Stanovení spolehlivosti metod při detekci fluidních, intermediálních a nefluidních kmenů patogena Clavibacter michiganensis subsp.

Transkript

1 Stanovení spolehlivosti metod při detekci fluidních, intermediálních a nefluidních kmenů patogena Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus tuzemské a zahraniční provenience. EKOTECH Metody detekce rostlinných patogenů Doc. Ing. Ivan Mráz, CSc. BC AV ČR, v.v.i. Ústav molekulární biologie rostlin

2 Obsah přednášky 1) Škodlivost bakterióz. 2) Charakteristika bakterie Cms - hostitelský okruh - škodlivost - geografické rozšíření - symptomy - epidemiologie - ochranná opatření 3) Testování spolehlivosti vybraných metod při detekci F, I a NF variant Cms. 4) Vyhodnocení použitých metod.

3 Škodlivost bakterióz Celkem cca 400 původců bakterióz, fytoplazmóz a spiroplazmóz, 1/5 1/4 (80 100) výskyt na území ČR. Ze 162 hospodářsky důležitých infekčních chorob zemědělských plodin ve střední Evropě - 8% bakteriálního původu. Ztráty - každoročně v Evropě 13% sklizně. Ekonomický význam chorob

4 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus [(Spieckermann & Kotthoff 1914) Davis, Gillaspie, Vidaver & Harris 1984]

5 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus Prokaryota Mikroskopický jednobuněčný organismus Koryneformní, kyjovité buňky, G+ Nesporulující nepohyblivé bakterie (atrich) Nepigmentující,obligátně aerobní Velikost 0,3-1,1 x 0,5-4,0 um Typický okluzogen Karanténní organismus S a R-formy

6 Hostitelské rostliny, škodlivost patogena Brambor jediný přirozený hostitel. Výnosové a skladovací ztráty i 50% (nevzcházivost, menší počet a velikost hlíz, hniloba hlíz v půdě a při skladování. oregonstate.edu/potatoes/css322 WebNotes.html

7 Výskyt patogena v ČR Rok 1996 zjištěn první výskyt patogena, zavlečen s dováženou sadbou ze západní Evropy.

8 Geografické rozšíření patogena Domnělý výskyt: střední a jižní Amerika: Haiti, Mexiko, Kostarika, Panama, Venezuela, Peru Evropa: Belgie, Švýcarsko Asie: Libanon, Afghánistán, Kambodža, Vietnam

9 Symptomy choroby Obtížná diagnóza v porostu. První symptomy - konec července Vadnutí stonků, svinování listů, hnědé nekrózy na okrajích listů.

10 Symptomy choroby Hlízy: sklovitě žluté, později až hnědé zbarvení a změknutí cévních svazků i přilehlého pletiva. Rozklad pletiva, světle zbarvená kašovitá hmota. Slabě napadené hlízy - žádné symptomy.

11 Epidemiologie Zdroje nákazy - infikované hlízy (krájení, napichovací sázecí mechanismus, kontaminované sklízecí stroje, obaly, dopravní prostředky), rozšíření patogena z matečných hlíz cévami do cévního systému a přes stolony do dceřinných hlíz - půda nepatrný význam (nepřezimují), průnik do cévního systému často přes poranění farmerfredrant.blogspot.com /2009/08/whats-pot.

12 Epidemiologie Šíření patogena během vegetace z nemocných na zdravé rostliny velmi řídký jev Rozvoj choroby - půdní teplota nad 18 C - nadzemní teplota cca 24 C Chladné počasí infikované rostliny často asymptomatické

13 Možnosti ochrany proti Cms Legislativní opatření Zákon č. 326/2004 Sb. o rostlinolékařské péči a o změně některých souvisejících zákonů, pozměňující zákony č.131/2006 Sb. a č. 249/2008 Sb postrikovace.html Vyhláška č. 215/2008 Sb. o opatřeních proti zavlékání a rozšiřování škodlivých organismů rostlin a rostlinných produktů (18 bakterióz vč. Cms).

