Už od počátků molekulární biologie a centrálního dogmatu bylo jasné, že produktem některých genů jerna a ne protein. Týkalo se to ribosomálních genů,

Transkript

1

2

3 Už od počátků molekulární biologie a centrálního dogmatu bylo jasné, že produktem některých genů jerna a ne protein. Týkalo se to ribosomálních genů, genů pro trna, splicesomálnía snorna, které se účastnily syntézy proteinů a dalších buněčných funkcí. Záhy po osekvenováníprvních genomů a jejich transkriptomůse zjistilo, že velkou část polya+ RNA nelze přiřadit kžádnému protein kódujícímu genu (u myši a člověka cca 50%). RNA polymeráza je přítomna vpodstatě na všech místech vgenomu, a i oblasti, které byly považovány za transkripčně neaktivní (pouště) jsou transkribovány (pervasivní transkripce). Spektrum těchto nekódujících RNAs(non-codingRNA) je veliké, liší se velikostí (long > 200 bp, a short bp) a stabilitou. Jedním zpřekvapení, která vyplynula z analýz genomů a transkriptomů, byl fakt, že nekódující RNA (non-protein-codingrna, ncrna) je vdrtivé většině exprimována vývojově specificky. Savčí transkriptomyse skládají zobrovsky variabilního spektra RNA, zahrnujícího překrývající se transkriptyzintronů i mezigenovýchoblastí, sensei antisense, srůznými pozicemi startu a konce, splicingema expresním patternemlišícím se mezi buňkami, typicky exprimovanými vmalém množství. Tyto transkriptybyly často považovány za pozadí při sekvenování, zřejmě díky nízké hladině transkriptu, což může být dané i omezeným množstvím buněk, kde ktranskripci konkrétního úseku dochází. Nové sensitivní technika sekvenovánícdnaodhalily, že domnělé genové pouště jsou transkribované a produkují velké množství sestřihovaných produktů. Technikami, které nejsou založeny na izolaci RNA pomocí oligo(dt), se ukázalo, že téměř ½ RNA vlidských buňkách nemá polyakonec, takže byla pominuta ztechnických důvodů. Tato RNA je zřejmě syntetizována RNA polymerázou III a strukturou se značně liší od polya+ RNA, syntetizované RNA polymerázou II.

4

5 Velké množství RNAs bylo nalezeno na hranicích různých částí genů: promoter associated srnas(pasrs), promoterassociatedlrnas(palrs), terminator-associatedrnas(tasrs), transcription-initiation RNAs(tiRNAs), transcription start site-associated RNAs(tssa- RNAs), promoter upstream transcripts(prompts). Není jisté jakou mají tyto RNAs asociované spromotorem funkci. Možné je, že mohou udržovat chromatin ve stavu přístupném transkripci a RNA polymerázu aktivní, což by obojí urychlilo transkripci genu vpřípadě potřeby. -tirnaje nová skupina malých RNAs, odvozených zmíst iniciace transkripce (downstreamod těchto míst), které jsou jen u zvířat. Jejich možnou funkcí je možná označit/regulovat pozici prvního nukleosomu. - splice site RNAs(spliRNA) jsou malé RNAs lokalizovaných na místech sestřihu (splice sites), opět byly nalezeny jen u zvířat. splirnai tirnajsou exprimovány velmi slabě, čili snadno uniknou sekvenování. Takových typů lokusspecifických RNAsmůže být mnoho, je potřeba je objevit. Byly nalezeny u člověka, myši, drozofily, háďátka a houbovce, ale ne u rostlin.

6 První mirna(lin-4) byla objevena u C. elegans, má funkci vnačasování vývoje (developmentaltiming) a nekóduje protein, jen RNA (60 bp prekurzor a 22 bpmirna). Princip regulace pomocí lin-4 je následující: lin-4 mirna se páruje s 3 UTR mrnalin-14, což způsobuje silencing. Toto bylo původně považováno za ojedinělý jev, ale pak byly objeveny další případy.

