VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ

Transkript

1 VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE A TECHNOLOGIE OCHRANY ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF CHEMISTRY AND TECHNOLOGY OF ENVIRONMENTAL PROTECTION EKOTOXIKOLOGICKÉ HODNOCENÍ POLYMERŮ A BIOLOGICKY AKTIVNÍCH LÁTEK V AKVATICKÉM PROSTŘEDÍ AUTOREFERÁT DIZERTAČNÍ PRÁCE SUBSTANTIAL RESULTS OF DOCTORAL THESIS AUTOR PRÁCE AUTHOR VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR Ing. OTAKAR KAŠPAR prof. RNDr. MILADA VÁVROVÁ, CSc. BRNO 2015

2 ABSTRAKT Předložená dizertační práce byla zaměřena na stanovení ekotoxicity, a to u jedné skupiny léčiv a polymerů. Ze skupiny léčiv byla vybrána analgetika, která patří mezi nejčastěji užívaná. Důvodem je také to, že velkou většinu z nich lze získat bez lékařského předpisu. Pro stanovení ekotoxicity byly zvoleny dva postupy, v prvním z nich bylo zvoleno stanovení ekotoxicity pouze jednoho analgetika, ve druhém případě byla posuzována směs dvou analgetik. Důvodem bylo to, že pacientům jsou často aplikována dvě léčiva z této skupiny. Ke stanovení byly použity standardní i alternativní testy toxicity (Daphnia magna, Sinapsis alba, Desmodesmus subspatiens, Vibrio fischeri, Thamnotoxkit a Daphnotoxkit). Pro toto posouzení byla jako analyty vybrána běžně používaná léčiva, tj. ibuprofen, kyselina acetylsalicylová, diklofenak a paracetamol, která patří mezi nejhojněji používaná léčiva v ČR a Evropě. Ze skupiny polymerů byly posuzovány dva polymery, a to běžně používaný polymer polyethyltereftalát (PET) a fenolformaldehydová pryskyřice, která je ve východní Evropě známá jako bakelit. Pro stanovení ekotoxicity polymerů byla aplikována nepřímá metoda, která je založená na stanovení antagonických nebo synergických efektů směsi monomerů, ze kterých se polymer vyrábí a na které se v přírodě může následně pomalu rozkládat. Také v tomto případě byly ke stanovení použity standardní i alternativní testy toxicity, výše specifikované. KLÍČOVÁ SLOVA: ekotoxikologie, standardní a alternativní testy toxicity, polyethyltereftalát, bakelit, ibuprofen, ASA, diklofenak, paracetamol, Daphnia magna, Sinapsis alba, Desmodesmus subspatiens, Vibrio fischeri, Thamnotoxkit a Daphnotoxkit. 2

3 ABSTRACT To determine the ecotoxicity of analgetics, first the individual ecotoxicity values of individual analgetics are determined and then a mixture of two analgetics is tested. To determine the toxicity, both standard and alternative toxicity tests are used (Daphnia magna, Sinapsis alba, Desmodesmus subspatiens, Vibrio fischeri, Thamnotoxkit F TM and Daphnotoxkit F TM magna). The analgetics being whish tested are the commonly used medicines ibuprofen, ASA, diclofenac and paracetamol, which are the most frequently used medicines in the Czech Republic and whole Europe. To determine the ecotoxicity of the polymers polyethyltereftalate (PET) and phenolphormaldehyde resine. I am using an indirect method of examination, in which I determine the antagonistic or synergistic effects of the mixture of monomers from which the polymer is prepared and into which it slowly decomposes in nature. For the determination both standard and alternative toxicity tests are used. The polymers the toxicity of which is being determined are the habitually used polymer PET and the formaldehyde resine known as bakelite in Eastern Europe. KEYWORDS ecotoxicology, standard and alternative toxicity tests, analgetics, polyethyltereftalate, bakelite, ibuprofen, ASA, diklofenak, paracetamol, Daphnia magna, Sinapsis alba, Desmodesmus subspatiens, Vibrio fischeri, Thamnotoxkit a Daphnotoxkit. 3

4 OBSAH Úvod Teoretická část Ekotoxikologie Toxicita Ekotoxicita Přehled standardních testů akutní toxicity Test toxicity na korýši Daphnia magna Test toxicity na chlorokokální řase Desmodesmus subspatiens Test toxicity na semenech hořčice bílé Sinapis alba Bakteriální bioluminiscenční test toxicity na Vibrio fischeri Alternativní biotesty Thamnotoxkit F Daphnotoxkit F magna a pulex Vlastnosti, struktura a rozdělení syntetických polymerů Monomery Polykondenzace Příklady průmyslových polykondenzací Příklady prakticky významných polymerů připravovaných polykondenzačními reakcemi Polyestery Fenoplasty Chemie a technologie léčiv Analgetika Nenarkotická analgetika Deriváty anilinu Deriváty kyseliny salicylové Arylalkanové kyseliny arylpropanové kyseliny Analgetika v životním prostředí Experimentální část Místo provádění zkoušek Výběr metod pro provedení zkoušek Metodika provedení zkoušek Test akutní toxicity na vodním členovci Test inhibice růstu na řase Test inhibice růstu kořene rostlin Bakteriální test inhibice bioluminiscence Vibrio fischeri Alternativní test Thamnotoxkit Alternativní test Daphnotoxkit Příprava a zpracování vzorků Vzorky biologicky aktivních látek (analgetika)

5 2.4.2 Vzorky monomerů pro výrobu polyethylentereftalátu a bakelitu Diskuze Výsledky srovnání ekotoxicity vybraných analgetik a jejich kombinací Ekotoxicita polyethylentereftalátu a bakelitu Porovnání standardního a alternativního testu Dafnia magna Závěr Literatura Profil autora Osobní údaje Vzdělání Kurzy, projekty a publikace

