Klinická biochemie vybrané anorganické analyty

Transkript

1 14 APLIKACE ANALYTICKÝCH METOD Luděk Dohnal 14.6 Klinická biochemie a toxikologie V medicině existuje řada laboratorních oborů, které provádějí laboratorní vyšetření biologického materiálu tělních tekutin, sekretů, tkání apod. Je to např. hematologie, biochemie, mikrobiologie, virologie, toxikologie a další. Chemické analysy se nejvíc uplatňují v klinické biochemii (chemii). Přitom z pohledu počtu analys, palety používaných analytických metod, způsobu organizace a stupně automatizace je klinická biochemie patrně největším producentem analytických dat na světě. Jen v České republice se provádí řádově 100 milionů analys za rok. Používá řada technik jako absorpční spektrofotometrie, fluorimetrie, nefelometrie, turbidimetrie, radiochemické a imunochemické techniky, iontově selektivní a enzymové elektrody, atomovová absorpční a plamenová emisní spektrofotometrie, plynová a kapalinová chromatografie, coulom(b)metrie, elektroforesa a další. Stanovují se stovky analytů, z toho rutinně a většinou automatizovaně kolem 80 analytů. Kromě mnoha set organických analytů se stanovuje též nemnoho analytů anorganických. Mezi anorganické analyty byl zařazen též oxid uhličitý (respektive rovnovážný parciální tlak oxidu uhličitého pco 2 ), na který však můžeme nahlížet jako na analyt organický ve smyslu definice, že organická chemie je chemií uhlíkatých sloučenin. Dalším laboratorním oborem, v němž se provádějí převážně chemické analysy, je toxikologie. Toxikologie je multidisciplinární obor. Rozeznáváme toxikologii klinickou, forensní (soudní), přírodních látek, léčiv, průmyslovou, životního prostředí a ekotoxikologii. Zatímco okruh látek, kterými se zabývá klinická biochemie, je úzce vymezen tím, že se jedná až na nepatrné výjimky o látky organismu vlastní, předmětem toxikologie může být téměř kterýkoliv prvek nebo sloučenina. Zda je látka toxická nebo obecněji zdraví škodlivá či nikoliv záleží vždy na velikosti dávky a na okolnostech. Z anorganických analytů přicházejí v úvahu halogeny a jejich sloučeniny. Dále pak sloučeniny těžkých kovů. Sloučeniny zcela nefysiologických kovů jako např. Pb, Hg, Li, As, Tl jsou silně toxické. Setkáváme se s nimi v průmyslu, ve farmacii nebo v kriminalistice. Existuje též skupina kovů či polokovů, které jsou v malých množstvích pro život nezbytné, avšak toxické ve větších množstvích. Příkladem budiž Zn, Se, Cu. Stanovení posledně zmíněných pak přísluší celkem pochopitelně nejen toxikologii, ale též klinické biochemii. Zvláštní postavení má skupina sloučenin, které lze vnímat jako organické (poněvadž obsahují uhlík) i jako anorganické. Z nich nejznámější jsou patrně oxid uhelnatý, kyanovodík a kyanidy Klinická biochemie vybrané anorganické analyty Sodné a draselné ionty Sodík je hlavním kationtem v extracelulární (mimobuněčné) tekutině. Jeho koncentrace kolem 140 mmol/l představuje asi 90% všech anorganických kationtů v krevním séru. Zvýšená

