DMPK (ZNF9) V DIFERENCOVANÝCH. Z, Kroupová I, Falk M* M

Transkript

1 FISH ANALÝZA m-rna DMPK (ZNF9) V DIFERENCOVANÝCH TKÁNÍCH PACIENT IENTŮ S MYOTONICKOU DYSTROFI FIÍ Lukáš Z, Kroupová I, Falk M* M Ústav patologie FN Brno *Biofyzikáln lní ústav AVČR R Brno

2 Definice MD Myotonická dystrofie (MD): autosomálně dominantní neuromuskulární onemocnění s incidencí asi 1/8000. Nejčastější forma svalové dystrofie postihující dospělou populaci. Klasická myotonická dystrofie (DM1): Příčina - nestabilní trinukleotidová repetitivní sekvence (CTG)n v genu kódujícím protein kinázu DMPK ( dystrophia myotonica protein kinase) na chromosomu 19q13.3.

3 Definice MD Myotonická dystrofie DM2: mutace expanze repetice (CCTG)n - na 3q21 v intronu zinc finger proteinu 9 (ZNF9). Expanze jsou delší než u DM1, avšak ak u DM2 není korelace mezi závaz važností onemocnění a délkou d repetic

4 Transkripce, translace DMPK Norma: Nucleus: : DMPK DNA =>DMPK mrna => ER: : DMPK protein (exprese dosud prokázána jen v některých n tkáních) DM1: Nucleus: : DMPK DNA (CTG)n =>DMPK mrna (CUG)n = => stop ER: ---

5 Patogeneze DM Snížen ené množstv ství DMPK proteinu v důsledku d abnormáln lního transportu DMPK mrna do cytoplasmy (ER). Omezení exprese proteinu sousedícího genu (SIX5) Toxické účinky expanze CUG na úrovni RNA v intranukleárn rních fokusech: RNA-vazebn vazebné proteiny se specificky vážou v na expandované CUG repetice a ovlivňuj ují jejich regulaci, což způsob sobí aberantní sestřih některých genů

6

7 Exprese DMPK a přítomnost p inkluzí v lidských tkáních dosavadní údaje V normálních lidských buňkách a tkáních byla exprese DMPK proteinu zjištěna jen v hladkém a kosterním svalu a v myokardu. Nebyla prokázána v nervové tkáni DMPK mrna v normálních buňkách se nachází ve většině doposud studovaných tkání, i v těch, které nebývají postiženy při DM Inkluze obsahující retinovanou mrna u DM1 byly dosud popsány jen ve svalové tkáni, neuronech, fibroblastech a myoblastech. Rovněž byly popsány v extraembryonálních strukturách lidského zárodku v buňkách trofoblastu. Jsou přítomny i ve tkáních nepostižených myotonickou dystrofií?

8 Předmět t tohoto sdělen lení: (1) histopatologické vyšet etření a (2) FISH analýza RNA některých n tkání dospělých pacientů postižených MD. Vyšet etřeny eny byly tkáně přítomné v diagnostických svalových excizích ch

9 Vyšet etřené tkáně Kosterní sval Svalovina cévnc vní medie Endotel Schwannovy buňky Fibroblasty Lymfocytárn rní infiltrát

10 Kosterní sval DNA: expanze CTG potvrzena v jádrech j lymfocytů periferní krve pacienta mrna: retinovný transkript v jádře j mrna v normě: : pozitivní reakce v sarkoplasmě (byla prokázána) Protein: : prokázan zaná pozitivní exprese v sarkoplasmě (byla prokázána)

11 DM1, kosterní sval (celkový výřez + detail jádra)

12 Hladký sval cévnc vní medie DNA: expanze CTG potvzena v jádrech j lymfocytů periferní krve pacienta mrna pacienta: retinovný transkript v jádře e v.t. mrna v normě: : pozitivní reakce v sarkoplasmě (byla prokázána) Protein: pozitivní reakce (byla prokázána)

13 DM1, hladký sval medie

14 Endotel DNA: expanze u pacienta potvrzená DMPK mrna norma: : exprese není známa mrna(cug)n u pacienta: retinovný transkript v jádře j e v.t. Protein: : exprese není známa

15 DM1, Endotel

16 Schwannova buňka DNA: expanze u pacienta potvrzená DMPK mrna norma: : exprese není známa mrna(cug)n u pacienta: retinovný transkript v jádře j e v.t. Protein: : exprese není známa

17 DM1, Schwannova buňka

18 Fibroblast DNA: expanze u pacienta potvrzená DMPK mrna norma: : exprese není známa mrna(cug)n u pacienta: retinovný transkript v jádře j e byl prokázán (nedemonstrováno) no) Protein: : exprese není známa

19 Lymfocyt DNA: expanze u pacienta potvrzená DMPK mrna norma: : exprese není známa mrna(cug)n u pacienta: zcela ojedinělý retinovný transkript v jádře j e v.t. Protein: : exprese není známa

20 DM2, Lymfocyt

21 Exprese mrna (CUG)n retinované v jádrech lidských tkání u DM souhrn popsaných nálezn lezů: Kosterní sval (fet( fetální i diferencovaný) Hladký sval cévnc vní medie Hladký sval fetáln lního GIT Endotel cévní Epitel stěny GIT (fet( fetální) Schwannovy buňky Fibroblasty Lymfocyty??

22 ZÁVĚRY: DM1 Pacient č.: South. blot [Počet repetic] kost. sval endotelie media Schwann. b. FBL průměr SD SE průměr SD SE průměr SD SE průměr SD SE průměr SD SE průměr SD SE Frekvence pozitivních jader Kost. sval Endothel Media Schwann Fbl DM2 Pacient č.: kost. sval endotelie média Schwann. b. lymf. infiltrát 1 průměr SD SE průměr SD SE průměr SD SE průměr SD SE Kost. sval Endothel Media Schwann Fbl Lymfo 55% 75% 35% 70% 1% 70% 70% 42% 62% 62% 50% 66% postižené tkáně u MD (kosterní + hladký sval) vyšší frekvence pozitivních jader než u nepostižených tkání, taktéž vyšší počet retinovaných ohnisek mrna(cug)n 2. avšak výskyt retinovaných ohnisek i v tkáních, které nejsou výrazně postiženy a neexprimují DMPK protein

23 Program další šího studia patogeneze MD: Sledovat a porovnat expresi genu DMPK na úrovni transkripce a translace a zejm. detekce fokusů mrna (CUG)n v dosud nezkoumaných tkáních účastných v patogeneze DM a ve tkáních nepostižených ených tímto onemocněním Sledovat přítomnostp a lokalizaci (CUG)n - vazebných proteinů u obou skupin tkání