vnášení cizorodých genů či jiné genetické informace do rostlin a manipulace s nimi

Transkript

1 TRANSGENOZE ROSTLIN vnášení cizorodých genů či jiné genetické informace do rostlin a manipulace s nimi (GMO) TRANSGENOZE trvalá - změna genetické informace je přenášená na potomstvo (infekce Agrobakteriem) TRANSGENOZE dočasná genetická informace je změněna pouze u vegetativní části - genetická informace je změněna pouze u vegetativní části rostliny a nepřenáší se na potomstvo (elektroporace, biolistické metody) 1

2 PG1 Agrobacterium tumefaciens patogenní bakterie přirozeně se vyskytující v kořenovém systému bobovitých rostlin přítomnost baktérie se projevuje tumory tzv. crown gall tissue Agrobacterium je schopné napadat jakékoliv pletivo většiny dvouděložných rostlin a za určitých podmínek i rostlin jednoděložných ipt,aux,nop syntéza cytokininů auxinů opinů Ti plazmid (tumor inducing) Agrobacteria tumefaciens (200 kb) další geny pro biosyntézu cytokininů, permeasy, přenašeče přes membránu, enzymy metabolizující opiny a ostatní enzymy umožňující infekci 2

3 Snímek 3 PG1 čeleď Rhizobiaceae, stejně jako symbiotické bakterie fixující dusík např druh Rhizobium galuszka; 18/03/2006

4 PG2 rostlina při zranění produkuje fenolické látky (acetosyringon), ty se váží na specifické receptory na membráně Agrobacteria VirA a způsobují transkripci genu s vir regionu Ti plazmidu Agrobacteria nopalin aktivace vir regulonu VirD2 protein se váže na 5 T-DNA (transferred) denaturace ss T-DNA z Ti plazmidu VirE2 proteiny stabilizují ss T-DNA VirD2 a VirE2 proteiny obsahují sekvenci potřebnou pro cílení do jádra rostlinné buňky VirE2 se váže na proteiny VIP1 a VIP2 které zacílí T-DNA řetězec do chromatinu rostlinného chromozomu 3

5 Snímek 5 PG2 opines: nopaline a octopine, together with cytokinins nand auxins are synthetised in infected cells, serve as a source of nitrogen and energy for agrobacterium galuszka; 18/03/2006

6 binární vektory odvozené od Ti plazmidu pro genetickou modifikaci rostlin Ti plazmid je rozdělen na dva: pomocný plazmid (velký): nese větší část Ti plazmidu, všechny geny potřebné pro symbiózu s hostitelem a přenos T-DNA klonovací plazmid (malý): nese pouze T-DNA, do jejíž části se naklonuje požadovaná gen.informace, replikační počátky pro E.coli a Agrobacterium a potřebné selekční markery klonovací plazmid pbin-hyg-tx polylinker resistence k hygromicinu B (selekce transgenních rostlin) tetracyklinový supresor T-DNA replikační počátky ori požadovaný gen se překlonuje do polylinkeru a konstrukt se namnoží v E.coli. Pro přenos je nutná jen 25bp repetice z konce původní T-DNA. (kanamycinová selekce) transformace do Agrobacteria nesoucí pomocný vektor (selekce Kan, Rimf, Gent) transformace rostliny a selekce transgenního potomstva (selekce hygromycinová) resistence ke kanamycinu pomocný plazmid ma resistenci k rimfapicinu a gentamycinu 4

7 začlenění T-DNA do chromozomu začlenění T-DNA do hostitelského chromozomu je víceméně náhodné nejčastěji se začlení jedna T- DNA do jedné buňky, muže však nastat i několikanásobné začlenění kolem centromer je začlenění méně pravděpodobné čím blíže telomerám tím větší pravděpodobnost Arabidopsis thaliana transgenoze Agrobacteriem standardní postupy pro řadu dvouděložných užitkových rostlin (rajče, hořčice, fazole). nevýhoda: zdlouhavá regenerace přes tkáňové kultury ne u všech se dá použít germ-line transformace jako u Arabidopsis transformace T-DNA se dá využít i jako inzertní mutageneze. T-DNA přeruší důležitý gen (mutace) a tuto mutaci lze pak pomocí markerů na T-DNA snadno lokalizovat. Existují databanky mutantních (transgeních) rostlin Arabidopsisu, kdy máte mutaci (inzerci) přímo v genu který studujete. od poloviny 90 let možná transformace i jednoděložných - lilie, palmy, obilniny. Použití supervirulentních kmenů Agrobacteria, hlavní problém je v regeneraci. 5

8 transgenoze namáčením květů (floral dipping, germ-line) A) rostliny Arabidopsis se vypěstují do fertilního stádia (3-5 v květináči) B) lodyhy s květy se vymáchají v kultuře Agrobacteria nesoucí binární systém vektorů s naklonovaným transgenem (5-10 min., přidává se smáčedlo). C) rostliny se nechají pořádně okapat a vrátí do skleníku, kde dozrají (vytvoří semena) D) transgenní semena se selektují vyklíčením na živném médiu obsahující selekční marker (hygromycin) např. Arabidopsis thaliana transgenoze namáčením květů (floral dipping) Agrobacterium se dostává do vyvíjejících j se květů a T-DNA je včleněna do samičího gametofytu a přenesená přes vajíčko do další generace (nikdy ne do samičích pohl. buněk, transgenní semena jsou proto vždy heterozygotní na vložený transgen). zlepšení : vakuová infiltrace přidávání smáčedla silikon Silwet L-77 účinnost: až 20% transgenního potomstva tato metoda funguje i u vojtěšky a petúnie 6

9 REPORTÉROVÉ TRANSGENY jsou geny jejichž expresi lze snadno detekovat a kvantitativně stanovovat, slouží hlavně ke stanovování účinnosti různých rostlinných promoterů MODRÉ ROSTLINY REPORTÉROVÝ GEN pro β-glucuronidasu z E.coli po transformaci se rostlina namočí do barviva X-Gluc vzniká nerozpustné indigo zabarvení, které jde detekovat v intaktní rostlině. Stabilní enzym bez kofaktoru. GUS (uida gen) β-glucuronidasa X-Gluc 5-bromo-4-chloro-3-inolyl -β-d-glucuronic acid modrý precipitát SVĚTELKUJÍCÍ ROSTLINY využívá se cdna pro gen luciferasu ze světlušky Photinus pyralis nebo baktérie Vibrio harvei substrát luciferin se přidává do substrátu (hlíny), pletivo rostliny pak emituje viditelné záření, které se měří luminimetrem nebo scintilační kamerou = velice citlivá metoda, žádna nespecifická aktivita, velmi nákladná PG3 REPORTÉROVÉ TRANSGENY FLUORESKUJÍCÍ ROSTLINY malý gen pro GFP (green fluorescent protein) z medúzy Aequorea victoria po ozáření modrým světlem ( nm) zeleně fluoreskuje bez jakéhokoliv substrátu a je velice stabilní fluorescenci si zachovává i po fúzi s jiným proteinem (chimerické geny) A. thaliana C24 wild type (vlevo) 35S-mgfp4-ER transformed (vpravo) Aequorea victoria 7

10 Snímek 14 PG3 v medúze není třeba osvětlovat, jelikož GFP se váže na aquaporin, který po vazbě Ca2+ vyzařuje modré záření, které aktivuje GFP galuszka; 19/03/2006