14 Možnosti ochrany proti Cms Legislativní opatření Vyhláška č. 331/2004 Sb., o opatření k zabezpečení ochrany proti zavlékání a šíření původce bakteriální - kroužkovitosti bramboru a původce bakteriální hnědé hniloby. Produkce a výsadba zdravé sadby Netoleruje se výskyt nemocných trsů, zamořené pozemky 2 roky nepěstovat brambory. Šlechtění na rezistenci Získáno několik tolerantních odrůd, příliš nepěstovány.

15 Testování spolehlivosti některých metod při detekci Cms (F, I, NF variant) Testováno celkem 57 izolátů Cms (F, I, NF varianty) ze 13 zemí (genetické, imunochemické, biochemické, patogenní vlastnosti)

16 Testování spolehlivosti některých metod při detekci Cms (F, I, NF variant) Morfologie bakteriálních kolonií Cms - fluidní (hladké, mukoidní) častější výskyt - intermediální (méně fluidní) - nefluidní (drsné, nemukoidní) produkce nedostatečného množství EPS nebo rozdílné EPS oproti fluidním

17 Testování spolehlivosti některých metod při detekci Cms (F, I, NF variant) Nefluidní kmeny nedetekovatelné při použití protilátek proti EPS fluidních kmenů v ELISA testu či dvojité difúzi v agaru Použité metody: ELISA, IFAS, BIOLOG, FAA, PCR, BOX - PCR, dot blot hybridizace, testy patogenity na lilku

18 Použité metody DAS - ELISA test Použity komerční monoklonální protilátky (Agdia, USA). Fluidní kmeny detekovány spolehlivěji než kmeny intermediální a nefluidní. IFAS (indirect fluorescent antibody stain) cs.wikipedia.org/wiki/elisa

19 Použité metody IFAS Spolehlivě detekovány všechny kmeny Cms, ačkoliv v populacích některých drsných kmenů zaznamenány i atypické buňky.

20 Použité metody PCR (Pastrikovy primery) Spolehlivě detekovány všechny kmeny bez ohledu na stupeň fluidity, 1% gel. VAP 502 bp. PCR 16 fluidních a nefluidních Cms kmenů

21 Použité metody Dot blot hybridizace Neradioaktivní sonda značená digoxigeninem, sonda = amplifikát (502 bp) kmene Cms PD59 (F, Argentina), spolehlivě detekovány všechny kmeny bez ohledu na stupeň fluidity. Dot blot 32 F, I a NF kmenů Cms

22 Použité metody Rep-PCR (primer BOX) Nestanoveny žádné skupiny ve vztahu k morfologii kolonií, provenienci izolátů apod. Potvrzena vysoká homogenita Cms. BOX-PCR 26 F, I a NF kmenů Cms

23 Použité metody BIOLOG NF kmeny vykazují klesající metabolickou aktivitu ve srovnání s F identifikovány pouze na úroveň druhu nebo nedostatečně. Fluidní kmeny detekovány spolehlivěji než kmeny intermediální a nefluidní.

24 Použité metody Testy patogenity na lilku Vykazují rozdíly mezi F, I a NF kmeny Cms. NF a některé I kmeny vykazují na hostitelských rostlinách atypické symptomy, některé kmeny jsou asymptomatické. Solanum_melongena_ja001.jpg

25 Použité metody Analýza mastných kyselin (FAA) Určeno několik skupin, nemají spojitost s morfologií kolonií, původem kmenů apod. Potvrzena vysoká homogenita Cms. plantpath.ifas.ufl.edu/fame/default.htm

26 Použité metody Sekvenování Osekvenována (Pastrikovy primery) část genomu čtyř Cms kmenů (F, I, NF) z různých evropských zemí a USA. Nenalezeny rozdíly mezi jednotlivými sekvencemi. (2).htm (2).htm

27 Závěr vyhodnocení Nejvhodnější metody pro detekci Cms jsou PCR (popř. dot blotči rep- PCR při použití referenčního kmenu), imunofluorescence a analýza mastných kyselin.

28 Děkuji za pozornost.