7 Princip RNAi Malé regulační RNAsjsou nekódující RNAs, které umlčují geny nebo ničí cílovou RNA na základě komplementarity sekvencí. Jsou 3 hlavní skupiny: sirna(shortinterferingrna), mirna(microrna) a pirna(piwi interacting RNA). sirnasnižuje množství cílové RNA prostřednictvím jejího štěpení. Jsou odvozeny zdlouhých dsrnas, které vznikají při replikaci viru, šíření mobilního elementu nebo experimentální RNAi. Tato RNA je naštěpenarnázouiii jménem Dicer(RNázyIII štěpí dsrna), která funguje jako pravítko a odměřuje délku výsledných produktů, takže vznikají fragmenty dlouhé bp. Jeden řetězec (guidestrand) ze vznikéhofragmentu je následně vložen do komplexu RISC (RNA-inducedsilencingcomplex) na protein Argonaute. Toto vložení se odehrává na RISC loadingcomplex, který se skládá zargonaute, Dicerua dsrnabindingprotein. Druhý řetězec sirna(passangerstrand) je naštěpenargonautem a ostraněn. Argonaut poté využije guidestrandkvazbě cílové RNA, která musí být perfektně komplementární a naštěpí ji. RNA je poté uvolněna. Kromě této funkce existuje ještě endogenní sirna, která je kódována genomem. Přestože exogenní sirnajsou známé relativně dlouho, endogenní sirnas(endosirnas) byly objeveny relativně nedávno u savců a octomilky (mimo zvířata i u rostlin a kvasinek).tato endo-sirnase účastní obrany proti virům, umlčení transposonů, chromatin remodelingua post-transkripční regulace genů. mirna jsou malé RNA kódované vlastním genomem. U rostlin je princip umlčení mrna stejný jako u sirna, ale u zvířat je RNA jsou dva způsoby jak s RNA naložit. mirnaje

8 transkribována zmirnagenů ve formě primárního transkriptu(pri-mirna) se strukturami stem-loop dlouhými cca bp. Vlásenkové struktury jsou v jádře naštěpené komplexem Drosha-DGCR8, čímž vzniká pre-mirna(droshaje RNázaIII). Vcytoplazmě je tato struktura dále štěpena Dicerem, takže vzniká mirna-mirna* duplex (mirna= guide, mirna* = passanger). Guide strand je naložen na Argonauta a hledá komplementání RNA. Podle stupně komplementarity je buď cílová mrnanaštěpena(téměř perfektní komplementarita), nebo je potlačena translace mrna(částečná kompementarita). pirnajsou krátké bprna, které umlčují transposonyvživočišných zárodečných buňkách. pirnajsou jednořetězcové, takže nepotřebují Dicer. pirnaindukují štěpení transkriptu mobilního elementu (ME), což je provedeno proteiny ze skupiny PIWI(= p- element inducedwimpytestis) patřící dorodiny Argonaute (PIWI, Aubergine, Argonaute 3). PIWInebo AUBštěpí sensetranskript, vzniká sensepirna, ta asociuje sago3, ten štěpí antisensetranskripttransposonu, vznikne antisensepirna, asociuje spiwia AUB, což vede kštěpení sensetranskriptutransposonu. 7

9 pirnasjsou malé RNA, které jsou exprimovány vzárodečné linii mnoha živočichů. Jsou asociované spiwiproteiny, které patří do rodiny AGO proteinů, specificky exprimovaných vzárodečné linii. Stávají se součásti pirisckomplexu, který brání expanzi MEs, což je nezbytné pro správný vývoj gonád a tato funkce je u mnohobuněčných živočichů konzervovaná. Proteiny z PIWI rodiny D. melanogaster(piwi, Aubergine (AUB)) jsou potřeba pro samčí i samičí fertilitu, AGO3 pro samičí fertilitu a částečně pro samčí. U myši knock-outgenů PIWIrodiny (MILI, MIWI2) vede kaktivaci LINEsa LTR retrotransposonůvsamčí zárodečné linii, zastavení gametogeneze a kompletní sterilitě samce. Na samici nemá vliv. Sterilita je zřejmě způsobena aktivitou MEs, která vede kdvouřetězcovýmzlomům, které mají za následek zastavení vkontrolním bodě buněčného cyklu, což vede k ukončení dělení buněk. Navíc byl pozorován pokles metylace CpG, která je potřeba pro umlčení MEs, čili myši bez těchto genů nejsou schopny ustavit metylaci MEsde novo během spermatogeneze, což je zřejmě další role pirisc(navést metylační mašinérii k MEs). pirnasekvence jsou velice početné (stovky tisíc až miliony), ale zabírají relativně malé oblasti genomu (několik kbp až více než 200 kbp), vyskytují se v klastrech.

10 pirna může ovlivňovat expresi i protein kódujících genů. Příkladem je pirna lokus Su(ste) u drozofily, který je lokalizovaný na Y chromosomu, kde se zřejmě vyvinul zkopie genu Stellate, lokalizovaného na X. Su(ste) reguluje expresi Stellate genů(repetitivní protein kódující geny), které jsouexprimovány vtestesa při overesxpresise zjejich produktů tvoří krystaly, které poškozují buňky a brání spermatogenezi. Dalším genem regulovaným pirnaje fasciclin3(kódující immunoglobulin-likecell adhesionmolecule) exprimovaný vovariích drozofily. OverexpreseFas3brání promíchání somatických a zárodečných buněk vováriícha vede kselhání oogeneze. Knock-outPIWIproteinů vede koverexpresifas3, což napovídá, že pirnaslouží kjeho regulaci.