11 PŘÍKLAD VYUŽITÍ TRANSGENOZE V ZÁKLADNÍM VÝZKUMU: subcelulární lokalizace AtCKX-GFP chimerického proteinu GFP kontrola cytosol+ jádro (Werner et al., 2003) mitochondrie AtCKX1-GFP AtCKX3-GFP detekováno ve vakuolách AtCKX2-GFP lokalizace na endoplasmatickém retikulu s následnou sekreci ven z buňky transgenoze pomocí listových disků např. tabák metoda používaná u většiny dvouděložných rostlin 8

12 regenerace transgenních tabákových rostlin z kalusu vzniklých na listových discích Arabidopsis tabák 9

13 TRANSFORMACE TOPOLU TOP 10 ZEMĚDĚLSKÝCH PLODIN 1. rýže setá 2. sója luštinatá 3. pšenice setá 4. lilek brambor 5. kukuřice setá 6. čajovník 7. banánovník 8. réva vinná 9. tabák virdžinský 10. mák polní 10

14 transgenoze jednoděložných např. ječmen (Tingay et al.,1997) izolace nevyvinutých embryí z obilniny mechanické narušení odstranění embryonální osy kokultivace s Agrobacteriem kultivace na kalusotvorném médiu detekce reportérového genu v T0 i T1 generaci efektivita do 4% (např. z 1282 embryí vyselektováno 54 transformovaných linií poprvé chřest (1988) problém: jednoděložné obsahují daleko méně fenolických látek zlepšení: ošetření acetosyringonem (aktivace vir regionu) supervirulentní kmeny Agrobacteria: mají zmnožený gen pro virg, který je navíc pod konstitutivním promotorem SELEKCE HOMOZYGOTNÍ LINIE T0 generace T1 generace T2 generace všichni transformanti jsou heterozygotní T-DNA inzerce na jednom lokusu ¼ 00 homozygotů ½ M0+0M heterozygotů ¼ MM homozygotů selekce semen na 3:1 75% nutričním mediu T-DNA inzerce na dvou lokusech obsahující selekční 1/14 oo 00 homozygotů antibiotikum 3/14 oo Mx homo-heterozygotů 3/14 mx 00 homo-heterozygotů 9/14 mx MX hetero-homozygotů 9:3:3:1 93% 100% 75% selekce semen na nutričním mediu obsahující selekční antibiotikum T-DNA inzerce na třech lokusech 1/64 oo homozygotů 27/64 homo-heterozygotů 36/64 MM hetero-homozygotů 27:9:9:3:9:3:3:1 98% HOMOZYGOTNÍ LINE 11

15 přímá transgenoze TRANSGENOZE PROTOPLASTů odstranění buněčné stěny a inkubace protoplastů s roztokem DNA, DNA vniká do protoplastu endocytózou polyetylenglycol elektoporace makroinjekce protoplasty se dají udělat ze všech rostlin lze z nich však jen velmi obtížně regenerovat celé rostliny BIOLISTICKÉ METODY TRANSGENOZE používají se zlaté nebo wolframové kuličky (2μm) smíchají se s roztokem plazmidové DNA s transgeny, odpaří se vstřelují se do pletiva pod vakuem transgen společně s reportérovým genem (GUS) snadná detekce transformace 1O% pronikne do pletiva 50% zůstane v epidermis (netvoří kalus) 95% cytoplazma nedochází k transkripci) 5% jádro 99% umírá 1% přežívá a dochází k integraci do genomu 12

16 genetické dělo pokud se nepodaří z buněk zregenerovat kalus, transgenoze je pouze dočasná PG4 PG5 SELEKČNÍ MARKERY pro ROSTLINN0U TRANSGENOZI 1.ANTIBIOTIKA KANAMYCIN gen nptii pro neomycinfosfotransferasu. Rostliny se buď stříkají, nebo se dává přímo do média. HYGROMYCIN B gen aphiv pro hygromycinfosfotransferasu silně toxický i pro člověka inhibitor proteosyntesy 2. HERBICIDY nejpoužívanější GLYFOZÁT inhibitor syntézy aromatických AK (je esenciální u autotrofních organismů) sp. 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntasa (EPSP) tři strategie: 1) overexprese EPSP 2) exprese mutantní ne tak citlivé formy EPSP 3) exprese glyfozátoxidoreduktasy (degradace glyfozátu) transgenní potomstvo se sprejuje glyfozátem, přežívají pouze rostliny nesoucí současně s transgenem jeden ze tří způsobů rezistence 13

17 Snímek 26 PG4 PG5 Hyg i Kan jsou aminotriglycosidy které se váží na ribozom a způsobují nesmyslný přepis mrna galuszka; 19/03/2006 glyfozát - fosfometylglycin 3-fosfošikimát + fosfoenolpyruvát = enolpyruvátšikimát 3 fosfát galuszka; 19/03/2006

18 SELEKČNÍ MARKERY pro ROSTLINN0U TRANSGENOZI 3. ZDROJ SACHARIDů v ranných stádiích vývoje rostlin v in vitro podmínkách je plná závislost na zdroji uhlíku v médiu (sacharóza). Selekční marker: v médiu je místo sacharózy xylóza a manóza. Hexokinasou vzniká manóza-6-fosfát, který není schopen podléhat následné glykolýze a je pro rostlinu toxický, kumuluje fosfor. Selekční transgen: fosfomanózaizomerasa přeměňuje manóza-6-fosfát na fruktóza-6-fosfát (použito u tabáku, cukrovky a kukuřice) 4. SELEKCE ROSTLINNÝMI HORMONY transgen isopentenyltransferasa produkuje nadbytek cytokininů (nemusí se přidávat do selekčního média) které podporují tvorbu prytů z transformovaného pletiva, u tabáku a salátu bylo zjištěno že tento nadbytek nemá vliv na celkovou morfologii transgenní rostliny. PG6 ODSTRANĚNÍ SELEKČNÍCH TRANSGENů Z ROSTLIN někdy je třeba tento transgen odstranit aby nenarušoval vývoj rostliny (ipt,nptii) využití bakteriofágového systému Crelox, přirozený exscisní systém, gen cre kóduje rekombinasu (transpozasu) a lox symbolizují krátké cílové sekvence excise. 14

19 Snímek 28 PG6 bakterifág p1 využívá systém k zaclenení casti DNA do bakterie loxb místa galuszka; 19/03/2006

20 ODSTRANĚNÍ SELEKČNÍCH TRANSGENů Z ROSTLIN SYSTÉM MAT (multi-autotransformation ) rekombinační systém z kvasinky Zygosaccharomyces rouxii R/RS,R- gen pro rekombinasu, RS specifická rozpoznávací sekvence. Gen R je pod inducibilním promotorem (např. tetracyklin), t mezi RS místa vložen ipt selekční gen. Po transformaci (exprimuje se ipt gen vyrůstají tzv. teratomy (rychle rostoucí výhony ale zakrslé, (a), ESP fenotyp (enormous shooty phenotype) po indukci tetracyklinem, dojde k vyštěpení ipt a z teratomového pletiva začnou vyrůstat normální výhony (b). tabák topol PG25 SLOŽKY TRANSGENů konstitutivní 35 S - nejpoužívanější, virového původu, nebezpečí KOSUPRESE ubikvitin rostlinného původu, exprese kolísá během ontogeneze actin rostlinného původu, vysoká ale kolísavá exprese tkáňově specifické 2A11 - z rajčete, plodově specifický Lhcb3 - listově specifický, světlem regulovaný z Arabidopsis promoter APasy - indukovaný v kořeni, fosfátem PROMOTOR inducibilní In2-2 je indukovaný benzensulfonamidovým herbicidem Safener tet - indukce tetracyklinem, nejpoužívanější pop - indukovaný glucocortikoidem DEXAMETHASONE, živočišný systém přenesený do rostliny CaMV35S:GUS PsMTA:GUS 15

