Biotechnologie rostlin, kultivace rostlinných buněk

Transkript

1 Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta Univerzita Palackého v Olomouci Ivo FRÉBORT Biotechnologie rostlin, kultivace rostlinných buněk I. část Šlechtění kulturních plodin Zemědělské plodiny jsou výsledkem zásahů do genetické informace trvajících více než let 1

2 Transformace pomocí Agrobacterium tumefaciens -Půdní baktérie, vyvolává tvorbu nádorů u rostlin -Přenáší do genomu rostliny část plasmidu Ti plasmid Příprava transgenních rostlin 2

3 Genové dělo Nastřelování DNA do buněk pomocí zlatého prachu Využití genetických modifikací rostlin Zvyšování výnosů (boj s plevelem, odolnost proti škůdcům) Obohacená krmiva pro dobytek (lysin) Potraviny obsahující vitamíny Jedlé vakcíny (rozvojové země, brambor, banán hepatitida B, cholera) Fytoremediace půdy (odstraňování těžkých kovů) Molekulární farmaření (výroba léčiv protilátky, terapeutika, bioplasty) Umlčování genů (oddálení dozrávání, rajče, květiny) 3

4 Boj s hladem - vyšší výnosy - nové odrůdy Klasické šlechtění Pomalé Dostává se na hranice možností Genetické modifikace Rychlé Zatím nejsou jasné jeho limity Hlad ohrožuje na životě mil. lidí Oslabení lidé náchylní k infekcím Nejvíce ohrožení děti, matky, staří lidé Možnosti boje s hladem t/ha 3 Nedostatek živin Plevele, choroby,škůdci Sucho 2 Místní hnojiva 1 Nezávadná osiva a sadba HRANICE PROSPERITY HRANICE PŘEŽITÍ Odolné odrůdy 4

5 Odolnost rostlin k herbicidům - Roundup Gen pro rozklad glyfosátu Sója odolná vůči herbicidům Více než 50% ploch na světě oseto RR sójou 5

6 Kukuřice - rozmach škůdců Vyvolávají druhotné napadení plísněmi - mykotoxiny Zavíječ kukuřičný v ČR

7 Bacillus thuringiensis - δ-endotoxin - Specifický účinek na určitou čeleď hmyzu - Používá se jako ekologický insekticid od Člověku neškodí ani dávka ze 2 hektarů Bt- kukuřice - odolná vůči hmyzím škůdcům - Široce rozšířena v USA (90%) - Je povolena k pěstování v EU 7

8 Rizika vzniku rezistentních škůdců Rezistence je dědičná Založena recesivně Musí se udržovat pole, kde škůdci nejsou vystaveni selekčnímu tlaku Křížením vzniknou heterozygoti, kteří jsou na Bt citliví Rezistence vzniká na všechny pesticidy, nejen na GMO!!! Papája na Havaji Papaya ringspot virus (PRV) - Produkce na Havaji v období klesla o 40% transgenní papája overexprimující plášťový protein pod 35S promotorem připravená biolistickou metodou - od roku 1998 nárůst produkce 8

9 Boj s podvýživou zlatá rýže Avitaminóza i A u konzumentů loupané rýže (JV Asie) Ročně oslepne 200 tisíc dětí Rýže obsahující β-karoten Je zapotřebí obohatit stravu i o tuky High laurate canola 1996 Brassica napus transformována acyl-acp-thiolesterasou pod specifickým promoterem s cílením do semen zvýšený obsah nenasycené kyseliny laurové na úkor olejové a linoleové myristová 4% palmitová 3% olejová 31% linolová 11% linoleová 7% laurová 38% další 6% 0.02% původně využití: výroba mýdel a šampónů výroba čokolády výroba rostlinných sýrů light smetana 9

10 Obohacení krmiv - změna obsahu zásobních proteinů (obiloviny a luštěniny) A) zvýšení syntézy nedostatkových AK bakteriální mutovaný gen pro DIHYDROPIKOLINÁT SYNTHASU a ASPARTÁT KINASU, které nemají zpětnou inhibici nadbytkem produktu (Lys) transgenní rostliny 100x vyšší obsah lysinu a methioninu ten se ale nezabudovává v tak velké míře do zásobních proteinů. B) transgenoze genu pro zásobní protein zein -28% methioninu 2S-albumin z paraořechů 18% methioninu GMO ve světě stále přibývá Hlavní producenti: USA (50%) Argentina Brazílie Kanada Indie Čína Hlavní plodiny: Kukuřice Sója (60% produkce) Bavlník 10

