TRANSGENOZE ROSTLIN. vnášení cizorodých genů či jiné genetické informace do rostlin a manipulace s nimi (GMO)

Transkript

1 TRANSGENOZE ROSTLIN vnášení cizorodých genů či jiné genetické informace do rostlin a manipulace s nimi (GMO)

2 transformace rostlinné buňky TRANSGENOZE trvalá - změna genetické informace je přenášená na potomstvo (infekce Agrobacteriem tumefaciens) TRANSGENOZE dočasná - genetická informace je změněna pouze u vegetativní části rostliny a nepřenáší se na potomstvo (biolistické metody, virální infiltrace)

3 Agrobacterium tumefaciens patogenní bakterie přirozeně se vyskytující v kořenovém systému bobovitých rostlin přítomnost baktérie se projevuje tumory tzv. crown gall tissue Agrobacterium je schopné napadat jakékoliv pletivo většiny dvouděložných rostlin a za určitých podmínek i rostlin jednoděložných

4 Ti plazmid (tumor inducing) Agrobacteria tumefaciens (200 kb) ipt,aux,nop syntéza cytokininů auxinů opinů nopalin další geny pro biosyntézu cytokininů, permeasy, přenašeče přes membránu, enzymy metabolizující opiny a ostatní enzymy umožňující infekci

5 rostlina při zranění produkuje fenolické látky (acetosyringon), ty se váží na specifické receptory na membráně Agrobacteria VirA a způsobují transkripci genu s vir regionu Ti plazmidu Agrobacteria

6 aktivace vir regulonu VirD2 protein se váže na 5 T-DNA (transferred) denaturace ss T-DNA z Ti plazmidu VirE2 proteiny stabilizují ss T-DNA VirD2 a VirE2 proteiny obsahují sekvenci potřebnou pro cílení do jádra rostlinné buňky VirE2 se váže na proteiny VIP1 a VIP2 které zacílí T-DNA řetězec do chromatinu rostlinného chromozomu

7 začlenění T-DNA do chromozomu začlenění T-DNA do hostitelského chromozomu je víceméně náhodné nejčastěji se začlení jedna T-DNA do jedné buňky, muže však nastat i několikanásobné začlenění kolem centromer je začlenění méně pravděpodobné čím blíže telomerám tím větší pravděpodobnost Arabidopsis thaliana

8 binární vektory odvozené od Ti plazmidu pro genetickou modifikaci rostlin Ti plazmid je rozdělen na dva: pomocný plazmid (velký): nese větší část Ti plazmidu, všechny geny potřebné pro symbiózu s hostitelem a přenos T-DNA klonovací plazmid (malý): nese pouze T-DNA, do jejíž části se naklonuje požadovaná gen.informace, replikační počátky pro E.coli a Agrobacterium a potřebné selekční markery

9 klonovací plazmid pbin-hyg-tx polylinker resistence k hygromycinu B (selekce transgenních rostlin) 35S promotor tetracyklinový supresor T-DNA replikační počátky ori požadovaný gen se překlonuje do polylinkeru a konstrukt se namnoží v E.coli. Pro přenos je nutná jen 25bp repetice z konce původní T-DNA. (kanamycinová selekce) transformace do Agrobacteria nesoucí pomocný vektor (selekce Kan, Rimf, Gent) transformace rostliny a selekce transgenního potomstva (selekce hygromycinová) resistence ke kanamycinu pomocný plazmid ma resistenci k rimfapicinu a gentamycinu

10 transgenoze Agrobacteriem standardní postupy pro řadu dvouděložných užitkových rostlin (rajče, hořčice, fazole). nevýhoda: zdlouhavá regenerace přes tkáňové kultury ne u všech se dá použít germ-line transformace jako u Arabidopsis transformace T-DNA se dá využít i jako inzertní mutageneze. T-DNA přeruší důležitý gen (mutace) a tuto mutaci lze pak pomocí markerů na T-DNA snadno lokalizovat. Existují databanky mutantních (transgenních) rostlin Arabidopsis, kdy máte mutaci (inzerci) přímo v genu který studujete.