11 Hybridní dysgeneze je jev, při kterém je potomstvo křížení určitých linií neplodné, zatímco potomstvo reciprokého křížení je v pořádku. Slavným případem je křížení drozofilíchlinií P (nesoucí transposonzvaný P-element) a M (P-element nemají). Při křížení samice P se samcem M je potomstvo plodné, při reciprokém křížení (samice M a samec P) je všechno potomstvo neplodné (dystrofie gonád, aktivace P elementů, chromosomální přestavby, vyšší mutageneze). Dlouho se předpokládalo, že na umlčení P-elementu je zodpovědný nějaký maternálnífaktor, který samice umísťují do vajíček. Dnes víme, že tímto faktorem je pirna, která iniciuje vlastní amplifikaci a tím vede kochraně před MEsod samce.

12

13 Distribuce mirna v genomu není náhodná: 1) mirna geny jsou často organizovány v klastrech (např. u člověka cca 40% mirna genů). Důvodem je zřejmě to, že takto organizované geny lze koexprimovatjako jednu pri-mirna, i když ne vždy to tak je. 2) Více než polovina savčích mirnaje vintronech genů, které regulují, a mnoho znich je s tímto genem koexprimováno. 3) Mnoho mirnaje lokalizovánove fragilních místech a oblastech, které jsou spojené srakovinou, což naznačuje, že se účastní procesů spojených sbuněčným růstem, proliferací a diferenciací. -Expresní patternmirnaje různý některé jsou exprimovány vurčitou dobu během vývoje, zatímco jiné jsou exprimovány kontinuálně. Množství produktů mirnagenů je až 500xvíc než mrna. -Protože se jedná o jednoduché a malé geny, vznikají častěji než klasické protein kódující geny a představují tak pružnější mechanismus regulace genomu. Je zajímavé, že přestože mirnanajdeme u živočichů i u rostlin, není známa žádná mirna, která by se vyskytovala u obou těchto skupin.

14 Pro interakci mirnas mrnaje klíčová oblast umístěná v pozicích 2-7 od 5' konce mirna, tzv. seed. Na základě komplementarity mezi seedoblastí a cílovou oblastí v (obvykle) 3' UTRmRNAdochází k interakci těchto RNA, což vede k represi translace zúčastněné mrna. Pokud je seednebo cílová oblast zasažena mutací, může to vést k nerozpoznání mrnaa tím k selhání regulace genu. Nejčastějším cílem mirnaje 3 UTR, ale jsou známy i cíle v 5 UTRa kódující oblasti, ty jsou ale mnohem méně významné. Jedna mrnamůže mít více cílových oblastí pro několik mirnas, jejich umlčovací účinek je pak silnější.

15 U živočichů snižuje mirnaexpresi cílových mrnadvěma způsoby v závislosti na stupni komplementarity mezi seeda cílovou oblastí. Perfektní nebo téměř perfektní komplementarita vede k rozštěpení a degradaci mrna, zatímco částečná komplementarita vede k inhibici translace. Na rozdíl od rotlin, kde je mrnatakto degradována, u živočichů převládainhibice translace.

16 Nepřítomnost mirnau jednobuněčných organismů a další data indikují, že mirnasjsou klíčové pro diferenciaci buněk i tkání a pro udržení buněk v diferencovaném stavu. -Nediferencované nebo málo diferencované buňky nepotřebují mirnakpřežití (myší ESCbez mirnapřežijí, ale nediferencují se, zárodečné buňky zebřičky nepotřebují mirna k přežití a udržení linie. -Většina mirnanení exprimována během raného vývoje zebřičky, kdy jsou buňky nediferencované, ale vykazují vysokou tkáňově specifickou expresi později, kdy se určují buněčné typy. -Mnoho nádorových buněk redukuje expresi mirnave srovnání spůvodní diferencovanou buňkou Př. let-7 mirnaje downregulovanáu různých rakovin plic a zpokusů na tkáňových kulturách víme, že je schopná potlačovat růst nádorových buněk. let-7 může sloužit i pro predikci vývoje rakoviny, protože pacienti snejnižší expresí let-7 mají i nejmenší šanci na přežití. -Transfekce HeLabuněk mir-1 (svalově specifická) a mir-124 (mozkově specifická) změní expresní profil buněk na svalové/mozkové.

