STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY METODOU FOTOCHEMILUMINISCENCE NA PŘÍSTROJI PHOTOCHEM

Transkript

1 STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY METODOU FOTOCHEMILUMINISCENCE NA PŘÍSTROJI PHOTOCHEM ANTIOXIDAČNÍ KAPACITA ČAJŮ Princip metodiky: Analyzátor Photochem je určen pro stanovení antioxidační kapacity vybraných komodit rostlinného i živočišného původu a krevní plasmy. Analýza je založená na fotochemiluminescenci, která je využita pro stanovení antioxidační kapacity antioxidantů rozpustných ve vodě (ACW) a antioxidační kapacity antioxidantů rozpustných v tucích (ACL) a umožňuje kvantifikaci antioxidačního stavu. Princip měření je založen na produkci volných radikálů optickou excitací fotosensitivního roztoku (je součástí setu pro analýzu). Tyto radikály jsou částečně eliminovány reakcí s antioxidanty ve vzorku. Zbylé radikály vyvolávají luminiscenci, která je detekována detektorem a využita pro stanovení antioxidační kapacity vzorku. Výsledky jsou kvantifikovány srovnáním s kalibrační křivkou a vyjádřeny jako ekvivalenty standardu (využitého ke kalibraci) a to Troloxu (analog vitaminu E) pro ACL antioxidanty a jako ekvivalenty kyseliny askorbové pro ACW antioxidanty. Výsledky jsou vyhodnoceny softwarem PCLSoft a vyjádřeny jako ekvivalenty standardu v nmol/l, případně v μmol/l spolu s relativní směrodatnou odchylkou (RSD) vyjádřenou v procentech. STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY ANTIOXIDANTŮ ROZPUSTNÝCH VE VODĚ (ACW) Složení setu pro stanovení ACW: - Činidlo R1 diluent (sample solvent, ředidlo) nutno uchovávat při 4 ºC (v chladničce) - Činidlo R2 reaction buffer (pufr) nutno uchovávat při 4 ºC (v chladničce) - Činidlo R3 fotosensitivní roztok - uchováván při -20 ºC a po naředění při 4 ºC 1

2 - Činidlo R4 standard kyselina askorbová - uchováván při -20 ºC Činidlo R3 (fotosensitivní roztok) je nutno před vlastní analýzou nechat rozpustit při laboratorní teplotě a následně naředit 750 μl činidla R2. Tím je činidlo R3 dostatečné pro 40 stanovení. Je nutné jej uchovávat v temnu a chladu (cca 4 ºC) a to i při vlastní analýze, protože je velmi citlivý na světlo. Kalibrace Kalibrace, respektive příprava kalibrační přímky, je provedena pomocí ředění standardního roztoku. - příprava zásobního roztoku (10 nmol/l) - rozpuštěním standardu (zamražený a vysušený) v 500 μl činidla R1 - příprava pracovního roztoku R5 (0,1 nmol/l) naředěním zásobního roztoku 1:100 (10 μl zásobního roztoku a 990 μl činidla R1) činidlem R1 Dále je nutno sestrojit kalibrační křivku na základě série měření standardů kyseliny askorbové v rozmezí 0,2 2,5 nmol (to je 2 25 μl pracovního roztoku) metodou lineární. Před každým měřením je nutno stabilizovat přístroj měřením slepých vzorků (minimálně 3x) a následně jednoho ze standardů, využitých pro kalibraci. Preanalytická příprava vzorku Vzorky je možné používat od koncentrovaných až po ředěných 1:500 (po předchozí filtraci na odstranění případných nečistot). Mohou se používat vzorky čajů granulovaných, sáčkových, sypaných i čajů ledových. Při přípravě vzorků je důležité zachovat stejný postup přípravy, včetně použitého množství. Je možné sledovat celkovou antioxidační kapacitu a také její změnu v závislosti na době a teplotě vyluhování, teplotě a způsobu skladování atd. skladování. 2