21 Snímek 30 PG25 pop/lhg4. The pop/lhg4 transcription factor system is based on regulatory elements of the E. coli lac operon. It was first described in tobacco, but has subsequently been deployed in numerous developmental studies in tobacco, Arabidopsis, or maize. The pop/lhg4 system comprises an artificial promoter pop and a chimaeric transcription factor LhG4 ). The pop promoter consists of two ideal lac operators positioned upstream of a minimal CaMV 35S promoter ()50 to þ8 relative to the transcription initiation point) and is physiologically silent in the absence of the artificial transcription factor LhG4. LhG4 binds to the lac operators in the pop promoter via its DNAbinding domain, which is derived from a high-affinity DNAbinding mutant of the E. coli lac repressor. Once bound, LhG4 promotes transcription from the minimal CaMV 35S promoter of pop by virtue of a transcription-activation domain derived from the Saccharomyces cerevisiae transcription factor Gal4p (Moore et al., 1998). The sequences that are critical for transcriptional activation in Arabidopsis lie within the carboxy-terminal 17 amino acids of the Gal4 activation domain and conform to the consensus for eukaryotic acidic activation domains (Rutherford et al., 2005). pop can be activated in specific cells following a cross with activator lines that express LhG4 from appropriate promoters galuszka; 31/03/2008

22 SLOŽKY TRANSGENů POLYADENYLAČNÍ SIGNÁL a TERMINÁTOR v klonovací kazetě je kromě promotorové sekvence i terminátor transkripce s polyadenylačním signálem nejčastěji používaný terminátor z agrobacteriálního genu pro nopalin syntasu používá se jak u jedno tak dvouděložných rostlin další používané terminátory: 3 nekódující sekvence rostlinného genu pro pšeničný histon H3 může se použít i vlastní 3 nekódující sekvence transgenu, ale ta nemusí vždy fungovat, je jednodušší mít univerzální již v plasmidu SLOŽKY TRANSGENů INTRONY ínkorporace intronu do transgenu může zvyšovat sílu exprese transgenu v rostlině např. intron I z genu pro rýžový aktin nebo intron I z genu pro kukuřičný k ubikvitin iti 5 NEKODUJÍCÍ REGION Kozákova sekvence a podobné sekvence zvyšují postranskripční stabilitu mrna a tím zvyšují míru exprese NUKLEOTIDOVÉ SLOŽENÍ pokud vkládáme do rostliny gen z baktérie, hrozí nebezpečí použití odlišného genetického kódu, vyštěpení neexistujícího intronu atd. geny ze vzdálených taxonů se proto musí často syntetický upravovat (mutacemi) aby bylo dosaženo dostatečné exprese v rostlinném hostiteli (např. u Bt toxinu z baktérie) 16

23 odchylky v genetickém kódu? snižují výtěžek heterologní exprese výjimky: jiná preference: kodón pro arginin (6 různých): CGU CGA CGG CGC AGA AGG E. coli Arabidopsis th. H. sapiens AGA 2.2% AGA 18.9% AGA 11.9% AGG 1.6% AGG 11.0% AGG 12.1% ORGANELOVÉ CÍLENÍ TRANSGENU transgen je začleněn do genomu v jádře, transkripce probíhá v jádře, zralá mrna je pak transportovaná do cytosolu kde probíhá proteosyntéza na ribozómech, buď volně nebo vázaně na ER POSTRANSLAČNÍ ÚPRAVY PROTEINU ZAHRNUJÍ i OGANELOVÉ CÍLENÍ specifické signály SIGNÁLNÍ PEPTID, úprava transgenu: cílení do plastidu: genetická informace pro 23AK signální peptid malé podjednotky Rubisca se naklonuje před vlastní N-terminus transgenu cílení do mikrotělísek: ke konci transgenu se připojí posledních 34 AK z isocitrátlyasy zůstává na ER: motiv H/KDEL se zabuduje na C-terminus proteinu transgenu atd. 17

24 PŘÍMÁ TRANSFORMACE CHLOROPLASTů začlenění tragenu do chloroplastové DNA VÝHODY: dědí se pouze matrilineárně, tzn. transgen se nepřenáší pylem. k začleňování transgenu dochází pouze na specifických místech DNA homologní rekombinací vysoká exprese, až několik procent celkových proteinů lepší pro expresi bakteriálních genů v rostlinách (stejný gen.kód) NEVÝHODY: provedení: používá se biolistické metody velice silné genetické dělo hnané héliem, musí prorazit dvojitou chloroplastovou membránu, velice malá účinnost specifické vektory: obsahují část genetické informace chloroplastu aby mohla proběhnout homologní rekombinace selekční marker antibiotikum spektinomycin PŘÍKLAD VYUŽITÍ TRANSGENOZE V ZÁKLADNÍM VÝZKUMU: Cytokinin-deficientníní rostliny Nadexprese cytokinin oxidasy pod silným konstitutivním promotorem vyvolává cytokinin-deficientní fenotyp Potvrzení hlavní funkce cytokininů na diferenciaci rostliny Možné aplikace v zemědělství Galuszka et al., Eur.J.Biochem.,

25 Trvalá transgenoze ječmene s ektopickou expresí CKX pomocí Agrobacterium tumefaciens Umlčení CKX pod specifickými promotory reprodukčních orgánů např. HvLTP2 (lipid transporter protein) CKX aktivita v aleuronové vrstvě Nadexprese CKX pod kořenově specifickým promotorem RAF (root abundant factor) VYUŽITÍ TRANSGENOZE ROSTLIN A) ZMĚNA VLASTNOSTÍ ZEMĚDĚLSKÝCH PLODIN 1. rezistence k herbicidům 2. resistence k hmyzím škůdcům 3. rezistence k virům 4. změna obsahu olejů 5. oddálení dozrávaní plodů 6. kontrola opylování 7. zvyšování nutriční hodnoty (zlatá rýže) B) TOLERANCE VůČI STRESU (WeatherGuardGenes) C) MOLEKULÁRNÍ FARMÁŘSTVÍ 1. plantibodies a jedlé vakcíny 2. produkce léků rostlinami 3. produkce biopolymerů rostlinami 19