17 let-7 byla jednou zprvních objevených mirna, je u metazoí vysoce konzervovaná a funguje jako hlavní regulátor vývoje a diferenciace vrannémembryu i vkomplexních tkáních dospělce, jako je mozek (u Danio, Ceanorhabditis, myši a drozofily. Cílem let-7 jsou významné regulátory buněčného cyklu, jako Ras a Cdk6. Každý krok biogeneze let-7 je pečlivě regulovaný. Diferenciační faktory jako je Notch, indukují transkripci, pluripotenčnífaktory jako c-myc, transkripci reprimují. Pluripotenčnífaktor LIN28se váže na smyčku (loop) pri-let-7, což inhibuje Droshu. Naopak let-7 inhibuje LIN28, c-myc a c-mycaktivatinggene IMP-1 vazbou na jejich 3 UTR.

18

19 Genová duplikace mirnas, které jsou homologické a mají téměř identické seedsekvence, jsou řazeny do rodin. Vlidském genomu je vrodinách o 2 a více členech 1/3 mirnas, u myši 38%, u C. elegans10%, drozofily 13%. Tyto mirnarodiny jsou paralognísekvence, které vznikly duplikací původní mirnagenu. Pokud se jednalo o lokální duplikaci, jsou geny řazeny těsně za sebou v tandemu a často jsou součástí stejného transkruptu. Pokud to nebyla lokální duplikace, jsou geny klokalizoványna vydálenýchčástech genomu, třeba i na jiných chromosomech. Většina ne-lokálních duplikací u obratlovců je důsledkem duplikace celého genomu, které se vevoluci obratlovců odehrály. Duplikace genu následovaná subfunkcionalizacínebo neofunkcionalizacíjsou největším zdrojem nových mirna.

20 Introny Mnoho mirnasse vyskytuje vintronech protein-kódujících genů (1/2 lidských, 20% u C. elegansvintronech ve stejné orientaci jako hostitelský gen). Introny jsou výhodným místem pro vznik nových mirnas, protože není potřeba nový promotor (jsou koexprimoványs genem, i když některé mirnasvintronech mají vlastní promotor). Bylo pozorováno, že nové mirnasspecifické pro určitou skupinu jsou častěji lokalizované v intronech (intronic exaptation).

21 AntisensetranskriptymiRNAsmají pochopitelně schopnost skládat se do vlásenek, takže, pokud jsou transkribovány, mohou získat vlastní novou funkci. Produkce antisense mirnasbyla skutečně pozorována a je zdrojem nových mirnagenů.

22 Pseudogeny, snornas a trnas vliteratuře informace o mirnasztěchto zdrojů x problematické, protože snornasa trnasse taky mohou účastnit mirnamašinérie, takže je obtížné rozlišit co je skutečná mirnaa o by-productnormální biosyntézy snornaa trna. TEs U člověka identifikováno 278 mirnas, které jsou určitě/možná ztes. Je jich více mezi mladšími, méně konzervovanými mirnasa mirnasspecifickými pro určitou skupinu živočichů (linagespecific). Problematická je jejich lokalizace vgenomu kvůli repetitivnímu okolí a taky možná některé piwirnas chybně považovány za mirnas.

23 Vlidském genomu byly předpovězeny stovky tisíc mirnas+ velká část genomu se transkribuje (pervasivetranscription, všudypřítomná transkripce). Čili vgenomu je mnoho substrátu pro vznik nových mirnas. Vlásenka, kterou by zpracovala Droshaa Dicermusí mít přesnou sekundární strukturu, což je splněno jen u malé části sekvencí, a u těch se prokázalo, že jsou skutečné mirnas. Stovky sekvencí vgenomu tvoří suboptimálnívlásenky ty jsou na půl cesty. Čili pro vznik nové mirnaje potřeba více kroků. Nové mirnasmají náhodné cíle (seedje krátká sekvence), což může být fatální. Model vzniku mirnasje tento: nová mirnaje nejprve transkribována slabě a jen vurčitých tkáních, aby se omezil negativní efekt náhodné interakce scílovými geny. Postupně jsou škodlivé transkriptyodstraněny selekcí a je zesílena transkripce a doba působení nové mirna. Tento model je podpořen faktem, že konzervované sekvence jsou obecně transkribovány silněji než méně konzervované mirnas. Ztoho také vyplývá, že mirnas, které jsou transkribovány slabě, jsou teprve ve fázi testování a nemají žádnou regulační roli.

24

25 mirnapassangerstrandsbyly považovány za biologicky inertní, ale vbuňkách se mohou vyskytovat vrelevantním množství (i když méně, než guidestrands), být asociované sargonaoutema regulovat expresi genů. Představují tedy materiál pro diverzifikaci funkce mirna. U duplikovaných mirnagenů může dojít kposunu transkripce ve prospěch druhého ramene a tím kzisku nové funkce. Armswitchingje častý jev, pozorovaná u mnoha rodin mirnadrozofily a háďátka, u 11% ortologůu hmyzu, a je považován za jeden ze základních mechanismů diverzifikace mirna. Mechanismus, jak ktomu dochází, není jasný.

