VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ

Transkript

1 VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE A TECHNOLOGIE OCHRANY ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF CHEMISTRY AND TECHNOLOGY OF ENVIRONMENTAL PROTECTION EKOTOXIKOLOGICKÉ HODNOCENÍ POLYMERŮ A BIOLOGICKY AKTIVNÍCH LÁTEK V AKVATICKÉM PROSTŘEDÍ DIZERTAČNÍ PRÁCE DOCTORAL THESIS AUTOR PRÁCE AUTHOR VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR Ing. OTAKAR KAŠPAR prof. RNDr. MILADA VÁVROVÁ, CSc. BRNO 2015

2

3 ABSTRAKT Předložená dizertační práce byla zaměřena na stanovení ekotoxicity, a to u jedné skupiny léčiv a polymerů. Ze skupiny léčiv byla vybrána analgetika, která patří mezi nejčastěji užívaná. Důvodem je také to, že velkou většinu z nich lze získat bez lékařského předpisu. Pro stanovení ekotoxicity byly zvoleny dva postupy, v prvním z nich bylo zvoleno stanovení ekotoxicity pouze jednoho analgetika, ve druhém případě byla posuzována směs dvou analgetik. Důvodem bylo to, že pacientům jsou často aplikována dvě léčiva z této skupiny. Ke stanovení byly použity standardní i alternativní testy toxicity (Daphnia magna, Sinapsis alba, Scenedesmus, Vibrio fischeri, Thamnotoxkit a Daphnotoxkit). Pro toto posouzení byla jako analyty vybrána běžně používaná léčiva, tj. ibuprofen, kyselina acetylsalicylová, diklofenak a paracetamol, která patří mezi nejhojněji používaná léčiva v ČR a Evropě. Ze skupiny polymerů byly posuzovány dva polymery, a to běžně používaný polymer polyethylentereftalát (PET) a fenolformaldehydová pryskyřice, která je ve východní Evropě známá jako bakelit. Pro stanovení ekotoxicity polymerů byla aplikována nepřímá metoda, která je založená na stanovení antagonických nebo synergických efektů směsi monomerů, ze kterých se polymer vyrábí a na které se v přírodě může následně pomalu rozkládat. Také v tomto případě byly ke stanovení použity standardní i alternativní testy toxicity, výše specifikované. KLÍČOVÁ SLOVA: ekotoxikologie, standardní a alternativní testy toxicity, polyethyltereftalát, bakelit, ibuprofen, ASA, diklofenak, paracetamol, Daphnia magna, Sinapsis alba, Scenedesmus, Vibrio fischeri, Thamnotoxkit a Daphnotoxkit. 3

4 ABSTRACT To determine the ecotoxicity of analgetics, first the individual ecotoxicity values of individual analgetics are determined and then a mixture of two analgetics is tested. To determine the toxicity, both standard and alternative toxicity tests are used (Daphnia magna, Sinapsis alba, Scenedesmus subspicatum, Vibrio fischeri, Thamnotoxkit F TM and Daphnotoxkit F TM magna). The analgetics being whish tested are the commonly used medicines ibuprofen, ASA, diclofenac and paracetamol, which are the most frequently used medicines in the Czech Republic and whole Europe. To determine the ecotoxicity of the polymers polyethyltereftalate (PET) and phenolphormaldehyde resin. I am using an indirect method of examination, in which I determine the antagonistic or synergistic effects of the mixture of monomers from which the polymer is prepared and into which it slowly decomposes in nature. For the determination both standard and alternative toxicity tests are used. The polymers the toxicity of which is being determined are the habitually used polymer PET and the formaldehyde resine known as bakelite in Eastern Europe. KEYWORDS ecotoxicology, standard and alternative toxicity tests, analgetics, polyethyltereftalate, bakelite, ibuprofen, ASA, diklofenak, paracetamol, Daphnia magna, Sinapsis alba, Scenedesmus, Vibrio fischeri, Thamnotoxkit a Daphnotoxkit. 4

5 KAŠPAR, O: Ekotoxikologické stanovení polymerů a biologicky aktivních látek v akvatickém prostředí. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, s. Vedoucí disertační práce prof. RNDr. Milada Vávrová, CSc. PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem dizertační práci vypracoval samostatně a že všechny použité literární zdroje jsem správně a úplně citoval. Dizertační práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího dizertační práce a děkana FCH VUT.... podpis studenta Poděkování: Rád bych poděkoval své vedoucí dizertační práce, prof. RNDr. Miladě Vávrové, CSc., za odborné vedení, cenné rady a podporu při studiu na Fakultě chemické VUT v Brně. Moc si vážím její ochoty a vstřícnosti. Obrovský dík patří také Ing. Šárce Hřibové a Ing. Tereze Švestkové za ochotnou pomoc při formálních a jazykových úpravách disertační práce. 5

6 OBSAH Úvod Teoretická část Ekotoxikologie Historický vývoj ekotoxikologie Toxicita Ekotoxicita Rozdělení a použití ekotoxikologických testů Podle doby expozice Testy akutní toxicity Testy subakutní toxicity Testy chronické toxicity Podle pokročilosti designu testovacího systému Testy I. Generace Testy II. Generace Testy III. a IV. Generace Rozdělení testů podle trofických úrovní testovaných organismů První trofická úroveň Druhá trofická úroveň Třetí trofická úroveň Čtvrtá trofická úroveň Pátá trofická úroveň Rozdělení biotestů podle prostředí Akvatické testy toxicity Terestrické testy toxicity Další možné dělení ekotoxikologických testů Obecný postup při provádění testů toxicity Předúprava vzorku Obecný postup při hodnocení vlastnosti ekotoxicita Vyhodnocení výsledků testů Podmínky provádění testů Kontrola Ředící voda Vnitřní kontrola Vnější kontrola Přehled standardních testů akutní toxicity Test toxicity na korýši Daphnia magna Test toxicity na semenech hořčice bílé Sinapis alba Test toxicity na chlorokokální řase Desmodesmus quadricauda Bakteriální bioluminiscenční test toxicity na Vibrio fischeri Vyhodnocení testů Alternativní biotesty Thamnotoxkit F Daphnotoxkit F magna a pulex

7 1.3 Vlastnosti, struktura a rozdělení syntetických polymerů Chemická a fyzikální struktura Fázový stav Monomery Rozdělení syntetických polymerů Polykondenzace Příklady průmyslových polykondenzací Příklady prakticky významných polymerů připravovaných polykondenzačními reakcemi Polyestery Fenoplasty Likvidace, zpracování a recyklace polymerního odpadu Chemie a technologie léčiv Historie Rozdělení léčiv Názvosloví léčiv Analgetika Nenarkotická analgetika Deriváty anilinu Deriváty kyseliny salicylové Arylalkanové kyseliny Analgetika v životním prostředí Experimentální část Místo provádění zkoušek Výběr metod pro provedení zkoušek Metodika provedení zkoušek Test akutní toxicity na vodním členovci Test inhibice růstu na řase Test inhibice růstu kořene rostlin Bakteriální test inhibice bioluminiscence Vibrio fischeri Alternativní test Thamnotoxkit Alternativní test Daphnotoxkit Příprava roztoků Příprava a zpracování vzorků Vzorky biologicky aktivních látek (analgetika) Vzorky monomerů pro výrobu polyethylentereftalátu a bakelitu Výsledky Výsledky testů na členovci Daphnia magna, standardní test Biologicky aktivní látky včetně směsí (analgetika) Monomery pro polymery polyethylentereftalát a bakelit včetně směsí Výsledky testů na členovci Daphnia magna, alternativní test (Daphnotoxkit) Biologicky aktivní látky včetně směsí (analgetika) Monomery pro polymery polyethylentereftalát a bakelit včetně směsí

8 3.3 Výsledky testů inhibice růstu na řase Desmodesmus subspicatus Biologicky aktivní látky včetně směsí (analgetika) Monomery pro polymery polyethylentereftalát a bakelit včetně směsí Výsledky testů inhibice růstu kořene rostliny Sinapis alba Biologicky aktivní látky včetně směsí (analgetika) Monomery pro polymery polyethylentereftalát a bakelit včetně směsí Výsledky bakteriálních testů inhibice bioluminiscence Biologicky aktivní látky včetně směsí (analgetika) Monomery pro polymery polyethylentereftalát a bakelit včetně směsí Výsledky testů akutní toxicity na vodním členovci Thamnocephalus platyurus (thamnotoxkit) Biologicky aktivní látky včetně směsí (analgetika) Monomery pro přípravu polymerů polyethylentereftalát a bakelit včetně směsí Diskuze Výsledky porovnání ekotoxicity vybraných analgetik a jejich kombinací Ekotoxicita polyethylentereftalátu a bakelitu Porovnání standardního a alternativního testu Daphnia magna Závěr Literatura Seznam zkratek Profil autora Osobní údaje Vzdělání Kurzy, projekty a publikace Přílohy

9 ÚVOD Testy ekotoxicity jsou využívány především při hodnocení nepříznivých účinků škodlivých látek a jejich směsí na životní prostředí, dále pro hodnocení toxicity znečištěných povrchových a podzemních vod, zemin a rovněž pro posuzování nebezpečných vlastností odpadů. V poslední době tyto testy nacházejí rovněž uplatnění při kontrole kontaminovaných území a rizik spojených s přítomností znečišťujících látek. Při hodnocení rizik v určených kontaminovaných územích je nedílnou součástí stanovení koncentrace znečišťujících látek v zasažené lokalitě. Soubory získaných dat z provedených chemických analýz kontaminovaných matric jsou následně porovnávány s maximálními reziduálními limity, pokud již byly pro sledovaný kontaminant určeny. Na základě komplexního zhodnocení celého území je následně rozhodováno o provedení nápravných opatření a cílových maximálních limitech. Cílové limity jsou určovány především zbytkovými koncentracemi stanovených polutantů v zemině, případně v podzemní vodě nebo v půdním vzduchu. Hodnocení rizika kontaminovaného území ve vztahu k ekologickým receptorům (půdním nebo vodním mikroorganismům) je velmi důležité, protože se převážně hodnotí směs látek, kterou nelze přesně a jednoznačně popsat chemickou analýzou. Bylo prokázáno, že biologická využitelnost chemických látek receptory, jakými jsou například půdní nebo vodní mikroorganismy, může být ovlivňována vazbou látek na pevné částice zeminy a je závislá na vlastnostech půdy, případně na vlastnostech akvatického prostředí. Kromě toho musíme uvažovat také o tom, že rychlost a rozsah, v jakém je chemická látka uvolňována z půdy do vodné fáze nebo do ovzduší, se může měnit s časem. Celková koncentrace kontaminantu v půdě proto nemůže poskytnout přesnou informaci o ekologickém riziku. Pokud však jsou použity ekotoxikologické testy v kombinaci s chemickou analýzou, je možné lépe definovat sanační limity. V současné době existuje velké množství testů toxicity využívajících nejrůznější indikátorové organismy. Z hlediska použití mají pro posouzení ekotoxicity kontaminovaných zemin nebo vod výhodu zejména ty testy, které umožňují přímé stanovení toxických účinků na půdní nebo vodní prostředí. Z dosud publikovaných výsledků získaných pomocí jednotlivých testů ekotoxicity je zřejmé, že máme k dispozici dostatek testů s vysokou vypovídající schopností, vhodných pro hodnocení nebezpečných vlastností toxikantů působících na složky životního prostředí. Z těchto publikovaných dat je rovněž patrné, že pro dokonalé hodnocení nebezpečných vlastností je zapotřebí používat větší soubor vhodných testů, protože prostřednictvím jednoho testu nelze postihnout veškeré rizikové faktory působící na daný ekosystém. 9

10 1. TEORETICKÁ ČÁST 1.1 Ekotoxikologie Vědní disciplína ekotoxikologie je poměrně mladým vědním oborem, který stojí na hranici mezi obory environmentální chemie, toxikologie, ekologie a biologie. Je důležitou mezioborovou vědní disciplínou zabývající se posuzováním stavu životního prostředí a vlivu lidské činnosti na životní prostředí. Zatím nejpodrobněji rozpracovaná část se týká expozice a následné intoxikace živých organismů ve vodním (akvatickém) prostředí, která byla dříve označovaná termínem hydrotoxikologie. Zabývá se především studiem a hodnocením vlivu škodlivých látek na volně žijící organismy v jejich prostředí, případně působením škodlivých látek ze životního prostředí na člověka, ať už přímo ze složek prostředí (voda, půda, vzduch), nebo i prostřednictvím přirozených nebo člověkem řízených procesů. Jako o samostatné vědní disciplíně se o ekotoxikologii hovoří teprve od konce 60. let 20. století 3,11. Základním nástrojem ekotoxikologické hodnocení jsou testy toxicity, které slouží ke zjištění nebo odhadu možného toxického vlivu testovaných látek nebo směsných vzorků na živé organismy, v obecnější úrovni také na životní prostředí. Testy toxicity patří mezi experimentální metody, pomocí kterých můžeme určit odpovědi organismu na expozice nebo intoxikace způsobené toxickými látkami 3,11,13. Ekotoxikologie se zabývá především stanovením akutní a chronické toxicity pomocí testů na rybách, korýších a mikroorganismech žijících ve vodním prostředí. Kromě toho se testují toxikologické účinky na ptácích, zvěři, hmyzu a na půdních mikroorganismech. Testy ekotoxicity jsou rovněž předepsány pro hodnocení výluhů z odpadů. Do oblasti ekotoxikologie můžeme zahrnout i tzv. fytotoxikologii, která sleduje nejen působení chemických škodlivin na rostliny, ale především vliv rostlinné buňky na škodlivinu vedoucí k její biotransformační přeměně 13,15,20. Na rozdíl od environmentální chemie, která se soustředí zejména na stanovení obsahu kontaminantů v dané matrici a na následné posouzení jednotlivých účinků sledovaných toxických látek, v rámci ekotoxikologie se posuzují účinky toxických látek na všechny úrovně biologické organizace, tzn. od molekulární úrovně, přes společenstva, až ke komplexním ekosystémům Cílem tohoto vědního oboru je rovněž vyvíjet metody, které umožňují sledovat nepříznivý vliv látek na živé organismy za standardních reprodukovatelných podmínek. Pro možnost porovnání výsledných hodnot testů toxicity, které pocházejí z různých laboratoří, případně na hodnocení negativních účinků různých kontaminantů, jsou jednotlivé metody testů toxicity standardizovány na mezinárodní úrovni. Standardizaci provádí mezinárodní organizace ISO (International Organization for Standardization) a OECD (Organization for Economical Cooperation of Development) 3,25. Důležité je konstatování, že bez ekotoxikologických hodnocení není možné vytvořit žádný vypovídající ekologický program. Znalost působení škodlivin na ekotoxikologické úrovni je prvním předpokladem k vytvoření potřebné základny pro plánovanou ochranu životního prostředí 23, Historický vývoj ekotoxikologie Termín ekotoxikologie byl poprvé použit v roce 1969 Truhautem, který ekotoxikologii definoval jako vědu, která zkoumá účinky jedu na jednotlivý organismus, sleduje ekologické 10

11 dopady polutantů a následně také vlivy na populace a společenstva (nehumánní toxikologie). Později bylo prezentováno několik dalších definic ekotoxikologie: Cairnsen ji popsal jako metodu testování toxicity škodlivých látek na jednu nebo více složek ekosystému, Newman do své definice ekotoxikologie, zaměřené na posouzení dopadů znečišťujících látek na biosféru, zahrnul i člověka. V roce 1988 ekotoxikologii ještě definoval Moriarty, podle kterého byla ekotoxikologie definována jako věda, jejímž cílem je studovat, monitorovat a předpovídat osud a vlivy cizorodých látek vyskytujících se v různých složkách životního prostředí 3. Testy toxicity jsou v určité podobě prováděny již po staletí, přičemž v lékařské praxi se o testování toxicity začalo intenzivně hovořit již od 17. století. I když byly testy toxicity prováděny na různých organismech, vždy byla snaha získané informace vztahovat prioritně na člověka. Počátky pozorování dopadů lidské činnosti na životní prostředí se objevují v období průmyslové revoluce, tj. přibližně kolem roku Teprve až v 60. letech 20. století se začaly popisovat toxické účinky chemických látek na jednotlivé složky životního prostředí. Byly vyvíjeny metody, které umožnily popsat toxické účinky člověkem vyráběných látek na životní prostředí a zejména na organismy v něm žijící. Jedním z prvních odborníků zkoumajících z tohoto hlediska vodní ekosystémy byl Forbes. První test akutní toxicity provedli v roce 1863 Penny a Adams a potom v roce 1885 Weigelt, Saare a Schwab, kteří posuzovali negativní dopady průmyslové odpadní vody na vodní ekosystém. První standardní metoda pro posouzení ekotoxicity vodních ekosystémů byla publikována Hartem v roce 1945; následně byla tato metoda přijata společností American Society for Trstiny and Materials 3,13. K vyčlenění ekotoxikologie z klasické toxikologie přispěla v roce 1962 také publikace knihy s názvem Mlčící jaro, která byla vydána americkou bioložkou Rachel Carsonovou. Autorka ve svém díle rozvíjí myšlenku totální katastrofy, k níž by mohlo vést další neuvážené používání pesticidů. Tato kniha vzburcovala veřejné mínění a má značnou zásluhu na tom, že se ochrana životního prostředí začala stávat masovějším hnutím 24,85. V 80. letech bylo prezentováno velké množství dalších metod umožňujících testování toxicity na vodních organismech, s cílem odhadnout účinky chemických látek na vodní ekosystémy. Jednalo se o konkrétní jednodruhové testy toxicity. S rozvojem poznatků o komplexnosti možných účinků environmentálních polutantů začaly být vyvíjeny především metody hodnocení na úrovni společenstev. Sledování změn v četnosti jedinců jednotlivých druhů bylo významné pro hodnocení reálného environmentálního rizika a představovalo mnohem citlivější parametr pro posouzení možných nepříznivých účinků, než pouhé sledování mortality jedinců jednoho druhu 3,24,85. V posledním desetiletí se zvyšuje zájem o posuzování ekotoxicity odpadů a využití testů toxicity pro hodnocení rizika starých ekologických zátěží. Rovněž vznikla potřeba získat dostatek informací o rizicích spojených s novými chemikáliemi a s úniky látek do životního prostředí. Příkladem může být Protokol o perzistentních organických znečišťujících látkách, který náleží k mezinárodní Úmluvě o dálkovém znečišťování ovzduší přecházejícím hranice států z roku 1979 a byl ratifikován ES v r Dalším příkladem může být Stockholmská úmluva o perzistentních organických znečišťujících látkách z téhož roku, jejímž cílem je omezovat, snižovat nebo vylučovat vypouštění, emise a ztráty perzistentních organických znečišťujících látek, které mají prokazatelné nepříznivé účinky na lidské zdraví nebo na životní prostředí, a to v důsledku dálkového přenosu ovzduším přes hranice států. Dalším důležitým dokumentem je nařízení EP a Rady ES č. 166/2006 z ledna roku 2006, kterým se 11

12 zřizuje Evropský registr úniků a přenosů znečišťujících látek, který bude představovat veřejně přístupnou databázi úniků znečišťujících látek do ovzduší, vody a půdy a informace o přenosech odpadů a znečišťujících látek v odpadních vodách i informace o únicích znečišťujících látek pocházejících z rozptýlených zdrojů 3, Toxicita Toxicita je definována jako účinek cizorodých látek na vodní společenstva organismů (rostlin a živočichů). Bez lidského zásahu se však v přirozených biotopech, a to působením meziproduktů rozkladu těl organismů, např. amoniaku, methanu, oxidu uhličitého a sulfanu, projevuje přirozená toxicita 16,48. V průmyslových odpadních vodách se často nachází toxické látky, které v lepším případě brzdí životní pochody a v horším případě organismy usmrcují. Existují i jiné způsoby projevu toxicity na biotopech a její vliv na chování organismů. Z tohoto pohledu vyplývá možnost hodnocení toxicity podle situace v terénu, a to z pohledu biologa. Znalec sledované lokality zaznamená jako prvotní varovný signál možné přítomnosti toxické látky redukcí počtu druhů (druhový deficit). Množství organismů v příslušné lokalitě je podstatně nižší, případně se snižuje počet jedinců v rámci druhu. Při studiu reprodukčního cyklu organismů můžeme zaznamenat zvýšený výskyt rozmnožovacích částic, spor, cyst nebo jiných encystovaných a trvalých útvarů. Organismy dlouhodobě vystavené toxické látce mají v orgánech nebo po těle vytvořené teratologické útvary, navíc se u řady živočichů se dostavují navíc dýchací potíže a křeče 16,47,48. Toxicita látek, přípravků, pevných odpadů, případně komunálních a průmyslových odpadních vod, je ovlivněna jejich rozpustností ve vodě, ph, chemickým složením, citlivostí vodních organismů a v neposlední řadě i charakterem vodního prostředí. Podle rychlosti působení látky na organismy navíc rozlišujeme toxicitu akutní a chronickou. Při akutní toxicitě se toxický účinek projevuje velmi rychle, řádově po několika hodinách i minutách. Při chronické toxicitě se účinek projeví po delší době, nejdříve po týdnech, měsících až rocích. Zatímco při akutní toxicitě je ovlivněn přímo jí vystavený organismus, u chronické toxicity se její projevy zjišťují až na dalších vývojových generacích (problémy s plodností, degenerace sledovaná u potomků). Tzv. vodohospodářská toxikologie je zaměřena na akutní toxicitu a využívá zejména testy akutní toxicity. Chronická toxicita má význam zejména pro pitné vody, a to z hlediska stanovení minimálních povolených koncentrací a nejvyšších přípustných koncentrací látek přítomných ve vodě z důvodu dodržení požadavků pro chov ryb. Nejvyšší přípustná koncentrace (NPK) je koncentrace látky a jejích metabolitů ve vodách, která při stálém působení nevyvolá negativní účinky na hydrochemický režim recipientů a rovněž na mikroorganismy, primární produkci recipientů, planktonní potravní organismy a ryby. Pro stanovení NPK je důležité nejprve provést testy akutní toxicity a navíc test detoxikace. Přechodnou kategorií mezi testy akutní a chronické toxicity jsou testy subchronické toxicity, založené na hodnocení fyziologických projevů a růstu s obdržením výsledků v krátké době (během 5 až 7 dní) 16,47, Ekotoxicita Ekotoxicita je jednou ze základních charakteristik chemických látek, přípravků a odpadů. Povinnost hodnotit ji je v České republice i v Evropské unii dána legislativou (Zákon č. 157/198 Sb. O chemických látkách a chemických přípravcích ve znění Zákona 12