11 Poměr tradičních a GM plodin Conventional Biotech % 43% 24% 20% Soybean Cotton Maize Canola 11

12 Hlavní druhy GMO schválené pro komerční využívaní na území ČR/EU Řepka olejka tolerantní k herbicidu glufosinátu pro krmiva (Plant Genetic Systems) tolerantní k herbicidu glufosinátu pro pěstování (AgrEvo) Sója tolerantní k herbicidu glyfosátu (Monsanto) Čekanka částečně tolerantní k herbicidu glufosinátu s pylovou sterilitou (Bejo- Zaden) Kukuřice v ČR ha v roce 2007 s rezistencí vůči hmyzu (Bt-endotoxin) a toleranci k glufosinátu (Ciba- Geigy a Novartis) rezistentní vůči hmyzu (Bt-endotoxin) (Monsanto) tolerantní vůči herbicidu glufosinátu (AgrEvo) tolerantní k herbicidu glyfosátu (Monsanto) Karafiáty se změněnou barvou květu (Florigene) karafiáty s prodlouženou trvanlivostí (Florigene) Protesty vůči pěstování GMO rostlin USA a další země velký rozvoj GMO, přijímáno jako nová pokroková technologie, řešení nedostatku potravin Evropa konzervativní, velký vliv Greenpeace, místní nadprodukce potravin, dotované zemědělství Greenpeace snaha o zastavení pěstování GMO, blokují např. používání zlaté rýže Samozákazy prodeje GMO produktů obchodními řetězci v Evropě reklamní trik 12

13 Vlivy na životní prostředí Testy s GMO řepkou, řepou, kukuřicí Velké snížení používání pesticidů Nižší nebezpečí vzniku rezistentních plevelů Vliv na biodiverzitu hmyzu, ptactva, hlodavců obdobný vlivu odrůd získaných klasickým šlechtěním Můžeme jíst GMO? GMO pro krmiva a potraviny - testovány a schvalovány (vývoj a velmi náročné testování ~10 let) Obsah pozměněné DNA v GMO rostlinách velmi nízký (celková DNA 0,005-0,02% sušiny) Produkty genů proteiny:degradovány v trávicím traktu Přenos genů z krmiv a potravin na mikroorganismy neprokázán, nepravděpodobný (daleko nebezpečnější je krmení a léčba antibiotiky) Nelze odlišit produkty zvířat krmených GMO a běžnými krmivy GMO jako krmiva a potraviny - bezpečné Produkty zvířat krmených GMO - bezpečné 13

14 Výzkum GMO rostlin na Univerzitě Palackého - Snížení obsahu hormonů regulujících růst - Kratší stonek, bohatší kořenový systém - Studium možné aplikace na obiloviny Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta Univerzita Palackého v Olomouci Ivo FRÉBORT Biotechnologie rostlin, kultivace rostlinných buněk II. část 14

15 Transgenoze rostlin Vnášení cizorodých genů či jiné genetické informace do rostlin a manipulace s nimi TRANSGENOZE trvalá - změna genetické informace je přenášená na potomstvo (infekce Agrobakteriem) TRANSGENOZE dočasnáč - genetická informace je změněna pouze u vegetativní části rostliny a nepřenáší se na potomstvo (elektroporace, biolistické metody) Agrobacterium tumefaciens Patogenní bakterie přirozeně se vyskytující v kořenovém systému bobovitých rostlin Přítomnost baktérie se projevuje j tumory tzv. crown gall tissue Agrobacterium je schopné napadat jakékoliv pletivo většiny dvouděložných rostlin a za určitých podmínek i rostlin jednoděložných 15

16 Ti plasmid (tumor inducing) Agrobacterium tumefaciens (200 kb) ipt,aux,nop syntéza cytokininů auxinů opinů další geny pro biosyntézu cytokininů, permeasy, přenašeče přes membránu, enzymy metabolizující opiny a ostatní enzymy umožňující infekci Infekce Agrobakteriem Rostlina při zranění produkuje fenolické látky (acetosyringon), ty se váží na specifické receptory na membráně Agrobacteria VirA a způsobují transkripci genu z vir regionu Ti plasmidu Agrobacteria 16