6 ÚVOD Testy ekotoxicity jsou využívány především při hodnocení nepříznivých účinků škodlivých látek a jejich směsí na životní prostředí, dále pro hodnocení toxicity znečištěných povrchových a podzemních vod, zemin a rovněž pro posuzování nebezpečných vlastností odpadů. V poslední době tyto testy nacházejí také uplatnění při kontrole kontaminovaných území a rizik spojených s přítomností znečišťujících látek. Při hodnocení rizik v již určených kontaminovaných územích je nedílnou součástí stanovení koncentrace znečišťujících látek v zasažené lokalitě. Soubory získaných dat z provedených chemických analýz kontaminovaných matric jsou následně porovnávány s maximálními reziduálními limity, pokud již byly pro sledovaný kontaminant stanoveny. Na základě komplexního zhodnocení celého území je následně rozhodováno o provedení nápravných opatření a cílových limitech. Cílové limity jsou určovány především zbytkovými koncentracemi stanovených polutantů v zemině, případně v podzemní vodě nebo v půdním vzduchu. Hodnocení rizika kontaminovaného území ve vztahu k ekologickým receptorům (půdním nebo vodním mikroorganismům) je velmi důležité, protože se převážně hodnotí směs látek, kterou nelze přesně a jednoznačně popsat chemickou analýzou. Bylo prokázáno, že biologická využitelnost chemických látek receptory, jakými jsou půdní nebo vodní mikroorganismy, může být ovlivňována vazbou látek na pevné částice zeminy a je závislá na vlastnostech půdy, případně na vlastnostech akvatického prostředí. Kromě toho musíme uvažovat také o tom, že rychlost a rozsah, v jakém je chemická látka uvolňována z půdy do vodné fáze nebo do ovzduší, se může měnit s časem. Celková koncentrace kontaminantu v půdě proto nemůže poskytnout přesnou informaci o ekologickém riziku. Pokud však jsou použity ekotoxikologické testy v kombinaci s chemickou analýzou, je možné lépe definovat potřebné sanační limity. V současné době existuje velké množství testů toxicity využívajících nejrůznější indikátorové organismy. Z hlediska použití mají pro posouzení ekotoxicity kontaminovaných zemin nebo vod výhodu zejména ty testy, které umožňují přímé stanovení toxických účinků na půdní nebo vodní prostředí. Z dosud publikovaných výsledků získaných pomocí jednotlivých testů ekotoxicity je zřejmé, že máme k dispozici dostatek testů s vysokou vypovídající schopností, vhodných pro hodnocení nebezpečných vlastností toxikantů působících na složky životního prostředí. Z těchto publikovaných dat rovněž vyplývá, že pro dokonalé hodnocení nebezpečných vlastností je zapotřebí používat větší soubor vhodných testů, protože prostřednictvím jednoho testu nelze postihnout veškeré rizikové faktory působící na daný ekosystém. 6

7 1. TEORETICKÁ ČÁST 1.1 Ekotoxikologie Vědní disciplína ekotoxikologie je poměrně mladým vědním oborem, který stojí na hranici mezi obory environmentální chemie, toxikologie, ekologie a biologie. Je důležitou mezioborovou vědní disciplínou zabývající se posuzováním stavu životního prostředí a vlivu lidské činnosti na životní prostředí. Zatím nejpodrobněji rozpracovaná část se týká expozice a následné intoxikace živých organismů ve vodním (akvatickém) prostředí, která byla dříve označovaná termínem hydrotoxikologie. Zabývá se především studiem a hodnocením vlivu škodlivých látek na volně žijící organismy v jejich prostředí, případně působením škodlivých látek ze životního prostředí na člověka, ať už přímo ze složek prostředí (voda, půda, vzduch), nebo i prostřednictvím přirozených nebo člověkem řízených procesů. Jako o samostatné vědní disciplíně se o ekotoxikologii hovoří teprve od konce 60. let 20. století 1, Toxicita Toxicita je definována jako účinek cizorodých látek na vodní společenstva organismů (rostlin a živočichů). Bez lidského zásahu se však v přirozených biotopech, a to působením meziproduktů rozkladu těl organismů, např. amoniaku, methanu, oxidu uhličitého a sulfanu, projevuje přirozená toxicita 3, Ekotoxicita Ekotoxicita je jednou ze základních charakteristik chemických látek, přípravků a odpadů. Povinnost hodnotit ji je v České republice i v Evropské unii dána legislativou 6,24. Toxicita látek vůči životnímu prostředí se nedá hodnotit jednoduchou kvantifikovatelnou veličinou. Nelze proto stanovit hodnoty ekotoxicity dvou látek a vzájemně je porovnat. Testované látky jsou na základě provedených testů buď negativní nebo pozitivní z hlediska vlastnosti ekotoxicita. Jak již bylo prezentováno, ekotoxicita se hodnotí, a to na základě souboru biotestů s organismy různých trofických úrovní 5, Přehled standardních testů akutní toxicity V první části přehledu jsou uvedeny v praxi nejpoužívanější standardní testy akutní toxicity, test toxicity na perloočkách, semenech, chlorokokální řase a bakteriích. V druhé části je uveden seznam dalších ve velké míře užívaných testů používaných v praxi Test toxicity na korýši Daphnia magna Metodika používaná při testech na korýších je podle ČSN EN ISO 6341, kterou se zjišťuje inhibice pohyblivosti perlooček. Cílem testu je zjištění vlivu vodou vyluhovatelných látek na mortalitu a imobilizaci drobného korýše Daphnia magna Test toxicity na chlorokokální řase Desmodesmus subspatiens Stanovení inhibice růstu sladkovodních řas Desmodesmus quadricauda, Desmodesmus subspatiens,l S. subspitatus, Selenastrup capricornutum je standardizováno v souladu s metodikou ČSN EN ISO Princip testu spočívá ve stanovení toxického účinku vodou vyluhovatelné látky na inhibici růstu a na rozmnožování chlorokokální řasy v jednotlivých koncentracích sledované látky v porovnání s kontrolou v čistém živném roztoku 3. 7

8 Test toxicity na semenech hořčice bílé Sinapis alba. Test byl vyvinut k testování účinku odpadních vod na závlahy. Při této zkoušce se využívá citlivosti klíčících semen hořčice bíle Sinapis alba v počátečních stadiích vývoje rostliny na toxické látky Bakteriální bioluminiscenční test toxicity na Vibrio fischeri Metoda je založena na sledování změny luminiscence mořských světélkujících bakterií Vibrio fischeri (Photobacterium phosphoreum), které žijí v symbióze s některými mořskými živočichy (pro některé však mohou být patogenní); bakterie jsou vystavené působení toxické látky a zjišťuje se hodnota relativní inhibice bioluminiscence. Bioluminiscence je produkována větví elektronového řetězce, do kterého jsou zahrnuty oxido-redukční koenzymy a enzym luciferáza. Za přítomnosti kyslíku a aldehydu se tvoří aktivovaný komplex, který po degradaci uvolňuje fotony a intenzita luminiscence odpovídá toxickému vlivu testované látky Alternativní biotesty Tyto testy nejsou na rozdíl od standardních biotestů dosud validovány ani schváleny jako rozhodčí oficiálními institucemi Thamnotoxkit F Testovacím organismem jsou larvy sladkovodního korýše Thamnocephalus platyurus, které se líhnou z cyst. Inkubace probíhá v časovém intervalu hodin při teplotě 25 C za kontinuálního osvětlení 4000 lx. Vylíhlí jedinci se umístí na testovací destičku do různých koncentrací testované látky. Destička se vloží do inkubátoru nastaveného na teplotu 25 C a po uplynutí 24 hodin se stanoví hodnota LC50. Celosvětově se tento test používá k posuzování vlivu testovaných matric na životní prostředí. Vhodný je také pro monitorování tuhých odpadů a kalů, hloubkových vrtů, říčních sedimentů, odpadních vod a půd 7,8-10. Tento 24 hodinový alternativní test byl porovnáván s 48 hodinovým standardním testem akutní toxicity s Daphnia magna. Porovnáním párů dat pro 43 čistých chemikálií, 16 výluhů z farmaceutických závodů, 12 domácích a 12 průmyslových odtoků odpadní vody, 63 tuhých odpadů a hloubkových vrtů, kalů a sedimentů, byly zjištěny velmi významné korelační vztahy mezi citlivostmi obou korýšů k testovaným látkám. Ukázalo se tak, že test Thamnotoxkit F může být používán jako alternativa ke konvenčnímu testu s perloočkami Daphnotoxkit F magna a pulex Daphnotoxkit používá spící vajíčka korýšů Daphnia magna, Daphnia pulex nebo Ceriodaphnia dubia, které jsou celosvětově používány k testům toxicity. Tato vajíčka jsou chráněna chitinovou skořápkou zvanou ephippium a mohou být skladována po dlouhou dobu bez ztráty životaschopnosti. Když jsou ephippia umístěna do specifických životních podmínek, vyvinou se z nich během tří dní larvy (neonaty), které mohou být přímo použity pro testování 2. Oba druhy dafnií jsou doporučovány jako standardní organismy pro testy toxicity. Daphnia magna je v laboratoři používaná běžně, přestože se od ostatních zooplanktonních druhů liší nejen svou velikostí, ale i životním cyklem a schopností odolávat predaci ryb. Tato fakta vyvolávají dohady mezi odborníky, do jaké míry je Daphnia magna ekologicky reprezentativním druhem organismu pro provádění testů toxicity 11. 8

