozadí stskem tlačítka Save. Na závěr přípravných prací požádáme asstenta o enzym. Zadané množství enzymu v mlgramech navážíme na laboratorních analytckých vahách a rozpustíme v destlované vodě v odměrné baňce objemu 50 ml. Pečlvě promícháme, aby byl enzym zcela rozpuštěný. Zatím enzym nepřdáváme do reaktoru. IV.2 Vlastní experment Měření koncentrací sacharózy a nvertního cukru během reakce spočívá ve stanovení optcké otáčvost odebraného vzorku reakční směs. Vzorek odebíráme v pravdelných časových ntervalech, přčemž čas reakce se počítá od okamžku přdání enzymu do reaktoru. 5

6 Na úplném začátku expermentu ještě před přdáním enzymu odebereme po opatrném pootevření ventlu 6 z výtokového otvoru 5 do skleněné kádnky přblžně 60 ml vzorku roztoku sacharózy k analýze. Vzápětí přes plastovou nálevku naljeme do reaktoru všechen roztoku enzymu (celých 50 ml), čímž rozběhneme reakc. Zbytky enzymu na nálevce spláchneme do reaktoru destlovanou vodou ze střčky. Na dsplej snímače teploty odečteme teplotu reakční směs a zapíšeme j v protokolu do kolonky měření číslo (čas τ=0 mn). Odebraným vzorkem roztoku sacharózy dvakrát propláchneme polarmetrckou trubc a poté j naplníme tímto vzorkem po okraj, přčemž nakláněním trubce ze strany na stranu vypudíme bublny. Polarmetrckou trubc se vzorkem umístíme do kyvetového prostoru polarmetru, zavřeme víko a stskneme na dotykovém dsplej konu (v pravém dolním rohu), čímž se spustí měření otáčvost α. Po několka sekundách se na dsplej objeví naměřená hodnota, kterou vydělíme 0, abychom dostal otáčvost v úhlových stupních, a výsledek zaznamenáme v protokolu do kolonky α t. Poté kyvetu vyjmeme, vzorek a zbytek z proplachování polarmetrcké trubce vljeme přes nálevku zpět do reaktoru. Nakonec ještě polarmetrckou trubc propláchneme nejméně dvakrát destlovanou vodou. Prvních 30 mnut stejným způsobem odebíráme a měříme vzorek reakční směs každých 5 mnut, poté následujících 70 mnut odebíráme a měříme vzorek každých 0 mnut, přčemž vždy do protokolu zaznamenáváme okamžtou hodnotu optcké otáčvost α t a teplotu reakční směs t př odběru. Mez jednotlvým odběry nkdy nesmíme opomenout propláchnout kyvetu daným vzorkem a poté oplachovat destlovanou vodou. Rovněž nezapomínáme mez jednotlvým odběry opláchnout destlovanou vodou an vzorkovací skleněnou kádnku. V čase 30 mn provedeme u odebraného vzorku rovněž kontrolu hodnoty ph stejným způsobem, jak bylo popsáno v přípravné fáz. Hodnotu ph zaznamenáme v protokolu do kolonky ph, poznámky. Pokud je hodnota ph výrazně zvýšená nebo snížená vzhledem k počáteční, upravíme j po poradě s asstentem přdáním dalšího množství roztoku kyselny octové nebo NaOH. IV.3 Ukončení měření Po odebrání posledního vzorku vypneme míchačku, termostat a polarmetr, zkontrolujeme, zda je ph-metr opláchnutý, osušený, zakrytovaný a vypnutý. Z boreaktoru se do nádoby vypustí spodním ventlem reakční směs a vylje do odpadu. Boreaktor se propláchne destlovanou vodou. Vntřní prostor polarmetru se otře suchým papírovým ubrouskem. Polarmetrcká trubce se několkrát vypláchne destlovanou vodou, osuší a umístí do kyvetového prostoru polarmetru. V umyvadle se umyje použté laboratorní vybavení, vlhkým hadrem a následně suchým ubrouskem se otřou všechna znečstěná místa. V Bezpečnostní opatření. Věnujeme zvýšenou pozornost př prác s kyselnou a nepoužíváme j na jné účely, než jak je uvedeno v postupu práce k úloze. 6