26 Zatímco výměna ramen nemění sekvenci genu, jen frekvenci přepisování jednotlivých ramen, posun vlásenky mění gen výměnou jednoho ramene za jinou sekvenci. To se děje především výměnou mezi členy mirnarodiny, které jsou lokalizovány blízko sebe. Tento jev byl identifikován u 8 z15 mirnarodin nematoda je to obecný mechanismus evoluce mirna.

27 Zdá ze, že RNA je prostředníkem interakcí mezi prostředím a epigenomem. RNA je předmětem editinguzávislém na kontextu. Editingspočívá vdeaminaci bází a je prováděn dvěmitřídami enzymů: ADAR (adenosin deaminázami) -změna A ani, který se chová jako G, a APOBEC(ApoBeditingcomplex) měnící C anu u RNA i DNA, je specifický pro obratlovce. U živočichů existují 3 ortologyadar: ADAR1a ADAR2, které jsou u bezobratlých i obratlovců, jejich knockoutu myši je letální, a ADAR3, specifický pro mozky obratlovců. O regulaci editinguse moc neví, ale je prokázáno, že je napojen na signální dráhy a tím na signály vnějšího prostředí. A>I editingbyl poprvé pozorován a generationago vdůležitých receptorech neuronů, jako receptorech glutamatu, GABA a serotoninu, kde mění sekvenci aminokyselin za účelem lepšího vyladění elektrofyziologických vlastností synapsí. Původně to bylo považováno za okrajovou věc, ale vroce 2004 bylo publikováno několik prací, které prokázaly, že se A>I editingtýká tisíců transkriptů. Většina editovaných míst je vnekódujících oblastech, což znamená, že editingovlivňuje regulační dráhy založené na RNA, čili potenciálně epigenetické procesy, které jsou základem fungování mozku a učení. Tyto studie navíc ukázaly, že u člověka došlo kmasivnímu nárůstu RNA editinguvporovnání smyší, navíc víc než 90% editace je v Alu. Alu jsou sekvence odvozené z funkční RNA sekvence (7SL RNA signal recognition particle), jsou specifické pro primáty a invadovalyjejich genomy vněkolika vlnách. Dnes tvoří 10,5% lidského genomu. Spolu snimi se vevoluci primátů zvyšovala i frekvence RNA editingua recentní (po rozdělení šimpanze a člověka) de novo inserce Alu jsou soustředěny hlavně do genů spojených sfunkcí neuronů a neurologických onemocnění. Alu byly půpodněpovažovány za odpadní (junk) DNA, ale tato nová zjištění přinášejí mnohem zajímavější interpretaci. Alu byly použity jako substrát pro RNA editinga umožnily zvýšení transkriptomickéa epigenomicképlasticity nutné kinterakci mezi prostředím a epigenomem. APOBECbyla poprvé objevena kvůli modifikaci mrnaapolipoproteinub, kde změnou C na U dělá předčasný stop kodon, a tím zkrácený protein ve střevech, zatímovjátrech je jeho nezkrácená verze. Z5 známých rodin APOBECjsou 2 specifické pro savce: 1) AID, která generuje hypermutacevimunoglobulinech AIS a je potřebná

28 k reprogramování buněk k pluripotenci. 2) APOBEC2 je potřebná k diferenciaci svalů. Zajímavé je, že mezi nervovým systémem a AIS je řada paralel. Např. přítomnost imunoglobulinových domén vmnoha povrchových receptorech neuronů, což indikuje, že se AIS savců vyvinul znervového systému a používají stejné mechanismy k vyladění svých receptorů. Zajímavá je rodina APOBEC3, která vznikla po oddělení vačnatců a placentálůa velmi expandovala vlinii primátů. Jednou její možnou funkcí je obrana proti mobilním elementům, což ovšem nevysvětluje její expanzi právě u primátů. Alternativní možností je, že se účastní domestikace transposonůvneuronech (APOBEC3G), což je podpořeno pozorováním, že de novo transpozice L1se odehrávají vkmenových buňkách neuronů a tím přispívají kindividuálnímu somatickému mozaicismuvmozku a komplexitě neuronové sítě. 26

29

30 Vlivem mutací vznikají v genech neustále nová cílová místa pro mirna. Pokud je jejich existence nevýhodná, jsou odstraněny selekcí. Pokud ale vznikají opakovaně příliš často, bude selekčně výhodné pozměnit cílové místo např. tím, že dojde k zkrácení 3 UTR, čímž ubude prostor pro vznik nových cílových míst. Skutečně bylo pozorováno, že housekeepergeny (např. ribosomalprotein-codinggenes) mají kratší 3 UTR, zatímco geny, jejichž exprese je časově a tkáňově specifická (např. transkripční faktory) mají 3 UTRmnohem delší s mnohem větším množstvím predikovaných mirnacílových míst.