26 rezistence k herbicidům REZISTENCE KE GLYFOZÁTU (RoundUp ) A) nadprodukce enolpyruvylšikimát-3-fosfát syntasy - málo účinné B) mutovaný EPSP z E.coli v pouze 1 AK má 8000x nižší sensitivitu ke glyfozátu, transgen má navíc ještě signální peptid pro cílení do chloroplastu (transgenní rostlina odolná i vůči 0.5 kg glyfozátu na ha, běžná letální dávka pro nerezistentní druhy) využito u řady kulturních rostlin firmou MONSANTO C) katabolismus glyfozátu glyfozátoxidoreduktasou (gox) z Achromobacteru se signálním peptidem genu pro Rubisco pod konstitutivním promotorem uplatňuje se u řepky olejné PG11 rezistence k herbicidům REZISTENCE KE FOSFINOTRICINU (glufozinát, BASTA ) - ireverzibilní inhibitor glutaminsyntasy (fixace amoniaku do glutamátu) geny bar a pat z bakterií Streptomyces inaktivují glufozinát acetylací, byly vneseny do odrůd kukuřice a řepky povolené v USA a Kanadě REZISTENCE K DERIVÁTůM SULFONYL MOČOVINY (chlorsulfuron, GLEAN ) - inhibitory acetolaktátsyntasy (první krok v biosyntéze Val,Leu a Ile) rezistence založená na mutaci původního genu ve vazebném místě pro herbicid účinné u čekanky, topolu, rýže, jabloně, lnu, řepky a tabáku transgenní odrůdy nejsou moc využívaný často byla pozorována samovolná mutace a získaní rezistence REZISTENCE K BROMOXYNILU inhibitor fotosystému II půdní baktérie jsou schopny ho metabolizovat transgen klonován z rodu Klebsiella REZISTENCE K 2,4-D (2,4-dichlorfenofyoctová kyselina) nalezeny půdní baktérie schopny ho metabolizovat 20

27 Snímek 40 PG11 gluphosinate 2-amino-4-hydroxymetylfosfinil butanová kyselina galuszka; 25/03/2006

28 PG7 rizika ekologická (pouze teoreticky, nebyla zatím prokázána) 1/ tolerance k herbicidu by mohla přeměnit kulturní rostlinu v plevel - u žádného transgenu nebyl zatím potvrzen pozitivní selekční tlak 2/ gen pro toleranci k herbicidu by mohl mít neočekávány pleiotropní efekt, který by mohl negativně změnit kulturní plodinu -testuje se 3/ šíření transgenu do okolních populací stejné cizosprašné plodiny pylem - největší riziko ik u řepky olejné, zabrání se zavedením transgenu do chloroplastu - dodržování základních principu agrotechniky, pokud by se stalo, je třeba na určitou dobu změnit herbicid rizika zdravotní vnesením transgenu do rostlin se dostávají do potravy tři nové typy molekul: 1/ DNA transgenu nemá smysl o riziku uvažovat, tento typ horizontálního přenosu nebyl nikdy prokázán á (např. přenos do střevních bakterií). 2/ produkt transgenu většinou jde o enzymy specifických metabolických drah rostlin či baktérií, které metabolismus člověka neovlivňují, alergické reakce nebyly u žádného prokázány, enzymy jsou v trávicím traktu člověka okamžitě rozkládány 3/ vlastní herbicid všechny herbicidy mají pro živočichy vysoké letální dávky např. glyfozát LD50= 5g na kg, potenciál podráždění kůže srovnatelný s detergentem na nádobí nebyly prokázány ani genotoxické, teratogenní či karcinogenní účinky spekulace: glyfozát se může v půdě bohaté na nitráty a nitrity měnit na slabě mutagenní N-nitroglyfozát (tato konverze však v rostlinách nikdy nebyla prokázána) 21

29 Snímek 41 PG7 pleiotropní efekt vnášeného genu vyvolaný buď nečekanou interakcí produktu vnášeného genu s některou komponentou rostliny, nečekanou interakcí metabolické cesty podmíněné vnášeným genem s jinou metabolickou cestou, jež je rostlině vlastní, nebo nečekanou aktivací metabolické cesty, jež není v rostlině obvykle aktivní. Vyloučit nelze ani tzv. inzerční mutaci, která vznikne nabouráním vnášeného genu do genu, jenž je rostlině vlastní a jenž je tímto zásahem narušen, takže nemůže zajišťovat obvyklé funkce. galuszka; 19/03/2006

30 GMO rezistentní k herbicidům Roundup Ready bavlna, kukuřice, sója a jarní řepka (kanola) běžná kanola Roundup Ready kanola PG12 rezistence ke hmyzím škůdcům Bt - rostliny 1902 byla v Japonsku objevena baktérie Bacillus thuringiensis, která způsobovala úhyn bource morušového 1987 byl z této baktérie izolován krystalický protein δ-endotoxin, který po projití trávicím traktem hmyzu, způsobuje jeho rozklad se začala tato baktérie využívat jako insekticid, postřiky byly drahé a dlouho neúčinkovali 1985 připraven transgenní tabák overexprimující Bt-toxin (nízká exprese % všech listovým proteinu) důvod: nestabilita bakteriální mrna v rostlině synteticky upravené geny pro δ-endotoxin - byl snížen obsah AT bází - pozměněn genetický kód tak aby vyhovoval rostlinám -vloženyintrony exprese se zvýšila až 1000x, většinou se využívá konstitutivní 35S promotor existuje řada genů pro Bt-toxin (CryIA-CryIIIB)srůznouspecifitouvůčirůzným hmyzím druhům 22

31 Snímek 44 PG12 zavíječ kukuřičný motýlek vytvářející chodby ve stéblech a palicích, housenky okusují listy a přezimují v pokosených stvolech na strništi největší škody na jižní Moravě galuszka; 25/03/2006

32 Bt-rostliny 40% pěstované kukuřice v USA jsou Bt-transgenní transgenní odrůdy Bt-kulturní plodiny 1989 rajče 1992 kukuřice 1993 bavlník 1995 zelí, brokolice 1997 brambor, baklažán 2000 čínské zelí běžná rostlina bramboru napadená mandelinkou Bt-brambora další: tabák, topol, borůvka, rýže, sója, ořešák země kde jsou povolené odrůdy Bt bavlníku a Bt kukuřice Argentina Indonésie Austrálie Mexiko Čína Jižní Afrika Indie USA Argentina Kanada EU (některé) Jižní Afrika USA PG13 vývoj a zavádění GMO VÝVOJ TRANSGENNÍ ODRUDY RAJČETE primární transgenní rostlina 6 měsíců (selektování homozygotní populace 2 roky) vývoj stabilní variety 3 roky zkoušky variety 2 roky uvádění na trh 1-2 roky 6-7 roku od transgenní rostliny po komerční uvedení ZAVÁDĚNÍ Bt-BAVLNÍKU BAVLNÍKU V INDII 1994 podání žádosti o dovoz transgenních semen 1995 povolení k dovozu z USA 1996 dovoz, pokusné pěstování ve skleníku 1996 první pokusné pole povoleno pět pokusných lokalit 1998 testy na stepních kozách a alergologické testy na lidech lokalit na pěstování první velkoplošné pěstování (100 ha) 2001 první vlastní sklizeň transgenních semen 2002 povolení pro komerční prodej a pěstování 23

33 Snímek 46 PG13 obsah významných hmyzích druhů v bavlníkových polích jednak konvenčních, jednak Bt bavlníku. Bt bavlník se používá k potlačení černopásky bavlníkové Helicoverpa armigera. V polích transgenního bavlníku zjistili vyšší zastoupení predátorů než na polích konvenčně ošetřených insekticidy, až na parazitické vosičky, jejichž počet byl snížen v odpovědi na sníženou hustotu a nízkou kvalitu larev černopásky. Jelikož je dosti predátorů, je snížen výskyt mšic, ale zvyšuje se počet svilušek, protože se nestříká insekticidem. Pestrost druhů členovců je vyšší v Bt bavlníku, což naznačuje, že Bt bavlník je výhodnou plodinou pro integrovanou ochranu. Kontrolně se testoval vliv pylu Bt bavlníku na bource produkující hedvábí (Antheraea pernyi a Bombyx mori) a zjistilo se, že vliv je zanedbatelný. galuszka; 25/03/2006

