NOVÉ TRENDY V REGENERATIVNÍ MEDICÍNĚ. doc. RNDr. Evžen Amler, CSc.

Transkript

1 NOVÉ TRENDY V REGENERATIVNÍ MEDICÍNĚ doc. RNDr. Evžen Amler, CSc.

2 TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ

3 TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ Aplikace zákonitostí a metod inženýrství a přírodních věd na vývoj biologických náhrad sloužících k obnově, zachování nebo zlepšení funkcí tkání. Vývoj a využití arteficiálních v laboratoři připravených molekul, buněk, tkání a orgánů k obnově nebo náhradě defektní nebo poraněnéčásti těla. Interdisciplinarita buněčná biologie molekulární biologie inženýrství biomateriálů počítačové modelování mikroskopická analýza robotové technologie výroba bioreaktorů medicína Obory biologie chemie fyzika technologie inženýrství vývoj materiálů počítačové technologie medicína

4 TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ Důvody vzniku a rozvoje umělé náhrady omezená životnost, nebezpečí infekce a tromboembolismus transplantace tkání a orgánů nedostatek donorů, imunosuprese tkáňové inženýrství a selektivní transplantace buněk náhrada tkáně živou tkání, která je konstruována tak, aby vyhovovala potřebám pacienta

5 TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ

6 TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ Odběr Izolace a následná kultivace buněk Nosiče (scaffoldy), osazení a následná kultivace (3D) Implantace Detekce analýza vlastností

7 TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ ODBĚR Izolace a následná kultivace buněk Nosiče (scaffoldy), osazení a následná kultivace (3D) Implantace Detekce analýza vlastností

8 Odběr tkání, buněk chirurgický zákrok lékař trend minimálně invazivní metody

9 TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ Odběr IZOLACE A NÁSLEDNÁ KULTIVACE BUNĚK Nosiče (scaffoldy), osazení a následná kultivace (3D) Implantace Detekce analýza vlastností

10 autologní alogenní heterologní (xenogenní) Buňky diferencované (tkáňově specifické) kmenové Zdroj primární tkáň buněčné linie Požadavky neimunogenní vysoká proliferace dobrá manipulace schopnost diferenciace na různé specializované typy (v některých případech kmenové buňky) Stimulace růstu, diferenciace růstovými faktory

11 TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ Odběr Izolace a následná kultivace buněk NOSIČE (SCAFFOLDY), OSAZENÍ A NÁSLEDNÁ KULTIVACE (3D) Implantace Detekce analýza vlastností

12 Nosiče (scaffoldy)

13 Nosiče (scaffoldy) Vlastnosti Biokompatibilita Bioresorbovatelnost Dostatečný přísun živin pro buňky Adekvátní vlastnosti NUTNOST VÝVOJE NOVÝCH NOSIČŮ

14 Nosiče (scaffoldy) vlákenné, pěnové, hydrogely, kapsle napodobení přirozeného prostředí - templáty extracelulárního prostředí Materiály přírodní syntetické polosyntetické

15 Nosiče (scaffoldy) Syntetické materiály lepší kontrola vlastností (pevnost, biodegradovatelnost, porosita, mikrostruktura) možnost inkorporace růstových faktorů přesná velikost a tvar možnost ovlivnění bioresorbovatelnost biokompatibilita neimunogennní podpora buněčného růstu indukce angiogenese

16 Nosiče (scaffoldy) první pokusy dvojrozměrné a nebiodegradovatelné materiály současný trend: trojrozměrné nosiče (3D) umožňují růst a diferenciaci buněk velká hustota buněk, rovnoměrné rozložení buněk biodegradabilní postupné odbourání a nahrazení novou funkční tkání nutnost kontroly růstu buněk různé modifikace nosičů adhezivní a neadhezivní povrchy, ligandy, liposomy...

17 Příprava nanovláken elektrostatické zvlákňování Technical University of Liberec, Czech Republic

18 TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ Odběr Izolace a následná kultivace buněk Nosiče (scaffoldy), osazení a následná kultivace (3D) IMPLANTACE Detekce analýza vlastností

19 Implantace chirurgický zákrok vhodné období optimálně připravený implantát

20 TKÁŇOVÉ INŽENÝRSTVÍ Odběr tkáně Izolace a následná kultivace buněk Osazení nosičů (scaffoldů) a následná kultivace (3D) Implantace DETEKCE ANALÝZA VLASTNOSTÍ