11 transgenoze namáčením květů (floral dipping, germ-line) A) rostliny Arabidopsis se vypěstují do fertilního stádia (3-5 v květináči) B) lodyhy s květy se vymáchají v kultuře Agrobacteria nesoucí binární systém vektorů s naklonovaným transgenem (5-10 min., přidává se smáčedlo). C) rostliny se nechají pořádně okapat a vrátí do skleníku, kde dozrají (vytvoří semena) D) transgenní semena se selektují vyklíčením na živném médiu obsahující selekční marker (hygromycin) např. Arabidopsis thaliana, řepka, vojtěška

12 transgenoze namáčením květů (floral dipping) Agrobacterium se dostává do vyvíjejících se květů a T-DNA je včleněna do samičího gametofytu a přenesená přes vajíčko do další generace (nikdy ne do samčích pohl. buněk, transgenní semena jsou proto vždy heterozygotní na vložený transgen). zlepšení : vakuová infiltrace přidávání smáčedla silikon Silwet L-77 účinnost: až 20% transgenního potomstva GUS (uida gen) X-Gluc 5-bromo-4-chloro-3-inolyl- -D-glucuronic acid -glucuronidasa modrý precipitát

13 transgenoze pomocí listových disků např. tabák metoda používaná u většiny dvouděložných rostlin

14 regenerace transgenních tabákových rostlin z kalusu vzniklých na listových discích

15 tabák Arabidopsis

16 TRANSFORMACE TOPOLU

17 TOP 10 ZEMĚDĚLSKÝCH PLODIN které se nejvíce transformují a budou transformovat 2006 budoucnost 1. Kukuřice setá 2. Lilek brambor 3. Řepka olejka 4. Sója luštinatá 5. Bavlník 6. Lilek rajče 7. Tabák viržinský 8. Rýže setá 9. Pšenice setá 10. Topol osika 1. Rýže setá 2. Sója luštinatá 3. Pšenice setá 4. Lilek brambor 5. Kukuřice setá 6. Tabák viržinský 7. Banánovník 8. Réva vinná 9. Čajovník a Kávovník 10. Mák polní

18 transgenoze jednoděložných např. ječmen (Tingay et al.,1997) izolace nevyvinutých embryí z obilniny mechanické narušení odstranění embryonální osy kokultivace s Agrobacteriem kultivace na kalusotvorném médiu detekce reportérového genu v T0 i T1 generaci efektivita do 4% (např. z 1282 embryí vyselektováno 54 transformovaných lini poprvé chřest (1988) problém: jednoděložné obsahují daleko méně fenolických látek zlepšení: ošetření acetosyringonem (aktivace vir regionu) supervirulentní kmeny Agrobacteria: mají zmnožený gen pro virg, který je navíc pod konstitutivním promotorem

19 Metoda transformace ječmene

20 Selekce homozygotní linie T0 generace všichni transformanti jsou heterozygotní selekce semen na nutričním mediu obsahující selekční antibiotikum T1 generace T-DNA inzerce na jednom lokusu ¼ 00 homozygotů ½ M0+0M heterozygotů ¼ MM homozygotů 3:1 75% T-DNA inzerce na dvou lokusech 1/14 oo 00 homozygotů 3/14 oo Mx homo-heterozygotů 3/14 mx 00 homo-heterozygotů 9/14 mx MX hetero-homozygotů 9:3:3:1 93% T-DNA inzerce na třech lokusech 1/64 oo homozygotů 27/64 homo-heterozygotů 36/64 MM hetero-homozygotů 27:9:9:3:9:3:3:1 98% T2 generace selekce semen na nutričním mediu obsahující selekční antibiotikum 100% 75% HOMOZYGOTNÍ LINE

21 přímá transgenoze TRANSGENOZE PROTOPLASTŮ odstranění buněčné stěny a inkubace protoplastů s roztokem DNA, DNA vniká do protoplastu endocytózou polyethylenglykol elektroporace makroinjekce protoplasty se dají udělat ze všech rostlin lze z nich však jen velmi obtížně regenerovat celé rostliny BIOLISTICKÉ METODY TRANSGENOZE používají se zlaté nebo wolframové kuličky (2 m) smíchají se s roztokem plazmidové DNA s transgeny, odpaří se vstřelují se do pletiva pod vakuem transgen společně s reportérovým genem (GUS) snadná detekce transformace

22 10% pronikne do pletiva 50% zůstane v epidermis (netvoří kalus) 1% přežívá a dochází k integraci do genomu 95% cytoplazma nedochází k transkripci) 5% jádro