13 č. 356/2003 Sb.; Zákon č. 326/2004 Sb. O rostlinolékařské péči a Zákon o odpadech č. 185/2001 Sb., ve znění Zákona č. 314/2006) 6,24. V legislativě platné v České republice byl pojem ekotoxicita také zaveden pro oblast hodnocení nebezpečnosti odpadů (vyhláška č. 376/2001 ve znění vyhlášky č. 502/2004). Nebezpečnou vlastnost označenou kódem H14 (ekotoxicitu) mají odpady, které představují nebo mohou představovat akutní nebo pozdní nebezpečí pro jednu nebo více složek životního prostředí 6,24. Jako nebezpečný se hodnotí odpad, jehož vodný výluh vykazuje ve zkouškách akutní toxicity, uvedených v bodě 7 přílohy č. 3, alespoň pro jeden testovaný organismus hodnoty LC(EC, IC) ml.l -1, a to při předem stanovené době působení testovaného odpadu na testovací organismus. Testovanými organismy při hodnocení odpadů jsou: Poecilia reticulata nebo Brachydanio rerio (doba působení 96 hodin) Daphnia magna (doba působení 48 hodin) Raphidocelis subcapitata (Selenastrum capricornutum) nebo Scenedesmus subspicatus (doba působení 72 hodin) Semeno Sinapis alba (doba působení 72 hodin) 6,24, Jestliže se prostřednictvím těchto čtyř testů neprokáží toxické účinky na testovací organismy, je testovaná látka hodnocena jako negativní ve vlastnosti ekotoxicita. V případě, že látka nebo testovaný vzorek vykazují toxické účinky, byť jen na jednom z testovacích organismů, je nutno ji považovat za ekotoxicky pozitivní 6,24. Toxicita látek vůči životnímu prostředí se nedá hodnotit jednoduchou kvantifikovatelnou veličinou. Nelze proto stanovit hodnoty ekotoxicity dvou látek a vzájemně je porovnat. Testované látky jsou na základě provedených testů buď negativní, nebo pozitivní ve vlastnosti ekotoxicita. Jak již bylo prezentováno, ekotoxicita se pouze hodnotí a posuzuje, a to na základě souboru biotestů s organismy různých trofických úrovní; přímo se neměří 6, Rozdělení a použití ekotoxikologických testů Biotest je definovaný jako zkouška využívající biologický systém, který zahrnuje expozici organismu testovaným materiálem a stanovuje odpověď tohoto organismu. Ekotoxikologické testy sledují reakce, při kterých je určený, často jednoduchý organismus s dobře známými životními projevy, tj. stavbou těla a fyziologií, vystaven v uměle připraveném prostředí známé koncentraci definované látky, případně také v případě, pokud je daný organismus vystaven působení neznámého prostředí. Z reakce organismu se usuzuje na rizika plynoucí z expozice sledovanými známými nebo neznámými noxy pro volně žijící populace téhož nebo jiného organismu, popřípadě se výsledky testů extrapolují na člověka 3,6,7. Jinak řečeno, biotesty jsou takové testy, které pro stanovení sledovaného jevu využívají relevantní detekční systémy (organismy, tkáně apod.), které umožňují interpretaci získaných výsledků a mají dostatečnou výpovědní hodnotu pro sledované ekosystémy nebo matrice (vodní, půdní ekosystémy, chemické látky, odpady apod.). Z tohoto popisu je zřejmé, že například nebezpečné vlastnosti odpadů, popisované v Zákoně o odpadech, zejména akutní toxicita, případně tzv. pozdní účinek (embryotoxicita, mutagenita, teratogenita apod.), jsou cíleny především ve vztahu k člověku, nikoliv k životnímu prostředí, a proto je nelze zařazovat mezi klasické ekotoxikologické biotesty. Proto je v zákonech a normách uváděna 13

14 ekotoxicita zvlášť a vždy by měla jednoznačně sledovat a definovat účinky testované substance na úrovni producentů, konzumentů a destruentů, protože ekosystém si lze představit jako jakýsi řetězec. Znamená to, že pokud praskne jeden jediný článek tohoto řetězce, řetězec není funkční a ekosystém je poškozený. Kdybychom například testovali insekticid pomocí jediného testu, například na bakteriích nebo na řasách, pravděpodobně nestanovíme komplexně jeho toxické účinky. Je zřejmé, že pokud by na základě tohoto posouzení vznikl závěr, že vzorek je netoxický, je tento závěr nesprávný, protože byla opomenuta skupina konzumentů 3,6,7. Ekotoxikologické testy můžeme rozdělit podle několika hledisek: Podle doby expozice Testy akutní toxicity Testy akutní toxicity jsou krátkodobé testy popisující účinky toxických látek na vodní organismy během krátké doby. Hodnotí se účinky v periodě 24 až 72 nebo 96 hodin. U těchto testů se stanovuje mortalita (úmrtnost), která je vyjádřená jako LC50, tj. letální koncentrace stanovené dávky, která způsobí akutní úhyn 50 % testovacích organismů v testech na rybách. Dále se stanovuje EC50 nebo IC50. EC50 je efektivní koncentrace, která způsobí úhyn nebo imobilizaci 50 % testovacích organismů a provádí se na zástupcích zooplanktonu. Další důležitou hodnotou v posuzování akutní toxicity je inhibiční koncentrace IC50, pomocí které se prokazuje, že koncentrace způsobí 50% inhibici růstu nebo růstové rychlosti řasové kultury, nebo 50% inhibici růstu kořene Sinapis alba v porovnání s kontrolou Testy subakutní toxicity Subakutní účinek je vyvolaný podáním mnohonásobně menšího množství škodliviny než u akutní toxicity, avšak organismus je tomuto účinku vystaven po delší dobu. Testovacím organismům je toxická látka podávána opakovaně, obvykle jednou denně. Zpravidla to bývá v časovém rozmezí dní. Cílem subakutních testů je zjistit kumulativní účinek testované látky, který je potřebný k odhalení a k popsání hlavních příznaků otravy a k získání hodnot NOAEL a LOAEL. Nemusí však být odhaleny následky dlouhodobého působení. K tomu slouží testy chronické. Výsledky subchronických testů jsou velmi užitečné také pro účelné navržení chronického testu Testy chronické toxicity Tyto testy představují studium účinků testované látky, která je opakovaně podávána dlouhodobě, zpravidla déle než tři měsíce. Negativní vliv toxické látky je patrný až na dalších vývojových stádiích, generacích a potomcích, dále na snížení porodnosti, případně se rovněž projevuje výskytem degenerativních útvarů a možným přenosem dědičných vad a chorob u testovaných jedinců. Pomocí těchto testů se zjišťují kumulační, mutagenní, karcinogenní a teratogenní vlastnosti látek. Testy se provádí zejména na řasách a vodních korýších. Poskytují informace nutné ke stanovení hodnot NOAEL (No Observed Averse Effect Level) a LOAEL (Lowest Observed Averse Effect Level). NOAEL je nejvyšší hodnota dávky (koncentrace) bez pozorovaného nepříznivého účinku a LOAEL nejnižší dávka nebo koncentrace spojená s pozorovaným nepříznivým účinkem

15 1.2.2 Podle pokročilosti designu testovacího systému Testy I. Generace První generace testů je představována klasickými, standardními a konvenčními metodami, které jsou založené na akutních testech toxicity, a to zejména na organismech chovaných v laboratorních podmínkách a na udržovaných kulturách; příkladem jsou ryby druhu Poecilia reticulata (živorodka duhová) a Brachydanio rerio (danio pruhovaný), korýši Daphnia magna (hrotnatka obecná), chlorokokální řasy druhů Scenedesmus quadricauda a Scenedesmus subspicatus, semena klíčících kulturních rostlin Sinapsis alba (hořčice bílá) a Lactaca sativa (salát setý) 5,13. Základem pro provádění těchto testů je příprava vodného výluhu a zásobních roztoků solí, chovy testovacích organismů a zajištění sterilního laboratorního zařízení s potřebným vybavením 6. Jednotlivé testy byly standardizovány na mezinárodní úrovni. Toto umožnilo porovnání výsledků z různých laboratoří a z různých zemí. Standardizaci provádí ISO (International organization for Standardization) a OECD (Organization for Economic Cooperation if Development) 13,14. Mezi výhody standardních testů patří jejich opakovatelnost a při dodržování stejného pracovního postupu i srovnatelnost s výsledky pocházejících z jiných laboratoří. Ověřováním a porovnáváním výsledků pocházejících z více laboratoří získáme, a to pomocí testů způsobilosti laboratoří, tzv. validovaný postup pro příslušný biotest. Mezi hlavní nevýhody biotestů, a to v porovnání s exaktními metodami environmentální analýzy, patří jejich omezená vypovídací hodnota, omezený počet standardizovaných postupů a rovněž finanční náročnost, protože kultury testovacích organismů je nutné dlouhodobě udržovat 6,15, Testy II. Generace Druhá generace testů toxicity, která se začíná stále více používat, představuje alternativní biotesty, které jsou známé pod názvem mikrobiotesty. Testovanými organismy využívanými v mikrobiotestech mohou být bakterie, prvoci, řasy, bezobratlí, rybí tkáňové kultury apod. Tyto testy využívají klidová stádia těchto organismů. V případě testů na bezobratlých se používají tkáňové kultury a jikry, v testech na bakteriích se používají jejich lyofilizované kultury a v řasových testech imobilizované a hluboce zmražené řasové kultury. Nověji je původní test na klíčících rostlinách nahrazován testem na kalusu, což je tkáňová kultura nediferenciovaných buněk 6, Testy III. a IV. Generace Využití třetí generace ekotoxikologických testů, které jsou založeny na použití biosenzorů, případně biomarkerů, je v současnosti ve stádiu ověřování. Tyto testy jsou založeny na fluorescenčním značení toxické látky. Jejich uplatnění se očekává v on-line monitorovacích systémech a screeningových testech toxicity (testy IV. generace) 6,7, Rozdělení testů podle trofických úrovní testovaných organismů Protože není možné testovat látky na všech používaných organismech, jsou z každé trofické úrovně vybráni reprezentativní zástupci a výsledky na nich provedených testů jsou 15

16 extrapolovány na ostatní rostlinné nebo živočišné druhy dané úrovně. Podle trofických úrovní testovaných organismů se používá rozdělení na pět základních úrovní 19, První trofická úroveň Jako zástupci první trofické úrovně se obvykle používají planktonní sladkovodní řasy Selenastrum capricornutum, Desmnodesmus subspicatus a Chorella vulgaris. Tyto řasy byly vybrány především z důvodu jejich rychlého růstu a snadného pěstování. Jedná se o test, který zahrnuje inkubaci řas po dobu 72 hodin, přičemž se vždy jedenkrát za 24 hodin změří hustota buněk. Vyhodnocuje se inhibice 72h IC50 13,19, Druhá trofická úroveň Z této trofické úrovně jsou pro ekotoxikologické testy nejčastěji používáni sladkovodní korýši Dapfnia magna (perloočky) pro sladkovodní akvatické systémy, pro mořské akvatické systémy potom Artemia salina (žábronožky) 19, Třetí trofická úroveň Testy ekotoxicity se na zástupcích třetí trofické úrovně zpravidla neprovádějí. Při posuzování se přitom vychází ze zjištění, že účinky látek na zástupce této trofické úrovně jsou stejné, případně velmi podobné účinkům na určité zástupce ze čtvrté trofické úrovně. Toto tvrzení však nebude platit bez výjimky, neboť rozmanitost druhů je, stejně jako ve všech ostatních úrovních, obrovská. Jako příklad lze uvést pavouky Araneida (zástupci třetí trofické úrovně) živící se perloočkami a pavouky Portia (zástupce čtvrté trofické úrovně), jejichž potravou jsou jiní pavouci. Jelikož se v obou případech jedná o pavouky, dá se předpokládat obdobná reakce na testované toxické látky 19, Čtvrtá trofická úroveň Tato trofická úroveň je reprezentována především rybami. Nejčastěji je využíván Salmo gairdneri (pstruh duhový), což je velmi citlivý druh, náročný především na čistotu vody a její okysličelnost, Poecilia reticulata (živorodka duhová) nebo Brachydanio rerio (danio pruhované) 19, Pátá trofická úroveň Kvartérní konzumenti jsou na samém konci potravního řetězce, nepočítáme-li sem také člověka. Proto jsou, a to především z důvodu bioakumulace, nejvíce ohroženi. Problém zástupců této trofické úrovně spočívá především v tom, že mnoho z nich patří mezi druhy ohrožené, což je převážně způsobeno dopadem negativní lidské činnosti, a z tohoto hlediska jsou velmi vzácní. Je proto nemožné jejich použití k ekotoxikologickým testům. Mezi nejvíce ohroženou skupinu páté trofické úrovně patří dravci, například Falco peregrinus (sokol stěhovavý). K toxikologickým testům byla proto vybrána jako náhrada dravců křepelka (Colinus virgianus). Není to sice dravec, avšak její metabolismus a citlivost k toxickým látkám je téměř srovnatelný s dravci 19,20. Kromě již zmíněných testů se dále provádí testy na vyšších cévnatých rostlinách. Pro testy toxicity se používá především Sinapsis alba (hořčice setá), Lepidium sativum (řeřicha setá), Raphanus sativa (ředkvička setá), Lactura sativa (salát hlávkový), Allium cepa (cibule), a mnoho dalších 19,20. 16

17 1.2.4 Rozdělení biotestů podle prostředí Na podkladě tohoto rozdělení posuzujeme testy akvatické a terestrické. Je známo, že základní charakteristika obou typů testů prováděných v akvatickém i v terestrickém prostředí je podobná, avšak pro každý typ existují i různá specifika Akvatické testy toxicity Akvatické testy byly pro sledování ekotoxicity použity jako vůbec první (testy odpadních vod), a proto jsou také nejvíce rozšířeny. Zahrnují všechny významné skupiny organismů všech trofických úrovní. Při aplikaci akvatických testů dochází obvykle k expozici celých organismů, ať už jde o příjem povrchem těla, dýchacím aparátem nebo potravou 13,19. Akvatické testy je možné dále rozdělit, například podle uspořádání expozice, a to na statické, statické s obměnou média, tzv. semistatické, necirkulační a průtočné. Při statických akvatických testech nedochází k výměně roztoků a proto jsou zde možné změny koncentrací a kyslíku. Při statických testech s obměnou média se tato obměna provádí v definovaných časech, například jednou za 24 hodin. Technicky náročnější jsou z důvodu recirkulace média tzv. necirkulační testy. Kontinuální udržování koncentrací je technicky značně náročné a je součástí provádění průtočných akvatických testů 13,21. Mezi popisované testy patří především testy prováděné za pomocí vodních výluhů z posuzovaných matric, které mají modelovat reálné situace nastávající ve volné přírodě (splachy, vymývání, déšť apod.). Novější studie však naznačují, že pro objektivní posouzení ekotoxicity je testování pouze vodního výluhu nedostačující; proto je zapotřebí tyto metody rozšířit o tzv. terestrické testy toxicity, při kterých se testovaná látka dostává do přímého styku s organismem 20, Terestrické testy toxicity Mezi terestrické testy se zařazují především testy aplikované v půdách a sedimentech. Mezi nejčastější testované organismy patří bakterie a bezobratlí. Testy probíhají tak, že při něm dochází k přímému kontaktu celého těla testovaného organismu s hodnocenou látkou, tzv. solid phase tests. Rostliny mají kontakt s látkami přes kořeny, který je možný jak pomocí pevného, tak také kapalného média. Možná je rovněž expozice plynnými polutanty z ovzduší. Jinou možností provádění terestrických testů u živočichů je dávkování testovaných látek do potravy, dále gaváž, což je aplikace přímo do žaludku nebo injekční aplikace. Využívá se také uzavřených cel, kde dochází k inhalaci kontaminovaného vzduchu 20,22. Terestrickým metodám je věnována značná pozornost, zejména v zahraničí, avšak jen málokterý z těchto testů je legislativně využíván. Například hodnocení nebezpečných vlastností odpadů (podle Basilejské úmluvy) se u nás stále hodnotí na základě vodného výluhu; avšak snahou všech států vázaných Basilejskou úmluvou je rozšířit tyto metody rovněž o metody terestrické 20, Další možné dělení ekotoxikologických testů Podle trofické úrovně testovacích organismů - testy na producentech, konzumentech a destruentech Podle testované matrice - testy pro vodu, půdu, vzduch, sedimenty, chemické látky a odpady Podle spektra testovacích organismů jednodruhové (single species), vícedruhové (multi species), s přírodními populacemi i s laboratorními směsmi kultur 17

18 Podle typu testovaného vzorku čisté chemické látky (hydrofilní, hydrofobní, těkavé), směs látek (známých i neznámých), přírodní vzorky (většinou neznámé, směsné, s neznámými interakcemi, což je nejsložitější interpretace) Podle způsobu přípravy vzorku definované koncentrace chemických látek, testování výluhů přírodních vzorků (extrakce organickými rozpouštědly, DMSO, vodou, různé ph, teplota atd.), semipermeabilní membrány, přímé testy (Direkt Tests, Solid Phase Tests, Whole Effluen tec.) Podle stupně komplexnosti detekčního systému od nejjednodušších k nejsložitějším: enzymy, biofondy, buněčné a tkáňové kultury in vitro, intaktní živý organismus, populace, micro/mezo kosmos, terénní experimenty. V tomto směru vývoj ekotoxikologických biotestů pokročil původní definice uznávala pouze vliv látek na živé organismy, dnes s pronikáním 3. generace ekotoxikologických biotestů jsou uznávány pro hodnocení rizik také biotesty na úrovni suborganismální. Podle způsobu vyhodnocování letální efekty (mortalita, imobilizace), subletální efekty (chování organismů např. rychlost a směr pohybu), hodnocení fyziologické aktivity (fytosyntetické asimilace, enzymatická aktivita, efekty na membránách, přírůstky délka kořene, počet buněk v populaci, hmotnost organismu, náchylnost k napadení chorobami, škůdci nebo parazity apod.), reprodukční aktivita, malformace a teratogenita atd. Speciální testy pro hodnocení rizik v životním prostředí v určitých, jasně definovaných případech, kdy je pro konkrétní interpretaci nutno stanovit jiné, než běžné (toxické, letální) efekty na testovací organismus, máme k dispozici řadu speciálních biotestů pro stanovení např. těchto parametrů: trofie, mutagenita/genotoxicita nejen na bakteriích, ale také na rostlinách, volně žijících zvířatech a rybách, teratogenita, např. na obojživelnících Xenopus laevis, embryotoxicita a reprodukční testy na rybách, korýších, obojživelnících, ptácích apod. Další biotesty tento přehled je směřován na ekotoxikologické biotesty. Biokoncentrace/bioakumulace a testy pro hodnocení biodegradability nepatří mezi ekotoxikologické biotesty ve smyslu stanovení toxických a letálních efektů v původním významu, avšak patří mezi biotesty ekotoxikologického hodnocení chemických látek i látek přírodních a odpadních matric Obecný postup při provádění testů toxicity Předúprava vzorku Jedná se o úpravu vzorků za účelem snadnějšího provedení biotestu. Obvykle je zapotřebí volit způsob předúpravy vzorku s ohledem na stanovovanou látku, protože již předúprava může zásadně ovlivnit výsledek testu. Nejjednodušší způsob přípravy vyžadují jednoduché chemické látky nebo jejich sloučeniny, u kterých tento proces představuje pouze přípravu vhodně zvolené koncentrační řady. Dalším způsobem úpravy může být úprava tepelná, aby byla dosažena teplota požadovaná metodami daných testů. Probublávání vzduchem je způsob úpravy, který se provádí z důvodu odstranění přebytečného chloru v ředící vodě a také pro zabezpečení dostatečného množství kyslíku, jsou-li testy prováděny na organismech akvatického ekosystému. Dosažení požadované hodnoty ph testovaného roztoku se provádí pomocí roztoků NaOH nebo HCl. Tento postup je nedílnou součástí úpravy vzorků před jejich vlastním testováním. Mnohem složitější předúpravu vzorku vyžaduje testování odpadů 18