7 2. S polarmetrem se zachází opatrně, dodržuje se čstota a suché prostředí v jeho okolí kyvetovém prostoru a je nezbytné přesně dodržovat postup uvedený v návodu nebo nstrukce od výrobce umístěné v prvním šuplíku pracovního stolu. 3. V případě nečnnost nebo poškození polarmetru se přvolá asstent, je zásadně vyloučeno zasahovat do polarmetru bez odborného dohledu. 4. Př prác s polarmetrckou trubcí je potřeba být opatrný a njak j nepoškodt nebo neznčt. Jedná se o drahý materál a není k dspozc náhradní kus. VI Zpracování naměřených hodnot Údaj odečtený na dsplej polarmetru je třeba nejprve vydělt 0, abychom dostal úhel stočení ve stupních. Tuto hodnotu zapíšeme do protokolu do sloupce α t (úhel stočení př teplotě měření t). Dále vypočteme odpovídající úhel stočení př C (značený jako α ) dle vztahu t a b, (0-0) přčemž hodnoty konstant teplotní korekce a, b jsou uvedeny v tab.. Tab.. Konstanty pro teplotní korekc t 30 C 40 C 50 C a - -,000 b - - 0,876 Pro první bod měření (čas = 0 mn) vypočítáme počáteční hmotnostní koncentrac přpraveného roztoku sacharózy c S0 (kg dm -3 ) dle vztahu (0-8) a výsledek zapíšeme do tabulky. Po přídavku enzymu určíme koncentrac sacharózy a vznkajícího nvertního cukru na základě užtí pravdla o adtvtě (0-9). Hmotnostní koncentrac sacharózy po přídavku enzymu c S vypočteme ze vztahu: c c M c, (0-) S S 0 I kde M je poměr molárních hmotností sacharózy M S (342 g mol - ) a nverzního cukru M I (360 g mol - ) a c I je hmotnostní koncentrace nvertního cukru, kterou získáme dosazením rovnce (0-) do rovnce popsující pravdlo o adtvtě (0-9): c I M c D, S S 0. (0-2) D, S D, I Invertní cukr je ekvmolární směs glukózy a fruktózy, jejchž molární hmotnost jsou totožné. Pro koncentrac glukózy resp. fruktózy tedy platí, že c c I c. (0-3) G F 2 Koncentrac sacharózy pak dopočteme podle rovnce (0-). Hodnoty jednotlvých konstant užtých ve výše uvedených rovncích jsou shrnuty v tab. 2. 7

8 Tab. 2 Hodnoty konstant. Konstanta Význam Hodnota Jednotka M poměr molárních koncentrací sacharózy a nvertního cukru 0,95 měrná otáčvost sacharózy př C +66,53 úhlové dm 2 kg - D, S měrná otáčvost nvertního cukru př C,59 úhlové dm 2 kg - D, I délka polarmetrcké trubce,00 dm VII Symboly mocnny rychlostní rovnce (0-5) a, b konstanty pro rovnc (0-0) α t naměřený úhel stočení př teplotě t úhlové α úhel stočení př C úhlové měrná otáčvost sacharózy př C úhlové dm 2 kg - D, S měrná otáčvost nvertního cukru př C úhlové dm 2 kg - D, I c n molární koncentrace složky mol dm -3 c hmotnostní koncentrace složky kg dm -3 c I hmotnostní koncentrace nvertního cukru kg dm -3 c F hmotnostní koncentrace fruktózy kg dm -3 c G hmotnostní koncentrace glukózy kg dm -3 c S hmotnostní koncentrace sacharózy kg dm -3 E enzym - ES enzym-substrátový komplex - k rychlostní konstanta chemcké reakce závsí na řádu reakce K M Mchaelsova konstanta mol dm -3 délka polarmetrcké trubce dm n látkové množství složky mol P produkt - S substrát - r rychlost chemcké reakce mol dm -3 mn - r reakční rychlost složky mol dm -3 mn - υ stechometrcký koefcent složky τ čas mn konverze složky v 0 počáteční rychlost enzymatcké reakce mol dm -3 mn - V objem reakční směs dm 3 V max maxmální (lmtní) rychlost enzymatcké reakce mol dm -3 mn - 8

9 VIII Kontrolní otázky. Co je cílem práce, jaké velčny budete nastavovat a jaké měřt? 2. Jaký typ reaktoru je v laboratoř? 3. Jak přpravíte reakční směs? 4. Jak upravíte ph reakční směs? 5. K čemu slouží polarmetr? 6. Může se nastavená teplota během expermentu měnt? 7. V jakých časových ntervalech budete odebírat vzorky a v jakém množství? 8. Na co musíte dát pozor př ukládání ph-metru po skončení měření? 9. Jakou závslost získáte po zpracování naměřených velčn? 9