9 1.2 Vlastnosti, struktura a rozdělení syntetických polymerů V současné době jsou polymery velmi využívanými a důležitými materiály. Jsou to chemické látky obsahující ve svých molekulách především atomy uhlíku, vodíku, kyslíku, dusíku, ale také halogenů, síry a jiných prvků. Synonymem k pojmu polymer je v literatuře často používaný pojem makromolekulární látka. Základním stavebním kamenem polymerů jsou makromolekuly, které vznikají spojováním molekul nízkomolekulárních látek (monomerní jednotky) chemickými vazbami. Podle typu makromolekul je možné polymery dělit na lineární, větvené a síťované. V určitém stádiu zpracování se polymery nachází v kapalném stavu, který mu dovoluje, a to většinou za zvýšené teploty a tlaku, vymodelovat tvar pro konečný stav; vzniklý polymer je ve většině případů již ve stavu tuhém Mezi nejdůležitější vlastnosti, které v praxi zajistily syntetickým polymerům pozici cenných materiálů, patří především mechanické, elektrické a optické vlastnosti, v některých případech především také odolnost vůči chemicky agresivnímu prostředí nebo povětrnostnímu stárnutí a další pozitivní vlastnosti. Všechny tyto vlastnosti jsou podmíněny jejich chemickou a fyzikální strukturou, chemickým složením a fázovým stavem Monomery Monomer je chemická sloučenina, která je tvořená molekulami, z nichž každá může poskytnout jednu nebo více konstitučních jednotek, tj. atomů nebo skupin atomů, které jsou přítomné v molekulách polymeru nebo oligomeru 12. Schopné vytvářet polymery jsou sloučeniny C, H, O, N, S, P, halogenidů a Si, případně také B a některé kovy. Páteř lineárních makromolekul a také základ skeletu trojrozměrných sítí makromolekul je schopno vytvářet z hořejšího souboru atomů jen několik druhů, tj. C, O, N, S, P, Si, (B). Tyto prvky, včetně ostatních jmenovaných, mohou být samozřejmě i součástí substituentů vázaných na základní skelet 12,15, Polykondenzace Polykondenzace je sled stejných opakujících se reakcí funkčních skupin výchozích látek. Ke vzniku polymeru je zapotřebí, aby výchozí sloučeniny měly potřebný počet funkčních skupin a obsahovaly nejméně dvě v každé molekule vzájemně reagující komponenty. V takovém případě vzniká lineární polymer. Má-li některá výchozí látka více funkčních skupin v molekule, vznikají produkty se strukturou prostorové sítě 12,13,17,18. Polykondenzace je reakce, při níž vzniká ze dvou nízkomolekulárních látek polymer a nějaká jiná nízkomolekulární látka, většinou voda. Rozdíl mezi polymerací a polykondenzací je v tom, že produkt polymerace (polymer) má stejné chemické složení jako původní výchozí látka (monomer), kdežto produkt polykondenzace (polykondenzát, běžně také označovaný jako polymer) má jiné chemické složení než nízkomolekulární látky, ze kterých vznikl 12,13,17,18. Typickým příkladem polykondenzace je reakce fenolu s formaldehydem poskytující pryskyřici známou pod názvem bakelit, nebo ethylenglykolu s kyselinou tereftalovou, vedoucí ke vzniku polyesteru známého u nás nejvíce jako vlákno Tesil, nebo jako PET láhve 12,13,17, Příklady průmyslových polykondenzací Úplný výčet druhů polykondenzací již průmyslově využívaných by byl velmi rozsáhlý. Odborníci a uživatelé plastů však mohou mít potíže s identifikací chemické podstaty toho kterého druhu materiálu, který je definován jen obchodním názvem. Pro příklad uvádím 9

10 jen nejčastěji používané monomery, kategorie plastu, který z nich vzniká, a pouze několik nejběžnějších obchodních nazvů 19, Příklady prakticky významných polymerů připravovaných polykondenzačními reakcemi K nejdůležitějším polymerům, které se vyrábějí polykondenzací v průmyslovém měřítku, patří polyestery, polyamidy, polyimidy, fenoplasty; nejrozšířenější jsou fenolformaldehydové pryskyřice a aminoplasty, pro jejichž výrobu jsou základními surovinami močovina, melamin a formaldehyd. Z polymerů, které mají v hlavním řetězci makromolekul konstituční jednotky obsahující i jiné atomy než C, N, O, patří polysiloxany 12,13,21, Polyestery Polyestery tvoří velkou skupinu polymerů, jejichž společným znakem je přítomnost esterových vazeb v hlavním makromolekulárním řetězci, tj. polymery mající obecný vzorec typu [-R1-CO O R2 - ] n. Jedním z možných typů klasifikace je rozdělení na dva základní typy, tj. na polyestery termoplastické, lineární, které jsou odvozené od kyseliny uhličité a tereftalové) a na polyestery reaktoplastické, rozvětvené a v konečném stádiu zpracování nesíťované 12,13. Komerčně nejdůležitějším polyesterem je polyethylentereftalát (PET; PETP). Klasický postup výroby vychází z reakce dimethyltereftalátu s ethan-1,2-diolem 12. Většina produkce PET se zpracovává na vlákna, menší podíl potom na fólie. Výhodou těchto fólií je možnost jejich snadného pokovování a proto se používají především v elektrotechnice a jako podložky pro výrobu magnetofonových a videorekordérových pásků a filmů. Vlákna se zpracovávají na spotřební textilie, technické tkaniny a lana, rovněž se používají k oplétání vodičů elektrického proudu a jako výstuže jiných polymerních materiálů (např. kordy pro pneumatiky a dopravní pásy). V posledních desetiletích mimořádně vzrostlo uplatnění PET v obalové technice, zejména v oblasti lahví pro nealkoholické nápoje. Mají však své využití i jako tzv. konstrukční (inženýrský) plast. Tímto označením jsou obecně charakterizovány polymery, které v různých výrobcích mohou nahrazovat ocel, hliník nebo jiné kovy 19, Fenoplasty Pojmem fenoplasty jsou označovány syntetické pryskyřice na bázi fenolu a aldehydů. Fenolformaldahydová pryskyřice získaná polyreakcí fenolu a formaldehydu byla prvním průmyslově vyráběným syntetickým polymerem. V roce 1910 byla zavedena její průmyslová výroba pod obchodním označením bakelit. Polykondenzace fenolu s formaldehydem se provádí ve vodném prostředí. Struktura produktu závisí na poměru obou monomerů v reakční násadě, na ph prostředí a na teplotě. V alkalickém prostředí, v přebytku formaldehydu, vznikají rezoly, nízkomolekulární produkty s vysoce reaktivními methylovými skupinami, jejichž vzájemnou reakcí vzniká nesíťovaný produkt, tzv. rezit. Produkty kondenzace, které probíhají v kyselém prostředí v přebytku fenolu, se označují jako novolaky 12,13,