17 Aktivace vir regulonu VirD2 protein se váže na 5 T-DNA (transferred) Denaturace ss T-DNA z Ti plasmidu VirE2 proteiny stabilizují ss T-DNA VirD2 a VirE2 proteiny obsahují sekvenci potřebnou pro cílení do jádra rostlinné buňky VirE2 se váže na proteiny VIP1 a VIP2 které zacílí T-DNA řetězec do chromatinu rostlinného chromozomu Binární vektory pro genetickou modifikaci rostlin (odvozené od Ti plasmidu) Ti plasmid je rozdělen na dva: pomocný plasmid (velký): nese větší část Ti plasmidu, všechny geny potřebné pro symbiózu s hostitelem a přenos T-DNA klonovací plasmid (malý): nese klonovací plasmid (malý): nese pouze T-DNA, do jejíž části se naklonuje požadovaná gen. informace, replikační počátky pro E. coli a Agrobacterium a potřebné selekční markery 17

18 Klonovací plasmid pbin-hyg-tx polylinker Resistence k hygromycinu B (selekce transgenních rostlin) tetracyklinový supresor T-DNA replikační počátky ori požadovaný gen se překlonuje do polylinkeru a konstrukt se namnoží v E. coli. Pro přenos je nutná jen 25 bp repetice z konce původní T-DNA. (kanamycinová selekce) transformace do Agrobacteria nesoucí pomocný vektor (selekce Kan, Rimf, Gent) transformace rostliny a selekce transgenního potomstva (hygromycin) resistence ke kanamycinu Pomocný plazmid má resistenci k rimfapicinu a gentamycinu Začlenění T-DNA do chromosomu Začlenění T-DNA do hostitelské-ho chromozomu je víceméně náhodné Arabidopsis thaliana Nejčastěji se začlení jedna T-DNA do jedné buňky, muže však nastat i několikanásobné začlenění Kolem centromer je začlenění méně pravděpodobné Čím blíže telomerám tím větší Čím blíže telomerám tím větší pravděpodobnost 18

19 Transgenoze Agrobakteriem Standardní postupy pro řadu dvouděložných užitkových rostlin (rajče, hořčice, fazole). Nevýhoda: zdlouhavá regenerace přes tkáňové kultury Jen u některých rostlin se dá použít germ-line transformace (Arabidopsis) Transformace T-DNA se dá využít i jako inserční mutageneze. T-DNA přeruší důležitý gen a tuto mutaci lze pak pomocí markerů na T-DNA snadno lokalizovat. Existují databanky semen takových mutantních rostlin Arabidopsis. Od poloviny 90. let možná transformace i jednoděložných rostlin - lilie, palmy, obilniny. Použití supervirulentních kmenů Agrobakteria, hlavní problém je v regeneraci. Transgenoze Arabidopsis namáčením květů (floral dipping, germ-line) A) rostliny Arabidopsis se vypěstují do fertilního stádia (3-5 v květináči) B) lodyhy s květy se namočí v kultuře Agrobacteria nesoucí binární systém vektorů s naklonovaným transgenem (5-10 min, přidává se smáčedlo). C) rostliny se nechají okapat a vrátí do skleníku, kde dozrají (vytvoří semena) D) transgení semena se vyselektují vyklíčením na živném médiu obsahující selekční marker (hygromycin) 19

20 Transgenoze namáčením květů Agrobacterium se dostává do vyvíjejících se květů a T-DNA je včleněna do samičího gametofytu a přenesená přes vajíčko do další generace, ne do samčích pohlavních buněk, transgenní semena jsou proto vždy hetero-zygotní na vložený transgen). vylepšení : vakuová infiltrace přidávání smáčedla (Silwet L-77) účinnost: až 6% transgenního potomstva Tato metoda funguje i u vojtěšky a petúnie Transgenoze pomocí listových disků: metoda používaná u většiny dvouděložných rostlin 20

21 Regenerace transgenních tabákových rostlin z kalusů vzniklých na listových discích Tabák Arabidopsis 21

22 Transgenoze topolu Transgenoze jednoděložných rostlin např. ječmen (Tingay et al.,1997) Izolace nevyvinutých embryí z obilniny Mechanické narušení odstranění embryonální osy Kokultivace s Agrobacteriem Kultivace na kalusotvorném médiu Detekce reportérového genu v T0 i T1 generaci Efektivita do 4% (např. z 1282 embryí vyselektováno 54 transformovaných linií) Poprvé chřest (1988) Problém: jednoděložné rostliny obsahují daleko méně fenolických látek Vylepšení: Ošetření acetosyringonem (aktivace vir regionu) Supervirulentní kmeny Agrobacteria: mají zmnožený gen pro virg, který je navíc pod konstitutivním promotorem 22