23 genetická puška pokud se nepodaří z buněk zregenerovat kalus, transgenoze je pouze dočasná

24 SELEKČNÍ MARKERY PRO ROSTLINNOU TRANSGENOZI 1.ANTIBIOTIKA KANAMYCIN gen nptii pro neomycinfosfotransferasu. Rostliny se buď stříkají, nebo se dává přímo do média. HYGROMYCIN B gen aphiv pro hygromycinfosfotransferasu silně toxický i pro člověka inhibitor proteosyntesy 2. HERBICIDY nejpoužívanější GLYFOZÁT inhibitor syntézy aromatických AK (je esenciální u autotrofních organismů) sp. 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntasa (EPSP) tři strategie: 1) overexprese EPSP 2) exprese mutantní ne tak citlivé formy EPSP 3) exprese glyfozátoxidoreduktasy (degradace glyfozátu) transgenní potomstvo se sprejuje glyfozátem, přežívají pouze rostliny nesoucí současně s transgenem jeden ze tří způsobů rezistence

25 SELEKČNÍ MARKERY PRO ROSTLINNOU TRANSGENOZI 3. ZDROJ SACHARIDŮ v raných stádiích vývoje rostlin v in vitro podmínkách je závislost na zdroji uhlíku v médiu (sacharóza). Selekční marker: v médiu je místo sacharózy manóza. Hexokinasou vzniká manóza-6-fosfát, který není schopen podléhat následné glykolýze a je pro rostlinu toxický, kumuluje fosfor. Selekční transgen: fosfomanozaizomerasa přeměňuje manóza-6-fosfát na fruktóza-6-fosfát (použito u tabáku, cukrovky a kukuřice) 4. SELEKCE ROSTLINNÝMI HORMONY transgen isopentenyltransferasa produkuje nadbytek cytokininů (nemusí se přidávat do selekčního média) které podporují tvorbu prýtů z transformovaného pletiva, u tabáku a salátu bylo zjištěno že tento nadbytek nemá vliv na celkovou morfologii transgenní rostliny.

26 ODSTRANĚNÍ SELEKČNÍCH TRANSGENů Z ROSTLIN někdy je třeba tento transgen odstranit aby nenarušoval vývoj rostliny (ipt,nptii) využití bakteriofágového systému Crelox, přirozený exscisní systém, gen cre kóduje rekombinasu (transpozasu) a lox symbolizují krátké cílové sekvence excise.

27 SLOŽKY TRANSGENŮ PROMOTOR konstitutivní 35 S - nejpoužívanější, virového původu, nebezpečí KOSUPRESE ubikvitin - rostlinného původu, exprese kolísá během ontogeneze actin - rostlinného původu, vysoká ale kolísavá exprese pletivově specifické 2A11 - z rajčete, plodově specifický Lhcb3 - listově specifický, světlem regulovaný z Arabidopsis RAmy3D - amylasa z rýže, aktivovaný sacharosou B-HORD a Zea - zásobní proteiny z obilek, hordein z ječmene a zein z kukuřice inducibilní In2-2 - je indukovaný benzensulfonamidovým herbicidem Safener tet - indukce tetracyklinem, nejpoužívanější pop - indukovaný glukokortikoidem DEXAMETHASONE, živočišný systém přenesený do rostliny ER - promotor lidského estradiolového receptoru

28 Pletivově specifické promotory u jednoděložných

29 SLOŽKY TRANSGENŮ POLYADENYLAČNÍ SIGNÁL a TERMINÁTOR v klonovací kazetě je kromě promotorové sekvence i terminátor transkripce s polyadenylačním signálem nejčastěji používaný terminátor z agrobakteriálního genu pro nopalin syntasu používá se jak u jedno tak dvouděložných rostlin další používané terminátory: 3 nekódující sekvence rostlinného genu pro pšeničný histon H3 může se použít i vlastní 3 nekódující sekvence transgenu, ale ta nemusí vždy fungovat, je jednodušší mít univerzální již v plasmidu

