Detekce a identifikace bakterie Erwinia amylovora některými sérologickými a molekulárně biologickými metodami

Transkript

1 Detekce a identifikace bakterie Erwinia amylovora některými sérologickými a molekulárně biologickými metodami EKOTECH Metody detekce rostlinných patogenů Doc. Ing. Ivan Mráz, CSc. Biologické centrum AV ČR, v.v.i. Ústav molekulární biologie rostlin

2 Osnova přednášky Škodlivost bakterióz Charakteristika bakterie Erwinia amylovora - hostitelský okruh a přežívání - symptomy choroby, ochrana - geografické rozšíření Sérologické (imunochemické) metody Molekulárně biologické metody

3 Škodlivost bakterióz Svět: 400 původců bakterióz, fytoplazmóz, spiroplazmóz ČR: druhů Střední Evropa: 162 hospodářsky důležitých infekčních chorob z nich 8% bakteriálního původu Ekonomický význam chorob rostlin houby 57% Evropa ztráty: viry 13% infekční choroby -13% potenciální sklizně viry 13% bakterie 8% háďátka 17%

4 Erwinia amylovora [(Burrill Burrill) Winslow, Buchanan, Krumwiede, Rogers et Smith 1920]

5 Erwinia amylovora Říše Procaryotae, odd.gracillicutes, čeleď Enterobacteriaceae rovné krátké tyčinky 0,5-1,0 x 1-3 mm G- (nemají kys. teichoovou, navíc vnější membrána) nesporulující peritrich

6 Erwinia amylovora kolonie krémově bíle fakultativně anaerobní S a R formy karanténní v ČR i EU velmi destruktivní Erwinia amylovora kacc.rda.go.kr/eng/menu2/2 _1_result_det.asp?s.

7 Hostitelé 146 druhů z 20 rodůčeledi růžovitých, podčeledi jabloňovitých hrušeň (Pyrus), jabloň (Malus), kdouloň (Cydonia), hloh (Crataegus), skalník (Cotoneaster), jeřáb (Sorbus), hlohovec (Pyracantha), kdoulovec (Chaenomeles)

8 Přežívání patogena Infekční a životní cyklus Infekční cyklus sled pochodů od přežívání parazitického patogena přes jeho šíření po infekci rostlin, vznik příznaků choroby a tvorbu propagulí. Rozlišujeme primární a sekundární infekční cyklus. Životní cyklus jeho součástí je infekční cyklus. Rozlišujeme 4 fáze životního cyklu: 1. Patogenní (velmi vysoká intenzita metabolismu) 2. Saprofytická (vysoká intenzita metabolismu) 3. Rezidentská (snížená intenzita metabolismu) 4. Přežívání (nepatrná intenzita metabolismu)

9 Přežívání patogena

10 Přežívání patogena V zimě korová pletiva na okrajích nekrotických lézí. Na jaře vystupuje na povrch rostlin ve formě slizu.

11 Symptomy spály růž ůžovitých Květy, plody vodnatění, vadnutí, sesychání, hnědnutí, černání.

12 Symptomy spály růž ůžovitých Letorosty - vodnatění, hnědočerné, usychání, svrašťování, vadnutí a hákovité ohýbání vrcholů.

13 Symptomy spály růž ůžovitých Listy - hnědnutí ažčernání, svinování. Napadené květy a listy zůstávají na letorostech.

14 Korová pletiva výhonů - vodnatění, nekrotizace, změna barvy na červenohnědou. Tvorba bakteriálního slizu. Symptomy spály růž ůžovitých graphics/fblight.jpghttp://t1.gstatic.com/images

15 Možnosti ochrany Legislativní opatření Zákon č.326/2004 Sb. o rostlinolékařské péči a o změně souvisejících zákonů, pozměňující zákony č.131/2006 Sb. a č. 249/2008 Sb. Vyhláška č. 215/2008 Sb. o opatřeních proti zavlékání a rozšiřování škodlivých organismů rostlin a rostlinných produktů.

16 Možnosti ochrany Chemická ochrana: měďnaté přípravky (fytotoxicita), antibiotika (vznik rezistence) Biologická ochrana: antagonistické kmeny E. herbicola, P. fluorescens Šlechtění na rezistenci: hrušně, jabloně, skalníky, hlohy

17 Geografické rozší šířen ení patogena Endemit v Severní Americe - plané jabloně, hlohy a jeřáby Mexiko, 1959 Chile, 1967 Guatemala, 1919 Nový Zéland, Egypt, 1985 Izrael, Kypr, později Turecko, Arménie, Irán. Evropa: 1957 jv. Anglie, 1966 kontinentální Evropa - Holandsko. ČR - první výskyt choroby v r na 4 lokalitách na území Prahy 4. Postupné šíření po celém území státu.