31 Polymorfismus cílové oblasti může ovlivnit regulaci genu vytvořením nebo likvidací cílového místa pro mirna. U člověka byla nalezena řada SNPsv potenciálních cílových oblastech mirna, které by mohly roly při vzniku chorob, a přibývá důkazů o roli SNPsve vzniku rakoviny. Příkladem dopadu vzniku nového místa pro mirnaje změna v regulaci genu pro myostatin. Protein myostatinfunguje jako růstový diferenciační faktor inhibující vznik svalů a porucha v jeho regulaci, nulové mutace v kódující sekvenci genu nebo jeho receptoru vedou k nadměrnému růstu svaloviny. Přirozené nulové mutace v kódující sekvenci byly pozorovány u skotu, chrtů a člověka, u kterých způsobují nárůst svaloviny (a síly) až na dvojnásobek. U ovčího plemene Texelsheepse silně vyvinutou svalovinou došlo ke změně regulace genu pro myostatinvznikem nového cílového místa v3 UTRpro mir-1 a mir-126, což má podobné účinky na nárůst svaloviny jako vyřazení myostatinového genu.

32 Cichlidy představují druhově nejbohatší čeleď obratlovců. Více než 3000 druhů se nachází voblasti Střední a Jižní Ameriky, Africe, Madagaskaru a jižní Indii. Jsou výborným modelem studia speciace, opakovaně předvedly rychlou radiaci a sympatrickou speciaci. Nejzkoumanější jsou cichlidy zvelkých jezer ve východní Africe, kde se nachází 2000 druhů. Stovky druhů se vyvinuly zjedné linie během 1 milionu let. Jejich genomy jsou velice podobné -diverzita nukleotidů je 0,26%, (což je srovnatelné s diverzitou mezi člověkem a šimpanzem, zatímco mezi liniemi laboratorních zebřiček je diverzita 0,48%), ale diverzita morfologie a chování (zbarvení, potravní chování a rozmnožování, organizace mozku) je na úrovni obratlovčího řádu. Ukazuje se, že řada rozdílů mezi genomy linií malawských cichlid je lokalizována v cílových oblastech mirnagenů (86% cílových míst vykazuje variabilitu), čili za diverzitu cichlid by mohly stát regulace genů pomocí mirna. Konkrétní příklady změn v regulacích genů prostřednictvím mirna: 1) mir-181a mir23aregulují hoxa10, který je u ryb exprimovaný vpárových ploutvích a přilehlých svalech u myší (exprese ve svalech nohou) je při vytrvalostním tréninku mir-181 je upregulovaný a mir23a downregulovaný. Dravé cichlidy mají vcílovém místě mutaci, která je odlišuje od ostatních cichlid. 2) Změny ve smyslových orgánech -rozdíly vcílových místech pro mir-34 -váže se na gen crb1, který se podílí na morfogenezi a sensitivitě fotoreceptorů vevoluci cichlid zrak velmi důležitý pro ekologii a výběr partnera. -mir-200arozdíly ve vazbě na triobp(trio and F-actinbindingprotein), jehož mutace způsobuje ztrátu sluchu u východoafrických cichlid hraje sluch roli ve výběru partnera. 3) Imunita 4) Vývoj kostí a zubů

33 Evoluce mirna u živočichů Z osekvenovaných genomů máme informace o mirna různých skupin, z nichž vyplývá že: 1) mirnajako regulátory genů se objevily už na začátku evoluce živočichů. Např. mir-100 je u všech eumetazoí. 2) početná sada mirna(34) u prvo+ druhoústýchje zřejmě svědkem četných inovací na bázi bilaterií(další expanze mirna byla na bázi obratlovců a na linii placentálů 3) mirnagen, který se objeví u společného předka, je jen málokdy ztracen u dceřiných linií. Např. u druhoústýchbylo identifikováno pouze 12 ztrát mirnas, u skupiny Drosophilaobscuraztráta 9 mirnas. To v kombinaci se snadností, sjakou se generují nové mirnasvede kneustálému nárustumirnaběhem evoluce. Studium genomů zástupců druhoústých ukázala, že každá linie má cca 1/3 vlastních mirnas. Existuje přímá korelace mezi počtem mirnaa morfologickou komplexitou! To napovídá, že mirnabyla klíčová pro vznik komplexních organismů.