30 SLOŽKY TRANSGENŮ INTRONY inkorporace intronu do transgenu může zvyšovat sílu exprese transgenu v rostlině např. intron I z genu pro rýžový aktin nebo intron I z genu pro kukuřičný ubikvitin 5 NEKODUJÍCÍ REGION Kozákové sekvence a podobné sekvence zvyšují postranskripční stabilitu mrna a tím zvyšují míru exprese NUKLEOTIDOVÉ SLOŽENÍ pokud vkládáme do rostliny gen z baktérie, hrozí nebezpečí použití odlišného genetického kódu, vyštěpení neexistujícího intronu atd. geny ze vzdálených taxonů se proto musí často syntetický upravovat (mutacemi) aby bylo dosaženo dostatečné exprese v rostlinném hostiteli (např. u Bt toxinu z baktérie), nebo se současně řeší umělou syntézou genů

31 odchylky v genetickém kódu snižují výtěžek heterologní exprese jiná preference: kodón pro arginin (6 různých): CGU CGA CGG CGC AGA AGG E. coli Arabidopsis th. H. sapiens AGA 2.2% AGA 18.9% AGA 11.9% AGG 1.6% AGG 11.0% AGG 12.1%

32 PŘÍMÁ TRANSFORMACE CHLOROPLASTŮ začlenění transgenu do chloroplastové DNA VÝHODY: dědí se pouze matrilineárně, tzn. transgen se nepřenáší pylem. k začleňování transgenu dochází pouze na specifických místech DNA homologní rekombinací vysoká exprese, až několik procent celkových proteinů lepší pro expresi bakteriálních genů v rostlinách (stejný genetický kód) NEVÝHODY: provedení: používá se biolistické metody velice silné genetické dělo hnané héliem, musí prorazit dvojitou chloroplastovou membránu, velice malá účinnost specifické vektory: obsahují část genetické informace chloroplastu, aby mohla proběhnout homologní rekombinace selekční marker antibiotikum spektinomycin Limitace: lze provést pouze u několika rostlinných druhů

33 VYUŽITÍ TRANSGENOZE ROSTLIN A) ZMĚNA VLASTNOSTÍ ZEMĚDĚLSKÝCH PLODIN 1. rezistence k herbicidům 2. rezistence k hmyzím škůdcům 3. rezistence k virům 4. změna obsahu olejů 5. oddálení dozrávaní plodů 6. kontrola opylování 7. zvyšování nutriční hodnoty (zlatá rýže) B) TOLERANCE VŮČI STRESU C) MOLEKULÁRNÍ FARMÁŘENÍ (rostlinná buňka jako bioreaktor) 1. plantibodies a jedlé vakcíny 2. produkce terapeutik rostlinami 3. produkce biopolymerů rostlinami

34 rezistence ke hmyzím škůdcům Bt - rostliny 1902 byla v Japonsku objevena baktérie Bacillus thuringiensis, která způsobovala úhyn bource morušového 1987 byl z této baktérie izolován krystalický protein -endotoxin, který po projití trávicím traktem hmyzu, způsobuje jeho rozklad se začala tato baktérie využívat jako insekticid, postřiky byly drahé a dlouho neúčinkovaly 1985 připraven transgenní tabák overexprimující Bt-toxin (nízká exprese % všech listovým proteinů), důvod: nestabilita bakteriální mrna v rostlině synteticky upravené geny pro -endotoxin - byl snížen obsah AT bází - pozměněn genetický kód tak aby vyhovoval rostlinám - vloženy introny exprese se zvýšila až 1000x, většinou se využívá konstitutivní 35S promotor existuje řada genů pro Bt-toxin (CryIA- CryIIIB) s různou specifitou vůči různým hmyzím druhům

35 Bt-rostliny a herbicid-rezistentní rostliny 40% pěstované kukuřice v USA jsou Bt-transgenní odrůdy 80% světové produkce sóji je ROUND-UP odrůda běžná rostlina bramboru napadená mandelinkou Bt-brambora

36 rizika Bt-rostliny i samotný endotoxin byly testovány na lidech, psech, morčatech, čolcích, krysách, rybách a ptácích bez žádných příznaků byly prováděny alergologické testy nebyl pozorován ani žádny vliv na hmyzích predátorech (1996 včela, slunéčko) 1999 NEJVĚTŠÍ SKANDÁL GMO případ motýlka Danaus plexipus tento motýl patří v USA mezi ohrožené druhy publikovaná práce kdy byla prokázána zvýšená mortalita larev po poprášení rostlin klejichy (potrava) pylem z Bt kukuřice v roce 1999 byl však zaznamenán nárůst populace tohoto motýlka nedochází k časové koincidenci kvetení kukuřice a vývoje larev GREENPEACE vydává seznam evropských motýlů ohrožených endotoxinem v Bt-rostlinách snaha o zavádění Bt-rostlin s matrilineární dědičnosti