3 Vzorky se ředí v činidle R1 a dále se pokračuje dle tabulky: Činidlo [ml] R1 R2 R3 R5 Vzorek Slepý vzorek 1,5 1 0, Kalibrace 1,5-X 1 0,025 X (0,002-0,025) Měření 1,5-Y 1 0,025 0 Y 0 VÝSLEDKY Pomocí softwaru PCLSoft je vytvořena kalibrační přímka, vyjádřena její rovnice včetně R 2 koeficientu. Na jejím základě jsou výsledky vzorků čajů vyjádřeny jako ekvivalenty kyseliny askorbové v nmol/l nebo μmol/l. Doporučuje se každý vzorek měřit jako triplikát, standardy 2-3x a slepý do ustálení přístroje. STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY ANTIOXIDANTŮ ROZPUSTNÝCH V TUCÍCH (ACL) Složení setu pro stanovení ACL: - Činidlo R1 diluent (sample solvent, ředidlo) METHANOL - Činidlo R2 reaction buffer (pufr) nutno uchovávat při 4 ºC (v chladničce) - Činidlo R3 fotosensitivní roztok - uchováván při -20 ºC a po naředění při 4 ºC - Činidlo R4 standard Trolox = ve vodě rozpustný analog vitaminu E - uchováván při - 20 ºC Činidlo R3 (fotosensitivní roztok) je nutno před vlastní analýzou nechat rozpustit při laboratorní teplotě a následně naředit 750 μl činidla R2. Tím je činidlo R3 dostatečné pro 40 3

4 stanovení. Je nutné jej uchovávat v temnu a chladu (cca 4 ºC) a to i při vlastní analýze, protože je velmi citlivý na světlo. Kalibrace Kalibrace, respektive příprava kalibrační přímky, je provedena pomocí ředění standardního roztoku. - příprava zásobního roztoku (10 nmol/l) - rozpuštěním standardu (zamražený a vysušený) v 500 μl činidla R1 - příprava pracovního roztoku R5 (0,1 nmol/l) naředěním zásobního roztoku 1:100 (10 μl zásobního roztoku a 990 μl činidla R1) činidlem R1 Dále je nutno sestrojit kalibrační křivku na základě série měření standardů Troloxu v rozmezí 0,2 2,5 nmol (to je 2 25 μl pracovního roztoku) metodou lineární regrese. Před každým měřením je nutno stabilizovat přístroj měřením slepých vzorků (minimálně 3x) a následně jednoho ze standardů, využitých pro kalibraci. Preanalytická příprava vzorku Vzorky je možné používat od koncentrovaných až po ředěných 1:500 (po předchozí filtraci na odstranění případných nečistot). Mohou se používat vzorky čajů granulovaných, sáčkových, sypaných i čajů ledových. Při přípravě vzorků je důležité zachovat stejný postup přípravy, včetně použitého množství. Je možné sledovat celkovou antioxidační kapacitu a také její změnu v závislosti na době a teplotě vyluhování, teplotě a způsobu skladování atd. skladování. Činidlo [ml] R1 R2 R3 R5 Vzorek Slepý vzorek 2,3 0,2 0, Kalibrace 2,3-X 0,2 0,025 X (0,002-0,025) Měření 2,3-Y 0,2 0,025 0 Y 0 4

5 VÝSLEDKY Pomocí softwaru PCLSoft je vytvořena kalibrační přímka, vyjádřena její rovnice včetně R 2 koeficientu. Na jejím základě jsou výsledky vzorků čajů vyjádřeny jako ekvivalenty Troloxu v nmol/l nebo μmol/l. Doporučuje se každý vzorek měřit jako triplikát, standardy 2-3x a slepý do ustálení přístroje. Poznámka: Uvedené metodiky je možné využít pro stanovení antioxidační kapacity ledových čajů, respektive nápojů s extrakty čajů a čajů granulovaných, kde je nutno se držet doporučení výrobce z hlediska dávkování a případné doporučené teploty. I zde je doporučené vzorky přefiltrovat přes filtrační papír. U čajů sypaných je nutné se držet nejen dávkování, ale i doporučené teploty pro zalití čajové směsi, doby louhování a případně dalšího přelití. Využití přístroje Photochem pro tyto analýzy je mnohostranné, protože je zde možné sledovat více hledisek, ovlivňujících antioxidační kapacitu sypaných čajů. 5

6 Obr. 1. Naměřené křivky slepého vzorku (blanku) a kalibračních standardů pro stanovení ACW antioxidační kapacity. Slepý vzorek (A) a standardy (B, C, D, E). Obr. 2. Naměřené křivky slepého vzorku (blanku) a kalibračních standardů pro stanovení ACL antioxidační kapacity. Slepý vzorek (A) a standardy (B, C, D, E). 6

7 Obr. 3. Příklad kalibrační křivky (lineární regrese) kyseliny askorbové, stanovení ACW. Obr. 4. Příklad kalibrační křivky (lineární regrese) Troloxu, stanovení ACL. 7