34 Na základě znalosti mirnasspolečných všem druhoústýma prvoústýmživočichům lze zrekonstruovat mirnasjejich společného předka. Na obrázku jsou seřazené do skupin podle místa exprese u nereidky.

35

36 Pro vznik nových mirnaobecně platí, že relativně snadno vznikají, ale vzácně se ztrácejí, což znich dělá výborný markerfylogeneze, který může pomoci vyřešit nejasnosti ve fylogenetických vztazích některých skupin. Příkladem je vztah mezi skupinami Cnidaria (žahavci), Porifera(houbovci) a Bilateria. Podle ESTsvypadají jejich vztahy takto: ((Porifera+ Cnidaria) + Bilateria), zatímco podle morfologie a molekulární biologie takto ((Cnidaria+ Bilateria) + Porifera). Podle mirnapatří Cnidariaa Bilateriak sobě, protože sdílejí mir-100, který chybí u houbovců, dále Cnidarianemají houbovčímirnasa houbovci žahavčí.

37 Žebernatky jsou skupinou mnohobuněčných živočichů, jejíž fylogenetická pozice stále není jasná. Jednou z možností je umístění na bázi mnohobuněčných živočichů. Argumentem, který by pro toto možnost mohl svědčit, je absence mirnaa genů pro Droshua Pashu(protein důležitý pro fungování Droshy, u obratlovců zvaný DGCR8), protože buď mirnaa/nebo geny důležité pro její zpracování jsou přítomny u všech ostatních skupin mnohobuněčných živočichů, zatímco Choanoflagellata, sesterská skupina mnohobuněčných živočichů, je nemá. mirnaa její zpracování by tak vznikla až po odštěpení žebernatek od zbytku mnohobuněčných živočichů. Alternativním vysvětlením je druhotná ztráta mirnau žebernatek a genů pro její zpracování. Salpingoeca rosetta + Monosiga brevicollis(choanoflagellata) Capsaspora owczarzaki(filasterea) Sphaeroforma arctica(ichthyosporea)

38 mirnapatrně hrála roli i vevoluci lidského mozku. Vpráci Somelet al je popsán experiment, při kterém byla zkoumána RNA v přední části čelního laloku a mozečku člověka, šimpanze a makaka rhezusevrůzných postnatálních obdobích (materiál pro izolaci RNA byl odebraný znáhle zemřelých lidí a zvířat). Zjistilo se, že většina rozdílů mezi druhy je vexpresi konstitutivních genů (tj. těch, jejichž exprese není závislá na fázi vývoje), cca 80%, což není až tak zajímavé, protože rychlost jejich evoluce je u člověka i šimpanze srovnatelná. Mnohem zajímavější ale je, že vývojově specifické geny se vyvíjejí u člověka 3-5xrychleji než u šimpanze a děje se tak přes změny vregulačních faktorech, hlavně v mirnas. Evoluce je 2xrychlejší u předního laloku než u mozečku, tedy vmístě, které je zodpovědné za sociální inteligenci, plánování, abstraktní myšlení a operační paměť (workingmemory) (vs. mozeček -motorika, paměť a řeč). Byly nalezeny tři mirnas, které se podílejí na regulaci genů vneuronech, ztoho dvě vca 2+ signálních drahách, které se účastní plasticity neuronů, čili mirnamůže být zodpovědná za rozvoj kognitivních schopností člověka, jako je paměť a učení.

39 Protože mirnareguluje množství genů a účastní se proliferace a diferenciace buněk, je jasné, že změny v její expresi mohou způsobit rakovinu. Přibývají informace o změnách exprese mirnau konkrétních rakovin, což z nich zároveň dělá zajímavý potenciální markera cíl protinádorové terapie. mirnamůže způsobit vznik rakoviny dvěma způsoby: 1) ztrátou funkce u tumor supresorových mirnasvede voverexpresionkogenů, 2) ziskem funkce, kdy posiluje funkci onkogenů. SNPsmohou mít vliv na obojí a to přímo či nepřímo. Přímý efekt zahrnuje mutace, které ovlivňují processing mirna, a nepřímý efekt, kdy SNPs vregulační oblasti mirnaovlivní expresi mirna, nebo vcílové oblasti regulovaného genu, kde buď zanikne cílové místo, nebo vznikne nové. SNPsasociované sfungováním mirnatedy mohou posloužit jako biomarkery tendence rozvoje některých rakovin, předpovědět účinky léčby nebo učinit prognózu postupu nemoci. Podle mirbase(2013) bylo dosud identifikováno prekurzorovýcha zralých (matured) mirnav193 eukaryotních druzích a virech, ztoho u člověka bylo izolováno 1600 prekurzorovýcha 2042 zralých mirna. 50% všech mirnagenů bylo nalezeno vnestabilních oblastech genomu, které jsou často vrakovinných tkáních deletované, amplifikované nebo chybně exprimované.