19 pomocí standardně připraveného vodního výluhu, kdy se odpad kontinuálně vytřepává spolu s deionizovanou vodou, a to v poměru 100 g na 900 ml vody po dobu 24 hodin způsobem hlava pata ; přesně podle metodického pokynu Ministerstva životního prostředí vydaného k hodnocení vyluhovatelnosti odpadů. Po oddělení pevné fáze se pracuje s neředěným vodným výluhem; v souladu s metodikou upraveným vodným výluhem se provedou úvodní testy na jednotlivých testovacích organismech akvatického nebo terestrického prostředí daného ekosystému. Provedení testů ekotoxicity se v detailech liší, a to zejména v případě, pokud se jedná o testování ekotoxicity chemických látek a jejich sloučenin rozpustných ve vodě nebo pokud se jedná o testování výluhů z odpadů 6,13,15, Obecný postup při hodnocení vlastnosti ekotoxicita a) Limitní test test se provádí při koncentraci 100 mg.l -1 a zjišťuje se při něm reakce testovacích organismů. Pokud v daném testu nedojde k úhynu žádného testovaného organismu, další testy se již neprovádí. Pokud však alespoň jeden organismus uhyne, zahájí se předběžný test. b) Úvodní test Provádí se s neředěným vodným výluhem z odpadů na testovacích organismech. Test se připravuje protřepáváním deionizované vody s odpadem v poměru 100 g sušiny a 900 ml vody po dobu 24 hodin. Podle získaných výsledků tohoto testu následuje buď ověřovací, nebo předběžný test. c) Ověřovací test V případě testování vodných výluhů z odpadů následuje i po negativním výsledku úvodního testu test ověřovací, který slouží k ověření tohoto negativního výsledku. V případě výsledku pozitivního (úmrtnost organismů je rovna 50 % nebo je vyšší) se provádí test předběžný. Výsledek negativní se ověřuje s nejméně trojnásobným množstvím organismů v porovnání s počtem organismů požadovaných při testech základních a provádí se s neředěným vodním výluhem. d) Předběžný test Účelem tohoto testu je určení rozmezí koncentrací, ve kterém lze očekávat hodnotu EC50 (IC50, LC50) testované látky. Používá se zde zpravidla 10 koncentrací vodného výluhu, volených v širokém rozpětí koncentrací (např. od 0,01 do 100 mg l -1 ), avšak s malým počtem testovacích organismů; např. 3 5 kusů ryb nebo 10 kusů vodních korýšů v každé koncentraci. Cílem je dále zjistit nejvyšší koncentraci látky, při které ještě nedochází k úhynu nebo imobilizaci organismů (OC0) a nejnižší koncentraci, která již působí letálně (OC100). Na základě výsledků předběžného testu se volí užší rozsah koncentrací s předpokládaným účinkem (mortalita, imobilizace a inhibice podle druhu testovaného organismu) pro základní test. e) Základní test Tento test slouží k vlastnímu určení hodnoty EC50 (LC50, IC50). Test se skládá zpravidla ze sedmi různých koncentrací vodného výluhu v rozmezí stanoveném orientačním testem. Ředění se provádí tak, aby kolem předpokládané hodnoty EC50 došlo k úhynu nebo imobilizaci 5 95 % organismů ve třech nebo více ředěních. Jako nejvyšší a nejnižší koncentrace ředící řady se volí limitní koncentrace zjištěná předběžným testem. Pro každou koncentraci se nasazují 2-3 paralelní stanovení. Po 24, 48 nebo 72 hodinách se odečítá počet uhynulých nebo imobilizovaných organismů. Ze zjištěných údajů se potom vypočítá hodnota EC50 6,13,15,26-,28. 19

20 1.2.7 Vyhodnocení výsledků testů a) Test negativní Výsledek ekotoxikologického testu je negativní, jestliže v ověřovacím testu nedojde k překročení 10% imobilizace nebo úhynu ve srovnání s kontrolou. Jestliže v ověřovacím testu uhyne méně než 50 % (ale více než 10 %) testovaných organismů, nelze hodnotu EC50 stanovit a tato skutečnost se uvede do protokolu. b) Test pozitivní Výsledek testu je pozitivní v případě, jestliže testovaná látka způsobuje úhyn nebo imobilizaci větší než 50 %; výsledkem je hodnota EC50, popřípadě i doplňkové hodnoty EC10, EC90, EC50/NOEC 6, Podmínky provádění testů Aby bylo možno porovnávat výsledky testů toxicity získané z různých laboratoří je zapotřebí, aby byla dodržována určitá pravidla a podmínky, což znamená, aby laboratoře postupovaly podle schválených metod. Proto jsou jednotlivé metody testů standardizovány na národní i mezinárodní úrovni. Takto je usnadněno pozdější porovnávání a případné publikování výsledků ekotoxikologických testů. Standardizaci provádí mezinárodní organizace ISO (Internacional Organization for Standardization) a OECD (Organization for Economic Cooperation of Develipment). Při provádění testů toxicity je nutné dodržovat zákon č.77/2006 Sb. na ochranu zvířat proti týrání a Vyhlášky MZe ČR 207/2004 Sb. o ochraně, chovu a využití pokusných zvířat 6, Kontrola Je velmi důležitou součástí každého testu toxicity. Provádí se za stejných podmínek, stejným způsobem a se stejným počtem organismů jako pokus. Kontrolní organismy se však nasazují do ředící vody v nepřítomnosti toxické látky. Kontrolní test slouží k ověření kondice a zdravotního stavu testovaných organismů a k zajištění standardních podmínek testu 6, Ředící voda Ředící voda je voda, která má známé fyzikálně-chemické vlastnosti a její ph je upravováno podle požadavků jednotlivých testů. Tato voda musí vyhovovat fyziologickým potřebám testovaných organismů a nesmí testovací organismus poškodit. Nesmí obsahovat zbytkový chlor, ani rezidua jiných toxických látek a rovněž nesmí ovlivňovat působení testovaných látek. Jedná se o tzv. umělou ředící vodu připravenou podle ČSN EN ISO 7346, případně pitnou vodu zbavenou chloru probubláváním vzduchem po dobu 24 hodin. V případě testů na řasách je ředící vodou standardní živný roztok. Pro testy toxicity na okřehku je ředící vodou živný roztok SIS (Swedish Standard medium) 6, Vnitřní kontrola Jedná se o základní test prováděný v určitých časových intervalech. Testovanou látkou je v tomto případě standard. V České republice i v zahraničí se jako standard obvykle používá dichroman draselný (K 2 Cr 2 O 7, p. a.). Kromě toho se v České republice jako standardy používají také p-nitrofenol nebo heptahydrát síranu zinečnatého (ZnSO 4.7H 2 O p.a.). Provedení testu se standardem a porovnání jeho hodnoty LC50 (IC50, EC50) s obecně platnými hodnotami pak umožňuje laboratoři kontrolu správnosti postupu při provádění příslušného testu i posouzení citlivosti použitých testovacích organismů 6,26. 20

21 Vnější kontrola Vnější kontrola je součástí okružních testů toxicity chemické látky, přípravků nebo výluhů z odpadů. Tyto testy provádí v České republice ASLAB při VÚV TGM v Praze. Laboratoř, která splní požadavky vnější kontroly, získává osvědčení, které přikládá k závěrečným protokolům. Vyšším stupněm kontroly práce v ekotoxikologických laboratořích jsou dva systémy kontroly jakosti, a to akreditační systém podle ČSN EN , který je zatím v našich laboratořích nejvíce využíván. Kvalitu práce laboratoří potvrzuje v tomto případě nezávislá třetí strana, tzv. akreditační orgán, kterým je v České republice ČIA (Český institut pro akreditaci) 6, Přehled standardních testů akutní toxicity V první části přehledu jsou uvedeny v praxi nejpoužívanější standardní testy akutní toxicity, test toxicity na perloočkách, semenech, chlorokokální řase a bakteriích. V druhé části je uveden seznam dalších ve velké míře užívaných testů používaných v praxi Test toxicity na korýši Daphnia magna Metodika používaná při testech na korýších je podle ČSN EN ISO 6341, kterou se zjišťuje inhibice pohyblivosti perlooček. Cílem testu je zjištění vlivu vodou vyluhovatelných látek na mortalitu a imobilizaci drobného korýše Dafnia magna 16. Obr. 1: Dafnia magna 64,65 Požadované koncentrace se připraví ředěním testované látky ředící vodou. Před testem je vhodné vytemperovat vzorky na laboratorní teplotu. Asi 2 hodiny před prováděním testu se doporučuje odlovit mladé dafnie o stáří maximálně 24 hodin od vylíhnutí do nádobky s ředící vodou a nakrmit je kulturou chlorokokální řasy přidané v podobě několika kapek k roztoku. Do každé koncentrace se nasazuje po 10 až 60 kusech dafnií (požadavek 5 ml na jedince); stejným způsobem se nasadí i kontrola. Test probíhá po dobu 48 hodin, při teplotě 20 C ± 2 C, bez aerace, bez osvětlení a bez krmení perlooček. Během testu se zaznamenává chování (imobilizace) a úhyn perlooček za 24 hodin a 48 hodin. Zjištěné hodnoty Ii během 24 a 48 hodin se převedou podle tabulky na pravděpodobnostní (probitové) jednotky a tyto jednotky se spolu s odpovídajícími koncentracemi převedenými na logaritmy použijí pro sestrojení grafu, kde na ose x jsou logaritmy koncentrací a na ose y probitové jednotky. Lineární regresí se zjistí hodnota efektivní koncentrace 48hEC

22 Správnost přípravy pracovních roztoků a použití životaschopných jedinců limituje hranice maximálně 10% mortality nebo imobilizace v kontrolním roztoku Test toxicity na semenech hořčice bílé Sinapis alba. Test byl vyvinut k testování účinku odpadních vod na závlahy. Při této zkoušce se využívá citlivosti klíčících semen hořčice bílé Sinapis alba v počátečních stadiích vývoje rostliny na toxické látky 34. Obr. 2: Sinapis alba 66,67 Test probíhá po dobu 72 hodin, a to při teplotě 20 C ± 2 C, bez osvětlení. Test spočívá v kultivaci semen za standardních podmínek v různých koncentracích toxické látky v Petriho miskách na podložce nasycené pracovním roztokem. Počet semen v jedné koncentraci je 30 kusů, s požadavkem 5 ml roztoku na Petriho misku o průměru 120 až 140 mm. Pro každé ředění se připraví minimálně dvě paralelní stanovení. Do dvou Petriho misek se vloží filtrační papír s připravenými otvory pro umístění semen (dodržení bezpečné vzdálenosti mezi jednotlivými semeny a zajištění tak neomezování jejich klíčení okolními semeny). Před vložením semen se filtrační papír napustí 5 ml testovaného roztoku, stejným způsobem se připraví i kontrola. Pomocí pinzety se do každého otvoru na filtračním papíru vloží rovnoměrně velká, nezdeformovaná, nepoškozená a odlišně zbarvená semena tak, aby jejich počet v jedné misce odpovídal 30. Po 72 hodinách se přesně změří délka kořene každé rostliny u jednotlivých koncentrací. Pro každé ředění se vypočítá aritmetický průměr délky kořenů L v mm z obou paralelních měření a vypočítá se inhibice Iμ (popř. i stimulace, je-li inhibice růstu menší než 0) růstu kořene v toxické látce v porovnání s nasazenou kontrolou 34, I ( Lc Lv ) 100 L c (1) kde I μ je inhibice růstu kořene v %, L c je aritmetický průměr délky kořene v kontrole v mm, L v aritmetický průměr délky kořene v testovaném roztoku v mm 41. Zjištěné hodnoty I i se převedou podle tabulky na pravděpodobnostní (probitové) jednotky; tyto jednotky se spolu s odpovídajícími koncentracemi, převedenými na logaritmy, použijí pro 22

23 sestrojení grafu, kde na ose x jsou logaritmy koncentrací a na osy y probitové jednotky. Lineární regresí se zjistí hodnota inhibiční koncentrace 72hIC50 40, Test toxicity na chlorokokální řase Desmodesmus quadricauda Stanovení inhibice růstu sladkovodních řas Desmodesmus quadricauda, S. subspitatus, Selenastrup capricornutum je standardizována podle metodiky ČSN EN ISO Princip testu spočívá ve stanovení toxického účinku vodou vyluhovatelné látky na inhibici růstu a na rozmnožování chlorokokální řasy v jednotlivých koncentracích sledované látky v porovnání s kontrolami v čistém živném roztoku. Při provádění testu je vhodné zaznamenávat si i odchylky od normálního tvaru buněk. Při testování lze použít kulturu chlorokokální řasy Desmodesmus quadricauda, kmen Greifswald Obr. 3: Desmodesmus quadricauda 68,69 Kmenová kultura se udržuje na šikmém 1,5% agaru ve standardním živném médiu (Knappův roztok nebo roztok dle ISO) v zazátkovaných zkumavkách sterilně uložených v termolumininostatu s osvětlením minimálně 6000 luxů. V případě potřeby se kultura přeočkovává do živného média o objemu cca 100 ml do 250 ml Erlenmayerových baněk, čímž se připraví zásobní inokulační kultura řas, udržovaná za stejných podmínek jako kmenová kultura. Řasové inokulum pro test se odebírá z exponenciálně rostoucí inokulační kultury. Nejprve se zjistí hustota inokulační kultury v počítací komůrce Cyrus I. Po přípravě ředící řady testované látky se ke každé koncentraci i ke kontrole přidá stejný objem řasové suspenze, jejíž množství se zjistí výpočtem 34, 37, Počáteční hustota řasové suspenze by po naočkovaní měla odpovídat počtu cenobií v 1 ml. Cenobium je typ kolonie tvořené pouze dceřinými buňkami, jejichž celkový počet odpovídá mocnině 2 n, v případě řasy Desmodesmus quadricauda je cenobium čtyřbuněčné 34, 37. V c x a kde x je potřebný objem inokula v ml, c je požadovaná hustota řasové kultury na začátku testu v 1 ml (zde cenobií), V je množství testovaného roztoku v ml (zde 50) a hustota inokulační kultury (počet v 1 ml) 41. (2) 23

24 Kultivační baňky se vzorky o objemu 50 ml s inokulem se uzavřou buničitými zátkami a umístí se do termoluminostatu s osvětlením 6000 až luxů a teplotou 27 C ± 2 C. Test probíhá po dobu minimálně 72 hodin; během této doby se vzorek alespoň třikrát denně promíchává. Od počátku až po konec testu se hodnotí růst řasových buněk v nasazených koncentracích s četností jednou denně. Při zvolené delší době expozice se hodnocení provádí řádově ve dvou až čtyřech intervalech. Hustota buněk se zjišťuje pomocí počítací komůrky Cyrus I Na konci testu se z naměřených hodnot zjišťuje růstová rychlost μ, podle rovnice: ln ln t kde N n je počet cenobií v 1ml na konci testu, N 0 je počet cenobií v 1 ml na počátku testu a t n je doba trvání testu ve dnech 41. Také se zjišťuje integrál biomasy A, neboli plochy pod růstovými křivkami, v jednotlivých vzorcích; z těchto hodnot se v porovnání s kontrolní koncentrací stanoví inhibice Iμ a IA. Z obou hodnot inhibice lze stanovit inhibiční koncentraci IC50, u které lze rozlišit způsob výpočtu koeficienty. V případě použití hodnoty Iμ se používá označení IrC50 (index r značí použití hodnoty růstové rychlosti); obdobně se při použití hodnoty IA používá označení IbC50 (index b značí použití hodnoty velikosti vytvořené biomasy). Koncentrace 72hIC50 se stanovuje stejným způsobem, jako v případě předchozích testů, tzn. probitovou regresní analýzou 34, Inhibice Iμ se stanoví podle vztahu: kde Iμ je procento inhibice růstu v %, μc je růstová rychlost v kontrole, μi je růstová rychlost ve sledované koncentraci 41. V případě, kdy je Iμ menší než 0, jedná se o stimulaci růstu. Integrál biomasy A se vypočte podle vztahu: Nn N0 c i 100 N1 N0 t1 N1 N2 2N0 t2 t1 Nn 1 Nn 2N0 ( tn tn 1) A (5) kde Nn je počet cenobií v 1 ml v čase tn, N1 je počet cenobií v 1 ml v čase t1, tn je doba n-tého měření testu od počátku testu 41. Inhibice integrálu biomasy IA se vypočte podle vztahu: I I A c kde IA je inhibice integrálu biomasy v %, Ac je růstová rychlost v kontrole, Ai je rychlost ve sledované koncentraci 41. n Ac Ai 100 A c (3) (4) (6) 24

25 V případě, kdy je IA menší než 0, se jedná o stimulace růstu. Zjištěné inhibice jsou převedeny na probity a vyneseny do grafu na ose y proti logaritmům koncentrací na ose x; lineární regresí je vypočítána hodnota IC50 34,39, Bakteriální bioluminiscenční test toxicity na Vibrio fischeri Metoda je založena na sledování změny luminiscence mořských světélkujících bakterií Vibrio fischeri (Photobacterium phosphoreum), způsobené vystavením toxické látce a zjištěním hodnoty relativní inhibice bioluminiscence H, která se vypočte podle rovnice 7. Tyto bakterie žijí v symbióze s některými mořskými živočichy, pro některé však mohou být patogenní. I H I B (7) kde H je inhibice bioluminiscence v %, I je intenzita světla produkovaného bakteriemi ve zkumavce s testovanou látkou a IB je intenzita světla ve zkumavce se slepým vzorkem 41. Bioluminiscence je produkována větví elektronového řetězce, do kterého jsou zahrnuty oxidoredukční koenzymy a enzym luciferáza. Za přítomnosti kyslíku a aldehydu se tvoří aktivovaný komplex, který po degradaci uvolňuje fotony a intenzita luminiscence odpovídá toxickému vlivu testované látky Obr. 4: Vibrio fischeri 60,61 Bakteriální kultura se používá v podobě lyofilizovaného materiálu. Porovnávacím roztokem je chlorid sodný ve výsledné 2% koncentraci (velmi důležité je dodržení těchto podmínek, protože se jedná o mořské organismy). Test probíhá po dobu 15 minut. K provedení testu se používá luminometr a při stanovení se postupuje podle návodu od výrobce zařízení. Měří se množství emitovaného světla před a po přidání testované látky Vyhodnocení testů Vyhodnocení testů toxicity a zjištění hodnoty efektivní, inhibiční nebo letální koncentrace je založeno na probitové analýze podle Rothencheina, která je analýzou kvartálních dat 34, 37,39 danými relativní četností mrtvých organismů v závislosti na logaritmu koncentrace 25

26 Počet mrtvých jedinců, buněk a velikost biomasy se převede na procento inhibice Ii, IA, nebo Iμ. Procentuální hodnoty inhibic se převedou podle tabulky probitových hodnot na pravděpodobnostní probitové jednotky, které se spolu s odpovídajícími logaritmy koncentrací testovaných vzorků použijí pro sestrojení grafu, kde na ose x jsou logaritmy koncentrací a na ose y probitové jednotky. Regresní křivka se aproximuje distribuční funkcí logaritmického normálního rozdělení. Pomocí lineární regrese se vyjádří rovnice závislosti mezi logaritmem koncentrace a probitem. V softwarové aplikaci Excel se sestrojí graf se znázorněním rovnice lineární regrese. Není-li k dispozici program pro výpočet toxicity a počítačové vybavení, vypočítá se rovnice lineární regrese metodou nejmenších čtverců ve tvaru y = b1 + b2.x. Hodnoty b1 a b2 se vypočítají z rovnic 41 : b b x j y j x j 2 2 n x j x j n x j y j x j 2 2 n x j x j Z rovnice lineární regrese se vypočítá požadovaná hodnota efektivní koncentrace EC50 tak, že za hodnotu y v rovnici se dosadí hodnota probitu 50% inhibice, tj. hodnota 5.00 a z rovnice se vypočítá logaritmus koncentrace x. Odlogaritmováním se získá koncentrace látky v mg.l -1, při které dochází k 50% úmrtnosti nebo inhibici růstu celkového počtu nasazených organismů Statistickým zabezpečením správnosti obdrženého výsledku je udávání konfidenčího intervalu (intervalu spolehlivosti), tj. rozpětí hodnot kolem zjištěné efektivní koncentrace. Dílčí statistické charakteristiky testu jsou rozptyl sr, rozptyl s2 a výběrový rozptyl S2y. Výsledky se doplňují hodnotami EC5, EC95, NOEC, LOEC, TU, popř. poměrem hodnoty EC50 a NOEC, EC50 a LOEC. 2 s y b y b x y R j 1 j 2 2 sr s n sy s 1 n KI EC50 s y j x y j j y 2 x x 2 2 x j n x t n p, EC s t n p 50 j y j (8) (9) kde KI je konfidenční interval na procentuální úrovni α, zde 5%, tj. α = 0.05; p charakterizuje lineární regrese se dvěma členy b1 a b2, tj. p = 2, n = počet měření a t α(n p) je kritická hodnota zjištěná ze statistických tabulek Studentova testu Alternativní biotesty Tyto testy nejsou na rozdíl od standardních biotestů dosud validovány ani schváleny institucemi, které byly již dříve v této souvislosti zmíněny. Jejich výsledky však ve většině případů odpovídají výsledkům standardních testů toxicity a tak je jen otázkou času, kdy budou i tyto testy zařazeny mezi standardní testy. Rostoucí potřeba testovat nové chemické látky ve velkých sériích a posuzovat environmentální matrice vede k rychlému vývoji 26