34 PG14 rizika Bt-rostliny i samotný endotoxin byly testovány na lidech, psech, morčatech, čolcích, krysách, rybách a ptácích bez žádných příznaků byly prováděny alergologické testy nebyl pozorován ani žádny vliv na hmyzích predátorech (1996 včela, slunéčko) 1999 NEJVĚTŠÍ SKANDÁL GMO případ motýlka Danaus plexipus tento motýl patří v USA mezi ohrožené druhy publikovaná práce kdy byla prokázána zvýšená mortalita larev po poprášení rostlin klejichy (potrava) pylem z Bt kukuřice v roce 1999 byl však zaznamenán nárůst populace tohoto motýlka nedochází k časové koincidenci kvetení kukuřice a vývoje larev GREENPEACE vydává seznam evropských motýlů ohrožených endotoxinem v Bt-rostlinách snaha o zavádění Bt-rostlin s matrilineární dědičnosti PG1 odsekvencovaný genom díky člověku ztratil schopnost létat bourec morušový první transgenní motýl? hledání genetických příčin (porovnání s drosofilou a anopheles) 1874 genů odpovědných za produkci vlákem ze kterých se vyrábí hedvábí 24

35 Snímek 47 PG14 Monarch butterfly galuszka; 25/03/2006 Snímek 48 PG1 Samička klade vajíček, ta jsou nejprve žlutá a později tmavnou. Housenky, které se z nich líhnou, se živí výhradně listím moruše bílé nebo černé ( Morus alba, M. nigra ), jedná se tedy o tzv. monofágní hmyz. Vývoj housenek trvá asi 35 dnů a má pět instarů (vývojových stadií, z nichž každé je zakončeno svlékáním). Za tuto dobu housenka vyroste na 25-30násobek své délky a hmotnost zvýší sedm- až devěttisíckrát. Plně vyvinutá, dorostlá housenka se začne kuklit. Z párových slinných žláz vylučuje tekutinu, která na vzduchu tuhne, čímž vzniká tenké hedvábné vlákno. Jím se opřádá tak dlouho, až vytvoří pevný pružný zámotek - kokon. Ten je svrchu ještě opředen jemnými vlákénky, tzv. bourovinou. Petr Galuszka; 20/03/2007

36 PG8 PG2 rezistence ke hmyzím škůdcům transgeny rostlinného původu inhibitory trávicích enzymů (amylas a proteas) hmyzu, lektiny (proteiny vážící sacharidy), chitinasy, syntéza alkaloidů INHIBITORY PROTEAS sójový inhibitor serinových proteas inhibitor trypsin proteas z vigny inhibitor proteas z rajčete INHIBITORY AMYLAS amylasový inhibitor z fazole LEKTINY (účinné proti mšicím) lektin sněženky GNA (Galantus nivalis aglutinin) lektin hrachu chitinasa z fazole rezistence k háďátkům ročně způsobují ztráty až 77 miliard dolarů napadají především brambory, řepu, rajčata existují přirozené proteiny způsobující rezistenci v těchto plodinách již dlouhodobě se šlechtí brambory s vysokou rezistenci genetickým mapováním byly nalezeny geny způsobující rezistenci použity jako transgeny v GMO stírají se rozdíly mezi přirozenou a umělou rezistenci (GMO pouze urychlilo klasické šlechtění) 25

37 Snímek 49 PG8 PG2 GNA - nebyla na krysách prokázána toxicita, až na podivnou studii Arpada Pusczaye ze Skotska, mediální vlna, navíc brambory se vaří a lektin se varem ničí galuszka; 19/03/2006 lektin - bilkovina vážicí se na glykosylované povrchy buněk Petr Galuszka; 20/03/2007

38 virové a bakteriální nemoci kukuřice Varieta WI MD NB R SB SM SW BW C Seneca White Knight x Silver Dollar x x x x Silver Queen Hybrid x x Silverado x x Snowbelle x Snow White x Spring Snow x Stardust x x Summer Flavor #81W x Summer Sweet 7101W x x Summer Sweet 8101W x x Sweet Ice x x x Sweet Magic x x rezistence různých variet kukuřice MD = maize dwarf mosaic virus NB = corn leaf blight R = rust SB = so. corn leaf blight SM = smut SW = Stewart s wilt BW = bacterial wilt C=cold rezistence k virům hlavním způsobem rezistence je exprese genu pro plášťový protein daného viru 1986 první transgenní rostliny tabáku rezistentní t vůči TMV (existuje faktor, který rozbalí virus a aktivuje ho, tento faktor se při infekci vychytá plášťovým proteinem produkovaným rostlinou. Korelace: čím větší exprese tím vyšší rezistence byly nalezeny i jiné původní geny způsobující rezistenci, ty byly mapovány a použity jako transgeny proti RNA virům se využívá protismyslná RNA strategie 26

39 PG9 papája na Havaji papaya ringspot virus (PRV) ovlivňoval úrodu na Havaji od roku 92 do roku 96 klesla produkce díky viru o 40% 1996 první transgenní papája overexprimující plášťový protein pod 35S promotorem připravená biolistickou metodou od roku 1998 nárůst produkce PG15 rizika TRANSKAPSIDACE transgenní rostlina napadená jiným virem, sestavování pseudovirionů, hmyzem přeneseny do rostliny, která nebyla vůči původnímu viru senzitivní k tomuto jevu dochází přirozeně, virové populace již přirozeně vyčerpaly všechny možnosti pozitivních mutací REKOMBINACE virový genom se může rekombinovat s transgenní mrna virového původu a dát vznik viru novému bylo již prokázáno, ale nikdy zatím nevznikl infekční virus (schopnost přenosu z buňky do buňky) 27

40 Snímek 53 PG9 u nás se začíná zavádět odrůda transgenní slivoně Stanley s expresí obalového proteinu viru šarky galuszka; 19/03/2006 Snímek 54 PG15 To assess the risks associated with recombination involving viral sequences in transgenic plants, we have constructed two hybrids between tobacco mosaic tobamovirus (TMV) and cucumber mosaic cucumovirus (CMV).These hybrid viruses have been used to assess risks associated with recombination and transcapsidation. In Nicotiana tabacum, both viruses could infect the inoculated leaf and move cell-to-cell, but neither virus could move systemically. In N. benthamiana, T/CMV-0 did not show systemic symptoms and moved systemically very poorly. In the same host, T/CMV-1 gave a systemic infection, in which the leaves showed mosaic symptoms, although the kinetics of infection suggested that the route of systemic invasion was not via the vasculature. Since only encapsidated RNAs can be transmitted by the aphid vectors of CMV, these data demonstrate that RNAs of heterologous viruses will only be encapsidated efficiently if the RNAs are similar in size to the CMV RNAs. Thus, these data indicate that transgenic plants expressing CMV CP, at levels orders of magnitude lower than observed here for T/CMV-1, do not pose a risk of transcapsidation and transmission of heterologous viral genomes. These data also demonstrate that recombinant viruses formed between TMV and the CMV CP gene are debilitated for long-distance movement via the vascular system. Thus, recombinant viruses formed between the CMV CP gene and most other viral genomes are unlikely to survive in nature. The issue of whether transgenic plants expressing the coat protein (CP) gene(s) of a virus are likely to be sources of genetic material for recombination with unrelated viruses, generating unique, and by inference, more virulent viruses has been of concern to a number of critics and some researchers in the field. While transcapsidation occurs with some closely related plant viruses, it occurs rarely, Recombination has been observed to occur among plant viruses and also between a plant virus and similar viral sequences expressed from a transgene, under strong or moderate selection pressure However, this is not the main cause of concern, which is whether an unrelated virus could obtain viral sequences from a transgene and alter its pathogenicity, host range, or method of transmission; i.e., virus-vector interactions Thus, transgenic plants are being examined for recombination between viral transgenes and various viruses to see if such recombinant viruses will form and whether the recombinant viruses display any selective advantage and/or altered phenotype. Although many plants are infected by several plant viruses at one time, there is no evidence for new viruses having been formed recently by recombination between two viruses that are taxonomically different galuszka; 25/03/2006