23 Selekce homozygotní linie T0 generace T1 generace T2 generace Všichni i transformanti ti jsou heterozygotní T-DNA inzerce na jednom lokusu ¼ 00 homozygotů ½ M0+0M heterozygotů ¼ MM homozygotů selekce semen na 3:1 75% nutričním mediu T-DNA inzerce na dvou lokusech obsahující selekční 1/14 oo 00 homozygotů antibiotikum 3/14 oo Mx homo-heterozygotů 3/14 mx 00 homo-heterozygotů 9/14 mx MX hetero-homozygotů 9:3:3:1 93% 100% 75% Nutná Selekce semen na nutričním mediu obsahující selekční antibiotikum T-DNA inzerce na třech lokusech 1/64 oo homozygotů 27/64 homo-heterozygotů 36/64 MM hetero-homozygotů 27:9:9:3:9:3:3:1 98% HOMOZYGOTNÍ LINE Přímá transgenoze TRANSGENOZE PROTOPLASTŮ Odstranění buněčné stěny a inkubace protoplastů s roztokem DNA, DNA vniká do protoplastu endocytózou polyetylenglycol elektoporace makroinjekce Protoplasty se dají připravit ze všech rostlin lze z nich však jen velmi obtížně regenerovat celé rostliny BIOLISTICKÉ METODY TRANSGENOZE Používají se zlaté nebo wolframové kuličky (2 μm) Smíchají se s roztokem plasmidové DNA s transgeny, odpaří se Nastřelují se do pletiva pod vakuem Transgen společně s reportérovým genem (GUS) Snadná detekce transformace 23

24 10% DNA pronikne do pletiva 50% zůstane v epidermis (netvoří kalus) 95% cytoplasma (nedochází k transkripci) 5% jádro 99% umírá 1% přežívá a dochází k integraci do genomu Genové dělo Genové dělo Pokud se nepodaří z buněk zregenerovat kalus, transgenoze je pouze dočasná 24

25 Reportérové transgeny Geny jejichž expresi lze snadno detekovat a kvantitativně stanovovat; slouží hlavně ke stanovování účinnosti různých rostlinných promoterů MODRÉ ROSTLINY REPORTÉROVÝ GEN pro β-glucuronidasu z E.coli po transformaci se rostlina namočí do barviva X-Gluc vzniká nerozpustné indigo, které jde detekovat v intaktní rostlině. Stabilní enzym bez kofaktoru. FLUORESKUJÍCÍ ROSTLINY Malý gen pro GFP (green fluorescent protein) z medúzy Aequorea victoria Po ozáření modrým světlem ( nm) zeleně fluoreskuje bez jakéhokoliv substrátu a je velice stabilní. Fluorescenci si zachovává i po fúzi s jiným proteinem (chimérické geny) Selekční markery 1. ANTIBIOTIKA (vážou se na ribosom, způsobují nesmyslný přepis mrna) KANAMYCIN gen nptii pro neomycinfosfotransferasu. Rostliny se buď stříkají, nebo se dává přímo do média. HYGROMYCIN B gen aphiv pro hygromycinfosfotransferasu y silně toxický i pro člověka inhibitor proteosyntézy. 2. HERBICIDY nejpoužívanější GLYFOSÁT (fosfomethylglycin) inhibitor syntézy aromatických AK (je esenciální u autotrofních organismů) sp. 5-enolpyruvylšikimát-3- fosfátsynthasa (EPSP) tři strategie: 1) overexprese EPSP 2) exprese mutantní ne tak citlivé formy EPSP 3) exprese glyfosátoxidoreduktasy (degradace glyfosátu) Transgenní potomstvo se stříká glyfosátem, přežívají pouze rostliny nesoucí současně s transgenem jeden ze tří způsobů rezistence. 25

26 Selekční markery 3. ZDROJ SACHARIDŮ V ranných stádiích vývoje rostlin v in vitro podmínkách je plná závislost na zdroji uhlíku v médiu (sacharosa). Selekční marker: v médiu je místo sacharosy xylosa a manosa. Hexokinasou vzniká manosa- 6-fosfát, který není schopen podléhat následné glykolýze a je pro rostlinu toxický, kumuluje fosfor. Selekční transgen: fosfomanosaizomerasa přeměňuje manosa-6-fosfát na fruktosa-6-fosfát (použito u tabáku, cukrovky a kukuřice) 4. SELEKCE ROSTLINNÝMI HORMONY Transgen isopentenyltransferasa produkuje nadbytek cytokininů (nemusí se přidávat do selekčního média) které podporují tvorbu prýtů z transformovaného pletiva. U tabáku a salátu bylo zjištěno že tento nadbytek nemá vliv na celkovou morfologii transgenní rostliny. Odstranění selekčních markerů Někdy je třeba transgenní marker odstranit aby nenarušoval vývoj rostliny y(p (ipt, nptii); často nutno odstranit pro komerční využití Bakteriofágový systém Cre-lox: gen cre - rekombinasa (transposasa) lox - krátké cílové sekvence excise 26