27 biotestů. Jsou výhodné především pro práci v laboratorních podmínkách, protože zde dochází k jejich miniaturizaci; rovněž umožňují zkrácení doby inkubace a přispívají k celkovému zjednodušení manipulace s používanými organismy 34, 37,41. Alternativní biotesty jsou velmi cenné z hlediska rychlého hodnocení vzorku neznámého složení; požadavek na toto hodnocení může vzniknout např. v důsledku ekologické havárie. V takových případech je velice důležité, aby byla toxicita látky určena v co nejkratším čase. Další výhodou těchto testů je snadná dostupnost organismů, jelikož se uchovávají v klidových stádiích, tj. vajíčka, cysty, ephipia, tkáně, lyofilizované a imobilizované kultury organismů. Jejich oživení je pak velice snadné a rychlé. Testům se někdy říká miniaturizované testy, což je dáno minimálním množstvím objemů potřebných pro testování a také minimálním požadavkem na laboratorní prostory a vybavení 34, 37,39. Nejrozšířenějšími formami mikrobiotestů jsou tzv. toxkity. Jsou to nejrychlejší možné testy toxicity, protože obsahují všechen materiál, včetně testovacích organismů nezbytných k provedení reprodukovatelných testů toxicity. Jejich výhodou je rovněž nejen vysoká citlivost srovnatelná se standardními testy, ale také jejich cenová dostupnost a jednoduchost. Jsou vhodné k vyhodnocování průsakových vod, skládkových vod a výluhů z průmyslových odpadů. Výhodou, která se uvádí u každého toxkitu je určení, pro jakou vodu je daný test určen; např. F pro sladkou, M pro slanou. Nejpoužívanějšími toxkity jsou: Rototoxkit (vířník Brachionus calyciflorus), Thamnotoxkit (korýš Thamnocephalus platyurus), Daphtoxkit (korýš Daphnia pulex, D. magna), Algaltoxkit (řasa Selenastrum capriornutum, syn. Raphidocelis subcapitata) Thamnotoxkit F Testovacím organismem jsou larvy sladkovodního korýše Thamnocephalus platyurus, které se líhnou z cyst. Inkubace probíhá v časovém intervalu hodin při teplotě 25 C za kontinuálního osvětlení 4000 lx. Vylíhlí jedinci se umístí na testovací destičku do různých koncentrací testované látky. Destička se vloží do inkubátoru nastaveného na teplotu 25 C a po uplynutí 24 hodin se stanoví hodnota LC50. Tento postup je ve světě nejvíce používán k posuzování vlivu testovaných matric na životní prostředí. Vhodný je také pro monitorování tuhých odpadů a kalů, hloubkových vrtů, říčních sedimentů, odpadních vod a půd 34, Obr. 5: Thamnocephalus platyurus; thamnotoxkit souprava 51,52 27

28 Tento 24 hodinový alternativní test byl srovnáván s 48 hodinovým standardním testem akutní toxicity s Daphnia magna. Porovnáním párů dat pro 43 čistých chemikálií, 16 výluhů z farmaceutických závodů, 12 domácích a 12 průmyslových odtoků odpadní vody, 63 tuhých odpadů a hloubkových vrtů, kalů a sedimentů, byly nalezeny velmi významné korelační vztahy mezi citlivostmi obou korýšů k testovaným látkám. Ukázalo se tak, že test Thamnotoxkit F může být používán jako alternativa ke konvenčnímu testu s perloočkami. Studie Evropského společenství (Persoone et. Al. 1993b) hodnotila možnosti a limitace použití Thamnotoxkitu F pro rutinní monitoring kontaminovaného životního prostředí. Test je vhodný pro hodnocení tuhých odpadů a kalů, hloubkových vrtů, říčních sedimentů a odpadních vod. Společně s dalšími biotesty byl Thamnotoxkit F aplikován na různé typy přírodních vzorků i v České republice. Kromě výše uvedených typů bylo ověřeno jeho použití i pro extrakty ze zemědělské půdy. Jeho aplikace pro různé typy kapalných vzorků není příliš omezena ani případným zabarvením, protože tito do běla zabarvení korýši jsou dobře viditelní právě proti tmavému pozadí. Thamnocephalus Platyurus zastupuje v trofické hierarchii úroveň konzumentů a díky podobné citlivosti s Daphnia magna je vhodným zástupcem pro testování vzorků z vodních ekosystémů. Jedinou nevýhodou může být to, že se nevyskytuje v prostředí České republiky, což by mohlo znesnadnit interpretaci výsledků při hodnocení našich ekologicky reprezentovatelných druhů v testech toxicity; to se týká i všeobecně nejpoužívanějšího korýše Daphnia magna 34, 37, Daphnotoxkit F magna a pulex Daphnotoxkit používá spící vajíčka korýšů Daphnia magna, Daphnia pulex nebo Ceriodaphnia dubia, které jsou celosvětově používány k testům toxicity. Tato vajíčka jsou chráněna chitinovou skořápkou zvanou ephippium a mohou být skladována po dlouhou dobu bez ztráty životaschopnosti. Když jsou ephippia umístěna do specifických životních podmínek, vyvinou se z nich během tří dní larvy (neonaty), které mohou být přímo použity pro testování 11. Obr. 6: Daphnia magna, Daphnia pulex, Ceriodaphnia dubia 53,54,55 Líhnutí ephippií je započato 3 4 dny před začátkem testu při 20 C a osvětlení lx. Inkubace musí probíhat při teplotě 20 C; po 24 a 48 hodinách se sleduje imobilizace organismů. Testovací destičky jsou přizpůsobeny velikosti organismu, lze testovat 5 koncentrací ve čtyřech opakováních s pěti organismy v jamce. Výsledkem tohoto testu je stanovení 24h EC50 a 48h EC50 (nebo LC 50). Tento test se řídí ISO normou 6341 a OECD direktivou ,42. 28

29 První porovnání Daftoxkitu s konvenčním testem je publikováno v knize o mikrobiotestech (Persone 1996a). Bylo prokázáno, že pro většinu z 19 posuzovaných anorganických a organických chemikálií poskytoval Daphnoxkit F magna nižší hodnoty EC50 než konvenční test. Daphnotoxkit pules byl citlivější k 8 z 19 testovaných chemikálií, a to v porovnání se standardním testem Daphnia magna. Zvýšená citlivost cyst vylíhlých z eppipií je však přisuzována spíše vlivu tvrdosti ředící vody (voda ve standardním testu je tvrdší než voda v toxkitech) než testovacímu organismu jako takovému 37. Litius et. al. (1995) porovnávali citlivost Daphnia magna a Daphnia pulex na 30 referenčních chemikáliích (MEIC); bylo zjištěno, a to na podkladě vysokého korelačního koeficientu, že u těchto dvou druhů dafnií nebyl prokázán podstatný rozdíl. Daphnotoxkit byl prozatím použit pouze k testování několika organických a anorganických látek a také odpadních vod pocházejících z textilního průmyslu. Na podkladě této porovnávací studie lze předpokládat, že jeho využití bude stejně široké jako u předchozích toxkitů a standardního testu toxicity s Daphnia magna 37. Oba druhy dafnií jsou doporučovány jako standardní organismy pro testy toxicity. Daphnia magna je v laboratoři používaná běžně, přestože se od ostatních zooplanktonních druhů liší nejen svou velikostí, ale i životním cyklem a schopností odolávat predaci ryb. Tato fakta vyvolávají mezi odborníky otázku, do jaké míry je Daphnia magna ekologicky reprezentativním druhem organismu pro provádění testů toxicity Vlastnosti, struktura a rozdělení syntetických polymerů V současné době jsou polymery velmi využívanými a důležitými materiály. Jsou to chemické látky obsahující ve svých molekulách především atomy uhlíku, vodíku, kyslíku, dusíku, ale také halogenů, síry a jiných prvků. Synonymem k pojmu polymer je v literatuře často používaný název makromolekulární látka. Základním stavebním kamenem polymerů jsou makromolekuly, které vznikají spojováním molekul nízkomolekulárních látek (monomerní jednotky) chemickými vazbami. Podle typu makromolekul je možné polymery dělit na lineární, větvené a síťované. V určitém stádiu zpracování se polymery nachází v kapalném stavu, který mu dovoluje, a to většinou za zvýšené teploty a tlaku, vymodelovat tvar pro konečný stav; vzniklý polymer je ve většině případů již ve stavu tuhém 1,2,88. Mezi nejdůležitější vlastnosti, které v praxi zajistily syntetickým polymerům pozici cenných materiálů, patří především mechanické, elektrické a optické vlastnosti, v některých případech především také odolnost vůči chemicky agresivnímu prostředí nebo povětrnostnímu stárnutí a další pozitivní vlastnosti. Všechny tyto vlastnosti jsou podmíněny jejich chemickou a fyzikální strukturou, chemickým složením a fázovým stavem 1,2, Chemická a fyzikální struktura Chemická struktura popisovaná v oblasti makromolekulárních látek je následující: Konstituce makromolekul typ a uspořádání strukturních jednotek v makromolekulách. Mezi nejčastější konstituce patří polymery lineární a větvené, dále pak polymery zesíťované a žebříčkovité. Konfigurace makromolekul definuje vzájemné prostorové uspořádání atomů nebo substituentů v makromolekulách. Toto uspořádání je z chemického hlediska trvalé, nelze ho změnit bez přerušení chemické vazby. Uspořádání stereoizomerních center v hlavním řetězci makromolekul se nazývá pojmem takticita; jako taktické se označují polymery mající vysoký stupeň pravidelnosti. 29

30 Konformace makromolekul se dá definovat jako jedno z prostorových uspořádání atomů nebo skupin atomů, které se může změnit v důsledku rotace kolem jednoduchých vazeb při zachování valenčních úhlů. Volná rotace kolem jednoduchých vazeb v makromolekulách je omezována různými interakcemi, případně přitažlivými nebo odpudivými silami. Molární hmotnost polymeru (relativní molekulová hmotnost) patří mezi nejdůležitější veličiny charakterizující daný polymer. Molární hmotností M se rozumí poměr hmotnosti a látkového množství (počtu molů). Její rozměr je kg.mol -1 1,2. Chemická struktura poskytuje informace o izolovaných makromolekulách a předurčuje možnosti vzájemného uspořádání jednotlivých makromolekul, tj. fyzikální strukturu polymerů. Mezi základní vlastnosti úzce související s fyzikální strukturou polymeru patří především velice rozmanitý vzhled a mechanické vlastnosti. Například fólie různých polymerů o stejné tloušťce mohou být průsvitné, mléčně zakalené (polyethylen), nebo zcela transparentní (polyethylentereftalát), křehké (polystyren), případně se mohou vyznačovat vysokou pevností. Kromě chemické struktury mají vliv na fyzikální strukturu polymeru také vnější podmínky působící na polymer. Jednou z dalších důležitých vlastností je fázový stav makromolekul 1, Fázový stav Značně vysoká molekulová hmotnost polymerů způsobuje, že jejich bod varu je neobyčejně vysoký a nachází se ve všech případech nad teplotou jejich rozkladu. Plynný stav polymerů neexistuje. Polymery mohou existovat ve čtyřech různých fázových stavech: Krystalickém (vysoce uspořádaný stav) Amorfním sklovitém (prakticky neuspořádaný stav) Amorfním kaučukovitém (stav přechodový) Amorfním plastickém (kapalném) látku lze poměrně malou silou deformovat do neobvyklé míry; při deformaci nedochází k nevratnému toku, takže ji nelze definovat ani jako pevnou látku ani jako kapalinu. O tom, ve kterém z těchto stavů se polymer za běžných podmínek nachází a jak široké je teplotní rozmezí existence těchto jeho stavů, rozhoduje především chemické složení a molekulová hmotnost polymeru 1, Monomery Monomer je chemická sloučenina, která je tvořená molekulami, z nichž každá může poskytnout jednu nebo více konstitučních jednotek, tj. atomů nebo skupin atomů, které jsou přítomné v molekulách polymeru nebo oligomeru 1. Látky schopné vytvářet polymery jsou sloučeniny C, H, O, N, S, P, halogenidů a Si. Ve speciálních případech i jiných prvků (B, některé kovy). Páteř lineárních makromolekul a také základ skeletu trojrozměrných sítí makromolekul je schopno vytvářet z hořejšího souboru atomů jen několik druhů, tj. C, O, N, S, P, Si, (B). Tyto prvky, včetně ostatních jmenovaných, mohou být samozřejmě i součástí substituentů vázaných na základní skelet 1,89,90. Monomery se nejčastěji rozdělují podle klasifikace organické sloučeniny, převládajícího použití připravených polymerů (pryskyřice, elastomery, aj.), způsobu výroby nebo podle iniciace polymerizace. Monomery se mohou klasifikovat rovněž podle své polarity, 30

31 a to na monomery rozpustné ve vodě (butadien nebo styren), monomery ve vodě rozpustné jen částečně, jejichž polymery jsou ve vodě nerozpustné (akrylonitril), monomery částečně rozpustné ve vodě, jejichž polymery jsou rozpustné ve vodě (vinylacetát) a monomery, které jsou ve vodě zcela rozpustné a jejichž polymery i kopolymery jsou ve vodě buď také rozpustné, nebo v ní bobtnají (akrylová a metakrylová kyselina). Nejvhodnějším způsobem rozdělením monomerů je však dělení podle jejich procesu řetězení, kterým vznikají příslušné polymery 70,89,90. Z chemického hlediska mohou být monomery alkeny, dieny konjugované i nekonjugované, prosté i substituované (vinylové, vinylidenové sloučeniny), alkiny, cyklické alkeny, cyklické konjugované i nekonjugované dieny, ve speciálních případech také cykloalkany, heterocykly aj Nejjednodušším a nejčastěji využívaným monomerem je ethylen a jeho deriváty, dále vinylové monomery (styren, vinylchlorid, vinylestery, kyselina akrylová a její deriváty), propen, buteny a butadien (prosté i substituované); nejjednodušší heterocykly (oxiran), případně formaldehyd. Speciálnější charakter už mají heterocykly s větším počtem cyklů a substituentů (oxetan, tetrahydrofuran) a také monomery silikonové (substituované cyklotrinebo cyklotetrasiloxany), fosfazeny a mnoho dalších 1,70,92,93. Odpady z výroby polymerů představují velký problém především pro životní prostředí. Tyto odpady často obsahují polyfunkční reagující monomery jako např. styren nebo formaldehyd. Velmi často se také uvolňují plynné emise, které jsou znečištěné nejen nebezpečnými těkavými monomery, ale zejména reakčními zbytky s obsahem monomerů, polymerů, rozpouštědel, emulgátorů a dalších nečistot. Jinými odpady z výroby polymerů mohou být znečištěné monomery nebo kaly ze zpracování směsí s obsahem těžkých kovů a pigmenty Rozdělení syntetických polymerů Polymery ve formě výrobku jsou v tuhém stavu, avšak v určitém stádiu zpracování se vyskytují především ve stavu kapalném, který za zvýšené teploty a tlaku umožňuje dát výrobku nejrůznější tvar 1-4. Podle základních technických vlastností (chování za tepla a způsobu technologického zpracování) se polymery dělí na: Elastomery polymery, které po deformaci rychle obnovují původní tvar Plastomery (plasty) polymery, které zůstávají deformovány i v případě, kdy na ně deformující napětí přestane působit 1-4. Plasty se dále rozdělují podle toho, jak se chovají při zahřívání, a to na: Termoplasty zahříváním měknou a lze je opakovaně roztavit a ochlazením převést zpět do tuhého stavu. Reaktoplasty (termosety) zahříváním přecházejí nevratně do netavitelného a nerozpustného stavu 1-4. Podle struktury hlavního chemického řetězce můžeme polymery rozdělit na: Polymery s řetězcem C C Polymery s heteroatomy v řetězci

32 Podle objemů a spotřeby aplikací (komerční dělení) můžeme rozdělit plasty na: Velkoobjemové plasty Inženýrské plasty Speciální plasty 1-4. Podle počtu druhů monomerních jednotek v makromolekule se polymery dělí na: Homopolymery makromolekuly obsahující jen jeden druh monomerních jednotek (vznikají polymerizací jednoho monomeru). Kopolymery vznikají současnou polymerizací dvou nebo více monomerů 1-4. Podle struktury kopolymery dále rozdělujeme na: Statistické lineární kopolymery obsahující dva typy monomerních jednotek, přičemž pořadí obou jednotek je nahodilé Alternující jednotky se pravidelně střídají Blokové makromolekuly tvořené delšími sekvencemi vždy jednoho typu monomerních jednotek Roubované hlavní řetězce makromolekuly jsou tvořeny jedním druhem monomerní jednotky a na ně jsou naroubovány postranní řetězce vystavěné z druhého monomeru 1-4. Podle takticity můžeme polymery rozdělit na: Izotaktické substituenty ve všech monomerních jednotkách ( CHR CH 2 ) leží na jedné straně roviny nataženého uhlíkového řetězce Syndiotaktické pravidelné střídání konfigurace stereoizomerních center v makromolekulách, kde substituent R leží střídavě nad a pod rovinou uhlíkového řetězce Ataktické v makromolekulách je náhodná distribuce konfigurací stereoizomerních center Polykondenzace Polykondenzace je sled stejných opakujících se reakcí funkčních skupin výchozích látek. Ke vzniku polymeru je zapotřebí, aby výchozí sloučeniny měly potřebný počet funkčních skupin a nejméně dva v každé molekule vzájemně reagující komponenty. V takovém případě vzniká lineární polymer. Má-li některá výchozí látka více funkčních skupin v molekule, vznikají produkty se strukturou prostorové sítě 1,2,4,7. Polykondenzace je reakce, při níž vzniká ze dvou nízkomolekulárních látek polymer a nějaká jiná nízkomolekulární látka, většinou voda. Rozdíl mezi polymerací a polykondenzací je v tom, že produkt polymerace (polymer) má stejné chemické složení jako původní výchozí látka (monomer), kdežto produkt polykondenzace (polykondenzát, běžně také označovaný jako polymer) má jiné chemické složení než nízkomolekulární látky, ze kterých vznikl 1,2,4,7. Jednotlivé dílčí děje probíhající při polykondenzaci mají převážně rovnovážný charakter a neliší se aktivační energií ani reakční rychlostí. Zastavení růstu makromolekul je způsobeno významným snížením koncentrace funkčních skupin a také pohyblivosti vzniklých makromolekul, a to v důsledku řádového zvýšení viskozity reakčního prostředí (polykondenzátu). Molekulovou hmotnost polykondenzátu lze regulovat přídavkem monofunkčních látek, které reagují s jeho funkčními skupinami a růst makromolekul 32

33 ukončují. Vhodnými regulátory molekulové hmotnosti (zastavovači polykondenzace) jsou např. monokarboxylové kyseliny, jednomocné alkoholy nebo aminy 1,2,4,7. Vznik dostatečně velkých (jsou-li lineární, tak dlouhých) definovaných makromolekul je podmíněn jednoznačností reakcí, kterými vznikají. Výchozí nízkomolekulární sloučeniny, tj. monomery, musí být dostatečně stálé vůči agresivním vlivům okolí a jejich kondenzace schopné funkční skupiny musí být naopak reaktivní. To však platí pouze pro hlavní reakci, protože reakce vedlejší musí být eliminovány. Vlastnosti makromolekul jsou velice citlivou funkcí strukturního uspořádání; zdánlivě nepatrné defekty silně ovlivní vlastnosti (zvláště makromolekul lineárních; makromolekulární sítě jsou méně senzitivní). Každá ze stovek až tisíců kondenzací vytvářejících makromolekulu musí být jednoznačná a její chemismus totožný. Je známo, že ne každá skupina ochotná kondenzovat je pro makromolekulární syntézy vhodná. Těch vhodných je však dostatečný počet a jsou v dostatečném výběru 1,2,4,7. Typickým příkladem polykondenzace je reakce fenolu s formaldehydem poskytující pryskyřici známou pod názvem bakelit, nebo ethylenglykolu s kyselinou tereftalovou, vedoucí ke vzniku polyesteru známého u nás nejvíce jako vlákno Tesil, nebo jako PET láhve 1,2,4, Příklady průmyslových polykondenzací Úplný výčet druhů polykondenzací již průmyslově využívaných by byl velmi rozsáhlý. Odborníci a uživatelé plastů však mohou mít potíže s identifikací chemické podstaty toho kterého druhu polymeru, který je definován jen obchodním názvem. Pro příklad uvádím jen nejčastěji používané monomery, kategorie plastu, který z nich vzniká, a pouze několik nejběžnějších obchodních nazvů 70, Příklady prakticky významných polymerů připravovaných polykondenzačními reakcemi K nejdůležitějším polymerům, které se vyrábějí polykondenzací v průmyslovém měřítku, patří polyestery, polyamidy, polyimidy, fenoplasty, z nichž nejrozšířenější jsou fenolformaldehydové pryskyřice a aminoplasty, pro jejichž výrobu jsou základními surovinami močovina, melamin a formaldehyd. Z polymerů, které mají v hlavním řetězci makromolekul konstituční jednotky obsahující i jiné atomy než C, N, O, patří polysiloxany 1,2,72, Polyestery Polyestery tvoří velkou skupinu polymerů, jejichž společným znakem je přítomnost esterových vazeb v hlavním makromolekulárním řetězci, tj. polymery mající obecný vzorec typu [-R1-CO O R2 -] n. Jedním z možných typů klasifikace je rozdělení na dva základní typy, tj. polyestery termoplastické, lineární, které jsou odvozené od kyseliny uhličité a tereftalové a polyestery reaktoplastické, rozvětvené a v konečném stádiu zpracování nesíťované 1,2. 33