41 PG16 další využívané transgeny ZMĚNA OBSAHU ROSTL.OLEJů řepka olejka, sója, len a slunečnice biosyntéza olejů v rostlinách dvě části 1) v chloroplastech 2) na ER (prekurzor k.palmitová) roční produkce 60 miliónů tun ročně cíle transgenoze: změna poměru jednotlivých mastných kyselin ve prospěch nasycených využití: potravinářství (zvýšení nutriční hodnoty) kosmetický průmysl mazadla, bionafta (metylestery mastných kyselin) hlavní transgeny: lauroyl-acp-tiolesterasa (z krysy) vznik kratších uhlíkatých řetězců 1-acylglycerol-3-fosfátacetyltransferasa - opak high laurate canola 1996 Brassica napus transformována acyl-acp-tiolesterasou pod specifickým promotorem s cílením do semen zvýšený obsah k.laurové na úkor olejové a linoleové myristová 4% palmitová 3% olejová 31% linolová 11% linoleová 7% laurová 38% další 6% 0.02% původně využití: výroba mýdel a šampónů výroba čokolády výroba rostlinných sýrů light smetana 28

42 Snímek 55 PG16 přirozeně v řepce 90% mastných kyselin s 16 a více uhlíky, laurová 12 nasycených galuszka; 26/03/2006

43 PG17 další využívané transgeny ZMĚNA OBSAHU ZÁSOBNÍCH PROTEINů obiloviny a luštěniny A) zvýšení syntézy y nedostatkových AK bakteriální mutovaný gen pro DIHYDROPIKOLINÁT SYNTASU a ASPARTÁT KINASU, které nemají zpětnou inhibici nadbytkem produktu (Lys) transgenní rostliny 100x vyšší obsah lyzinu a methioninu ten se ale nezabudovává v tak velké míře do zásobních proteinů. B) transgenoze genu pro zásobní protein zein -28% methioninu i 2S-albumin z paraořechů 18% methioninu aspartát kinasa dihydropikolinát syntasa 29

44 Snímek 57 PG17 hlavně jako krmné směsi pro živočichy, větší výživná hodnota vysoké procento esenciálních AK, které jsou důležité pro správný a rychlý vývoj živočichů galuszka; 26/03/2006

45 GENOVÉ UMLČOVÁNÍ (gene silencing) genové umlčování TGS (transcriptional gene silencing) nedochází k transkripci transgenu může jí předcházet transkripce promotorové sekvence a následná inhibice promoteru komplementárním duplexem RNA-DNA nebo častěji metylace promotorové sekvence PTGS (post-transcriptional gene silencing) založena na specifické degradaci mrna 30

46 TGS a PTGS read-through transcription ti DNA-DNA pairing methylation chromatin remodelling RNA-DNA pairing RNA degradation RNA-RNA pairing methyltransferases chromatin remodelling factors dsrna SYNTÉZA PROTEINU přirozený promoter 3 5 A T G C T A C G 5 3 Gen (dsdna) jednořetězcová mrna transkripce Ribosome translace exprese genu protein 31

47 obecný princip PTGS přirozený promoter 3 5 TEORIE PROTISMYSLNÉ RNA A T G C 5 T A C G 3 gen (dsdna) jednořetězcová mrna transkripce mrna řetězec hybridizuje a stává á se duplexem dsrna Ribosom žádná translace žádná exprese genu gen (dsdna) mnoho kopií A T G C 5 T A C G 3 5 transkripce silný promoter transgen = žádný protein GEN JE UMLČEN 32

48 poprvé pozorováno 1990 u transgenní petúnie vědci se pokoušeli ztmavit květy petúnie overexpresí genu pro chalkonát syntasu (enzym produkující černý antokyanin) pod silným virálním promotorem. Transgen interferoval s vlastním genem pro tento enzym a docházelo k jeho vzájemnému umlčování. prpl prpl RNA interference (RNAi) Science, prosinec

49 PRINCIP RNAi hairpin RNA dsrna Virus dsrna Transgene RNA p sirna HO (short interfering p RNAs, nt long) HO OH p p HO OH p Cleavage of dsrna by dicer-like enzyme OH p p HO OH p (DICER contains dsrna cleavage activity, helicase and dsrna binding activity) RNase III like protein systém funguje v cytoplasmě a zřejmě existuje jako rezistence vyvinutá proti RNA virům sirna/protein complex p HO OH p sirna is unwound, single-stranded RNA formed mrna target RISC complex (RNA-induced silencing complex) sequence-specific target recognition p p OH OH RISC se automaticky generuje v rostlině v přítomnosti sirna imunitní odpověď na úrovni NK mrna degradation continued on next slide 34

50 RNA dependentní RNA polymerasa Single-stranded sirnas can also be used as primers to make more dsrna by host RNA polymerase New dsrna formed from target mrna p OH Dicer (as in previous slide) p HO p OH p p HO OH OH p p OH HO p HO p význam RNAi Etc. Model was modified from Roth et al., (2004) Virus Research 102: STUDIUM FUNKCE GENů TERAPEUTICKÉ VYUŽITÍ knock-out out nebo inhibice funkce genu přežije organismus? jaké pozorujeme fenotypové změny? léčba rakoviny (viz. genová terapie) PG20 dvě strategie: a) KLASICKÁ PCR s dvěma typy primerů a postupné klonování (vektor phannibal) b) REKOMBINANTNÍ jedno PCR a klonování s následnou rekombinací (BP klonasa, vektor phellsgate) 35

51 Snímek 69 PG první testy na lidech, degenerativní poškození sítnice, zmožení cév, praskání, způsobeno nadměrnou expresí určitého růstového faktoru 2005 degerativní onemocnění mozku SGA1, exprese toxinu v buňkách, který je zodpovědný za rozpad neuronů galuszka; 26/03/2006