2 koncentrace může být způsobena dehydratací organismu ale též například intoxikací vitaminem D. Snížená koncentrace může souviset např. s retencí vody při srdeční nebo ledvinové nedostatečnosti. Draslík je hlavním intracelulárním (vnitrobuněčným) kationtem. Jeho koncentrace v krevním séru je cca 4,5 mmol/l. Příčinou jejího snížení může být užívání diuretik (léků na odvodňování ), silný průjem aj. Zvýšení může způsobit m.j. ledvinová nedostatečnost. Oba kationty se stanovují nejčastěji společně a to v krevním séru nebo plazmě a v moči. Stanovení emisní plamenovou spektrofotometrií Principem je měření íntenzity ostrých čar emisního spektra atomů Na a K excitovaných plamenem propan vzduch. Vzorek séra se stonásobně zředí typicky vodným roztokem LiCl obvykle s přídavkem tenzidu. Měřeným signálem je poměr intenzity emisní čáry Na a K k intenzitě emisní čáry Li. Tímto způsobem se stabilizuje odezva přístroje. Stanovení iontově selektivními elektrodami Principem je potenciometrické měření elektrodou se skleněnou membránou (Na) a elektrodou s kapalnou membránou s valinomycinem (K). Pokud se do měřící cely vnáší neupravený vzorek, jedná se o tzv. přímé měření. Jestliže se vnáší vzorek silně zředěný diluentem s velkou iontovou silou, mluvíme o měření nepřímém Chloridové ionty Chloridy tvoří dvě třetiny všech aniontů tělních tekutin. Jejich obvyklá koncentrace v krevním séru je kolem 100 mmol/l. Příčinou snížení může být ledvinová nedostatečnost, diabetické koma aj. Zvýšení koncentrace může nastat např. při nadměrném přísunu potravou. Podobně jako sodné a draselné ionty se chloridy stanovují nejčastěji v krevním séru či plazmě a v moči. Stanovení coulom(bm)etrickou titrací Elektrochemicky se konstantní rychlostí generují ionty stříbra, které reagují s chloridy v kyselém prostředí (kys. octová a dusičná) za přítomnosti želatiny nebo polyvinylalkoholu a tvoří se nerozpustný AgCl. Jakmile jsou chloridy ze vzorku vysráženy, začíná růst koncentrace stříbrných iontů a tento bod ekvivalence je indikován potenciometricky stříbrnou elekterodou. Prošlý elektrický náboj spotřebovaný ke generování Ag + je úměrný množství Cl. Stanovení spektrofotometrické s thiokyanatanem Po přidání vzorku s chloridy k roztoku nedisociovaného thiokyanatanu rtuťnatého se tvoří chlorid rtuťnatý. Uvolněné thiokyanatanové ionty reagují s Fe 3+ za vzniku červeně zbarveného thiokyanatanu železitého. Měří se spektrofotometricky v okolí 500 nm Anorganické fosforečnany Fosfor je v tělních tekutinách přítomen ve formě anorganických a organických fosforečnanů. Fysiologická koncentrace anorganických fosfátů v séru je řádově 1 mmol/l. Snížení bývá např. u rhachitidy (křivice), osteomalacie resp. osteoporosy (měknutí resp. řídnutí kostí), zvýšení např. u chronické ledvinové nedostatečnosti. Anorganické fosfáty se stanovují v séru a v moči.

3 Stanovení spektrofotometrické s molybdenanem amonným K supernatantu po deproteinaci séra kys. trichloroctovou se přidá činidlo s molybdenanem amoným v prostředí kys. sírové. Vznikne žlutý komplex, který je možno měřit při 340 nm nebo po redukci jako fosfomolybdenovou modř v oblasti 600 až 700 nm Vápník Vápník společně s fosforem úzce souvisí s metabolismem kostí, zubů, s acidobasickou rovnováhou a hladinami elektrolýtů v tělních tekutinách a následně v tkáních. Přítomnost vápenatých iontů v krvi je nezbytná aby se krev v případě potřeby srážela. Ke snížení koncentrace Ca v séru dochází např. při snížené funkci příštitných tělísek nebo při nedostatku vitaminu D. A naopak, zvýšená koncentrace bývá při hyperfunkci příštítných tělísek a při hypervitaminose D. V séru je vápník přibližně z 50% vázán na bílkoviny a z 50% je volný ve formě vápenatých iontů. Dohromady mluvíme o tzv celkovém vápníku, jehož fysiologická koncentrace v séru je cca 2,5 mmol/l. Ca se stanovuje v séru a v moči. Stanovení celkového Ca atomovou absorpční spektrofotometrií Tato metoda je považována za referenční. Do plamene acetylen vzduch se rozprašuje vzorek séra zředěného v poměru 1:50 roztokem LaCl 3 v HCl. Stanovení celkového Ca spektrofotometricky s o kresolftaleinkomplexonem (CPC) CPC je 3, 3 bis[[bis(karboxymethyl)amino] methyl] 5,5 dimethylfenolftalein. CPC tvoří s vápníkem v alkalickém prostředí ph=12 červeně zbarvený komplex. K potlačení interference Mg se přidává 8 hydroxychinolin. Zbarvení se měří při 580 nm. Stanovení volného Ca iontově selektivní elektrodou Principem je potenciometrické měření pomocí elektrody s membránou selektivní provápník. Membrána bývá z PVC, který je impregnován komplexní solí Ca vhodného neutrálního nosiče Hořčík celkový Mg je kofaktorem řady enzymů intermediárního metabolismu. Tím se účastní např. fosforylace sacharidů nebo tvorby kostní tkáně. Má vliv na neuromuskulární dráždivost. Fysiologická koncentrace Mg v séru je kolem 1 mmol/l. Zvýšen bývá m.j. u ledvinové nedostatečnosti nebo při diabetickém komatu, snížen může být např. u alkoholismu nebo při zvýšeném cholesterolu. Stanovení atomovou absorpční spektrofotometrií Provádí se podobně jako u vápníku po naředění séra roztokem chloridu lanthanitého v HCl užívaného jako tzv. spektrální pufr. Tento roztok slouží k uvolnění Mg z jeho fosforečnanových komplexů a současně ke zředění vzorku a tím snížení jeho viskosity, kterou způsobují bílkoviny. Stanovení spektrofotometrické s Magonem, Xylidyl Blue II