34 Tabulka I: Nejčastěji používané monomery, kategorie plastu včetně nejběžnějších obchodních názvů 70 Polykondenzující monomery Produkt Technický název dikarboxylové kyseliny; estery dikarboxylových kyselin; anhydridy dikarboxylových kyselin dioly polyestery Terylen, Dacron, Diolen, PES licí pryskyřice anhydrid kyseliny ftalové glycerol polyestery Alkydové pryskyřice dikarboxylové kyseliny; aminokarboxylové diaminy polyamidy Nylon 6,6; Rilsan kyseliny anhydridy tetrakarboxylových diaminy polyamidy kyselin fenol formaldehyd fenolformaldehydové Bakelit pryskyřice močovina formaldehyd močovinoformaldehydové Kaurit, aminoplasty hmoty melamin formaldehyd polyamid Melaminoformaldehydové hmoty bisfenoly fosgen polykarbonáty Makrolon, Lexan diisokianáty diaminy polyuretany Lycra diisokianáty glykoly polyuretany Vulcollan diisokianáty voda polymočovina Moltopren bisfenoly epoxidy epoxidové pryskyřice Araldit, Epoxi dichloralkany sulfid sodný polysulfidy Thikol Dikarboxylové kyseliny, jejich estery, anhydridy a chloridy reagují v rámci polykondenzace s alifatickými i aromatickými dioly za vzniku lineárních, technicky významných polyesterů (Tesil, Terilen, Dacron, Diolen, Trevira, aj.); s 1,2,3-propantriolem (glycerolem), eventuálně s jinými polyoly (pentatritolem), potom na rozvětvené až zesíťované systémy (alkydové pryskyřice), tj. polyesterové licí hmoty. Síťované soustavy polyesterových segmentů lze však získat i prostřednictvím tri- a tetrakarboxylových kyselin nebo jejich derivátů a di- nebo polyolů 70,74,75. Komerčně nejdůležitějším polyesterem je polyethylentereftalát (PETP). Klasický postup výroby vychází z reakce dimethyltereftalátu s ethan-1,2-diolem. 34

35 První fáze výroby: Ve druhé fázi teprve vzniká polymer, a to po vydestilování přebytečného ethylenglykolu. Obr. 7: Schéma výroby PETP 72 Teplota při transesterifikaci dimethyltereftalátu ethylenglykolem se pohybuje v rozmezí 190 C až 195 C, protože při teplotě nižší než 180 C probíhá reakce velmi pomalu a při teplotě 197 C ethylenglykol již vře. V současné době se polyethylentereftalát vyrábí i přímou polykondenzací kyseliny tereftalové a ethan-1,2-diolu 1,2,70. Většina produkce PETP se zpracovává na vlákna, menší podíl potom na fólie. Výhodou těchto fólií je možnost jejich snadného pokovování, a proto se používají především v elektrotechnice a jako podložky pro výrobu magnetofonových a videorekordérových pásků a filmů. Vlákna se zpracovávají na spotřební textilie, technické tkaniny a lana, dále se používají rovněž k oplétání vodičů elektrického proudu a jako výstuže jiných polymerních materiálů (např. kordy pro pneumatiky a dopravní pásy). V posledních desetiletích mimořádně vzrostlo uplatnění PETP v obalové technice, zejména v oblasti lahví pro nealkoholické nápoje. PETP má své využití i jako tzv. konstrukční (inženýrský) plast. Tímto označením jsou obecně charakterizovány polymery, které v různých výrobcích mohou nahrazovat ocel, hliník nebo jiné kovy 70, Jako konstrukční plast má své využití i polybutylentereftalát (PBT), jehož výroba, analogická PETP, vychází z dimethyltereftalátu a butan-1,4-diolu 1,2,70, Fenoplasty Pojmem fenoplasty jsou označovány syntetické pryskyřice na bázi fenolu a aldehydů. Fenolformaldahydová pryskyřice získaná polyreakcí fenolu a formaldehydu byla prvním průmyslově vyráběným syntetickým polymerem. V roce 1910 byla zavedena její průmyslová výroba pod obchodním označením bakelit. Polykondenzace fenolu s formaldehydem se provádí ve vodném prostředí. Struktura produktu závisí na poměru obou monomerů v reakční násadě, na ph prostředí a na teplotě. V alkalickém prostředí, v přebytku formaldehydu, vznikají rezoly, nízkomolekulární produkty s vysoce reaktivními methylovými skupinami, jejichž vzájemnou reakcí vzniká nesíťovaný produkt, tzv. rezit. Produkty kondenzace, které probíhají v kyselém prostředí v přebytku fenolu, se označují jako novolaky 1,2, A) Rezoly Hydroxylová skupina fenolu řídí substituci na aromatickém jádře do polohy orto a para. Při bazicky katalyzované reakci fenolu s formaldehydem, a to v molárním poměru menším 35

36 než jedna (v praxi obvykle 0,8 0,9), vznikají mono-, di- a trimethylfenoly. Přednostní poloha substituce je určena hodnotou ph prostředí. Methylfenoly vzájemně kondenzují za vzniku methylenetherových nebo methylenových můstků 1,2, Jako rezoly jsou označovány směsi jedno-, dvou- a vícejaderných methylfenolů, jejichž molární hmotnost je zpravidla v rozmezí 500 až 2000 g.mol -1. V závislosti na molární hmotnosti a složení mohou být pevné nebo kapalné, ve vodě rozpustné nebo nerozpustné. V kyselém prostředí nebo působením tepla (nad 180 C) se rezoly vytvrzují, což znamená, že síťují. Síťování rezolů zahrnuje obdobné chemické reakce jako syntéza prepolymeru: vznik methylenových a methylenetherových můstků. Jejich poměr závisí na vytvrzovací teplotě; se vzrůstající teplotou převažují můstky methylenové. Za podmínek vytvrzování rezolů vznikají také velmi reaktivní vedlejší meziprodukty, tzv. chinonmethidy. Fenolformaldehydové pryskyřice mají tmavé, hnědočervené zbarvení 1,2, B) Novolaky Fenolformaldehydové prepolymery, označované jako novolaky, vznikají při kysele katalyzované reakci formaldehydu s fenolem v poměru 0,75 0,82 : 1, někdy i v poměru nižším. Vzhledem k přebytku fenolu neobsahují novolaky reaktivní methylové skupiny a jsou proto, na rozdíl od rezolů, stabilní 1,2,70-,72. Novolaky jsou trvale termoplastické produkty s průměrnou molární hmotností kolem 1000 g.mol -1. Samotné je nelze vytvrzovat ani působením tepla, ani vlivem kyselého prostředí. K zesíťování novolaků může dojít v přítomnosti sloučeniny, která uvolňuje formaldehyd, např. hexamethylentetraaminu. Při vytvrzování (při teplotách kolem 160 C) jsou aromatická jádra spojována prostřednictvím methylenových nebo benzylaminových můstků 1,2, Fenolformaldehydové pryskyřice, známé také jako fenoplasty, se využívají jako lisovací, vrstvené a izolační hmoty, adheziva, laky a lehčené polymery 1,2, Likvidace, zpracování a recyklace polymerního odpadu Obrovský rozmach výroby a použití polymerů má také své negativní důsledky. Jedním z nich je zvyšující se objem polymerního odpadu. Současná světová roční spotřeba polymerních materiálů činí téměř 200 miliónů tun, z čehož největší procento představuje polyethylen (32 %), za ním následuje polypropylen (20 %), polyvinylchlorid s 17 %, polystyren s 12 % a polyuretany se 6 %. Protože se polymerní materiály obvykle vyznačují značnou životností vůči běžnému vnějšímu prostředí, což znamená, že nejsou degradovatelné, můžeme proto konstatovat, že právě plasty jsou považovány za jeden z největších zdrojů znečištění životního prostředí 2,3,75,94. Dva základní přístupy k polymerním odpadům jsou buď jejich znehodnocení nebo odstranění. Z ekologického hlediska je nejpřijatelnější formou jejich recyklace, tj. proces, při němž byly použité a vyřazené výrobky sbírány, tříděny, dále zpracovávány a materiál z nich získaný byl znovu v jiné formě vrácen do užívání 94,109,110. Odpad může vznikat již při výrobě, což představuje tzv. vratný odpad. Tento odpad je nekontaminovaný a zpracovává se primární recyklací, která je nejjednodušším a nejlevnějším typem recyklace 94,109,110. Jestliže dojde k upotřebení výrobku, vzniká tzv. odpad sběrový. Tento odpad obsahuje různé druhy plastů a je zpracováván řadou operací, které mohou zahrnovat granulaci, drcení, 36

37 separaci plastů od ostatních odpadů, čištění a sušení. Toto zpracování polymerních odpadů se nazývá sekundární recyklace 2,3,109,110. Dalším možným způsobem recyklace odpadu je tzv. terciární (chemická) recyklace. Zahrnuje postupy, při nichž je polymerní materiál rozkládán na nízkomolekulární látky, vhodné k opětovnému využití jako monomery pro polymerace, případně jako paliva nebo chemikálie 2,3,110. Posledním způsobem je tzv. kvartérní (fyzikální) recyklace, což je spalování plastů, při kterém se získává alespoň tepelná energie. Je to nepochybně lepší alternativa než zavážení plastového odpadu na skládky. Zavážením plastového odpadu na skládky se zhruba likviduje cca polovina polymerního odpadu 94,109,110. K nejčastějšímu způsobu zneškodnění polymerního odpadu patří jeho ukládání na skládky komunálního odpadu. Jak již bylo výše uvedeno, plasty ani po dlouhé době nepodléhají významným oxidačním nebo biologickým přeměnám, čímž narušují proces přirozené homogenizace skládkového terénu. Proto se v posledních letech objevuje snaha o maximální omezení tohoto způsobu nakládání s plastovými odpady a využívání skládek jen k odstraňování odpadu, který již nelze žádným způsobem znehodnotit (přibližně 20 % plastových odpadů) 94,109,110. Jednou z vhodných alternativ, doplňujících recyklaci, by mohlo být využití biopolymerů. Tato alternativa se dá označit jako preventivní předcházení vzniku plastového odpadu. V zásadě se biopolymery rozdělují na: a) kompostovatelné polymery - vyráběné z obnovitelných nebo neobnovitelných zdrojů. Jsou to především polymery na bázi škrobu, polymery kyseliny mléčné (PLA), polyhydroxyalkanoáty (PHA), mezi něž patří také polyhydroxybutyrát (PHB) a polyhydroxyvalerát (PHV) a polymery z chemicky modifikované celulózy; b) biopolymery vyráběné z přírodních zdrojů - u kterých je kladen důraz na použitý materiál. K výrobě těchto polymerů se používají obnovitelné zdroje, přesto však nemusí být tyto biopolymery ve všech případech rozložitelné. Příkladem těchto materiálů mohou být např. specifické polyestery na bázi biopropandiolu (PDO), případně specifické polyamidy, které jsou vyráběné z ricinového oleje. Vývoj rovněž směřuje k využívání polyethylenu (PE) nebo polyvinylchloridu (PVC) na bázi bioethanolu, vyráběného například z cukrové třtiny 2,3,75,94,109, Chemie a technologie léčiv Pojem léčiva velmi podrobně definuje zákon o léčivech č. 79/1997 Sb. ve znění pozdějších předpisů. Stručná definice uvádí, že za léčiva lze považovat léčivé látky nebo jejich směsi, případně léčivé přípravky, které jsou určené k podání lidem nebo zvířatům 95,96,97. Léčivými látkami se rozumějí látky přírodního nebo syntetického původu s farmakologickým nebo imunologickým účinkem, případně látky ovlivňující metabolismus. Tyto látky slouží k prevenci, k léčení a mírnění chorob, k diagnostice a k ovlivňování fyziologických funkcí 97,98,100. Léčivými přípravky se rozumějí přípravky získané technologickým zpracováním léčivých a pomocných látek do určité lékové formy, balené ve vhodných obalech a náležitě označené. Humánní léčivé přípravky jsou určeny k podání lidem, veterinární léčivé přípravky k podání zvířatům 95,96,97. 37

38 Léková forma představuje způsob úpravy léčiva do formy vhodné pro léčebné použití. Léková forma musí být přizpůsobena požadované cestě přívodu léčiva do organismu a musí respektovat jeho fyzikálně-chemické vlastnosti 95,99, Historie Nejrůznější chemické sloučeniny se záměrně používají k dosažení určitých pozitivních účinků. Některé z nich patří mezi léky, které slouží k terapii nemocí, jiné se označují jako drogy a berou se převážně proto, že vyvolávají příjemné pocity. Před vznikem písemných záznamů se poznatky o léčivých rostlinách předávaly ústně z generace na generaci 95. Mezi nejstarší písemnosti o léčivých rostlinách patří záznamy ze starověké Číny. První z nich je kniha Šen-nung Pen-cchao-ťing, která byla vydaná v době dynastie Chan ve 2. století před n. l., která uváděla léčivé vlastnosti 365 rostlin a léčivých přípravků. V průběhu času byla tato kniha mnohokrát doplňována. Zvlášť významná je verze Pen-cchao kang-mu ( Velký lékopis ), kterou napsal Li Š -čen za vlády dynastie Ming v 16. století. Její autor patřil mezi první učence, kteří účinky léků studovali víceméně vědeckou metodou 95. Mnoho lékařských textů bylo napsáno i ve starém Egyptě, a to zhruba mezi lety 2000 až 1500 před n.l. Také v těchto textech byl popisován velký počet rostlinných i jiných přírodních léků, například senna, med, tymián, jalovec, římský kmín a kolokvinta, které se užívaly pro léčbu zažívacích potíží, případně kořen granátovníku a blín pro odstranění červů. Rovněž se psalo o lnu, duběnce, borové pryskyřici, maně, vavřínových bobulích, akantu, aloi, kmínu, cedru, koriandru, cypřiši, bezu, česneku, fenyklu, locice jedovaté, řeřiše, cibuli, papyru, máku, šafránu, fíku nebo vodním melounu 95. Vědecká metoda začala mít podstatný vliv na medicínskou praxi teprve v 19. století. Stalo se tak díky některým učencům, z nichž lze jmenovat například Clauda Bernarda ( ), který byl známým francouzským fyziologem. Klíčovým posunem v léčbě bylo zjištění, že infekční nemoci jsou způsobeny mikroskopickými živými organismy. Tento objev si připsal francouzský chemik Louis Pasteur. Josef Lister následně odvodil z Pasteurových objevů potřebu zavést v chirurgii principy aseptické práce. Začal využívat kyselinu karbolovou k vytvoření antiseptické bariéry mezi zraněním a okolním vzduchem obsahujícím choroboplodné zárodky 95. V Německu byla v 19. století odstartována moderní epocha vývoje léků. Němečtí chemici jako první na světě izolovali z rostlinných materiálů čisté léčivé substance; v roce 1803 to byl morfin z opia a v roce 1820 chinin z kůry chinovníku. Morfin se začal aplikovat jako velmi účinný prostředek proti bolestem, avšak stejně jako předtím opium se stal brzy zneužívanou drogou. Chinin hrál významnou úlohu při prevenci malárie 95. Během 20. století se aplikace léků neobyčejně rozmohla. Užívání drog se v chudších vrstvách šířilo jako reakce na neutěšenou situaci, v jiných zemích bylo jejich užívání naopak známkou blahobytu. Výroba a prodej léků i ilegálních drog se celosvětově staly důležitým odvětvím a mají značný ekonomický dopad Rozdělení léčiv V současném lékařství se aplikuje mnoho léčiv vyráběných farmaceutickým průmyslem. Tento průmysl přichází na trh neustále s novými výrobky, které se nejčastěji rozdělují do skupin podle účinku: Analgetika látky používané ke snížení a potlačování bolesti. 38

39 Celková anestetika látky působící na CNS za účelem potlačení bolesti; jsou používána především při chirurgických zákrocích a operacích, kdy se pod pojmem celková anestéze rozumí stav bez bolesti, ztráta vědomí, aj. Sedativa a hypnotika způsobují zklidnění CNS, často provázené i zmírněním stavů úzkosti. Útlum CNS způsobený vyššími dávkami sedativ navozuje stav podobný přirozenému spánku. Psychofarmaka látky ovlivňující lidskou psychiku jsou používané při léčení různých duševních poruch. Potlačují projevy těžkých psychóz, odstraňují neurózy, zlepšují náladu a stimulují aktivitu CNS. Lokální anestetika a myorelaxanicia způsobují dočasné potlačení nebo úplnou blokádu šíření nervového vzruchu reverzibilním zablokováním receptorů sodíkových kanálů v neuronálních membránách. Antitusika a expektorancia ovlivňují funkce dýchacího traktu. Antitusika potlačují intenzitu a četnost kašle, expektorancia napomáhají odstranit nadbytečný sekret z dýchacích cest. Léčiva vegetativní nervové soustavy látky ovlivňující především nervový systém spolu se systémem endokrinním. Vegetativní nervový systém je část nervového systému, která nepodléhá přímé kontrole vůlí. Antialergika a antihistaminika potlačují alergické příznaky nebo přímo alergie. Léčiva oběhové soustavy léčiva upravující činnost oběhové soustavy, např. při nedostatečném výkonu srdce, nepravidelné srdeční činnosti, arteroskleróze, trombózách, apod. Léčiva trávící soustavy a vylučovací soustavy léčí nebo upravují činnost zažívacího traktu (anticida snižují aciditu žaludečních šťáv, antiulceróza zmírnění příznaků peptického vředu, cytoprotektiva chrání buňky epitelu sliznic GIT před působením žaludečních kyselin), jater (cholagoga, hepatoprotektiva), slinivky břišní (antitiabetika), vylučovací soustavy (diuretika a saluretika). Vitamíny jsou nezbytné pro život. Slouží jako kofaktory pro enzymy a účastní se rozkladu a odklízení molekul volných radikálů. Hormony látky produkované žlázami s vnitřní sekrecí, tzv. endokrinními žlázami, které jsou vylučované do krevního oběhu. Žlázy s vnitřní sekrecí a jimi produkované hormony tvoří endokrinní systém, který řídí a ovlivňuje periferní tkáně a celou řadu funkcí organismu, např. metabolismus, růst, reprodukci, apod. Protiinfekční a protiinvazní látky působí preventivně proti infekcím (dezinficencia a antiseptika), potlačují různé typy již vzniklých infekcí (antibakteriální, antimykotická, antivirová a antiprotozoární chemoterapeutika a antibiotika). Chemoterapeutika zhoubných nádorů snižují počet zhoubných rychle rostoucích rakovinových buněk (tzv. maligních) v organismu. Opakují-li se léčebné kůry s dostatečnou frekvencí, lze dosáhnout sestupného trendu v počtu maligních buněk a dokonce i trvalého vyléčení 96,98, Názvosloví léčiv Každé syntetické léčivo je chemická sloučenina, kterou můžeme pojmenovat systematickým názvoslovím podle IUPAC. Tyto názvy se však většinou v praxi nepoužívají, protože bývají příliš dlouhé a málo přehledné. Proto má každé léčivo tzv. generický název nebo INN (Internacional Non-Properietory Name), který nejčastěji vzniká zkrácením názvu 39

40 systematického. Generický název je evidován Světovou zdravotnickou organizací (WHO); pod tímto názvem lze údaje o příslušném léčivu vyhledat nejen ve farmaceutické literatuře (např. v lékopisech), nýbrž i v literatuře chemické (např. v Chemical Abstracts). Různé farmaceutické společnosti vyrábějí totéž léčivo pod různými obchodními názvy (trace names); tyto názvy představují obchodní značku, která bývá předmětem ochrany. Jako příklad lze uvést analgetikum s protizánětlivou látkou ibuprofenem. Její chemický systematický název je kyselina (±) 2-(4-isobutylfenyl)propanová; na trhu se tento výrobek prodává pod různými obchodními názvy (AKTREN, BRUFEN, DOLGIT, EXNEURAL, IBUMERACK, MOTRIN, NIROFEN, IBALGIN aj.) Analgetika Analgetika jsou léčiva, která snižují nebo potlačují pocit bolesti, aniž by výrazně ovlivňovaly smyslové vnímání a vědomí. Mnohá analgetika vykazují také protizánětlivý (antiflogistický) a antipyretický účinek. Přestože analgetika neléčí příčinu onemocnění, jejich podávání může významně napomáhat vlastnímu léčení tím, že snižují zátěž a stres organismu způsobený bolestí, zánětem a zvýšenou teplotou 96. Analgetika se dělí podle míry a mechanismu účinku na analgetika narkotická, nazývaná též anodyna nebo opioidní analgetika a na analgetika-antipyretika, patřící do skupiny nesteroidních protizánětlivých látek (NSPZL) 96. Narkotická analgetika se používají ke zvládnutí silné bolesti. Anodyna interagují jako agonisté s opioidními receptory v centrálním nervovém systému (CNS), jejichž přirozenými ligandy jsou endorfiny. Tyto látky zvyšují práh vnímání bolesti. Jejich působení je však selektivní a neovlivňují vnímání ostatních podnětů (dotyku, tlaku a teploty) 96. Skupina nenarkotických analgetik zahrnuje analgetika-antipyretika spolu s nesteroidními protizánětlivými látkami. Tato léčiva se používají k potlačení mírnějších bolestí, horečky a různých zánětů. Podstatou účinku všech těchto látek je inhibice enzymu cyklooxygenasy (COX), která zahajuje biosyntézu prostanglandinů z kyseliny arachidonové. Pro zvýšení analgetického účinku se nenarkotická analgetika často kombinují s dalšími látkami, např. s kofeinem Nenarkotická analgetika Veškerá nenarkotická analgetika vykazují kromě analgetického účinku rovněž účinek antipyretický a antiflogistický. Přestože mají všechna tato léčiva podobný mechanismus působení, u některých vystupují více do prostředí antipyretické vlastnosti, u jiných naopak účinky protizánětlivé (nesteroidní protizánětlivé látky, které se dnes nejčastěji označují jako NSAIDs, tj. non-steroidal anti-inflammatory drugs). Z hlediska chemické struktury lze nenarkotická analgetika rozdělit na deriváty anilinu, deriváty kyseliny salicylové, deriváty kyseliny anthranilové, deriváty 2-arylalkanových kyselin, tzv. kyselé enol-deriváty (různé typy enolizujících oxoheterocyklických sloučenin) a další 96,111. Jsou to látky spadající do mnoha odlišných chemických skupin. Hlavním představitelem analgetik-antipyretik i NSAIDs a současně používaným standardem při jejich stanovení je kyselina acetylsalicylová (aspirin). Mechanismus účinků těchto látek je následující: kyselina acetylsalicylová, případně další NSAIDs, inhibují přednostně cyklooxygenázu (COX), ve vyšších koncentracích inhibují i řadu dalších enzymů 96,