21 Analýza vlastností v průběhu přípravy výsledné vlastnosti Detekce Některé možnosti hodnocení makroskopicky mikroskopicky histologicky viabilita buněk molekulárně biologické a biochemické biomechanické a další biofyzikální vlastnosti diagnostické a zobrazovací metody (NMR )

22 BIOREAKTORY zařízení, ve kterém probíhá biologický a/nebo biochemický proces při definovaných a kontrolovaných podmínkách (ph, teplota, tlak, přísun živin, odstraňování odpadu) KONSTRUKCE pomocí počítačových simulací matematické modely bioreaktorů

23 Bioreaktory Spinner-flask bioreactors baňka (láhev) s mícháním Rotating-wall vessels bioreactors - RWV nádoby s rotující stěnou dynamický laminární proud Hollow-fiber bioreactors bioreaktor s dutými vlákny proudění skrz nebo okolo vláken Direct perfusion bioreactors přímé promývání proudění scaffoldem s buňkami Bioreactors that apply controlled mechanical forces aplikace kontrolovaných mechanických sil

24 Bioreaktory a) odběr tkáně - lékař b) materiál c) izolace buněk d) kultivace buněk e) osázení scaffoldu f) příprava transplantátu g) monitorování a analýza procesu přípravy transplantátu h) klinická data pacienta i) určení a kontrola předem definovaných parametrů přípravy transplantátu j) implantace - lékař Bioreaktor budoucnosti

25 UMĚLÉ CHRUPAVKY NA BÁZI AUTOLOGNÍCH CHONDROCYTŮ

26 KLOUBNÍ CHRUPAVKA

27 Kloubní chrupavka stavba a složení Buňky chondrocyty (syntetizují vlákna a matrix) Mezibuněčná hmota kolagenní vlákna + amorfní matrix kolagen, kyselina hyaluronová, proteoglykany, glykoproteiny kolagen chondrocyt proteoglykan

28 Mezibuněčná hmota Kolagen Proteoglykan

29 Kloubní chrupavka Kloubní chrupavka hyalinní chrupavka Specializovaný typ pojivové tkáně s pevnou, pružnou matrix Pokrývá kloubní plochy, brání abrazi třecích ploch Vyrovnává otřesy a nárazy Tloušťka 0,5 6 mm S věkem klesá pružnost, snižuje se výška Porézní (chování podobné houbě); submikroskopické otvory (cca 6 nm) Zatížení pružná deformace vtlačována a vytlačována synoviální tekutina Zátěž chování určováno stupněm nasycenosti synoviální tekutinou zatížení z amorfní mezibuněčné hmoty chrupavek vytlačována synoviální tekutina do kloubní štěrbiny, roste hustota mezibuněčné hmoty odlehčení synoviální tekutina zpět do chrupavky (nasávána osmotickými silami proteoglykanů)

30 Chrupavky Bezcévnaté tkáně Vyživované difuzí z kapilár přilehlého kolagenního vaziva (perichondria) a synoviální tekutiny kloubní dutiny Velmi nízká mitotická aktivita chondrocytů Bez lymfatických cév a nervů Hojení pomalé, závislé na věku pacienta Větší defekty nereparabilní Novotvořená chrupavka je fibrózního typu biomechanicky méně kvalitní než hyalinní Nezatížená kloubní chrupavka vystavena trvalému tlaku 6 8 kg/cm 2 Bez zátěže (např. imobilizace kloubu) porušena látková výměna hlubších vrstev chrupavky degenerace chondrocytů Pro regeneraci optimální střídavé zatěžování

31 Kloubní chrupavka vrstvy zóny I POVRCHOVÁ oploštělé chondrocyty mezi kolagenními vlákny rovnoběžnými s kloubním povrchem II STŘEDNÍ vlákna systém oblouků vzdorujících tlaku (arkády), minimum mezib. hmoty a chondrocytů III HLUBOKÁ větší, kulovité buňky, orientovány do sloupců; produkují mezibuněčnou hmotu IV KALCIFIKOVANÁ velké chondrocyty a vazivová vlákna ve zvápenatělé mezibuněčné hmotě, přecházejí do kosti SUBCHONDRÁLNÍ KOST

32 OSTEOARTRÓZA osteo kost; arthritis poškození, otok + zánět klouby zátěž vysoký tlak poškození (ztenčení) chrupavky zbytnění (zvětšení) kosti ZDRAVÝ KLOUB OSTEOARTRÓZA Příčiny věk (okolo 50 let, neobvyklá do 40 let) pohlaví (častější u žen) obezita úrazy a operace kloubů (v mladším věku) dědičnost (zejména ruce, méně kolena a kyčle)