37 GMO rezistentní k herbicidům Roundup Ready bavlna, kukuřice, sója a jarní řepka (kanola)... běžná kanola Roundup Ready kanola

38 zlatá rýže další využívané transgeny největší evropský projekt GMO ovlivněná celá metabolická dráha geranylgeranyl pyrofosfát fytoensyntasa fytoen fytoendesaturasa fytoendesaturasa normální zrna rýže -karoten -karoten desaturasa lykopen lykopen- β-cyklasa b-karoten endogenní lidské geny zrná rýže s β-karotenem Vitamin A

39 projekt - zlatá rýže rýže je schopná syntetizovat β-karoten jen v zelených částech v obilkách je posledním meziproduktem geranylgeranylpyrofosfát do genomu rýže vneseny pod specifickým glutinovým promotorem s cílením do endospermu tři geny: fytoendesaturasa z baktérie Erwinia fytoensyntasa z narcisu lykopen- β-cyklasa β-karoten (provitamín A) nejsou obratlovci schopni syntetizovat, ale potřebují ho pro syntézu retinalu (součást pigmentu rhodopsinu) a k.retinové (reguluje morfogenezi) avitaminóza způsobuje dětskou slepotu, snižování imunity a je příčinou asi půl milionové dětské úmrtnosti především v rozvojových zemích jihovýchodní Asie silné námitky antibiotechnologických aktivistů není třeba, jsou tabletky - může dojít k předávkování atd.

40 USA 2. Argentina 3. Brazílie 4. Kanada 5. Indie 6. Čína 7. Paraguay 8. JAR 9. Uruguay 10. Filipíny 11. Austrálie 12. Španělsko 13. Mexiko 14. Kolumbie 15. Chile 16. Francie 17. Honduras 18. Česko 19. Portugalsko 20. Německo 21. Slovensko 22. Rumunsko USA 2. Brazílie 3. Argentina 4. Kanada 5. Indie 6. Paraguay 7. Pákistán 8. Čína 9. JAR 10. Uruguay 11. Bolivie 12. Austrálie 13. Filipíny 14. Barma 15. Španělsko 16. Súdán 17. Mexiko 18. Kolumbie 19. Vietnam 20. Honduras 21. Chile 22. Portugalsko 23. Bangladéš 24. Kostarika 25. Slovensko 26. Česko 27. Rumunsko 28. Burkina Faso

41

42

43

44 Polní experiment s GM ječmenem v Olomouci

45 situace v roce 2013 (GM plodiny komerčně pěstovány od ) GM plodiny na více než hektarech (cca rozloha Libye) 27 zemí (v roce přibyla Kuba, Barma, Burkina Faso, Súdán) z toho 19 rozvojových a 8 vyspělých odrůda brambor Amflora po 13 letech nová schválená odrůda v EU 2012 kukuřice odolná vůči suchu 2019 zlatá rýže Round up a další herbicid tolerantní Sója Kukuřice Bavlna Vojtěška Řepa Psineček (bentgrass) Len Rýže Pšenice Bt a tolerantní vůči hmyzu Kukuřice bavlna Rajče Dýně Topol Lilek Rýže Řepka (high-laurate, male-sterile) Rajče (FlavrSavr, ethylen) Karafiáty (umělá barva) Brambor (high amylopektin) Čekanka (male-sterile) Meloun (oddálení senescence) Růže (změna barvy květů) Cukrová třtina (tolerantní vůči suchu) Tabák (nicotin free) Tolerantní vůči virům Papaja Dýně Sweet Pepper Fazol Slivoň

46

47 molekulární farmáření v rostlinách připravené živočišné protilátky nebo části protilátek v rostlinách lze produkovat i monoklonální protilátky protilátky jsou vylučovány do mezibuněčného prostoru mohou sloužit přímo v rostlině (jako ochrana proti patogenům) nebo mohou být extrahovány a použity v diagnostice či medicíně výrazně se sníží náklady a čas na tvorbu protilátek (hybridomové buňky) plantibodies