41 Deriváty anilinu Analgeticko-antipyretické účinky acetanilidu (N-fenylacetamid, ANTI-FEBRIN), prvního terapeuticky využívaného derivátu anilinu, byly objeveny již v 80. letech 19. století. Obr. 8: Deriváty anilinu 96 Tento preparát se pro řadu vedlejších účinků (methemoglobinémie a poškozování ledvin) již nedodává. Později se ukázalo, že N-(4-hydroxyfenyl)acetamid, na který je acetanilid v organismu metabolizován, má nejen lepší antipyretické účinky, nýbrž i nižší toxicitu. Pod názvem paracetamol (PARALEN, PANADOL) se stal v současné době jedním z nejpoužívanějších analgetik a antipyretik 96. Paracetamol si získal značnou oblibu vzhledem ke své vysoké účinnosti při relativně nízké toxicitě (pouze v případě předávkování může být hepatotoxický). Paracetamol patří mezi volně prodejná léčiva Deriváty kyseliny salicylové Kyselina salicylová (kyselina 2-hydroxybenzoová) a její deriváty jsou účinná antipyretika s mírnými analgetickými a protizánětlivými účinky. Kyselina salicylová je ve formě glykosidu salicynu obsažena ve vrbové kůře, používané odedávna v lidovém léčitelství k potlačování horečky. Použití kyseliny salicylové a jejích derivátů v širším měřítku umožnila až Kolbeho-Schmittova syntéza 96,111. Obr. 9: Kolbe-Schmittova syntéza 96 Kyselina salicylová se v dnešní době používá v omezené míře, většinou ve formě solí (natriumsalicylát, lysinsalicylát, cholinsalicylát). Salicyláty se dobře absorbují ze žaludku a tenkého střeva. Během 30 minut dosahují hladin, při kterých se již projevují terapeutické účinky. Maximální hladina salicylátů v krvi bývá obvykle dosažena asi za 2 hodiny po perorálním podání přípravku. Rektální absorpce je pomalejší než perorální aplikace. Salicyláty se metabolizují a konjugují v játrech. Vylučování probíhá močí, a to převážně ve formě kyseliny salicylové a jejich konjugátů 96,111. Nejrozšířenějším derivátem kyseliny salicylové je kyselina acetylsalicylová ASA (kyselina 2-acetoxybenzoová, ACYLPYRIN, ASPIORIN). Jedná se o antipyretikum volně dostupné na trhu. Ve vyšších dávkách vykazuje rovněž protizánětlivé účinky, a proto se často aplikovala při léčení revmatoidních artritid různého typu. K jejím nežádoucím vedlejším účinkům patří dráždění gastrointenstinálního traktu vedoucí při delším používání až k tvorbě žaludečních 41

42 nebo dvanácterníkových vředů. Kyselina acetylsalicylová snižuje agregační schopnost krevních destiček v důsledku inhibice syntézy tromboxanu A 2, čehož se využívá například k prevenci srdečního infarktu a mozkové mrtvice. Vyšší dávky kyseliny acetylsalicylové však mohou vyvolat nežádoucí zvýšenou krvácivost. Nezanedbatelným rizikem při podávání kyseliny acetylsalicylové dětem mladším 12 let je možnost vzniku tzv. Reyova syndromu, což je onemocnění jater a mozku končící často smrtí 96, Arylalkanové kyseliny Účinnými látkami patřícími do této skupiny jsou antiflogistika typu aryloctové kyseliny. Nejznámějším zástupcem léčiv z této skupiny je diklofenak, zejména ve formě léčiva VOLTAREN (kyselina 2-[(2,6-dichlorfenyl]aminofenyl)octová), který má protizánětlivé a analgetické účinky 96,111. Obr. 10: Strukturní vzorec dikofenaku 96 Aplikuje se jak při akutních stavech, tak také dlouhodobě. Rychle a úplně se absorbuje z trávicího traktu (GIT), přičemž vrchol plazmatické hladiny je za 2 3 hodiny. Metabolizuje se v játrech hydroxylací a konjugací a z těla se vylučuje močí a žlučí. K jeho vedlejším nežádoucím účinkům patří rovněž gastrointestinální obtíže 96,111. Poslední skupinou jsou 2-arylpropanové kyseliny, které se v posledních letech staly nejpoužívanějšími analgetiky a antiflogistiky. Látky patřící do této skupiny jsou většinou lépe snášeny než ASA. Z farmak tohoto strukturního typu je třeba jmenovat hojně používaný ibuprofen (kyselina (±)-2-(4-isobutylfenyl)propanová), BRUFEN, IBALGIN, BRUFALGIN, DOLGIT, NUROFEN). Ibuprofen se stal vzhledem ke své nízké toxicitě a minimálním nežádoucím vedlejším účinkům na gastrointestinální trakt volně prodejným léčivem. Používá se jako analgetikum nebo jako antiflofistikum při léčení akutních, případně chronických revmatických potíží 96,

43 Obr. 11: Strukturní vzorce vybraných 2-arylpropanových kyselin 96 Ibuprofen se připravuje a podává jako racemát, stejně jako většina 2-arylpropanových kyselin; účinný však je pouze (+)-(S)-stereoisomer. Analogické použití jako ibuprofen má rovněž naproxen (kyselina (±)-(S)-2-(6-methoxylnaft-2-yl)-propanová, NAPROSYN, NAXEN); v tomto případě je registrovanou substancí účinný (+)-(S)-stereoisomer. Do klinické praxe bylo zavedeno větší množství aryl-propanových kyselin. Jako příklady lze uvést ketoprofen (kyselina (±)-2-(3-benzoylfenyl) propanová, ORUDIS, KETOFEN, MEPROFEN), pirprofen (kyselina (±)-2-((3-chlor-4-(2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)fenyl) propanová, RENGASIL), suprofen (kyselina (±)-2-(4-((thien-2-yl)carbonyl)fenyl) propanová, SUPROL, SUFENIDE) a kyselinu thiaprofenovou (kyselina (±)-2-(5-benzoylthien-2-yl)- propanová, SARGAM, SURGAM) 96, Analgetika v životním prostředí Analgetika, stejně tak jako jiná léčiva aplikovaná v humánní a veterinární medicíně, se kumulují v životním prostředí. Vzhledem k tomu, že tyto látky nebývají vždy kompletně eliminovány z těla člověka nebo zvířat, protože se z organismů vylučují močí nebo exkrementy; do životního prostředí se dostávají jako směs metabolitů, tzv. reziduí a nezměněných látek. Rezidua léčiv mají podobné fyzikálně chemické vlastnosti jako škodlivá xenobiotika, která jsou perzistentní, případně vyvolávají nepříznivé účinky. Proto je těmto látkám jako potenciálním polutantům věnována stále se zvyšující pozornost Cesty a množství vstupu léčiv do životního prostředí mohou být různé. Záleží na druhu léčiv, na množství a způsobu používání, na schopnostech organismu odbourávat tyto látky, na účinnosti vylučování a na chování těchto látek 104,105. Perzistence léčiv, stejně jako jiných chemických látek, je v životním prostředí dána především fotostabilitou sloučeniny, rychlostí biotransformace, schopností vázat a adsorbovat se a také schopností transportu mezi vodním a terestrickým prostředím. Perzistence léčiv je úzce spjata se strukturou sloučeniny, což zahrnuje chemickou stabilitu a rozdělení. Toto spojení vedlo ke zjištění, že hydrofobní chemické sloučeniny mají větší tendenci k vyšší perzistenci. Bylo prokázáno, že nezáleží pouze na perzistenci. Důvodem je především to, že všechny sloučeniny nejsou snadno degradovatelné a proto se i hydrofilní a biodegradovatelné sloučeniny mohou stát perzistentními polutanty. V neposlední řadě je nutno si uvědomit, že metabolizované nebo degradované produkty mohou být životnímu prostředí mnohem více nebezpečné než původní látky

44 2. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Experimentální část je rozdělena na dvě části, a to na ekotoxikologické posouzení dvou analgetik a také na posouzení ekotoxicity odpadních vod z výroby polymerů. V první části je vlastnost ekotoxicita posuzována u dvou analgetik, a to pomocí standardních a alternativních ekotoxikologických testů. V druhé části byly aplikovány vybrané testy toxicity na zjištění ekotoxicity pracích vod odebíraných z polymerní výroby medicínských pomůcek na bázi polyamidonitrilu. Sledovány byly jak prací vody, které se využívají při výrobě implantátů z prasečích kůží s příměsí polyamidonitrilu na popáleniny, tak také prací vody z výrobní směsi pro výrobu dilatátoru děložního hrdla. 2.1 Místo provádění zkoušek Testy toxicity pro posuzování vybraných analgetik a výrobků na bázi polyamidonitrilu byly prováděny na pracovišti společnosti GelMed, s.r.o. se sídlem v Kamenných Žehrovicích, a to v oddělení analýz a ve vývojové laboratoři. Tato laboratoř se mimo jiné zabývá analýzou složek životního prostředí, technických materiálů a polymerních výrobků na bázi polymerních hydrogelů. Laboratoře jsou akreditovány Českým institutem pro akreditaci. Vybavení této laboratoře splňuje podmínky pro kompletní provádění základních testů toxicity, včetně využití přístroje Lumino M 90a pro provádění bakteriálního bioluminiscenčního testu toxicity. 2.2 Výběr metod pro provedení zkoušek Pro vlastní posuzování ekotoxicity byly vybrány klasické ekotoxikologické testy, které se nejčastěji používají pro hodnocení vlivu znečišťujících látek na životní prostředí. Do souboru nebyl zařazen pouze test akutní toxicity na rybách, který je finančně značně nákladný a kromě toho podléhá legislativě z hlediska zákona na ochranu zvířat (Zákon č Sb. ve znění pozdějších předpisů); pro jeho aplikaci je rovněž nezbytný plán pokusů schválený MZe ČR. Z novějších testů byl použit nový bakteriální test inhibice bioluminiscence. Tento test je perspektivní jak z hlediska levnějšího přístrojového vybavení, tak také z hlediska rychlosti získávání výsledků. Zařazení tohoto testu přispěje k porovnání výsledků a citlivosti klasických ekotoxikologických testů s tímto perspektivním testem. Pro testování byly zvoleny tyto testy ekotoxicity: Test akutní toxicity na vodním členovci (Daphnia magna). Při testování se postupuje podle normy ČSN EN ISO Test je založen na stanovení koncentrace, která za 24 (48) hodin způsobí úhyn nebo imobilizaci 50 % jedinců dafnie, vystavených toxickému působení zkoumané látky. Tento test je dostatečně citlivý již pro velmi malé koncentrace testovaných látek. Test inhibice růstu zelené řasy (Desmodesmus subspicatus). Provedení zkoušky bylo prováděno podle normy ČSN EN Test je založen na stanovení koncentrace, která za 72 hodin způsobí 50% inhibici (stimulaci) růstu jednobuněčné zelené sladkovodní řasy, vystavené toxickému působení zkoušené látky. Tento test umožňuje zjišťovat inhibici testované látky pomocí snížení růstové rychlosti ve vztahu ke kontrolní kultuře. Test inhibice růstu kořene hořčice bílé (Sinapis alba). Provedení testu bylo prováděno v souladu s normou OECD Test je založen na stanovení koncentrace, která za 72 hodin způsobí 50% inhibici (stimulaci) růstu kořene 44

45 v počátečních stádiích vývoje rostliny Sinapis alba, vystavené toxickému působení zkoušené látky. Bakteriální test inhibice bioluminiscence (Vibrio fischeri). Tento test byl proveden podle normy ČSN EN ISO Test je založen na stanovení koncentrace, která způsobuje 50% inhibici bioluminiscence světélkujících bakterií vystavených toxickému působení zkoušené látky při expozici 15 minut nebo 30 minut. Test je založen na tomto principu: ve styku s toxickou látkou dojde u testovaného organismu k podstatnému snižování emise světla bakterií. Změna intenzity vyzařované luminiscence se stanovuje luminometrem (Lumino M 90a). Výsledkem testu je stanovení takového ředění, které způsobí 50% inhibici emise světla v porovnání s kontrolou. Alternativní test akutní toxicity na sladkovodním korýši Thamnocephalus platyurus (Thamnotoxkit F TM ). Tento test se provádí v multišachtové desce za použití růstového stádia larev sladkovodního korýše Thamnocephalus platyurus, které byly vylíhnuté z cyst. Jedná se o 24 hodinový test, při kterém se hodnotí mortalita. Alternativní test akutní toxicity na sladkovodním korýši Daphnia magna (Daphnotoxkit F TM ). Tento 24 hodinový nebo 48 hodinový test 50% efektivní koncentrace se provádí v jednorázové testovací desce za použití korýše Daphnia magna, který byl vylíhnut z vajíček. 2.3 Metodika provedení zkoušek Za standardní lze považovat takovou metodu, která jednoznačně definuje podmínky testu, včetně způsobu matematického vyhodnocení. Z hlediska standardizace testů je nezbytné specifikovat následující parametry: Vyjadřování množství testované látky. Množství testované látky představuje její hmotnost v 1 litru ředěného média, a to nezávisle na tom, zda se jedná o látku pevnou nebo kapalnou. Ředící médium a způsob ředění. V akutních testech s vodními organismy a při sledování klíčivostí semen je nutné používat standardní ředící vodu. Testovací organismus. Je nezbytné používat organismy z dlouhodobých laboratorních chovů nebo kultur. Je naprosto nepřípustné získávat organismy těsně před provedením testu z volné přírody. Množství organismů v jednotlivém ředění. Množství organismů v testech musí být voleno tak, aby umožnilo pokud možno statistické vyhodnocení toxicity. Teplota a osvětlení. Teplota má značný vliv na průběh biologických pochodů, a proto se u většiny testů pracuje s teplotou od 20 C do 25 C. Testy s klíčením semen rostlin hořčice se provádějí v termostatu. Akutní testy s vodními organismy se provádějí za nepřímého denního osvětlení. U testů toxicity s řasami je intenzita osvětlení důležitým faktorem limitujícím rozvoj řasové kultury. Osvětlení musí být dostatečné, aby rozvoj kultury probíhal za optimálních podmínek. Bakteriální test inhibice bioluminiscence se provádí ve tmě za poměrně nízké teploty, tj. 15 C. U tohoto testu vždy používáme chlazení. Doba provedení testu. Ukončení testů na vodních členovcích se provádí po 24 a po 48 hodinách, testy na semenech hořčice po 72 hodinách a testy na řasách rovněž po 72 hodinách. Nejkratší testovací doba 30 minut je u bakteriálního růstu. 45

46 Krmení organismů, živná média. Je nepřípustné během testování krmit organismy, protože krmení výrazně ovlivňuje citlivost organismů k toxické látce. Nakrmený organismus je méně citlivý na přítomnost toxických látek než organismus hladový. Hodnocené parametry a způsoby vyhodnocení. Důležitými parametry při použití akutních testů toxicity je LC 50, u testů inhibičních pak IC 50 a EC 50, což představuje koncentraci zkoušené látky mající za následek 50% úhyn, případně 50% snížení růstu nebo růstové rychlosti ve vztahu ke kontrolnímu vzorku. Pomocí testů na chlorokokální řase je zjišťován vliv toxické látky na inhibici růstu řasových buněk (IC 50 ), testů na korýších vliv na úhyn a imobilizaci organismů (EC 50 ), testů na semenech inhibice růstu kořene (IC 50 ) a u bakteriálního testu se měří inhibice bioluminiscence (IC 50 ) Test akutní toxicity na vodním členovci Jako zkušební organismus byl použit vodní korýš Daphnia magna z laboratorních chovů. Podstatou zkoušky je stanovení akutní toxicity látek rozpustných ve vodě za specifických podmínek. Zkušební podmínky jsou určeny příslušnou normou. Teplota se v průběhu celého testu udržuje v rozmezí 20 C ± 1,0 C. Test se provádí bez osvětlení v testovací aparatuře termostatu. Adaptace dafnií na zkušební roztoky je trvalá, stáří organismů použitých pro test je maximálně 24 hodin. Maximální počet jedinců v jednom ředění je 20 kusů na 200 ml roztoku. U každé koncentrace byla provedena tři paralelní stanovení. Příprava standardní ředící vody odpovídá normě ISO Pro její přípravu se používá kvalitní demineralizovaná voda, neobsahující inhibující koncentrace toxických látek. Pro každou řadu zkoušek se použije stejná šarže vody. Všechny použité chemikálie jsou čistoty ch.č. nebo p.a. Po přípravě se ředící voda provzdušňuje tak dlouho, až koncentrace rozpuštěného kyslíku odpovídá nasycení vzdušným kyslíkem. Potom se nechá 2 dny odstát; ph takto připravené vody se pohybuje v rozmezí hodnot 7,0±0,2. Testované roztoky získáme přidáním daného množství zásobního roztoku testovaného výluhu k ředící vodě pro dosažení požadované koncentrace. Nejprve se orientačně testuje s nižšími počty organismů na ředění (10 ks). Potom vybereme nejméně 10 koncentrací pro základní test. Ten zahrnuje nejnižší koncentraci, ve které uhynuly všechny perloočky v orientačním testu a nejvyšší koncentraci, která nezpůsobila úhyn. Nasazuje se 20 ks na kontrolu a stejný počet pro jednotlivé testované roztoky. Objem testovacího média je na jeden testovací organismus minimálně 10 ml (provádí se při teplotě 20 C±1,0 C). Kontrola úhynu se v průběhu testu provádí jednou denně, na začátku a na konci testu měříme obsah rozpouštěného kyslíku, ph a teplotu. Každý test byl proveden třikrát. Hodnoty EC 50 se vyhodnocují pro každý test zvlášť a vypočítává se z nich průměr, přičemž jednotlivé hodnoty se nesmí od sebe lišit o více než 30 %. Výsledky testů se vyhodnocují s použitím programu MS Excel. Při výpočtu EC 50 je přesnost výsledku vyjádřena intervalem spolehlivosti na 95% hladině významnosti. Vyjadřování výsledků se provádí v mg testované látky na 1 litr, a to za 24 a za 48 hodin. Výsledky zkoušky byly platné, jestliže u kontrolních stanovení nedošlo k úhynu nebo k imobilizaci testovacích organismů vyššímu než 10 %. Tato koncentrace na konci testu musí být větší nebo rovna 2,0 mg l. V průběhu testu nesmí dojít k náhlé změně ph testovaných roztoků. 46

47 2.3.2 Test inhibice růstu na řase Test slouží ke zjištění toxicity vodného výluhu, a to pomocí zkušebního organismu, planktonní sladkovodní řasy Desmodesmus subdpicatus Chodat (chlorococcales, Chlorophyta, Chlorophyceae). Byl použit testovací organismus ze Sbírky autotrofních organismů hydrobotanického oddělění Botanického ústavu AV v Třeboni. Cílem zkoušky je stanovení koncentrace, při které látka inhibuje právě 50 % testované řasové kultury při expozičních dobách 24, 48 a 72 hodin. Tato inhibiční koncentrace se vyjadřuje jako např. 72 IC50. Podmínky pro provedení testu byly následující: teplota v průběhu celého testu byla dodržena v rozmezí 23 ± 2,0 C, osvětlení bylo umělé, rovnoměrné, 24 hodin denně. Pro provedení testu byl použit termoluminostat s nastavenou intenzitou osvětlení v rozmezí 8000 až lux. Každý den byly minimálně 4x denně testované nádoby intenzivně promíchávány. U každé koncentrace prováděna tři paralelní stanovení. V průběhu testu nebyla použita aerace jednotlivých testovaných koncentrací. Pro přípravu živných roztoků byla použita kvalitní demineralizovaná voda neobsahující inhibující koncentrace toxických látek. Použité chemikálie byly chemicky čisté, případně čistoty p.a. Po přípravě se živné roztoky sterilizují a následně se uchovávají ve tmě v chladničce při teplotě 4 C. Takto připravené živné roztoky se použijí pro přípravu zásobního roztoku živin, který se připravuje vždy čerstvý. Před použitím se nechá ustavit jeho rovnováha se vzduchem tak, že se po dobu 30 minut provzdušňuje filtrovaným vzduchem. Po dosažení rovnováhy se ph takto připraveného živného roztoku pohybuje v rozmezí hodnot ph 7,5 ± 0,2. Testované roztoky se připravují přidáním určeného množství zásobního roztoku testované látky k demineralizované vodě, a to pro dosažení požadované koncentrace. Potom se přidá přesně vypočtené množství živného roztoku. Pro provedení zkoušky byla nejprve nutná příprava inokula. Řasové inokulum se odebíralo z exponenciálně rostoucí řasové inokulační kultury, nasazené v tzv. předkultivaci tři dny před započetím zkoušky. Při nasazování testů byla počáteční hustota buněk ve zkušených roztocích ks buněk v 1 ml roztoku. Vlastní inkubace zazátkovaných zkušebních nádob jednotlivých koncentrací testované látky proběhla při teplotě 23 ± 2 C za stálého osvitu bílým světlem. Světelná intenzita se pohybovala v rozmezí lx. Řasové buňky se udržují v suspenzi třepáním a mícháním z důvodu zajištění výměny plynů. Také nesmí docházet ke změnám ph ve zkoušených roztocích. Hustota buněk ve zkušebních nádobách (včetně kontrolních) se měří každých 24 hodin v počítací komůrce pod mikroskopem. Testování trvá 72 hodin. Na začátku a na konci se změří ph vzorků zkoušených roztoků, a to u každé koncentrační úrovně a kontrolních vzorků. Nejprve se provádí orientační test s velkou koncentrační řadou testované látky. Potom se vybere nejméně 8 koncentrací v přibližně geometrické řadě pro základní test. Ten zahrnuje nejnižší koncentraci, ve které byla 100% inhibice řasové kultury v orientačním testu a nejvyšší koncentrací, která nezpůsobila inhibici. Objem testovacího média v jedné baňce je 100 ml. Nasazuje se také kontrolní vzorek bez testované látky. Odečet se v průběhu testu provádí jednou denně, přičemž na začátku a na konci testu měříme ph. Každý test byl proveden třikrát. Hodnoty IC 50 se vyhodnocují pro každý test zvlášť a počítá se z nich průměr. Jednotlivé hodnoty IC 50 se nesmí od sebe lišit o více než 30 %. Při výpočtu IC 50 je přesnost výsledku vyjádřena intervalem spolehlivosti na hladině významnosti 95 %. Výsledky se vyjadřují v mg testované látky na 1 litr ředící vody (mg.l -1 ). Při stanovení inhibice růstu se vychází z některého ze dvou následujících parametrů, 47