11 1.3 Chemie a technologie léčiv Pojem léčiva velmi podrobně definuje zákon o léčivech č. 79/1997 Sb. ve znění pozdějších předpisů. Stručná definice uvádí, že za léčiva lze považovat léčivé látky nebo jejich směsi, případně léčivé přípravky, které jsou určené k podání lidem nebo zvířatům Léčivými látkami se rozumějí látky přírodního nebo syntetického původu s farmakologickým nebo imunologickým účinkem, případně látky ovlivňující metabolismus. Tyto látky slouží k prevenci, k léčení a mírnění chorob, k diagnostice a k ovlivňování fyziologických funkcí 27, Analgetika Analgetika jsou léčiva, která snižují nebo potlačují pocit bolesti, aniž by výrazně ovlivňovaly smyslové vnímání a vědomí. Mnohá analgetika vykazují také protizánětlivý (antiflogistický) a antipyretický účinek. Přestože analgetika neléčí příčinu onemocnění, jejich podávání může významně napomáhat vlastnímu léčení tím, že snižují zátěž a stres organismu způsobený bolestí, zánětem a zvýšenou teplotou 26. Analgetika se dělí podle míry a mechanismu účinku na analgetika narkotická, nazývaná též anodyna nebo opioidní analgetika a na analgetika-antipyretika, patřící do skupiny spolu s nesteroidními protizánětlivými látkami Nenarkotická analgetika Veškerá nenarkotická analgetika vykazují kromě analgetického účinku rovněž účinek antipyretický a antiflogistický. Přestože mají všechna tato léčiva podobný mechanismus působení, u některých vystupují více do prostředí antipyretické vlastnosti, u jiných naopak účinky protizánětlivé (nesteroidní protizánětlivé látky, které se dnes nejčastěji označují jako NSAIDs, tj. non-steroidal anti-inflammatory drugs). Z hlediska chemické struktury lze nenarkotická analgetika rozdělit na deriváty anilinu, deriváty kyseliny salicylové, deriváty kyseliny anthranilové, deriváty 2-arylalkanových kyselin, tzv. kyselé enol-deriváty (různé typy enolizujících oxoheterocyklických sloučenin) a další 26, Deriváty anilinu Analgeticko-antipyretické účinky acetanilidu (N-fenylacetamid, ANTI-FEBRIN), prvního terapeuticky využívaného derivátu anilinu, byly objeveny již v 80. letech 19. století. Tento preparát se pro řadu vedlejších účinků (methemoglobinémie a poškozování ledvin) již nedodává. Později se ukázalo, že N-(4-hydroxyfenyl)acetamid, na který je acetanilid v organismu metabolizován, má nejen lepší antipyretické účinky, nýbrž i nižší toxicitu. Pod názvem paracetamol (PARALEN, PANADOL) se stal v současné době jedním z nejpoužívanějších analgetik a antipyretik 26. Paracetamol nevykazuje prakticky žádné protizánětlivé účinky. Značnou oblibu získal vzhledem ke své vysoké účinnosti při relativně nízké toxicitě (pouze v případě předávkování může být hepatotoxický). Paracetamol patří mezi volně prodejná léčiva Deriváty kyseliny salicylové Nejrozšířenějším derivátem kyseliny salicylové je kyselina acetylsalicylová ASA (kyselina 2-acetoxybenzoová, ACYLPYRIN, ASPIORIN). Jedná se o antipyretikum volně dostupné na trhu. Ve vyšších dávkách vykazuje rovněž protizánětlivé účinky, a proto se často aplikovala při léčení revmatoidních arthritid různého typu. K jejím nežádoucím vedlejším 11

12 účinkům patří dráždění gastrointenstinálního traktu, vedoucí při delším používání až k tvorbě žaludečních a dvanácterníkových vředů. Kyselina acetylsalicylová snižuje agregační schopnost krevních destiček v důsledku inhibice syntézy tromboxanu A 2, čehož se využívá například k prevenci srdečního infarktu a mozkové mrtvice. Vyšší dávky kyseliny acetylsalicylové však mohou vyvolat nežádoucí zvýšenou krvácivost. Nezanedbatelným rizikem při podávání kyseliny acetylsalicylové dětem mladším 12 let je možnost vzniku tzv. Reyova syndromu, což je onemocnění jater a mozku končící často smrtí 26, Arylalkanové kyseliny Účinnými látkami patřícími do této skupiny jsou antiflogistika typu aryloctové kyseliny. Nejznámějším zástupcem léčiv z této skupiny je diklofenak, zejména ve formě léčiva VOLTAREN (kyselina 2-((2,6-dichlorfenyl)aminofenyl)octová), který má protizánětlivé a analgetické účinky 26,29. Aplikuje se jak při akutních stavech, tak také dlouhodobě. Rychle a úplně se absorbuje z trávicího traktu (GIT), přičemž vrchol plazmatické hladiny je za 2 3 hodiny. Metabolizuje se v játrech hydroxylací a konjugací a z těla se vylučuje močí a žlučí. K jeho vedlejším nežádoucím účinkům patří rovněž gastrointestinální obtíže 26, arylpropanové kyseliny Poslední skupinou jsou 2-arylpropanové kyseliny, které se v posledních letech staly nejpoužívanějšími analgetiky a antiflogistiky. Látky patřící do této skupiny jsou většinou lépe snášeny než ASA. Z farmak tohoto strukturního typu je třeba jmenovat hojně používaný ibuprofen (kyselina (±)-2-(4-isobutylfenyl)propanová), BRUFEN, IBALGIN, BRUFALGIN, DOLGIT, NUROFEN). Ibuprofen se stal vzhledem ke své nízké toxicitě a minimálním nežádoucím vedlejším účinkům na gastrointestinální trakt volně prodejným léčivem. Používá se jako analgetikum nebo jako antiflofistikum při léčení akutních, případně chronických revmatických potíží. Ibuprofen se připravuje a podává jako racemát, stejně jako většina 2- arylpropanových kyselin; účinný však je (+)-(S)-stereoisomer 26, Analgetika v životním prostředí Analgetika, stejně tak jako jiná léčiva aplikovaná v humánní a veterinární medicíně, se kumulují v životním prostředí. Vzhledem k tomu, že tyto látky nebývají vždy kompletně eliminovány, dostávají se z organismů vylučováním močí nebo exkrementy; do životního prostředí se dostávají jako směs metabolitů, tzv. reziduí a nezměněných látek. Tato rezidua mají podobné fyzikálně chemické vlastnosti jako škodlivá xenobiotika, která jsou perzistentní, případně vyvolávají nepříznivé účinky. Proto je těmto látkám jako potenciálním polutantům věnována stále se zvyšující pozornost 30-32,. 12