48 plantibodies hlavní problém rozdíly v N-glykosylaci proteinů (protilátek) u živočichů a rostlin plantibodies mají jinak glykosylovanou strukturu a po aplikaci do zvířete či člověka vyvolávají nechtěnou imunitní odpověď řešení: společně s geny pro Ab je do rostliny vnesen gen pro lidskou β-1,4- galaktosyltransferasu rostlina pak produkovala polidštěné protilátky jako transgen stačí vložit pouze malou variabilní oblast tzv. Fv domény z lehkého a těžkého řetězce spojenou krátkým peptidem scfv single chain variable fragment

49 GLYKOSYLACE Rostliny: β(1,2)xylosa (1,3)fukosa Člověk: (1,6)fukosa β(1,2)galaktosa k.sialová řešení: stabilní genetická úprava glykosylačních enzymů v rostlinné buňce Ko et al. Plant-produced microbial vaccines. Springer, 2009.

50 Některé lidské proteiny produkované suspenzními rostlinnými kulturami terapeutický rostlina výtěžek Typ produkce promoter rok protein mg/l alfa-antitrypsin rýže 247 sekrece RAmy3D 2005 lidský růstový hormon hgh tabák 35 sekrece CaMV35S 2010 interferon α2b tabák 28 sekrece CaMV35S 2007 interleukin-12 rýže 31 sekrece RAmy3D 2010 glukocerebrosidasa mrkev 30 vakuolarní CaMV35S 2007 lysozym rýže 3% intra-buněčně RAmy3D 2002 lactoferrin ženšen tabák 4.3% intra-buněčně SWPA2 2006

51 rezistence ke hmyzím škůdcům transgeny rostlinného původu inhibitory trávicích enzymů (amylas a proteas) hmyzu, lektiny (proteiny vážící sacharidy), chitinasy, syntéza alkaloidů INHIBITORY PROTEAS sójový inhibitor serinových proteas inhibitor trypsin proteas z vigny inhibitor proteas z rajčete INHIBITORY AMYLAS amylasový inhibitor z fazole LEKTINY (účinné proti mšicím) lektin sněženky GNA (Galantus nivalis aglutinin) lektin hrachu chitinasa z fazole

52 rezistence k virům hlavním způsobem rezistence je exprese genu pro plášťový protein daného viru 1986 první transgenní rostliny tabáku rezistentní vůči TMV (existuje faktor, který rozbalí virus a aktivuje ho, tento faktor se při infekci vychytá plášťovým proteinem produkovaným rostlinou. Korelace: čím větší exprese tím vyšší rezistence byly nalezeny i jiné původní geny způsobující rezistenci, ty byly mapovány a použity jako transgeny proti RNA virům se využívá protismyslná RNA strategie

53 papája na Havaji papaya ringspot virus (PRV) ovlivňoval úrodu na Havaji od roku 92 do roku 96 klesla produkce díky viru o 40% 1996 první transgenní papája overexprimující plášťový protein pod 35S promotorem připravená biolistickou metodou od roku 1998 nárůst produkce

54 transgenní rostliny tolerantní vůči stresu VODNÍ STRES při nedostatku vody (i zasolení) se zvyšuje osmotický tlak buněk, dochází k poklesu fotosyntézy a fotoredukci kyslíku za vzniku aktivních kyslíkových radikálů poškození a) nadprodukce osmoprotektivních látek glycinbetain transgen cholindehydrogenasa z E.coli (tabák, brambor) prolin transgen semialdehyddehydrogenasa k. glutamové z vigny manitol transgen manitol-1-fosfátdehydrogenasa fruktany chimerický transgen fruktozyltransferasa z Bacillus subtilis a vakuolární signální sekvence z karboxypeptidasy ze Saccharomyces b) ovlivnění signální dráhy pro dehydratační stres u Arabidopsis thaliana byla objevena signální dráha společná pro stres dehydratací a chladem současně bylo zjištěno, že geny reagující na tyto stresy mají ve svých promoterech konzervovanou sekvenci TACCGACAT tzv. DRE (dehydratation responsive element). Byl nalezen transkripční faktor aktivující tuto sekvenci DREB1A, a jeho gen použit jako transgen. + transgenní rostliny daleko odolnější k suchu, mrazu zasolení - zpomalení růstu (může se použít specifický promotor indukovatelný stresem)