48 tj. z plochy pod růstovou křivkou a z růstových rychlostí. Nakonec se sestaví tabulka s hodnotami ploch pod růstovou křivkou (z růstových rychlostí), které odpovídají ověřovaným koncentracím. Takto zjistíme koncentrací IC 50, která odpovídá 50% inhibici. Pokud je to možné, určí se hodnota NOEC. NOEC je nejvyšší posuzovaná koncentrace, při které nedochází k významné inhibici růstu v porovnání s kontrolním vzorkem. Označování získaných výsledků se provádí tak, že hodnoty IC 50 vypočítané z plochy pod růstovou křivkou se označí jako ICb50 a z růstové rychlosti jako ICr50. Obdobně se označí hodnota NOEC jako NOECb a NOECr. Také se vyznačí časová rozpětí použitá pro stanovení. Hodnoty IC 50 a NOEC jsou toxikologická data odvozená z laboratorních zkoušek, které byly provedeny za definovaných normalizovaných podmínek. Výsledky zkoušky se posuzují podle norem, tj. jestliže se při kontrolních stanoveních zvýší hustota buněk více než 16krát za 72 hodin. V průběhu testu nesmí dojít v kontrolním vzorku ke změně ph o více než 1,5 jednotky Test inhibice růstu kořene rostlin Test umožní stanovení koncentrace, která za 72 hodin inhibuje (stimuluje) z 50 % růst kořene v počátečních stádiích vývoje rostlin Sinapis alba, vystavených toxickému působení zkoumané látky. Metoda je použitelná pro všechny typy vod i výluhů a používá se zejména pro stanovení toxicity látek rozpustných ve vodě, které mají vliv na inhibici růstu kořene v počátečních stádiích vývoje rostliny hořčice bíle. Cílem zkoušky je stanovení koncentrace, při které látka inhibuje právě 50 % testovaných kořenů při expoziční době 72 hodin. Tato inhibiční koncentrace se vyjadřuje jako 72 IC50 a uvádí se v jednotkách mg l. Jako testovací organismus byla použita semena hořčice bílé Sinapis alba L. (Brassicaeae), odrůda Veronika. Dodavatelem semen byla OSEVA UNI Choceň a.s., šlechtitelská stanice. Příprava standardní ředící vody použité pro test odpovídá normě ISO Pro její přípravu se používá kvalitní demineralizovaná voda, neobsahující inhibující koncentrace toxických látek. Pro každou řadu zkoušek se použije stejná šarže vody. Po přípravě se ředící voda provzdušňuje tak dlouho, až koncentrace rozpuštěného kyslíku odpovídá nasycení vzdušným kyslíkem. Potom se nechá 2 dny odstát. Hodnota ph takto připravené ředící vody je cca 7,8±0,2. Podmínky testování byly následující: teplota se v průběhu celého testu pohybovala v rozmezí 21±1,0 C. Test probíhal v termostatu bez osvětlení. Při nasazení testu bylo použito 30 ks semene na jedno ředění a na jednu Petriho misku. Nejprve se provede předběžná zkouška, která umožňuje stanovit koncentrační rozpětí, ve kterém bude zkouška probíhat. Pomocí ní se stanoví procento inhibice růstu kořene Sinapis alba. Pro každou koncentraci se použije nejméně 90 semen Sinapis alba ve třech Petriho miskách. Každá zkouška se provádí třikrát. Hodnoty IC 50 se vyhodnocují pro každou zkoušku a počítá se z nich průměr. Jednotlivá hodnoty IC 50 se nesmí od sebe lišit více než 30 %. Výsledky zkoušek se vyhodnocují pomocí počítačového programu. Výsledky se vyjadřují jako průměrná hodnota IC 50 za 72 hodin. Výsledky zkoušky jsou platné, pokud variabilita výsledků získaných po odečtu více Petriho misek jedné koncentrace není vyšší než 30 % Bakteriální test inhibice bioluminiscence Vibrio fischeri Zkouška je založena na určení koncentrace, která způsobuje 50% inhibici nebo stimulaci bioluminiscence světélkujících bakterií Vibrio fischeri (Photobacterium phoshoreum, 48

49 Vibrionaceae), vystavených toxickému působení posuzovaného toxikantu. Metoda je použitelná pro všechny typy vod i výluhů. Cílem zkoušky je stanovení koncentrace, při které látka inhibuje právě 50 % testované bakteriální kultury při expoziční době 15 a 30 minut. Tato inhibiční koncentrace se vyjadřuje jako EC 50 a uvádí se v jednotkách mg.l -1. Jako zkušební mikroorganismus byla použita zmrazená lyofilizovaná kultura bakterií Vibrio fischeri, připravená v laboratořích Mikrobiologického ústavu AV v Praze. V průběhu celého testu byl udržován testovací mikroorganismus při teplotě 15 C ± 1,0 C. Provedení zkoušky začíná přípravou zkušebního vzorku. Pro dosažení osmolarity odpovídající 2 % NaCl, přidáme ke vzorku vypočtené množství 22% roztoku NaCl nebo pevného NaCl. Připravený vzorek necháme temperovat na teplotu 15 C ± 1,0 C. Následně se připraví zásobní bakteriální suspenze tak, že k lyofilizátu Vibrio fischeri přidáme co nejrychleji 0,5 ml vychlazeného 2% chloridu sodného. Potom necháme minimálně 15 minut kulturu rehydratovat. Po rehydrataci zředíme zásobní suspenzi tak, aby 200 µl zředěné suspenze dávalo v luminimetru signál rovný asi 50 % až 90 % maximální hodnoty pro zvolený měřící rozsah. Vlastní měření začínáme předběžnou zkouškou, kterou se stanoví koncentrační rozmezí; obvykle se nasazuje 5 různých koncentrací v geometrické řadě vše ve dvou paralelních stanoveních. Základní zkouškou se stanoví procento inhibice bioluminiscence světélkujících bakterií Vibrio fischeri, vystavených toxickému působení zkoušené látky. Do zkumavek s různými koncentracemi testované látky se přidá kultura bakterií a změří se počáteční hodnota bioluminiscence. Po stanovené době působení (15, 30 minut) se znovu změří v každé zkumavce hodnota bioluminiscence. Výsledky zkoušek se vyhodnocují pomocí počítačového programu. Hodnoty EC 50 odpovídající 0% a 100% inhibici se vyjadřují u odpadních vod a výluhů v procentech ředění a u chemických látek v mg/l. Pokud nestačí údaje pro výpočet EC 50, uvede se nejvyšší dosažená míra inhibice v % a k ní příslušná koncentrace. Výsledky zkoušky jsou platné podle norem, jestliže variabilita jednotlivých naměřených paralelních výsledků je menší než 30 % a výsledky testu s referenční látkou (síran zinečnatý) musí odpovídat stanoveným limitům Alternativní test Thamnotoxkit Tento screeningový biotest byl vyvinut týmem prof. Dr. G. Petrsona na Státní Gentské Univerzitě v Belgii; 24h LC 50 biotest byl proveden v multišachtové testovací desce za použití II-III růstového stádia larev sladkovodního korýše Thamnocephalus platyurus, které jsou vylíhlé z cyst. Citlivost testu je dobře srovnatelná s mnoha bezobratlými. Protože každý Thamnotoxkikt obsahuje standardní testovací materiál, ředící vodu a cysty, je opakovatelnost pokusů velmi vysoká. Cysty mohou být skladovány v suchém stavu v chladničce přibližně při 5 C nejméně šest měsíců bez ztráty životaschopnosti. Ačkoliv jsou žábronožky nalézány jen poměrně zřídka v stálých vodních tělesech, principiálně mohou být přítomny v každé vodě jako planktonní korýš. Sladkovodní žábronožky, jako jejich halofilní homology, neodolávají tlaku predátorů, a proto se stahují do ekologicky méně extrémních lokalit; v tomto případě do dočasných vodních těles podléhajících cyklickému vysychání. V sadě jsou obsaženy ampule s koncentrovanými solnými roztoky, potřebné k přípravě standardní (uměle) sladké vody, která slouží jako medium pro inkubaci cyst a jako ředící médium pro přípravu sérií roztoků toxikantů. Litrová odměrná baňka se naplní přibližně 49

50 800 ml deionizované vody, do roztoku se přidají postupně obsahy 4 ampulí (NaHCO 3, CaSO 4, MgSO 4, KCl) v určeném pořadí a roztok se důkladně protřepe. Před samotnou inkubaci cyst je vhodné živné médium pomoci akvarijního kompresorku provzdušnit. Jeden litr standardní ředící vody postačuje pro provedení 6 kompletních biotestů každého Toxkitu. Před použitím je nutno médium opatrně (postupně) převést zpět na laboratorní teplotu. Inkubace cyst se provádí ve zředěném živném médiu (ředění 1:8 deionizovanou vodou). Zředění živného média sníží osmotický tlak, což vede k vyšší inkubační úspěšnosti cyst. Otevřená trubička s cystami se naplní živným médiem, trubička se uzavře a v pravidelných intervalech se po dobu 30 minut protřepává. Obsah kyvety s předhydratovanými cystami se přenese na jednu ze dvou Petriho misek, přidá se 10 ml zředěné ředící vody a opatrným kroužením se cysty rovnoměrně rozptýlí. Zakrytá Petriho miska se nechá inkubovat 20 až 22 hodin při 25 C, za kontinuálního osvětlení (světelný zdroj lx). Roztok toxikantů připravíme tak, že do 4 z pěti zkumavek nalijeme 5 ml ředící vody a do zbývající zkumavky dáme 10 ml vzorku, ze které pak 5 ml přeneseme do zkumavky 2, z té opět odebereme 5ml a postup opakujeme až ke zkumavce 5. Každá koncentrace toxikantu se přenese do všech šachet jednoho sloupce testovací desky. Šachty jsou označeny 1 až 6 horizontálně a A až D vertikálně. Do šachet označených číslem 1 se dá kontrola, do ostatních koncentrační řada s deseti jedinci Thamnocephalus platyurus. Test probíhá 24 hodin a vyhodnocuje se hodnota 24 LC Alternativní test Daphnotoxkit Tento alternativní test obsahuje vše potřebné pro provedení testu v setu, tj. všechny materiály, včetně ephippií (spící vajíčka) korýšů Daphnia magna, k provedení 6 testů akutní toxicity, a to v souladu se standardními metodami (např. OECD a ISO). Testy využívají novorozenců, kteří se vylíhnou za tři dni z těchto ephippií. Pro přípravu standardního živného média dáme do 2 litrové odměrné baňky deionizovanou vodu, přidáme obsah jedné ze dvou sad čtyř lahviček koncentrovaných roztoků solí, v pořadí 1 až 4 (podle přiloženého návodu). Po přidání roztoků solí se odměrná baňka doplní po rysku a protřepáním se médium zhomogenizuje. Dva litry standardní vody stačí pro kompletní provedení 3 biotestů. Ephippia by měla být nasazena 3 dny před zahájením samotného testu toxicity. Po vyjmutí ephippií je nutné je přenést do Petriho misky, kde se dafnie nechají tři dny líhnout při teplotě 20 až 22 C, při nepřetržitém osvětlení 6000 lx. Perloočky by měly být připraveny nejpozději do 90 hodin od začátku inkubace. Samotný test toxicity se provádí v jednorázových Petriho miskách s 30 jamkami. Každá deska je vybavena 4 jamkami pro kontrolu a 16 jamkami pro různé koncentrace pro stanovení toxicity. Do jamek se umístí koncentrační řada toxikantů a vylíhnuté perloočky se vždy po deseti jedincích mikropipetou přenesou do připravených jamek. 2.4 Příprava roztoků Základním roztokem používaným pro test akutní toxicity prováděný na členovcích a pro test inhibice kořene rostlin je ředící voda. Pro její přípravu se používá demineralizovaná voda. Připravená ředící voda se provzdušňuje tak dlouho, až koncentrace rozpuštěného kyslíku 50

51 odpovídá nasycení vzdušným kyslíkem. Poté se nechá 12 hodin odstát. Hodnota ph takto připravené ředící by měla být cca 7,8 ± 0,2. Pro přípravu ředící vody se používají čtyři základní roztoky: 1) CaCl 2.2H 2 0 (117,6 g/l), 2) MgSO 4.7H 2 0 (49,3 g/l), 3) NaHCO 3 (25,9 g/l), KCl (2,3 g/l). Ředící vodu je nutné spotřebovat do 2 měsíců od její přípravy. Pro zkoušku inhibice růstu řasy se připravuje živný roztok. Z čerstvě připravené demineralizované vody se připravují čtyři zásobní roztoky o následujícím složení: 1) roztok makroživin 1,50 g/l NH 4 Cl, 1,20 g/l MgCl 2.6H 2 O, 1,80g/l CaCl 2.2H 2 O, 1,50 g/l MgSO 4.7H 2 O a 0,16 g/l KH 2 PO 4 ; 2) zásobní roztok Fe EDTA, který obsahuje 80 mg/l FeCl 3.6H 2 0 a 100 mg/l Na 2 EDTA.2H 2 O; 3) zásobní roztok stopových prvků, který obsahuje 185 mg/l H 3 BO 3, 415 mg/l MnCl 2.4H 2 O, 3mg/l ZnCl 2, 1,5 mg/l CoCl 2.6H 2 O, 0,01 mg/l CuCl 2.2H 2 O a 7 mg/l Na 2 MoO 4.2H 2 O; 4) 50 g/l NaHCO 3. Tyto roztoky se skladují v temnu při 4 C. Smísením 100 ml zásobního roztoku makrolátek, 10 ml tří ostatních roztoků a doplněním demineralizovanou vodou na jeden litr se získá živné médium. Hodnota ph odpovídá 8,0 ± 0,2. Pokud je zapotřebí, tak se ph upraví pomocí NaOH nebo HCl. Pro bakteriální test inhibice bioluminiscence byly připraveny pouze dva roztoky, a to 200 ml roztoku NaCl o koncentraci 22 % a 500 ml 2% NaCl. Připravené roztoky byly uchovávány v chladu a před zkouškou byly temperovány na teplotu 15 C ± 1,0 C. Pro přípravu roztoků se vždy použila redestilovaná voda. Pro výrobu ředících médií pro alternativní testy Thamnotoxkit a Daphnotoxkit bylo pracováno přesně podle návodů dodaných s kity. Jejich popis je uveden přímo v příslušných kapitolách. 2.5 Příprava a zpracování vzorků Vzorky biologicky aktivních látek (analgetika) Pro provádění experimentu byla vybrána analgetika ibuprofen, paracetamol, kyselina acetylsalicylová a diklofenak, protože se jedná o komerčně nejprodávanější a nejčastěji aplikovaná analgetika v ČR. Velmi často lidé užívají pro potlačení bolesti i kombinaci dvou různých účinných látek; proto jsem se v první části práce zaměřil na ekotoxické účinky nejen jednotlivých analgetik, ale dvou léčiv, na základě předpokladu spolu aplikovaných. V rámci tohoto porovnání šlo o to zjistit, zda budou mít kombinace léčiv synergický (podpůrný) nebo antagonický (utlumující) efekt. Jako vzorky byly použity komerčně dodávané standardy léčiv. Pro porovnání synergických nebo antagonických efektů, byly vzorky smíchány v poměru 50 : Vzorky monomerů pro výrobu polyethylentereftalátu a bakelitu Polyethylentereftalát (PET) se syntetizuje z ethylenglykolu a kyseliny tereftalové. Ekotoxicita samotného polymeru bude stanovena nepřímo, tj. jako ekotoxicita směsi monomerů, ze kterých se polymer vyrábí a jako ekotoxicita produktů, na které se případně 51

52 rozpadá. Protože v přírodě dochází pouze k pozvolnému rozkladu polymeru, dá se s velkou pravděpodobností tvrdit, že posouzení ekotoxicity polymerů je diskutabilní. K provedení vlastního experimentu byly použity velmi čisté vzorky kyseliny tereftalové a ethylenglykolu rozpuštěné ve vodě. Bakelit, neboli fenolformaldehydová pryskyřice, se syntetizuje z monomerů formaldehydu a fenolu, tj. látek dobře mísitelných s vodou, a proto příprava vzorkovacích roztoků nevyžadovala žádné složité přípravy. Ekotoxicita PET byla posuzována tak, že nejprve byla stanovena u obou monomerů a následně potom ve směsi monomerů 50 : 50, z nichž se bakelit vyrábí. 52

53 3. VÝSLEDKY V následující části jsou prezentovány tabulky a grafy jednotlivých testů toxicity pro sledované analyty. Pro živočišné organismy byla aplikována rovněž probitová analýza. 3.1 Výsledky testů na členovci Daphnia magna, standardní test Biologicky aktivní látky včetně směsí (analgetika) Tab. 1: Úhyn Daphnia magna v jednotlivých koncentracích testované látky ASA ASA c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) mortalita(%) probity 100 2,0 8 3, , , , , , , , , , , , ,881 Graf 1: Graf závislosti úhynu testovaných organismů na koncentraci testované látky Výsledná průměrná hodnota 48h EC 50 = 348,7 mg.l -1 ASA. 53

54 Tab. 2: Úhyn Daphnia magna v jednotlivých koncentracích testované látky paracetamol paracetamol c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) mortalita (%) probity 10 1,0 10 3, , , , , , , , , , , , ,282 Graf 2: Graf závislosti úhynu testovaných organismů na koncentraci testované látky Výsledná průměrná hodnota 48h EC 50 = 69,98 mg.l -1 paracetamolu. 54

55 Tab. 3: Úhyn Daphnia magna v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek ibuprofen a diklofenak Ibuprofen/diklofenak c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) mortalita (%) probity 10 1,0 15 3, , , , , ,0 45 4, , , , , , ,751 Graf 3: Graf závislosti úhynu testovaných organismů na koncentraci testované látek Výsledná průměrná hodnota 48h EC 50 = 92,32 mg.l -1 směsi ibuprofenu a diklofenaku. 55

56 Monomery pro polymery polyethylentereftalát a bakelit včetně směsí Tab. 4: Úhyn Daphnia magna v jednotlivých koncentracích testované látky DMTF DMTF c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) mortalita (%) probity 1 0,0 2 2, , , ,0 32 4, , , , , , , , ,476 Graf 4: Graf závislosti úhynu testovaných organismů na koncentraci testované látky Výsledná průměrná hodnota 48h EC 50 = 12,53 mg.l -1 DMTF. 56

57 Tab. 5: Úhyn Daphnia magna v jednotlivých koncentracích testované látky glykol glykol c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) mortalita (%) probity 1 0,0 4 3, , , , , , , , ,44 6 0, , , ,647 Graf 5: Graf závislosti úhynu testovaných organismů na koncentraci testované látky Výsledná průměrná hodnota 48h EC 50 = 3,45 mg.l -1 glykolu. 57

58 Tab. 6: Úhyn Daphnia magna v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek DMTF a glykol. glykol/dmtf c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) mortalita (%) probity 2 0, , , , , , , , , , , , , ,054 Graf 6: Graf závislosti úhynu testovaných organismů na koncentraci testovaných látek Výsledná průměrná hodnota 48h EC 50 = 9,16 mg.l -1 směsi DMTF a glykol. 58

59 3.2 Výsledky testů na členovci Daphnia magna, alternativní test (Daphnotoxkit) Biologicky aktivní látky včetně směsí (analgetika) Tab. 7: Úhyn Daphnia magna v jednotlivých koncentracích testované látky diklofenaku diklofenak c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) mortalita (%) probity 10 1,0 7 3, , , , , , , , , , , , ,878 Graf 7: Graf závislosti úhynu testovaných organismů na koncentraci testované látky Výsledná průměrná hodnota 48h EC 50 = 79,68 mg.l -1 diklofenaku. 59

60 Tab. 8: Úhyn Daphnia magna v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek ibuprofen a diklofenak Ibuprofen/diklofenak c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) mortalita (%) probity 10 1,0 8 3, , , , , , , , , , , , ,751 Graf 8: Graf závislosti úhynu testovaných organismů na koncentraci testované látek Výsledná průměrná hodnota 48h EC 50 = 104,4 mg.l -1 směsi ibuprofenu a diklofenaku. 60

61 Tab. 9: Úhyn Daphnia magna v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek ibuprofen a ASA. Ibuprofen/ASA c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) mortalita (%) probity 50 1, , , , , , ,0 52 5, , , , , , ,881 Graf 9: Graf závislosti úhynu testovaných organismů na koncentraci testované látek Výsledná průměrná hodnota 48h EC 50 = 227,4 mg.l -1 směsi ibuprofenu a ASA. 61