27 Odstranění selekčních markerů SYSTÉM MAT (multi-autotransformation): rekombinační systém z kvasinky Zygosaccharomyces rouxii R/RS: R- rekombinasa, RS rekombinační sekvence Gen R je pod inducibilním promotorem (např. tetracyklin), t mezi RS místa vložen ipt selekční gen. Po transformaci (exprimuje se ipt gen vyrůstají tzv. teratomy (rychle rostoucí výhonky ale zakrslé - ESP fenotyp (enormous shooty phenotype) - (a); po indukci tetracyklinem, dojde k vyštěpení ipt a z teratomového pletiva začnou vyrůstat normální výhonky (b). tabák topol Promotery Konstitutivní 35S - nejpoužívanější, virální původ, nebezpečí KOSUPRESE ubikvitin rostlinný původ, exprese kolísá během ontogeneze aktin rostlinný původ, vysoká ale kolísavá exprese Tkáňově specifické 2A11 - z rajčete, plodově specifický Lhcb3 - listově specifický, světlem regulovaný z Arabidopsis PsMTA - z hrachu, kořenově specifický Inducibilní In2-2 2 je indukovaný benzen- sulfonamidovým herbicidem Safener tet - indukce tetracyklinem, nejpoužívanější promoter APázy - indukovaný v kořeni, fosfátem CaMV35S:GUS PsMTA:GUS 27

28 Terminační signál V klonovací kazetě je kromě promotorové sekvence i terminátor transkripce s polyadenylačním signálem Nejčastěji používaný terminátor z agrobakteriálního genu pro nopalin synthasu používá se jak u jedno tak dvouděložných rostlin Další používané terminátory: 3 nekódující sekvence rostlinného genu pro pšeničný histon H3 Může se použít i vlastní 3 nekódující sekvence transgenu, ale ta nemusí vždy fungovat, je jednodušší mít univerzální již v plasmidu Další důležité složky transgenů INTRONY Inkorporace intronů do transgenu může zvyšovat sílu exprese transgenu v rostlině např. intron I z genu pro rýžový aktin nebo intron I z genu pro kukuřičný k ubikvitin iti 5 NEKÓDUJÍCÍ REGION Kozákova sekvence a podobné sekvence zvyšují posttranskripční stabilitu mrna a tím zvyšují míru exprese NUKLEOTIDOVÉ SLOŽENÍ Pokud vkládáme do rostliny gen z baktérie, hrozí nebezpečí použití odlišného genetického kódu, vyštěpení neexistujícího intronu atd. Geny ze vzdálených taxonů se proto musí často upravovat (mutovat), aby bylo dosaženo dostatečné exprese v rostlinném hostiteli 28

29 Organelové cílení transgenního proteinu Transgen je začleněn do genomu v jádře, transkripce probíhá v jádře, zralá mrna je pak transportovaná do cytosolu kde probíhá proteosyntéza na ribosomech, buď volných nebo vázaných na ER Cílení do plastidu: genetická informace pro 23-AK signální peptid malé podjednotky Rubisco se naklonuje před vlastní N-konec transgenu Cílení í do mikrotělísek: k ke konci transgenu se připojí posledních 34 AK z isocitrátlyasy Zůstává na ER: motiv H/KDEL se zabuduje na C-konec proteinu transgenu Přímá transformace chloroplastů: začlenění transgenu do chloroplastové DNA VÝHODY: transgen se nepřenáší pylem k začleňování transgenu dochází pouze na specifických místech vysoká exprese, až několik procent celkových proteinů výhodné pro expresi bakteriálních genů v rostlinách (stejný gen. kód) NEVÝHODY: nutné velice silné genetické dělo hnané héliem velice malá účinnost Specifické vektory: obsahují část genetické informace chloroplastu pro homologní rekombinaci Selekční marker antibiotikum spektinomycin 29

30 Genové umlčování read-through transcription DNA-DNA pairing methylation chromatin remodelling RNA-DNA pairing RNA degradation RNA-RNA pairing methyltransferases chromatin remodelling factors dsrna Oddělení molekulární biologie, Katedra biochemie Biologické centrum PřF UP ul. Šlechtitelů 11 30