40 Cca 1/3 mirnagenů člověka je organizována vklastrech (390 genů v113 klastrech), které jsou ko-exprimovány, takže chyba vregulaci jednoho člena ovlivňuje i ostatní geny vklastru. Změny vexpresi mirnamezi normální a rakovinnou tkání jsou často způsobeny tím, že jsou příslušné geny lokalizovány voblastech schromosomální nestabilitou (amplifikace, delece, translokace, blízká oblast častých zlomů). Některé mirnajsou přímo regulovány tumor supresory nebo onkogeny a účastní se jejich signálních drah. Např. TP53 reguluje mir-34a, RAS reguluje mir-21 a MYC reguluje mir klastr. Změny vregulaci mirnasjsou spojeny i sepigenetickými změnami, konkrétně metylace a tím změna regulace mirnagenů. Př: mir-127 při rakovině močového měchýře a mir-9-1 při rakovině prsu. Chromosomální přestavby mohou způsobit rakovinu i tím, že se onkogen dostane pod vliv promotoru mirna genu. Příkladem je mir-142, marker hematopoetických buněk, který se nachází na 17. chromosomu blízko zlomové bodu, který je často příčinou translokace t(8;17). Ta způsobuje agresivní leukemii B buněk kvůli upregulaci genu MYC, který se traslokací dostane pod vliv promotory mir-142.

41 Nejpřímočařejší změnou vedoucí ke změně transkripce mirna genu je mutace v promotorové oblasti, na kterou si sedá transkripční faktor.

42 SNPs v mirna prekurzorech mirna biogeneze zahrnuje štěpení RNázami III Drosha a Dicer. Pro toto štěpení je klíčové správné poskládání mirna do vlásenky, takže mutace ovlivňující párování a tím složení (folding) vlásenky, mohou inhibovat následné zpracování pri-a/nebo pre-mirna. Konkrétní případ tohoto jevu byl pozorován u dvou pacientů schronickou lymfatickou leukémií (CLL). CLL je často způsobena homozygotní delecí voblasti 13q13.4. Tato oblast kóduje polycystronický transkript, ze kterého vznikají mir-15a a mir-16-1, mirnas, které jsou dynamicky exprimované během buněčného cyklu a regulují geny stimulující posun vbuněčném cyklu a apoptózu, čili tyto mirna fungují jako tumor supresory. Bodová mutace vgenu mir-16-1 patrně způsobila chybu ve zpracování mir-16-1 a tím i vznik leukémie.

43

44 Jednou z příčin rakoviny mohou být mutace v genech účastnících se biogeneze mirna včetně RNA editinga terminální modifikace, které změní cíl mirna, zpracování a stabilitu, ale zatím se o tom moc neví. Inhibice biogeneze mirnavede kvážným defektům vývoje a je u mnoha organizmů letální. Porovnáním rakovinných tkání a jejich zdravých protějšků se zjistilo, že mirnasje vtumoru méně než ve zdravé tkáni. To ukazuje, že mirnasfungují spíše jako tumor supresory než jako onkogeny. 27% různých tumorů je hemyzygotníchpro deleci Dicerua globální knockdownmirnasvyřazením Diceruzvyšuje onkogenetický potenciál již transformovaných buněk a rychlost rozvoje tumoru. U myší bylo prokázáno, že k rozvoji tumoru přispělo i snížení množství Diceru vbuňce.

45 Změna ve fungování mirnamůže být založena i na změně cílové sekvence. Ktomu může dojít buď bodovou mutací, translokací nebo zkrácením 3 UTR. Translokace může oddělit mirnavazebná místa od regulovaných onkogenů. Bodové mutace vytvoří/zruší stávající rozpoznávací místa, zkrácením 3 UTRmohou zaniknout rozpoznávací místa mirna. Komplementarita sekvencí je klíčová pro vyhledání cílového místa na genu regulovaným mirna. Takže mutace vytvářející nové nebo ničící stávající vazebné místo významně ovlivňuje regulaci příslušného genu. Let-7 je tumor supresorová mirna, která reguluje onkogeny KRAS, MYCa HMGA2. Exprese let-7je u řady typů rakovin snížena a u rakoviny plic je navíc spojena se špatnou prognózou. Bodová mutace ve vazebném místě let-7v 3 UTRgenu KRAS vede koverexpresikras, což znamená vyšší riziko melanomu a některých rakovin plic, vaječníků a prsu.

46 44

47