62 Monomery pro polymery polyethylentereftalát a bakelit včetně směsí Tab. 10: Úhyn Daphnia magna v jednotlivých koncentracích testované látky glykol glykol c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) mortalita (%) probity 1 0,0 4 3, , , , , , , , , , , , ,054 Graf 10: Graf závislosti úhynu testovaných organismů na koncentraci testované látky Výsledná průměrná hodnota 48h EC 50 = 3,42 mg.l -1 glykolu. 62

63 Tab. 11: Úhyn Daphnia magna v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek fenol a formaldehyd. formaldehyd/fenol c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) mortalita (%) probity 0,1-1,00 2 2,946 0,5-0, , ,0 45 4,876 1,5 0, , , ,772 2,5 0, , , ,878 Graf 11: Graf závislosti úhynu testovaných organismů na koncentraci testovaných látek Výsledná průměrná hodnota 48h EC 50 = 0,83 mg.l -1 směsi fenolu a formaldehydu. 48h EC 50 = 9,22 mg.l -1 směsi DMTF a glykol. 63

64 3.3 Výsledky testů inhibice růstu na řase Desmodesmus subspicatus Biologicky aktivní látky včetně směsí (analgetika) Tab. 12: Inhibice růstu Desmodesmus subspicatus v jednotlivých koncentracích testované látky ASA ASA c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 100 2, , , , , , , Graf 12: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testované látky Výsledná průměrná hodnota 72h IC 50 = 356,6 mg.l -1 ASA. 64

65 Tab. 13: Inhibice růstu Desmodesmus subspicatus v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek ibuprofen a diklofenak Ibuprofen/diklofenak c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 50 1, , , , , , , Graf 13: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testované látek Výsledná průměrná hodnota 72h IC 50 = 162,3 mg.l -1 směsi ibuprofenu a diklofenaku. 65

66 Tab. 14: Inhibice růstu Desmodesmus subspicatus v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek ibuprofen a paracetamol. Ibuprofen/paracetamol c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 10 1, , , , , , , Graf 14: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testované látek Výsledná průměrná hodnota 72h IC 50 = 110,8 mg.l -1 směsi ibuprofenu a paracetamolu. 66

67 Tab. 15: Inhibice růstu Desmodesmus subspicatus v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek diklofenak a paracetamol. diklofenak/paracetamol c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 10 1, , , , , , , Graf 15: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testované látek Výsledná průměrná hodnota 72h IC 50 = 102,9 mg.l -1 směsi diklofenaku a paracetamolu. 67

68 Tab. 16: Inhibice růstu Desmodesmus subspicatus v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek ASA a paracetamol. ASA/paracetamol c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 100 2, , , , , , , Graf 16: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testované látek Výsledná průměrná hodnota 72h IC 50 = 228,0 mg.l -1 směsi ASA a paracetamolu. 68

69 3.3.2 Monomery pro polymery polyethylentereftalát a bakelit včetně směsí Tab. 17: Inhibice růstu Desmodesmus subspicatus v jednotlivých koncentracích testované látky fenol fenol c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 0,01-2,0 6 0,05-1, ,1-1,0 39 0,5-0, , , ,0 95 Graf 17: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testované látky Výsledná průměrná hodnota 72h IC 50 = 0,32 mg.l -1 fenolu. 69

70 Tab. 18: Inhibice růstu Desmodesmus subspicatus v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek fenol a formaldehyd. formaldehyd/fenol c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 0,1-1,0 7 0,2-0, ,3-0, ,4-0, ,5-0, ,6-0, ,7-0, Graf 18: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testovaných látek Výsledná průměrná hodnota 72h EC 50 = 0,33 mg.l -1 směsi fenolu a formaldehydu. 70

71 3.4 Výsledky testů inhibice růstu kořene rostliny Sinapis alba Biologicky aktivní látky včetně směsí (analgetika) Tab. 19: Inhibice růstu kořene Sinapis alba v jednotlivých koncentracích testované látky ibuprofenu Ibuprofen c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 100 2, , , , , , , Graf 19: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testované látky Výsledná průměrná hodnota 72h EC 50 = 324,6 mg.l -1 ibuprofenu. 71

72 Tab. 20: Inhibice růstu kořene Sinapis alba v jednotlivých koncentracích testované látky paracetamol paracetamol c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 100 2, , , , , , , Graf 20: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testované látky Výsledná průměrná hodnota 72h IC 50 = 296,4 mg.l -1 parcetamolu. 72

73 Tab. 21: Inhibice růstu kořene Sinapis alba v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek ibuprofen a diklofenak Ibuprofen/diklofenak c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 100 2, , , , , , , Graf 21: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testované látek Výsledná průměrná hodnota 72h IC 50 = 329,8 mg.l -1 směsi ibuprofenu a diklofenaku. 73

74 Tab. 22: Inhibice růstu kořene Sinapis alba v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek diklofenak a paracetamol. diklofenak/paracetamol c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 100 2, , , , , , , Graf 22: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testované látek Výsledná průměrná hodnota 72h IC 50 = 331,8 mg.l -1 směsi diklofenaku a paracetamolu. 74

75 Tab. 23: Inhibice růstu kořene Sinapis alba v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek ASA a paracetamol. ASA/paracetamol c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 100 2, , , , , , , Graf 23: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testované látek Výsledná průměrná hodnota 72h EC 50 = 342,4 mg.l -1 směsi ASA a paracetamolu. 75

76 3.4.2 Monomery pro polymery polyethylentereftalát a bakelit včetně směsí Tab. 24: Inhibice růstu kořene Sinapis alba v jednotlivých koncentracích testované látky DMTF DMTF c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 10 1, , , , , , , Graf 24: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testované látky Výsledná průměrná hodnota 72h IC 50 = 42,75 mg.l -1 DMTF. 76

77 Tab. 25: Inhibice růstu kořene Sinapis alba v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek fenol a formaldehyd. formaldehyd/fenol c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 1 0, , , , , , , Graf 25: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testovaných látek Výsledná průměrná hodnota 72h IC 50 = 13,17 mg.l -1 směsi fenolu a formaldehydu. 77

78 Tab. 26: Inhibice růstu kořene Sinapis alba v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek DMTF a glykol. DMTF/glykol c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 1 0, , , , , , , Graf 26: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testovaných látek Výsledná průměrná hodnota 72h IC 50 = 13,61 mg.l -1 směsi DMTF a glykol. 78

79 3.5 Výsledky bakteriálních testů inhibice bioluminiscence Biologicky aktivní látky včetně směsí (analgetika) Tab. 27: Inhibice bioluminiscence bakteriální kultury Vibrio fischeri v jednotlivých koncentracích testované látky ibuprofenu Ibuprofen c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 50 1, , , , , , , Graf 27: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testované látky Výsledná průměrná hodnota IC 50 = 240,2 mg.l -1 ibuprofenu. 79

80 Tab. 28: Inhibice bioluminiscence bakteriální kultury Vibrio fischeri v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek ibuprofen a ASA. Ibuprofen / ASA c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 100 2, , , , , , , Graf 28: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testované látek Výsledná průměrná hodnota IC 50 = 337,0 mg.l -1 směsi ibuprofenu a ASA. 80

81 Tab. 29: Inhibice bioluminiscence bakteriální kultury Vibrio fischeri v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek ibuprofen a paracetamol. Ibuprofen / paracetamol c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 50 1, , , , , , , Graf 29: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testované látek Výsledná průměrná hodnota IC 50 = 250,5 mg.l -1 směsi ibuprofenu a paracetamolu. 81

82 3.5.2 Monomery pro polymery polyethylentereftalát a bakelit včetně směsí Tab. 30: Inhibice bioluminiscence bakteriální kultury Vibrio fischeri v jednotlivých koncentracích testované látky DMTF DMTF c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 10 1, , , , , , , Graf 30: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testované látky Výsledná průměrná hodnota IC 50 = 36,00 mg.l -1 DMTF. 82

83 Tab. 31: Inhibice bioluminiscence bakteriální kultury Vibrio fischeri v jednotlivých koncentracích testované látky glykol glykol c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 1 0, , , , , , , Graf 31: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testované látky Výsledná průměrná hodnota IC 50 = 13,51 mg.l -1 glykolu. 83

84 Tab. 32: Inhibice bioluminiscence bakteriální kultury Vibrio fischeri v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek DMTF a glykol. glykol / DMTF c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) inhibice (%) 5 0, , , , , , , Graf 32: Graf závislosti inhibice testovaných organismů na koncentraci testovaných látek Výsledná průměrná hodnota IC 50 = 17,07 mg.l -1 směsi DMTF a glykol. 84

85 3.6 Výsledky testů akutní toxicity na vodním členovci Thamnocephalus platyurus (thamnotoxkit) Biologicky aktivní látky včetně směsí (analgetika) Tab. 33: Úhyn Thamnocephalus platyurus v jednotlivých koncentracích testované látky ASA ASA c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) mortalita (%) probity 100 2,0 5,8 3, ,301 11,1 3, ,477 20,7 4, ,602 42,3 4, ,699 63,6 5, ,778 78,2 5, ,845 87,6 6,126 Graf 33: Graf závislosti úhynu testovaných organismů na koncentraci testované látky Výsledná průměrná hodnota 24h EC 50 = 384,6 mg.l -1 ASA. 85

86 Tab. 34: Úhyn Thamnocephalus platyurus v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek diklofenak a ASA. diklofenak/asa c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) mortalita (%) probity 50 1, , ,0 19 4, , , , , , , , , , ,878 Graf 34: Graf závislosti úhynu testovaných organismů na koncentraci testované látek Výsledná průměrná hodnota 24h EC 50 = 164,6 mg.l -1 směsi diklofenaku a ASA. 86

87 Tab. 35: Úhyn Thamnocephalus platyurus v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek diklofenak a paracetamol. diklofenak/paracetamol c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) mortalita (%) probity 25 1, , , , , , ,0 50 5, , , , , , ,326 Graf 35: Graf závislosti úhynu testovaných organismů na koncentraci testované látek Výsledná průměrná hodnota 24h EC 50 = 82,99 mg.l -1 směsi diklofenaku a paracetamolu. 87

88 3.6.2 Monomery pro přípravu polymerů polyethylentereftalát a bakelit včetně směsí Tab. 36: Úhyn Thamnocephalus platyurus v jednotlivých koncentracích testované látky fenol fenol c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) mortalita (%) probity 0,01-2,0 4 3,249 0,05-1, ,122 0,1-1,0 36 4,624 0,5-0, , ,0 63 5, , , ,0 98 7,054 Graf 36: Graf závislosti úhynu testovaných organismů na koncentraci testované látky Výsledná průměrná hodnota 24h EC 50 = 0,37 mg.l -1 fenolu. 88

89 Tab. 37: Úhyn Thamnocephalus platyurus v jednotlivých koncentracích směsi testovaných látek fenol a formaldehyd. formaldehyd/fenol c (mg.l -1 ) log c (mg.l -1 ) mortalita (%) probity 0,1-1,0 8 3,595 0,5-0, , ,0 41 4,772 1,5 0, , , ,468 2,5 0, , , ,054 Graf 37: Graf závislosti úhynu testovaných organismů na koncentraci testovaných látek Výsledná průměrná hodnota 24h EC 50 = 0,95 mg.l -1 směsi fenolu a formaldehydu. 89

90 4. DISKUZE 4.1 Výsledky porovnání ekotoxicity vybraných analgetik a jejich kombinací V první části práce bylo prováděno srovnání ekotoxicity vybraných analgetik šesti vybranými testy toxicity. Výsledné hodnoty jsou přehledně uspořádány do následující tabulky: Tab. 38: Porovnání výsledných hodnot ekotoxicity vybraných analgetik a jejich kombinací v mg.l -1 analyty 48h EC50 Dafnia st. 48h EC50 Dafnia al. 72h EC50 Scenedesmus 72h IC50 Sinapis IC 50 Vibrio 24h EC50 Thamnocep. dichroman 1,13 1,19 0,74 36,62 14,14 1,19 ibuprofen 144,2 145,0 125,3 324,6 240,2 104,5 diklofenak 83,92 79,68 83,7 309,9 251,5 69,87 ASA 348,7 362,0 356,6 346,0 595,0 384,6 paracetamol 69,98 64,16 133,6 296,4 250,4 76,92 IBU / DIK 92,32 104,4 162,3 329,8 231,8 100,0 IBU / ASA 222,5 227,4 214,3 335,0 337,0 174,6 IBU / PAR 117,9 119,5 110,8 318,8 250,5 83,40 DIK / ASA 87,81 82,74 223,1 330,0 454,9 164,6 DIK / PAR 98,20 99,59 102,9 331,8 233,7 82,99 ASA / PAR 83,38 82,96 228,0 342,4 364,8 167,4 Graf 38: Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí léčiv zjištěných teoretickým součtem a stanovením pomocí organismu Daphnia magna Pomocí grafu 38 byl porovnán teoretický součet toxicit všech binárních směsí analgetik s naměřenou toxicitou pro organismus Daphnia magna (zjištěno pomocí standardního testu). 90

91 Z naměřených hodnot vyplývá, že směsi ibuprofenu s kyselinou acetylsalicylovou, ibuprofenu s paracetamolem a diklofenaku s paracetamolem vykazují spíše aditivní účinek, kdy rozdíl mezi uvedenými hodnotami lze považovat za marginální. Antagonický účinek vykazují směsi diklofenaku s kyselinou acetylsalicylovou a kyselina acetylsalicylová s paracetamolem. Rozdíl mezi hodnotami směsi ibuprofenu a diklofenaku je již větší, avšak rozdíl je pořád málo významný; stanovení pomocí alternativního testem Daphnotoxkit (viz níže) již vychází aditivně, oba testy u ostatních směsí vycházejí podobně, a proto se dá usuzovat na to, že směs ibuprofenu a diklofenaku vykazuje aditivní účinek toxicity na organismus Daphnia magna. Prostřednictvím grafu 39 bylo provedeno porovnání teoretického součtu toxicit všech binárních směsí analgetik se stanovenou toxicitou pro organismus Daphnia magna pomocí alternativního testu Daphnotoxkit F. Z naměřených hodnot vyplývá, že směsi ibuprofenu s kyselinou acetylsalicylovou, ibuprofenu s paracetamolem a diklofenaku s paracetamolem vykazují spíše aditivní účinek, protože rozdíl mezi uvedenými hodnotami lze považovat za marginální. Antagonický účinek vykazují směsi diklofenaku s kyselinou acetylsalicylovou a kyselina acetylsalicylová s paracetamolem. Graf 39: Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí léčiv zjištěných teoretickým součtem a stanovením pomocí alternativního testu Daphnotoxkit F. Podobné porovnání teoretického součtu toxicit všech binárních směsí analgetik se stanovenou toxicitou pro organismus Desmodesmus subspatiens je prezentováno na grafu 40. U organismu Desmodesmus subspatiens se projevují směsi léčiv ibuprofen a kyselina acetylsalicylová, ibuprofen a paracetemol, diklofenak a kyselina acetylsalicylová a kyselina acetylsalicylová s paracetamolem aditivně. Směs léčiv ibuprofenu s diklofenakem má však efekt silně synergický, zatímco směs ibuprofenu a paracetamolu neposkytuje jednoznačný výsledek, nelze se přiklonit ani k aditivnímu ani k synergickému efektu. 91

92 Graf 40: Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí léčiv zjištěných teoretickým součtem a stanovením pomocí organismu Desmodesmus subspatiens Porovnání teoretického součtu toxicit všech binárních směsí analgetik se stanovenou toxicitou pro organismus Sinapis alba je prezentováno pomocí grafu 41. U organismu Sinapis alba vykazuji aditivní účinky směsi léčiv ibuprofen s kyselinou acetylsalicylovou a diklofenak s kyselinou acetylsalicylovou, zatímco směs diklofenaku s paracetamolem a kyseliny acetylsalicylové s paracetamolem vykazují efekt synergický. Spíše synergický efekt vykazuje rovněž směs ibuprofenu s diklofenakem. U směsi ibuprofenu s paracetamolem nelze rovněž jednoznačně říci, zda je výsledný efekt synergický nebo aditivní. Graf 41: Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí léčiv zjištěných teoretickým součtem a stanovením pomocí organismu Sinapis alba 92

93 Podobné porovnání teoretického součtu toxicit všech binárních směsí analgetik s naměřenou toxicitou pro organismus Vibrio fischeri je uvedeno na grafu 42. U organismu Vibrio fischeri vykazují prakticky všechny směsi léčiv aditivní účinek, kromě směsi ibuprofenu s kyselinou acetylsalicylovou, kde nelze účinek jednoznačně určit. Graf 42: Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí léčiv zjištěných teoretickým součtem a stanovením pomocí organismu Vibrio fischeri Graf 43: Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí léčiv zjištěných teoretickým součtem a stanovením pomocí organismu Thamnocephalus platyurus 93

94 Pomocí grafu 43 bylo provedeno porovnání teoretického součtu toxicit všech binárních směsí analgetik s naměřenou toxicitou pro organismus Thamnocephalus platyurus. U organismu Thamnocephalus platyurus vykazují aditivní účinky směsi léčiv ibuprofen s diklofenakem, ibuprofenu s paracetamolem a diklofenak s paracetamolem. Ostatní směsi vykazují spíše antagonické efekty. Při porovnání citlivosti metod bylo prokázáno, že nejcitlivějšími organismy jsou vodní členovci, nejméně citlivé byly testy na organismu Sinapis alba a na bakteriích Vibrio fischeri. Bylo prokázáno, že nejvyšší ekotoxicitu měl paracetamol (nejvyšší hodnoty byly naměřeny pomocí Daphnia magma a Sinapis alba) a diklofenak, který měl velmi podobnou ekotoxicitu jako paracetamol; výsledky se však většinou lišily jen v jednotkách. Kyselina acetylsalicylová měla naopak u všech testů jednoznačně nejnižší ekotoxicitu; důvodem může být také to, že se zde, na rozdíl od ostatních léčiv, posuzovala obsahová látka extrahovaná z přírodních matric, nejednalo se o účinnou látku synteticky vyráběnou. Budeme-li posuzovat biologické efekty jednotlivých léčiv, tak obecně antagonický efekt lze na podkladě výsledků konstatovat právě u kyseliny acetylsalicylové, která, pokud je součástí směsi, tak snižuje ekotoxicitu ostatním léčivům, protože výsledná hodnota ekotoxicity směsi léčiv odpovídá vesměs hodnotě kyseliny acetylsalicylové. Toto tvrzení však neplatí pro její směs s diklofenakem a paracetamolem, kde se v obou testech na vodních členovcích Daphnia magna konečná hodnota ekotoxicity spíše přibližovala hodnotě zjištěné u diklofenaku a paracetamolu; pravděpodobně to znamená, že paracetamol a diklofenak vykazují synergický efekt vůči kyselině acetylsalicylové. 4.2 Ekotoxicita polyethylentereftalátu a bakelitu V druhé části práce byly posuzovány výsledky získané měřením ekotoxicity polymerů bakelitu a PET, a to nepřímou metodou spočívající v tom, že byla hodnocena ekotoxicita monomerů, ze kterých se uvedené polymery vyrábějí. Výsledky měření jsou prezentovány v následující přehledné tabulce: Tab. 39: Výsledné hodnoty ekotoxicity monomerů a jejich kombinací 48h EC50 Dafnia st. 48h EC50 Dafnia al. 72h EC50 Scenedesmus 72h IC50 Sinapis IC 50 Vibrio 24h EC50 Thamnocep. fenol 0,85 1,16 0,32 9,92 10,59 0,37 formaldehyd 1,60 1,03 1,14 13,79 13,58 1,19 DMTF 12,53 12,58 7,48 42,75 36,00 13,84 glykol 3,45 3,49 1,18 14,27 13,51 19,03 form./fenol 0,80 0,82 0,33 13,17 9,11 0,95 DMTF/glyk. 9,16 9,22 3,03 13,61 17,07 12,29 V grafu 44 je prezentováno porovnání teoretického součtu toxicit všech binárních směsí analgetik se stanovenou toxicitou pro organismus Daphnia magna s využitím standardního testu. Obě směsi vykazovaly aditivní účinek, a to jak směs formaldehydu a fenolu, tak také směs DMTF s glykolem. 94

95 Graf 44: Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí monomerů zjištěných teoretickým součtem a stanovením pomocí organismu Daphnia magna Pomocí grafu 45 bylo provedeno porovnání teoretického součtu toxicit všech binárních směsí monomerů se stanovenou toxicitou pro organismus Daphnia magna zjištěnou pomocí alternativního testu Daphnotoxkit F. Obě směsi vykazují aditivní účinek, jak směs formaldehydu a fenolu, tak rovněž směs DMTF s glykolem. Graf 45: Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí monomerů zjištěných teoretickým součtem a stanovením pomocí organismu Daphnia magna s využitím alternativního testu Daphnotoxkit 95

96 V grafu 46 je zaznamenané Porovnání teoretického součtu toxicit všech binárních směsí monomerů se stanovenou toxicitou pro organismus Desmodesmus subspatiens je prezentováno v grafu 46. U organismu Desmodesmus subspatiens vykazuje směs formaldehydu s fenolem efekt aditivní a směs DMTF s glykolem mírně antagonický efekt. Graf 46: Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí monomerů zjištěných teoretickým součtem a stanovením pomocí organismu Desmodesmus subspatiens Graf 47 Graf porovnání hodnot toxicit binárních směsí monomerů zjištěných teoretickým součtem a stanovením pomocí organismu Sinapis alba 96