13 2. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Experimentální část je rozdělena na dvě části, a to ekotoxikologické posouzení dvou vybraných analgetik a dále na posouzení ekotoxicity odpadních vod z výroby polymerů. V první části je vlastnost ekotoxicita posuzována u dvou vybraných analgetik, a to pomocí vybraných standardních a alternativních ekotoxikologických testů. V druhé části byly aplikovány vybrané testy toxicity na zjištění ekotoxicity pracích vod odebíraných z polymerní výroby medicínských pomůcek na bázi polyamidonitrilu. Sledovány byly jak prací vody, které se využívají při výrobě implantátů z prasečích kůží s příměsí polyamidonitrilu na popáleniny, tak také prací vody z výrobní směsi pro výrobu dilatátoru děložního hrdla. 2.1 Místo provádění zkoušek Testy toxicity pro posuzování vybraných analgetik a výrobků na bázi polyamidonitrilu byly prováděny na pracovišti společnosti GelMed, s.r.o. se sídlem v Kamenných Žehrovicích, a to v oddělení analýz a ve vývojové laboratoři. Tato laboratoř se mimo jiné zabývá analýzou složek životního prostředí, technických materiálů a polymerních výrobků na bázi polymerních hydrogelů. Laboratoře jsou akreditovány Českým institutem pro akreditaci. Vybavení této laboratoře splňuje podmínky pro kompletní provádění základních testů toxicity, včetně využití přístroje Lumino M 90a pro provádění bakteriálního bioluminiscenčního testu toxicity. 2.2 Výběr metod pro provedení zkoušek Pro vlastní posuzování ekotoxicity byly vybrány klasické ekotoxikologické testy, které se nejčastěji používají pro hodnocení vlivu znečišťujících látek na životní prostředí. Do souboru nebyl zařazen pouze test akutní toxicity na rybách, který je finančně značně nákladný a kromě toho podléhá legislativě z hlediska zákona na ochranu zvířat (Zákon č Sb. ve znění pozdějších předpisů) plán pokusů schválený MZe ČR. Z novějších testů byl použit nový bakteriální test inhibice bioluminiscence. Tento test je perspektivní jak z hlediska levnějšího přístrojového vybavení, tak také z hlediska rychlosti získávání výsledků. Zařazení tohoto testu přispěje k porovnání výsledků a citlivosti klasických ekotoxikologických testů s tímto perspektivním testem. Pro testování byly zvoleny tyto testy ekotoxicity: Test akutní toxicity na vodním členovci (Daphnia magna). Test inhibice růstu zelené řasy (Desmodesmus subspicatus). Test inhibice růstu kořene hořčice bílé (Sinapis alba). Bakteriální test inhibice bioluminiscence (Vibrio fischeri). Alternativní test akutní toxicity na sladkovodním korýši Thamnocephalus platyurus (Thamnotoxkit F TM Alternativní test akutní toxicity na sladkovodním korýši Daphnia magna (Daphnotoxkit F TM ). 2.3 Metodika provedení zkoušek Za standardní lze považovat takovou metodu, která jednoznačně definuje podmínky testu, včetně způsobu matematického vyhodnocení. Z hlediska standardizace testů je nezbytné specifikovat následující parametry: 13

14 Vyjadřování množství testované látky. Množství testované látky představuje její hmotnost v 1 litru ředěného média, a to nezávisle na tom, zda se jedná o látku pevnou nebo kapalnou. Ředící médium a způsob ředění. V akutních testech s vodními organismy a při sledování klíčivostí semen je nutné používat standardní ředící vodu. Testovací organismus. Je nezbytné používat organismy z dlouhodobých laboratorních chovů nebo kultur. Je naprosto nepřípustné získávat organismy těsně před provedením testu z volné přírody. Množství organismů v jednotlivém ředění. Množství organismů v testech musí být voleno tak, aby umožnilo pokud možno statistické vyhodnocení toxicity. Teplota a osvětlení. Teplota má značný vliv na průběh biologických pochodů, a proto se u většiny testů pracuje s teplotou od 20 C do 25 C. Testy s klíčením semen rostlin hořčice se provádějí v termostatu. Akutní testy s vodními organismy se provádějí za nepřímého denního osvětlení. U testů toxicity s řasami je intenzita osvětlení důležitým faktorem limitujícím rozvoj řasové kultury. Osvětlení musí být dostatečné, aby rozvoj kultury probíhal za optimálních podmínek. Bakteriální test inhibice bioluminiscence se provádí ve tmě za poměrně nízké teploty, tj. 15 C. U tohoto testu vždy používáme chlazení. Doba provedení testu. Ukončení testů na vodních členovcích se provádí po 24 a po 48 hodinách, testy na semenech hořčice po 72 hodinách a testy na řasách rovněž po 72 hodinách. Nejkratší testovací doba 30 minut je u bakteriálního růstu. Krmení organismů, živná média. Je nepřípustné během testování krmit organismy, protože krmení výrazně ovlivňuje citlivost organismů k toxické látce. Nakrmený organismus je méně citlivý na přítomnost toxických látek než organismus hladový. Hodnocené parametry a způsoby vyhodnocení. Důležitými parametry při použití akutních testů toxicity je LC 50, u testů inhibičních pak IC 50 a EC 50, což představuje koncentraci zkoušené látky mající za následek 50% úhyn, případně 50% snížení růstu nebo růstové rychlosti ve vztahu ke kontrolnímu vzorku. Pomocí testů na chlorokokální řase je zjišťován vliv toxické látky na inhibici růstu řasových buněk (IC 50 ), testů na korýších vliv na úhyn a imobilizaci organismů (EC 50 ), testů na semenech inhibice růstu kořene (IC 50 ) a u bakteriálního testu se měří inhibice bioluminiscence (IC 50 ) Test akutní toxicity na vodním členovci Jako zkušební organismus byl použit vodní korýš Daphnia magna z laboratorních chovů. Podstatou zkoušky je stanovení akutní toxicity látek rozpustných ve vodě za specifických podmínek. Zkušební podmínky jsou určeny příslušnou normou. Teplota se v průběhu celého testu udržuje v rozmezí 20 C ± 1,0 C. Test se provádí bez osvětlení v testovací aparatuře termostatu. Adaptace dafnií na zkušební roztoky je trvalá, stáří organismů použitých pro test je maximálně 24 hodin. Maximální počet jedinců v jednom ředění je 20 kusů na 200 ml roztoku. U každé koncentrace byla provedena tři paralelní stanovení. Každý test byl proveden třikrát. Hodnoty EC 50 se vyhodnocují pro každý test zvlášť a vypočítává se z nich průměr, přičemž jednotlivé hodnoty se nesmí od sebe lišit o více než 30 %. Výsledky testů se vyhodnocují s použitím programu MS Excel. Při výpočtu EC 50 je přesnost výsledku vyjádřena intervalem spolehlivosti na 95% hladině významnosti. Vyjadřování výsledků se provádí v mg testované látky na 1 litr, a to za 24 a za 48 hodin. 14