18 Sérologick rologické metody Sklíčkov ková aglutinace (SA) Příprava specifických polyklonálních antisér (Ag živý, usmrcený teplem, fenolem, formalínem, typy imunizace, adjuvans) Testování titru a specifičnosti antiséra nejvyšší titr živý Ag, subkutánní injikace nejvyšší specifičnost Ag ošetřen formalínem, několik malých dávek s adjuvans

19 Sérologick rologické metody Sklíčkov ková aglutinace (SA) Stanovení optimální koncentrace Ag v SA optimum: Ea CFU/ml Pag CFU/ml Nezjištěny rozdíly u As připravených proti Ag ošetřeným různým způsobem.

20 Zvýraznění SA pomocí konjugátu Staphylococcus aureus Jako antigeny použity: bakteriální suspenze Ea (10 9 CFU/ml) extrakt z korového a listového pletiva bakteriální exsudát Optimální poměr ředění pro vizuální hodnocení SA s As Ea je 1:5 1:10. Optimální poměr (Sa:As Ea) pro mikroskopické hodnocení SA je 1:20 1:40.

21 Zvýraznění SA pomocí konjugátu Staphylococcus aureus Citlivost testu s konjugátem bakterií S. aureus je 8-16x vyšší než při použití rostlinné šťávy. Konjugát Sa s antiséry Ea = přímá detekce patogena v homogenizovaném pletivu a bakteriál- x.php?module=book&func ním exsudátu. Čas potřebný pro testování - zkrácení na 1 hodinu.

22 Vliv živn ivné půdy a stáří bakteriáln lní kultury na SA Testováno 10 kmenů Ea a 10 kmenů Pag Kultivace na 3 druzích živných půd: (MPAg, King B, YDC) Erwinia amylovora SA bakteriální suspenze 10 9 CFU/ml, vyhodnocována po dobu 11 dní Ea: nejlépe pozorovatelná aglutinace na médiu YDC po 8 dnech 7 z 10 izolátů reagovalo pozitivně kacc.rda.go.kr/eng/menu2/2 _1_result_det.asp?s.

23 Vliv živn ivné půdy a stáří bakteriáln lní kultury na SA Pag: reaktivita Ag klesá rychleji, nejvyšší počet pozitivních reakcí - YDC a KING B, po 6 dnech 8 z 10 izolátů reagovalo pozitivně Pantoea agglomerans kacc.rda.go.kr/search/image view.asp?seq=

24 Porovnání sérologických a biochemických vlastností tuzemských a zahraničních izolátů Ea Testováno 30 zahraničních (SRN, VB, Švýcarsko, Řecko) a 101 tuzemských izolátů E. amylovora ze 7 hostitelů (hloh, skalník, hrušeň, jabloň, kdoulovec,hlohyně, jeřáb). SA: Všechny Ea izoláty jsou sérologicky identické, druh Ea je sérologicky homogenní.

25 Porovnání sérologických a biochemických vlastností tuzemských a zahraničních izolátů Ea ENTEROTEST I, II: Určeny pro identifikaci střevních bakterií z čeledi Enterobacteriaceae a Vibrionaceae. Změna teploty na 27 C. Metoda numerické analýzy (Jackardův koeficient podobnosti, SZÚ Praha). Nejsou průkazné rozdíly v biochemických vlastnostech. Testy lze použít i pro identifikaci E. amylovora.

26 Detekce E. amylovora metodami ELISA a IFAS PTA-ELISA - (Ag vázán na destičku), polyklonální protilátky Neogen Europe Ltd. Citlivost: CFU/ml, cca 20% křížových reakcí je způsobeno přidruženými saprofytickými bakteriemi cs.wikipedia.org/wiki/elisa

27 Detekce E. amylovora metodami ELISA a IFAS IFAS - polyklonální protilátky Neogen Europe Ltd. Citlivost: CFU/ml, cca 14% křížových reakcí způsobeno přidruženými saprofytickými bakteriemi (např. bílé varianty Pag a Pd) katalog_cz_k10.pdf V rostlinných vzorcích je Ea detekována spolehlivěji metodou IFAS než metodou PTA- ELISA

28 Detekce E. E. amylovora molekulárn rními metodami PCR: tři dvojice primerů - P29A, P29B; vlastní - Eaf72, Ear560 (oba páry plazmid pea29); AMSbL, AMSbR (ams oblast, nutná pro biosyntézu kyselého exopolysacharidu amylovoranu). Citlivost PCR: 10 4 CFU/ml PCR s primery Eaf72, Ear560

29 Detekce E. E. amylovora molekulárn rními metodami Při optimalizaci PCR nedocházelo ke křížovým reakcím. PCR vykazovala mnohem vyšší specifičnost než použité sérologické metody.

30 Detekce E. amylovora molekulárn rními metodami Dot blot hybridizace: sonda amplifikát DNA značený digoxigeninem. Neprůkazné rozdíly. Dot blot 14 kmenů Ea Rep PCR s primery ERIC (Ea) Rep-PCR: primery BOX, ERIC, REP, použit referenční kmen, třídění většího počtu kmenů do homologních skupin.

31 Detekce E. amylovora molekulárn rními metodami PFGE - separace molekul DNA větších než cca 50 kb v měnícím se elektrickém poli. Kvalitnější rozlišení jednotlivých kmenů. PFGE 14 kmenů Ea

32 Děkuji za pozornost