33 Osteoartróza

34 Osteoartróza

35 Osteoartróza

36 Osteoartróza

37 Osteoartróza

38 Osteoartróza terapie poškozené chrupavky Umělé náhrady kloubů (protézy) starší pacienti umělé náhrady kloubů (protézy) mladší pacienti omezená životnost protéz Nutnost vývoje a optimalizace alternativních léčebných metod Mozaiková plastika Autologní chondrocyty nedostatečná mechanická stabilita Autologní chondrocyty + nosiče autologní chondrocyty v biodegradovatelné trojrozměrné matrici

39 Mozaiková plastika

40 Autologní chondrocyty

41 buňky + biodegradovatelný trojrozměrný nosič Nosiče (scaffoldy)

42 Nosiče (scaffoldy) autologní chondrocyty a biodegradovatelný trojrozměrný nosič

43 VÝVOJ A TESTOVÁNÍ NOSIČŮ

44 Postup při vývoji nosiče

45

46 MTT test Zjišťování proliferace, diferenciace a metabolické aktivity buněk Výsledná barva roztoku odpovídá počtu metabolizujících buněk. Absorbance 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Buňky Scaffold 1.den 3.den 7.den

47 Mikroskopické hodnocení izolace chondrocytů působení kolagenázy

48 Mikroskopické hodnocení proliferace chondrocytů Chondrogenní fenotyp po 4 dnech Fibroblast-like fenotyp po 7 dnech

49 Mikroskopické hodnocení kompozitní nosič osazený chondrocyty Chondrocyt

50 Buněčná viabilita konfokální mikroskopie nefixované nosiče živé buňky zeleně BCECF 2,7 -bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein mrtvé buňky červeně PI propidium jodide

51 Chondrocyty na nosiči Fluorescenční mikroskopie, barveno propidium jodidem

52 Nosič a nosič s chondrocyty SEM nosič, želatina síťovaná pěna Konfokální mikroskopie nosič s buňkami, želatina, 15. den, propidium jodid

53 Konfokální mikroskopie Imunofluorescenční barvení proti kolagenu typu II (monoklonální protilátka proti kolagenu II: Ab anti-kolii, sekundární protilátka značená Cy3)

54 Histologie Barvení hematoxylin-eosinem (A) Detekce GAG: kyselé (C); neutrální (E)

55 Imunohistochemie Detekce kolagenu II

56 HISTOLOGIE A IMUNOHISTOLOGIE Nově vytvořená chrupavka důkaz GAG alcianová modř + PAS (ph 2,5) Původní chrupavka Zv. 40x Nově vytvořená chrupavka kolagen II Zv. 80x

57 Biomechanické testy Schéma a fotografie přístroje pro testování biomechanických vlastností. Zátěžový diagram nativní chrupavky a buněčných nosičů.

58 Implantace

59 Implantace

60 Implantace Poškození Implantát

61 Makroskopické hodnocení po 6 týdnech králíci

62 NANOTECHNOLOGIE A ŘÍZENÉ DODÁVÁNÍ LÉČIV Nosiče léků micely liposomy dendrimery tekuté krystaly nanočástice nanoporézní materiály molekulárně vtištěné polymery MICELY NANOČÁSTICE NANOČÁSTICE DENDRIMERY LIPOSOMY

63 LIPOSOMY pro řízené uvolňování léčiv

64 ŘÍZENÉ UVOLŇOVÁNÍ LÉČIV Dodávání léčiv (anglicky drug delivery) - doručení bioaktivní látky (léčiva) k cílové oblasti. Nejpoužívanější metody aplikace léčiv: perorální nasální (nosní) pneumoniální (inhalace) rektální riziko degradace, poškození nebo neefektivní inkorporace léčiva injekční forma podání proteinových a peptidových léků liposomy jako nosiče léčiv

65 ŘÍZENÉ UVOLŇOVÁNÍ LÉČIV Základem řízeného uvolňování léčiv (anglicky controlled drug delivery) je skutečnost, že při standardizovaných podmínkách má uvolňování léčiva z léků určitýčasový průběh a podle toho je nutné zajistit v místě účinku potřebný koncentrační spád. Fyzikální veličinou, která řídi rychlost uvolňování léčiva, je tedy proces difúze. Nosič léčiv je látka, která poskytuje časově kontrolované dodání, orgánově specifické cílení, ochranu, přetrvávající in vivo funkce a snížení toxicity léčiva. Vhodné nosiče léčiv: liposomy, albuminové mikročástice, rozpustné syntetické polymery, DNA komplexy, konjugáty protein-léčivo, nosiče erytrocytů a další biodegradabilní látky.