15 Výsledky zkoušky byly platné, jestliže u kontrolních stanovení nedošlo k úhynu nebo k imobilizaci testovacích organismů vyššímu než 10 %. Tato koncentrace na konci testu musí být větší nebo rovna 2,0 mg.l -1. V průběhu testu nesmí dojít k náhlé změně ph testovaných roztoků Test inhibice růstu na řase Podmínky pro provedení testu byly následující: teplota v průběhu celého testu byla dodržena v rozmezí 23 ± 2,0 C, osvětlení bylo umělé, rovnoměrné, 24 hodin denně. Pro provedení testu byl použit termoluminostat s nastavenou intenzitou osvětlení v rozmezí 8000 až lux. Každý den byly minimálně 4x denně testované nádoby intenzivně promíchávány. U každé koncentrace prováděna tři paralelní stanovení. V průběhu testu nebyla použita aerace jednotlivých testovaných koncentrací. Pro přípravu živných roztoků byla použita kvalitní demineralizovaná voda neobsahující inhibující koncentrace toxických látek. Použité chemikálie byly chemicky čisté, případně čistoty p.a. Po přípravě se živné roztoky sterilizují a následně se uchovávají ve tmě v chladničce při teplotě 4 C. Takto připravené živné roztoky se použijí pro přípravu zásobního roztoku živin, který se připravuje vždy čerstvý. Před použitím se nechá ustavit jeho rovnováha provzdušňováním filtrovaným vzduchem po dobu 30 minut; po ustavení rovnováhy by se ph takto připraveného živného roztoku mělo pohybovat v rozmezí hodnot ph 7,5 ± 0,2. Testované roztoky se připravují přidáním určeného množství zásobního roztoku testované látky k demineralizované vodě, a to pro dosažení požadované koncentrace. Potom se přidá přesně vypočtené množství živného roztoku. Každý test byl proveden třikrát. Hodnoty IC 50 se vyhodnocují pro každý test zvlášť a počítá se z nich průměr. Jednotlivé hodnoty IC 50 se nesmí od sebe lišit o více než 30 %. Při výpočtu IC 50 je přesnost výsledku vyjádřena intervalem spolehlivosti na hladině významnosti 95 %. Výsledky se vyjadřují v mg testované látky na 1 litr ředící vody (mg.l -1 ). Při stanovení inhibice růstu se vychází z některého ze dvou následujících parametrů, tj. z plochy pod růstovou křivkou a z růstových rychlostí. Nakonec se sestaví tabulka s hodnotami ploch pod růstovou křivkou (z růstových rychlostí), které odpovídají ověřovaným koncentracím. Takto zjistíme koncentrací IC 50, která odpovídá 50% inhibici. Pokud je to možné, určí se hodnota NOEC. NOEC je nejvyšší posuzovaná koncentrace, při které nedochází k významné inhibici růstu v porovnání s kontrolním vzorkem Test inhibice růstu kořene rostlin Příprava standardní ředící vody použité pro test odpovídá normě ISO Pro její přípravu se používá kvalitní demineralizovaná voda, neobsahující inhibující koncentrace toxických látek. Pro každou řadu zkoušek se použije stejná šarže vody. Po přípravě se ředící voda provzdušňuje tak dlouho, až koncentrace rozpuštěného kyslíku odpovídá nasycení vzdušným kyslíkem. Potom se nechá 2 dny odstát. Hodnota ph takto připravené ředící vody je cca 7,8±0,2. Podmínky testování byly následující: teplota se v průběhu celého testu pohybovala v rozmezí 21±1,0 C. Test probíhal v termostatu bez osvětlení. Při nasazení testu bylo použito 30 ks semene na jedno ředění a jednu Petriho misku. Nejprve se provede předběžná zkouška, která umožňuje stanovit koncentrační rozpětí, ve kterém bude zkouška probíhat. Pomocí ní se stanoví procento inhibice růstu kořene Sinapis 15

16 alba. Pro každou koncentraci se použije nejméně 90 semen Sinapis alba ve třech Petriho miskách. Každá zkouška se provádí třikrát. Hodnoty IC 50 se vyhodnocují pro každou zkoušku a počítá se z nich průměr. Jednotlivá hodnoty IC 50 se nesmí od sebe lišit více než 30 %. Výsledky se vyjadřují jako průměrná hodnota IC 50 za 72 hodin a jsou platné, pokud variabilita výsledků získaných po odečtu více Petriho misek jedné koncentrace není vyšší než 30 % Bakteriální test inhibice bioluminiscence Vibrio fischeri Vlastní měření začínáme předběžnou zkouškou, kterou se stanoví koncentrační rozmezí; obvykle se nasazuje 5 různých koncentrací v geometrické řadě vše ve dvou paralelních stanoveních. Základní zkouškou se stanoví procento inhibice bioluminiscence světélkujících bakterií Vibrio fischeri vystavených toxickému působení zkoušené látky. Do zkumavek s různými koncentracemi testované látky se přidá kultura bakterií a změří se počáteční hodnota bioluminiscence. Po stanovené době působení (15, 30 minut) se znovu změří v každé zkumavce hodnota bioluminiscence. Výsledky zkoušek se vyhodnocují pomocí počítačového programu. Hodnoty EC 50 odpovídající 0% a 100% inhibici se vyjadřují u odpadních vod a výluhů v procentech ředění a u chemických látek v mg.l -1. Pokud nestačí údaje pro výpočet EC 50, uvede se nejvyšší dosažená míra inhibice v % a k ní příslušná koncentrace. Výsledky zkoušky jsou platné podle norem, jestliže variabilita jednotlivých naměřených paralelních výsledků je menší než 30 % a výsledky testu s referenční látkou (síran zinečnatý) musí odpovídat stanoveným limitům Alternativní test Thamnotoxkit V sadě jsou obsaženy ampule s koncentrovanými solnými roztoky, potřebné k přípravě standardní (uměle) sladké vody, která slouží jako medium pro inkubaci cyst a jako ředící médium pro přípravu sérií roztoků toxikantů. Litrová odměrná baňka se naplní přibližně 800 ml deionizované vody, do roztoku se přidají postupně obsahy 4 ampule (NaHCO 3, CaSO 4, MgSO 4, KCl) v určeném pořadí a roztok se důkladně protřepe. Před samotnou inkubaci cyst je vhodné živné médium pomoci akvarijního kompresorku provzdušnit. Jeden litr standardní ředící vody postačuje pro provedení 6 kompletních biotestů každého Toxkitu. Před použitím je nutno médium opatrně (postupně) převést zpět na laboratorní teplotu. Inkubace cyst se provádí ve zředěném živném médiu (ředění 1:8 deionizovanou vodou). Zředění živného média sníží osmotický tlak, což vede k vyšší inkubační úspěšnosti cyst. Otevřená trubička s cystami se naplní živným médiem, trubička se uzavře a v pravidelných intervalech se po dobu 30 minut protřepává. Obsah kyvety s předhydratovanými cystami se přenese na jednu ze dvou Petriho misek, přidá se 10 ml ředící vody a opatrným kroužením se cysty rovnoměrně rozptýlí. Zakrytá Petriho miska se nechá inkubovat 20 až 22 hodin při 25 C, za kontinuálního osvětlení (světelný zdroj lx). Roztok toxikantů připravíme tak, že do 4 z pěti zkumavek nalijeme 5 ml ředící vody a do zbývající zkumavky dáme 10 ml vzorku, ze které pak 5 ml přeneseme do zkumavky 2, z té opět odebereme 5ml a postup opakujeme až ke zkumavce 5. 16