52 další využívané transgeny ODDÁLENÍ DOZRÁVÁNÍ PLODů rajčata zrání plodů rajčat (i ostatních) je způsobováno hlavně degradaci pektinu (polysacharid, polymer kys. D-galakturonové) v buněčné stěně plodů při zrání se aktivuje polygalakturonasa která rozkládá pektin 1994 transgenní odrůda lilku rajčete FlavrSavr s knock-outovanou polygalakturonázou (na 10%) transgen produkuje protismyslnou RNA zvýšena trvanlivost rajčat po sklizni o 2 týdny větši rezistence vůči houbovým a bakteriálním chorobám control transgenic + ethylene transgenic další využívané transgeny ODDÁLENÍ SENESCENSE - karafiát, brokolice, rajče ETHYLÉN - rostlinný hormon aktivující senescenci klíčový enzym v biosyntéze ethylenu- 1-aminocyklopropan aminocyklopropan-1-karboxyloxidasa karboxyloxidasa transgeny produkující protismyslnou RNA prodloužení životnosti řezaných květin plody začnou zrát až v prostředí etylénu PROBLÉM: při transportu takovýchto transgenních rostlin nebo plodů docházelo ke styku s výfukovými plyny, které iniciovaly senescenci v současnosti se vytvářejí odrůdy, které budou mít zablokovány přímo etylenový receptor (gen Etr1-1) 1) model petúnie - životnost květů prodloužena o 8 dní 36

53 biosyntéza ethylénu další využívané transgeny MODRÁ RůŽE 2004 vědci z firmy FLORIGENE (Calgene Pacific) pracovali na vývoji transgenní modré růže po několik let. Nakonec použili jako transgen gen pro flavonoid 3', 5'- hydroxylasu z petúnie pod specifickým promotorem s cílením do květů a transformovali čínskou čajovou růži (Rosa x hybrida). Transgen způsobil syntézu modrého flavonoidu delfinidinu. 37

54 transgen PG21 další využívané transgeny pylová sterilita HETEROZE jev kdy se zemědělci snaží zvyšovat úrodu pěstováním rostlin v heterozygotním stavu, vyšlechtěná odrůda (homozygotní, hybridní linie) se zkříží s původní. heterozní osivo musí být tudíž získáno z pylově sterilních rostlin (jednodomých). Pylově sterilní rostliny usnadní produkci heterozního osiva. aby se tyto rostliny mohli ale klasicky rozmnožovat, musí mít partner křížení gen který obnovuje fertilitu. PG22 řepka olejka systém genu pro barnasu (extracelulární RNasa z Bacillus amyloliquefaciens) a jejího inhibitoru barstar do rostlin (I) byl gen pro barnasu vložen pod specifickým promotorem r s cílením í do tapeta (součást pylového váčku) + transgen pro rezistenci k herbicidu (pylově sterilní linie) do rostlin (II) byl pod stejným promotorem vložen gen pro barstar (i samosprášení) křížením těchto rostlin vzniká heterozní osivo, které se vždy v další generaci selektuje herbicidem pro něž mají rezistenci pouze rostliny nesoucí gen pro pylovou sterilitu (potlačení homozygotů z linie II) 38

55 Snímek 76 PG21 hybridní odrudy jsou u některých zemědělských plodin a většiny zeleniny nejpoužívanější. Zvýšení produkční schopnosti F1 generace a vitality proti rodičům pro přípravu heterozního osiva se většinou používá chemických látek způsobující pylovou sterilitu u samosprašných rostlin PG22 cytoplasmatická pylová sterilita, sporofytická inkompatibilita atd... galuszka; 27/03/2006 obě linie jsou vysazeny současně na pole sklizeň heterozního osiva samozřejmě příměs homozygotů původních u fertilní linie při výsevu heterozního osiva aplikace herbicidu, přeživají pouze heterozygoti galuszka; 27/03/2006

56 zlatá rýže další využívané transgeny největší evropský projekt GMO ovlivněná celá metabolická dráha geranylgeranyl pyrofosfát fytoensyntasa fytoen fytoendesaturasa fytoendesaturasa normální zrna rýže ζ-karoten ζ-karoten desaturasa lykopen lykopen- β-cyklasa b-karoten endogenní nní lidské geny zrná rýže s β-karotenem Vitamin A projekt -zlatá rýže rýže je schopná syntetizovat β-karoten jen v zelených částech v obilkách je posledním meziproduktem geranylgeranylpyrofosfát do genomu rýže vneseny pod specifickým glutinovým promotorem s cílením do endospermu tři geny: fytoendesaturasa z baktérie Erwinia fytoensyntasa z narcisu lykopen- β-cyklasa β-karoten (provitamín A) nejsou obratlovci schopni syntetizovat, ale potřebují ho pro syntézu retinalu (součást pigmentu rhodopsinu) a k.retinové (reguluje morfogenezi) avitaminóza způsobuje dětskou slepotu, snižování imunity a je příčinou asi půl milionové dětské úmrtnosti především v rozvojových zemích jihovýchodní Asie silné námitky antibiotechnologických aktivistů není třeba, jsou tabletky - může dojít k předávkování atd. 39

57 další využívané transgeny PG24 bezkofeinová káva 7-metylxantin N-metyltransferasa a theobromin N-metyltransferasa JAPONSKO 2003 exprese genů inhibována metodou RNAi druh Cofea canephora transformován Agrobaktériem transformované rostliny stejné jako wild type Cofea canephora se pěstuje na Madagaskaru a má 2x větší obsah kofeinu než nejrozšířenější Cofea arabica v mladých listech: theobromin 30-80% kofein 50-70% transgenní rostliny tolerantní vůči stresu VODNÍ STRES při nedostatku vody (i zasolení) se zvyšuje osmotický tlak buněk, dochází k poklesu fotosyntézy a fotoredukci kyslíku za vzniku aktivních kyslíkových radikálů poškození a) nadprodukce osmoprotektivních látek glycinbetain transgen cholindehydrogenasa z E.coli (tabák, brambor) prolin transgen semialdehyddehydrogenasa k. glutamové z vigny manitol transgen manitol-1-fosfátdehydrogenasa fruktany chimerický transgen fruktozyltransferasa z Bacillus subtilis a vakuolární signální sekvence z karboxypeptidasy ze Saccharomyces b) ovlivnění signální dráhy pro dehydratační stres u Arabidopsis thaliana byla objevena signální dráha společná pro stres dehydratací a chladem současně bylo zjištěno, že geny reagující na tyto stresy mají ve svých promoterech konzervovanou sekvenci TACCGACAT tzv. DRE (dehydratation responsive element).. Byl nalezen transkripční faktor aktivující tuto sekvenci DREB1A, a jeho gen použit jako transgen. + transgenní rostliny daleko odolnější k suchu, mrazu zasolení - zpomalení růstu (může se použít specifický promotor indukovatelný stresem) 40

58 Snímek 79 PG24 příprava bezkofeinové kávy -, buď extrakce chloroformem - karcinogen, vymražování tekutym CO2 - značně náročná finančně galuszka; 27/03/2006

59 transgenní rostliny tolerantní vůči stresu STRES CHLADEM významná je korelace mezi citlivosti k chladu a množstvím nenasycených mastných kyselin v membránách. vnesení transgenu které indukují tvorbu cis-dvojných vazeb v nasycených mastných kyselinách se zvýší rezistence k chladu (gen pro ω-6-desaturasu z Arabidopsis do tabáku, 1996). BIOTICKÝ STRES jako transgeny byly použity geny pro chitinasy a beta-1,3-glukanasy, které zvyšovaly resistenci vůči širokému spektru houbových patogenů, tím že rozkládaly jejich buněčnou stěnu byly zkoušeny i PR-proteiny, fungují ale ne samostatně, pouze v různých kombinacích kyselina salicylová signál hypersenzitivní reakce na napadení patogenem jako transgeny geny pro enzymy přeměňující chorismát na k.salicylovou až 1000x vyšší obsah k.salycilové, nezměnil fenotyp rostlin (tabák) a vyvolal silnou rezistentní reakci proti širokému spektru patogenů (viry,baktérie i houby) transgenní rostliny tolerantní vůči stresu FYTOREMEDIACE odstraňování těžkých kovů z půdy pomocí transgenních rostlin schopných lépe akumulovat těžké kovy. savčí nebo kvasničný transgen pro metalotionein přenesení genů redukující rtuťnaté soli z baktérií do rostlin, odčerpávání těchto solí z půdy, přeměna na rtuť a její následné odpařování do atmosféry. savčí gen pro cytochrom P450 2E1, jaterní enzym, schopný odbourávat TCE (trichloretylen, t l hlavní polutant podzemní vody), byl exprimován v rostlinách Arabidopsisu, které byly následně schopny ho odbourávat. 41