66 Espero Publishing, s.r.o. Struktura membrán

67 Struktury

68 LIPOSOMY V 60. letech minulého století publikoval Bangham sérii prací, ve kterých ukázal, že částice vznikající bobtnáním vysušeného filmu fosfolipidů ve vodě představují mono- a multilamelární struktury tvořené dvojvrstvami lipidů, které uzavírají ve svých vnitřních kompartmentech vodnou fázi. Liposomy, jak byly tyto útvary pojmenovány, se brzy staly oblíbeným modelem biologických membrán. Drawing of vesicle by Dr. André Pampel Universität Leipzig Fakultät für Physik und Geowissenschaften Avanti Polar Lipids

69 Vlastnosti membrána není propusná pro ionty a velké dipóly (proteiny a sacharidy) enkapsulované látky jsou chráněny před okolním prostředím amfifilní charakter nosiče hydrofilních i hydrofobních látek biokompatibilní nosičeřady substancí (léky, proteiny, peptidy, DNA, oligonukleotidy ) pro účely farmaceutické, kosmetické i biochemické cílená a řízená příprava různě vlastnosti - velikost (nanometry až mikrometry), složení membrány, množství enkapsulované látky, vlastnosti povrchu

70

71 Imunoliposomy

72 Imunoliposomy Modifikace povrchu liposomů specifické ligandy řízené-cílené (targeted) liposomy hydrofilní polymery s vysoce flexibilním hlavním řetězcem dlouhodobě cirkulující long-circulating liposomy značky monitorování osudu liposomů v buňce nebo organismu, příprava kontrastních liposomů pro zobrazovací metody deriváty lipidů s kladným nábojem, polymery s kladným nábojem vazba DNA a transfekce buněk protilátka nebo antigen imunodetekční systém

73 Klasifikace liposomů Podle velikosti malé unilamelární váčky (anglicky small unilamelar vesicles) velké unilamelární váčky (anglicky large unilamelar vesicles) velké multilamelární váčky (anglicky large multilamelar vesicles) Podle cirkulace in vivo klasické liposomy stericky stabilizované liposomy Podle lamelarity unilamelární multilamelární Podle aplikace diagnostické terapeutické Podle povrchového náboje s kladným nábojem (kationtové) / liposomální DNA vektory se záporným nábojem (aniontové) neutrální Podle specializace řízené-cílené (targeted) liposomy imunoliposomy transfeozomy liposomální DNA vektory LPDI, LPDII Banerjee et al. 2001

74 Liposomy jako nosiče léčiv

75 Liposomy jako nosiče léčiv Liposomy - nosiče léčiv ve farmaceutické a kosmetické oblasti: zásobníky sřízeným uvolňováním nosičové systémy k cílené orgánové distribuci (anglicky targeting) pomocná látka ke zlepšení absorpce léčiva do určených buněk Složení z přirozených a netoxických stavebních prvků vhodnější oproti jiným systémům, např. nanočásticím. Aplikace: nejčastěji parenterální a topická (nízká odolnost vůči žaludečnímu ph, enzymům v gastrointestiálním traktu a solím žlučových kyselin v tenkém střevě - nevhodné perorální podávání)

76 Degradace liposomů přesný mechanismus po kontaktu s buňkou není znám fůze s membránou endocytózy, fagocytózy uvolnění obsahu samovolným unikáním (propustnost), dfúzí, póry v membráně uvolňování lze ovlivnit např. teplotou, tlakem, ph, vlastnostmi povrchu (řízená a cílená interakce s receptory) pomocí ultrazvuku a rázových vln

77 Otevírání liposomů pomocí ultrazvuku AFM of liposomes before and after ultrasound application (Míčková et al. 2008) Shock-wave method (Šunka et al. 2006) Sonikace vhodná technika pro otevírání liposomů krátkodobá (minutová) ultrazvuková sonikace (intenzita I = 2 W/cm 2 při frekvenci f = 1 MHz) Technika rázových vln rázové vlny je možné dobře fokusovat a mají i podstatně menší vedlejší negativní účinky na organismus rázové vlny jsou velice perspektivním nástrojem pro řízené uvolňování léčiv ve tkáňovém inženýrství

78 NOSIČE OBSAHACENÉ O LIPOSOMY Výhody spojení s liposomy spojení materiálu s liposomy umožňuje další aplikace řízené otevírání liposomů cílenéřízení cílené uvolňování látek v těle pacienta

79 Nanovlákna obohacená o liposomy