17 Každá koncentrace toxikantu se přenese do všech šachet jednoho sloupce testovací desky. Šachty jsou označeny 1 až 6 horizontálně a A až D vertikálně. Do šachet označených číslem 1 se dá kontrola, do ostatních koncentrační řada s deseti jedinci Thamnocephalus platyurus. Test probíhá 24 hodin a vyhodnocuje se hodnota 24 LC Alternativní test Daphnotoxkit Pro přípravu standardního živného média dáme do 2 litrové odměrné baňky deionizovanou vodu, přidáme obsah jedné ze dvou sad čtyř lahviček koncentrovaných roztoků solí, v pořadí 1 až 4 (podle přiloženého návodu). Po přidání roztoků solí se odměrná baňka doplní po rysku a protřepáním se médium zhomogenizuje. Dva litry standardní vody stačí pro kompletní provedení 3 biotestů. Ephippia by měla být nasazena 3 dny před zahájením samotného testu toxicity. Po vyjmutí ephippií je nutné je přenést do Petriho misky, kde se daphnie nechají tři dny líhnout při teplotě 20 až 22 C, při nepřetržitém osvětlení 6000 lx. Perloočky by měly být připraveny nejpozději do 90 hodin od začátku inkubace. Samotný test toxicity se provádí v jednorázových Petriho miskách s 30 jamkami. Každá deska je vybavena 4 jamkami pro kontrolu a 16 jamkami pro stanovení toxicity koncentračních řad. Do jamek se umístí koncentrační řada toxikantů a vylíhnuté perloočky se vždy po deseti jedincích mikropipetou přenesou do připravených jamek. 2.4 Příprava a zpracování vzorků Vzorky biologicky aktivních látek (analgetika) Pro provádění experimentu byla vybrána analgetika ibuprofen, paracetamol, kyselina acetylsalicylová a diklofenak, protože se jedná o komerčně nejprodávanější a nejčastěji aplikovaná analgetika v ČR. Velmi často si lidé berou na zmírnění bolestí i kombinaci dvou různých účinných látek; proto byly v první části práce posuzovány ekotoxické účinky nejen jednotlivých analgetik, ale dvou, spolu aplikovaných. V rámci tohoto porovnání šlo o to zjistit, zda budou mít kombinace léčiv synergický (podpůrný) nebo antagonický (utlumující) efekt. Jako vzorky byly použity komerčně dodávané standardy léčiv. Pro porovnání synergických nebo antagonických efektů, byly vzorky smíchány v poměru 50 : Vzorky monomerů pro výrobu polyethylentereftalátu a bakelitu Polyethylenterftalát (PET) se syntetizuje z ethylenglykolu a kyseliny tereftalové. Ekotoxicita samotného polymeru bude stanovena nepřímo, tj. jako ekotoxicita směsi monomerů, ze kterých se polymer vyrábí a jako ekotoxicita produktů, na které se případně rozpadá. Protože v přírodě dochází pouze k pozvolnému rozkladu polymeru, dá se s velkou pravděpodobností tvrdit, že posouzení ekotoxicity polymerů je diskutabilní. K provedení vlastního experimentu byly použity kyselina tereftalová a ethylenglykol rozpouštěné ve vodě. Bakelit (fenolformaldehydová pryskyřice), se syntetizuje z formaldehydu a fenolu, tj. látek dobře mísitelných s vodou, a proto příprava vzorkovacích roztoků nevyžadovala žádné složité přípravy. Ekotoxicita PET byla posuzována tak, že nejprve byla stanovena u obou monomerů a následně potom ve směsi monomerů 50 : 50, z nichž se bakelit vyrábí. 17

18 3. DISKUZE 3.1 Výsledky srovnání ekotoxicity vybraných analgetik a jejich kombinací V první části práce bylo prováděno porovnání ekotoxicity vybraných analgetik šesti vybranými testy toxicity. Výsledné hodnoty jsou přehledně uspořádány v následné tabulce: Tab. 1: Porovnání výsledných hodnot ekotoxicity analgetik a jejich kombinací v mg.l -1 analyt 48h EC50 Dafnia st. 48h EC50 Dafnia al. 72h EC50 Scenedesmus 72h IC50 Sinapis IC 50 Vibrio 24h EC50 Thamnocep. dichroman 1,13 1,19 0,74 36,62 14,14 1,19 ibuprofen 144,2 145,0 125,3 324,6 240,2 104,5 diklofenak 83,92 79,68 83,65 309,9 251,5 69,87 ASA 348,7 362,0 356,6 346,0 595,0 384,6 paracetamol 69,98 64,16 133,6 296,4 250,4 76,92 IBU / DIK 92,32 104,4 162,3 329,8 231,8 100,0 IBU / ASA 222,5 227,4 214,3 335,0 337,0 174,6 IBU / PAR 117,9 119,5 110,8 318,8 250,5 83,40 DIK / ASA 87,81 82,74 223,1 330,0 454,9 164,6 DIK / PAR 98,20 99,59 102,9 331,8 233,7 82,99 ASA / PAR 83,38 82,96 228,0 342,4 364,8 167,4 Pomocí grafu 1 je provedeno porovnání teoretického součtu toxicit všech binárních směsí analgetik s naměřenou toxicitou pro organismus Daphnia magna (standardní test). Graf 1: Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí zjištěných pomocí teoretického součtu a stanovení na organismu Daphnia magna Z naměřených hodnot vyplývá, že směsi ibuprofenu s kyselinou acetylsalicylovou, ibuprofenu s paracetamolem a diklofenaku s paracetamolem vykazují spíše aditivní účinek, kdy rozdíl mezi uvedenými hodnotami se dají považovat za marginální. Antagonický účinek 18

19 vykazují směsi diklofenaku s kyselinou acetylsalicylovou a kyselina acetylsalicylová s paracetamolem. Rozdíl mezi hodnotami směsi ibuprofenu a dilofenaku je však již větší; posouzení se stejným organismem stanovené alternativním testem Daphnotoxkit (viz níže) již vychází aditivně, a proto lze usuzovat na to, že směs ibuprofenu a diklofenaku vykazuje aditivní účinek z hlediska toxicity na organismus daphnia magna. V grafu č. 2 je zaznamenané porovnání teoretického součtu toxicit všech binárních směsí analgetik s naměřenou toxicitou pro organismus Daphnia magna alternativního testu Daphnotoxkit F. Graf 2: Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí zjištěných pomocí teoretického součtu a stanovení na organismu Daphnia magna (Daphnotoxkit) Z naměřených hodnot vyplývá, že směsi ibuprofenu s kyselinou acetylsalicylovou, ibuprofenu s paracetamolem a diklofenaku s paracetamolem vykazují spíše aditivní účinek;. antagonický účinek vykazují směsi diklofenaku s kyselinou acetylsalicylovou a kyselina acetylsalicylová s paracetamolem. Pomocí grafu 3 bylo provedeno porovnání teoretického součtu toxicit všech binárních směsí analgetik s naměřenou toxicitou pro organismus Desmodesmus subspatiens. U organismu Desmodesmus subspatiens se projevují směsi léčiv ibuprofen a kyselina acetylsalicylová, ibuprofen a paracetemol, dikolfenak a kyselina acetylsalicylová a kyselina acetylsalicylová s paracetamolem aditivně. Směs léčiv ibuprofenu s diklofenakem má efekt silně synergický, zatímco u směsi ibuprofenu a paracetamolu nelze stanovit příslušný efekt. 19