60 molekulární farmářství rostlinné jedlé vakcíny jako transgeny se používají oslabené toxiny původců mnohých chorob stimulace mukózního imunitního systému v epitelu trávícího traktu (účinná imunizace) velice levné a efektivní značné uplatnění v rozvojových zemích, pojídáním čerstvých plodů se získá imunita vůči nemocem, které v těchto zemích způsobují milióny úmrtí. vše ve formě testů v rostlinách tabáku a bramboru zatím úspěšné zubní kaz protein spaa ze Streptococcus mutans hepatitida B povrchový antigen HBsAg viru cholera termolabilní enterotoxin B z Vibrio cholerae 1 g brambor vyrobí 30µg tohoto toxinu brambory se uvaří a toxin denaturuje testy na myši prokázaly vysokou účinnost a neškodnost 1997 poprvé testováno na člověku hlavní snaha vědců je produkce těchto vakcín v plodinách rozšířených ve třetím světě jako je banánovník molekulární farmářství v rostlinách připravené živočišné protilátky nebo části protilátek v rostlinách lze produkovat i monoklonální protilátky protilátky jsou vylučovány do mezibuněčného prostoru mohou sloužit přímo v rostlině (jako ochrana proti patogenům) nebo mohou být extrahovány a použity v diagnostice či medicíně výrazně se sníží náklady a čas na tvorbu protilátek (hybridomové buňky) plantibodies 42

61 plantibodies hlavní problém rozdíly v N-glykosylaci proteinů (protilátek) u živočichů a rostlin plantibodies mají jinak glykosylovanou strukturu a po aplikaci do zvířete vyvolávají nechtěnou imunitní odpověď řešení: společně s geny pro Ab je do rostliny vnesen gen pro lidskou β-1,4- galaktosyltransferasu rostlina pak produkovala polidštěné protilátky jako transgen stačí vložit pouze malou variabilní oblast tzv. Fv domény z lehkého a těžkého řetězce spojenou krátkým peptidem scfv single chain variable fragment non-hodgkinský lymfom rakovina lymfatických uzlin (B-lymfocytů) nádorové buňky produkují specifické protilátky (zachycené na svém povrchu, liší se od zdravých) tabák infikován TMV s vloženou části genu pro scfv myši tabák produkuje scfv nádorových buněk 43

62 tabák produkuje funkční antigen, který po aplikaci myši produkuje protilátky proti nádorovým buňkám imunitní odpověď nevznikla na mezidruhovou odlišnost, produkt rostliny odlišná glykosylace, špatně ustřižený signální peptid 80% myší přežilo antigen vytvořen během 6 týdnů velice jednoduchá izolace RYCHLE A LEVNĚ léčba (vakcína) dělaná pacientovi přímo na míru v současné době klinicky testované plantibodies antigen rostlina typ rekomb. Protilátky aplikace povrchový antigen Streptokoka Herpes simplex virus sperma non-hodginský lymfom virus vztekliny CEA - cancer embryonic antigen tabák sója, rýže kukuřice tabák tabák tabák, rýže, pšenice, rajče sekreční IgA CaroRx IgG IgG scfv IgG scfv, diabodies, chimerické protilátky terapeutická povrchová aplikace terapeutická povrchová aplikace antikoncepce ve formě gelu personalizovaná vakcína terapeutická intravenosně terapeutická diagnostická Stoger et al., Recent progress in plantibody technology, Curr. Pharm Design 11,

63 molekulární farmářství biodegradovatelné plasty některé bakterie jsou schopny uchovávat uhlík aenergii ve formě osmoticky inertních polymerů (polyester k. hydroxymaselné PHB) tyto jsou pak v přírodě rychle degradovatelné tři geny z baktérií byly vloženy do rostlin Arabidopsis 3-ketotiolasa NADH-dep. acetoacetyl-coa CoA-reduktasa PHB-polymerasa syntéza PHB navazuje na syntézu mastných kyselin, jejíž část probíhá v chloroplastech l h pokud byly tyto geny vloženy do jaderného genomu pod 35S promotorem docházelo k nadměrné produkci polyhydroxybutyrátu v listech (PHB tvořil 0.14% sušiny) pokud byly produkty transgenů cíleny pomocí signálních peptidů do chloroplastů zvýšila se produkce až 100x 45

64 molekulární farmářství biodegradovatelné plasty Arabidopsis i slouží jako modelová rostlina předpokládá se že, tento model bude přenesen do nějaké rostliny, která produkuje velké hlízy nebo semena a není konzumována ani člověkem ani zvířaty (skočec Ricinus communis) transgenní řepka p vyprodukuje až 10 g PHB na rostlinu fa MONSANTO zatím tento projekt pozastavila, jelikož to stále ještě není ekonomicky výhodné (výroba plastů z fosilních zdrojů je daleko levnější) PG10 GMO schválené pro komerční využívaní a polní pokusy na území ČR GM virus vakcína proti Aujeszkého chorobě (fa Vermie Veterinär Chemie) GM virus vakcína proti vzteklině (fa Rhone-Merieux) Streptococcus termophilus (fa Valio, testování residuí antibiotik v mléce) tabák tolerantní k herbicidu bromoxynilu (fa SEITA) řepka olejka tolerantní k herbicidu glufosinátu pro krmiva (fa Plant Genetic Systems) řepka olejka tolerantní k herbicidu glufosinátu pro pěstování (AgrEvo) sója tolerantní k herbicidu glyfozátu (Monsanto) čekanka částečně tolerantní k herbicidu glufosinátu s pylovou sterilitou (fa Bejo-Zaden) kukuřice s rezistenci vůči hmyzu (Bt-endotoxin) a toleranci k glufosinátu (Ciba-Geigy a Novartis) kukuřice rezistentní vůči hmyzu (Bt-endotoxin) (Monsanto) kukuřice k tolerantní t vůči herbicidu id glufosinátu (AgrEvo) kukuřice tolerantní k herbicidu glyfozátu (Monsanto) karafiáty se změněnou barvou květu (Florigene) karafiáty s prodlouženou trvanlivostí (Florigene) slivoň s obalovým proteinem viru šarky PPV brambor s pozměněným metabolismem sacharidů (redukce amylosy ve prospěch amylopektinu ve škrobu, BASF) len setý s genem pro hygromycin (testování křižitelnosti s wt druhy lna vyskytujícího se na území ČR) Evropa a GMO: Rumunsko, Španělsko, Francie, Německo, Portugalsko a ČR 46

65 Snímek 92 PG10 GM viry se používají např. do návnad pro lišky v lese galuszka; 19/03/2006