55 GENOVÉ UMLČOVÁNÍ (gene silencing; knock-down)

56 genové umlčování TGS (transcriptional gene silencing) nedochází k transkripci transgenu může jí předcházet transkripce promotorové sekvence a následná inhibice promoteru komplementárním duplexem RNA-DNA nebo častěji metylace promotorové sekvence PTGS (post-transcriptional gene silencing) založena na specifické degradaci mrna Science, prosinec 2002

57 TGS a PTGS read-through transcription DNA-DNA pairing methylation chromatin remodelling methyltransferases chromatin remodelling factors RNA-DNA pairing RNA degradation RNA-RNA pairing dsrna

58 poprvé pozorováno 1990 u transgenní petúnie vědci se pokoušeli ztmavit květy petúnie overexpresí genu pro chalkonát syntasu (enzym produkující černý antokyanin) pod silným virálním promotorem. Transgen interferoval s vlastním genem pro tento enzym a docházelo k jeho vzájemnému umlčování. prpl prpl

59 PRINCIP RNAi hairpin RNA Virus dsrna Transgene RNA dsrna sirna (short interfering RNAs, nt long) HO p HO p p OH p HO OH p Cleavage of dsrna by dicer-like enzyme p p HO OH p OH (DICER contains dsrna cleavage activity, helicase and dsrna binding activity) RNase III like protein systém funguje v cytoplasmě a zřejmě existuje jako rezistence vyvinutá proti RNA virům sirna/protein complex HO p p OH sirna is unwound, single-stranded RNA formed mrna target RISC complex (RNA-induced silencing complex) sequence-specific target recognition p p OH OH RISC se automaticky generuje v rostlině v přítomnosti sirna imunitní odpověď na úrovni NK mrna degradation continued on next slide

60 RNA dependentní RNA polymerasa Single-stranded sirnas can also be used as primers to make more dsrna by host RNA polymerase New dsrna formed from target mrna p OH Dicer (as in previous slide) HO p p p OH p HO OH OH p p OH HO p HO p význam RNAi STUDIUM FUNKCE GENů Etc. Model was modified from Roth et al., (2004) Virus Research 102: TERAPEUTICKÉ VYUŽITÍ knock-out nebo inhibice funkce genu přežije organismus? jaké pozorujeme fenotypové změny? léčba rakoviny (viz. genová terapie)

61 dvě strategie: a) KLASICKÁ PCR s dvěma typy primerů a postupné klonování (vektor phannibal) b) REKOMBINANTNÍ jedno PCR a klonování s následnou rekombinací (BP klonasa, vektor

62 ODDÁLENÍ DOZRÁVÁNÍ PLODů rajčata první transgenní komerční odrůda FLAVR SAVR zrání plodů rajčat (i ostatních) je způsobováno hlavně degradaci pektinu (polysacharid, polymer kys. D-galakturonové) v buněčné stěně plodů při zrání se aktivuje polygalakturonasa která rozkládá pektin 1994 transgenní odrůda lilku rajčete FlavrSavr s knock-outovanou polygalakturonasou (na 10%) transgen produkuje protismyslnou RNA zvýšena trvanlivost rajčat po sklizni o 2 týdny větši rezistence vůči houbovým a bakteriálním chorobám transgenic control + ethylene transgenic

63 další využívané transgeny bezkofeinová káva 7-metylxantin N-metyltransferasa a theobromin N-metyltransferasa JAPONSKO 2003 exprese genů inhibována metodou RNAi druh Cofea canephora transformován Agrobaktériem transformované rostliny stejné jako wild type Cofea canephora se pěstuje na Madagaskaru a má 2x větší obsah kofeinu než nejrozšířenější Cofea arabica v mladých listech: theobromin 30-80% kofein 50-70%

64 další využívané transgeny MODRÁ RůŽE 2004 vědci z firmy FLORIGENE (Calgene Pacific) pracovali na vývoji transgenní modré růže po několik let. Nakonec použili jako transgen gen pro flavonoid 3', 5'- hydroxylasu z petúnie pod specifickým promotorem s cílením do květů a transformovali čínskou čajovou růži (Rosa x hybrida). Transgen způsobil syntézu modrého flavonoidu delfinidinu.

65 transgen