20 Graf 3: Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí zjištěných pomocí teoretického součtu a stanovení na organismu Desmodesmus subspatiens Porovnání teoretického součtu toxicit všech binárních směsí analgetik se stanovenou toxicitou pro organismus Sinapis alba je prezentováno v grafu 4. U organismu Sinapis alba vykazuji aditivní účinky směsi léčiv ibuprofen s kyselinou acetylsalicylovou a diklofenak s kyselinou acetylsalicylovou. Směs diklofenaku s paracetamolem a kyseliny acetylsalicylové s paracetamolem vykazují efekt synergický. Spíše synergický efekt má směs ibuprofenu s diklofenakem, zatímco u směsi ibuprofenu s paracetamolem nelze efekt jednoznačně stanovit. Graf 4 Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí zjištěných pomocí teoretického součtu a stanovení na organismu Sinapis alba 20

21 Pomocí grafu 5 je prezentováno porovnání teoretického součtu toxicit všech binárních směsí analgetik se stanovenou toxicitou pro organismus Vibrio fischeri. Graf 5: Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí zjištěných pomocí teoretického součtu a stanovení na organismu Vibrio fischeri U organismu Vibrio fischeri vykazují prakticky všechny směs aditivní účinek, kromě směsi ibuprofenu s kyselinou acetylsalicylovou, kde efekt nelze jednoznačně určit. V grafu 6 je prezentováno porovnání teoretického součtu toxicit všech binárních směsí analgetik s naměřenou toxicitou pro organismus Thamnocephalus platyurus. Graf 6: Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí zjištěných pomocí teoretického součtu a stanovení na organismu Thamnocephalus platyurus 21

22 U organismu Thamnocephalus platyurus vykazují aditivní účinky směsi léčiv ibuprofen s diklofenakem, ibuprofenu s paracetamolem a diklofenakem s paracetamolem. Ostatní směsi vykazují spíše antagonické efekty. Při porovnání citlivosti metod bylo prokázáno, že nejcitlivějšími organismy jsou vodní členovci, nejméně citlivé byly testy na organismu Sinapis alba a na bakteriích Vibrio fischeri. Bylo prokázáno, že nejvyšší ekotoxicitu měl paracetamol (nejvyšší hodnoty byly naměřeny pomocí Daphnia magma a Sinapis alba) a diklofenak, který měl velmi podobnou ekotoxicitu jako paracetamol; výsledky se však většinou lišily jen v jednotkách. Kyselina acetylsalicylová měla naopak u všech testů jednoznačně nejnižší ekotoxicitu; důvodem může být také to, že se zde, na rozdíl od ostatních léčiv, posuzovala obsahová látka extrahovaná z přírodních matric, nejednalo se o účinnou látku synteticky vyráběnou. Budeme-li posuzovat biologické efekty jednotlivých léčiv, tak obecně antagonický efekt lze na podkladě výsledků konstatovat právě u kyseliny acetylsalicylové, která, pokud je součástí směsi, tak snižuje ekotoxicitu ostatním léčivům, protože výsledná hodnota ekotoxicity směsi léčiv odpovídá vesměs hodnotě kyseliny acetylsalicylové. Toto tvrzení však neplatí pro její směs s diklofenakem a paracetamolem, kde se v obou testech na vodních členovcích Daphnia magna konečná hodnota ekotoxicity spíše přibližovala hodnotě zjištěné u diklofenaku a paracetamolu; pravděpodobně to znamená, že paracetamol a diklofenak vykazují synergický efekt vůči kyselině acetylsalicylové. 3.2 Ekotoxicita polyethylentereftalátu a bakelitu V druhé části práce byly zpracovány výsledky měření ekotoxicity polymerů PET a bakelitu nepřímou metodou měřením ekotoxicity monomerů, ze kterých se uvedené polymery vyrábějí. Výsledky stanovení jsou uvedeny v přehledné tabulce: Tab. 2: výsledné hodnoty ekotoxicky vybraných monomerů a jejich kombinací Vše v mg/l 48h EC50 Dafnia st. 48h EC50 Dafnia al. 72h EC50 Scenedesmus 72h IC50 Sinapis IC 50 Vibrio 24h EC50 Thamnocep. fenol 0,85 1,16 0,32 9,92 10,59 0,37 formaldehyd 1,60 1,03 1,14 13,79 13,58 1,19 DMTF 12,53 12,58 7,48 42,75 36,00 13,84 glykol 3,45 3,49 1,18 14,27 13,51 19,03 form./fenol 0,80 0,82 0,33 13,17 9,11 0,95 DMTF/glyk. 9,16 9,22 3,03 13,61 17,07 12,29 V grafu 7 je prezentováno porovnání teoretického součtu toxicit všech binárních směsí monomerů se stanovenou toxicitou pro organismus Daphnia magna (standardní test). Obě směsi vykazují aditivní účinek, a to jak směs formaldehydu a fenolu, tak také směs DMTF s glykolem. Porovnání teoretického součtu toxicit všech binárních směsí monomerů s naměřenou toxicitou pro organismus Daphnia magna (alternativní test Daphnotoxkit F) je uvedeno v grafu 8. Obě směsi vykazují aditivní účinek, jak směs formaldehydu a fenolu, tak také směs DMTF s glykolem. 22

23 Graf 7: Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí zjištěných pomocí teoretického součtu a stanovení na organismu Daphnia magna (standardní test) Graf 8: Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí zjištěných pomocí teoretického součtu a stanovení na organismu Daphnia magna Pomocí grafu 9 je prezentováno porovnání teoretického součtu toxicit všech binárních směsí monomerů se stanovenou toxicitou pro organismus Desmodesmus subspatiens. U organismu Desmodesmus subspatiens vykazuje smes formaldehydu s fenolem efekt aditivní a smes DMTF s glykolem mírně antagonický efekt. 23

24 Graf 9: Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí zjištěných pomocí teoretického součtu a stanovení na organismu Desmodesmus subspatiens Pomocí grafu 10 bylo provedeno porovnání teoretického součtu toxicit všech binárních směsí monomerů s naměřenou toxicitou pro organismus Sinapis alba. U organismu Sinapis alba má směs formaldehydu s fenolem efekt aditivní a směs DMTF s glykolem antagonický efekt. Graf 10: Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí zjištěných pomocí teoretického součtu a stanovení na organismu Sinapis alba 24