4 Magon, Xylidyl Blue II je 1 (2 hydroxyazo) 2 naftol 3 (2,4 dimethyl) karboxyanilid, který v alkalickém cca 50% ethanolu s boritanovým pufrem s ph = cca 11 reaguje s Mg 2+ za vzniku červeně zbarveného komplexu, jenž se měří kolem 500 nm Amonné ionty Amonné ionty vznikají v intermediárním metabolismu převážně při odbourávání aminokyselin. Poněvadž jsou toxické, musí být průběžně odstraňovány. U člověka se tak děje v játrech za vzniku močoviny, která je vylučována ledvinami do moči. Fysiologická koncentrace amonných iontů v krvi je kolem 40 µmol/l. Zvýšené hodnoty se vyskytují při silnějším poškození jater jakoukoliv noxou. Dále pak při masivním krvácení do zažívacího traktu jako důsledek vzestupu bakteriálního rozkladu bílkovin ve střevě. Enzymové spektrofotometrické stanovení Amonný iont reaguje s 2 oxoglutarátem a redukovanou formou koenzymu nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (NADPH) za katalysy enzymem glutamátdehydrogenásou (GLD) a vzniká L glutamát a oxidovaná forma koenzymu (NADP + ). Měří se pokles absorbance NADPH při 340 nm Hydrogenuhličitany Často jsou označovány názvem (celkové) bikarbonáty nebo celkový oxid uhličitý. Stanovují se v séru nebo plazmě. Hydrogenuhličitany jsou důležitým prvkem systému iontové a acidobasické rovnováhy organismu. Jsou v chemické rovnováze s oxidem uhličitým, který je odnášen z tkání erytrocyty a vydechován plícemi. Jejich fysiologická koncentrace je kolem 22 mmol/l a tvoří asi 15% veškerých aniontů krevního séra. Jejich zvýšení či snížení je nutno interpretovat pouze v souvislostech s mnoha dalšími parametry vnitřního prostředí organismu. Enzymové spektrofotometrické stanovení Ke vzorku se přidá alkalický pufr (převedení všech forem CO 2 na HCO 3 ). Hydrogenuhličitan pak reaguje s fosfoenolpyruvátem za katalysy enzymem fosfoenolpyruvátkarboxylásou (PEPC) a vzniká oxalacetát a anorganický fosfát. Oxalacetát je redukován redukovanou formou koenzymu nikotinamidadenindinukleotidu (NADH) za katalysy enzymem malátdehydrogenásou (MD). Vzniká malát a oxidovaná forma koenzymu NAD +. Měří se pokles absorbance při 340 nm po 2 rovnovážný parciální tlak kyslíku Parametr po 2 se měří v celé nesrážlivé krvi. Je to parciální rovnovážný tlak kyslíku, tedy ukazatel sycení krve kyslíkem. Fysiologická hodnota v žilní a kapilární krvi je kolem 5,5 kpa (cca 40 mm Hg). Amperometrické stanovení O 2 kyslíkovou elektrodou Platinová elektroda je pokryta membránou propustnou pro O 2. Molekulární kyslík difunduje skrze membránu k povrchu platinové elektrody, která je katodou, a je tam za účasti vody

5 redukován na OH. Nepatrný elektrický proud protékající mezi plationovou a referenční elektrodou je úměrný po pco 2 rovnovážný parciální tlak oxidu uhličitého Parametr pco 2 se měří v celé nesrážlivé krvi. Je to parciální rovnovážný tlak oxidu uhličitého, tedy ukazatel sycení krve oxidem uhličitým. Hodnota pco 2 je prostřednictvím chemických rovnováh spjata s koncentrací hydrogenuhličitanů a s hodnotou ph. Fysiologická hodnota pco 2 v žilní a kapilární krvi je kolem 5,5 kpa (cca 40 mm Hg). Potenciometrické stanovení CO 2 elektrodou pro oxid uhličitý pco 2 elektroda se skládá ze skleněné elektrody, kde vnější povrch skleněné membrány je v kontaktu s roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Roztok hydrogenuhličitanu je prostřednictvím membrány propustné pro CO 2 v kontaktu se vzorkem krve. Potenciál na elektrodě je úměrný ph, které je úměrné obsahu CO 2 ve vzorku ph Parametr ph se měří v celé nesrážlivé krvi. Charakterizuje kyselost roztoku, tedy koncentraci vodíkových {aktivitu hydroxoniových} iontů. Jeho fyziologická hodnota je 7,4. Hodnota ph je prostřednictvím chemických rovnováh spjata s koncentrací hydrogenuhličitanů a s hodnotou pco 2. Potenciometrické stanovení ph skleněnou elektrodou Vnější povrch skleněná membrány elektrody je v přímém kontaktu se vzorkem, zatímco vnitřní povrch membrány je v kontaktu s roztokem o konstantní koncentraci (aktivitě) H + (H 3 O + ). Potenciál elektrody měřený proti referenční elektrodě je úměrný koncentraci (aktivitě) vodíkových (hydroxoniových) iontů Železo Železo je nezbytnou součástí řady enzymů a především hemoglobinu červeného krevního barviva, který zásobuje tkáně kyslíkem. Fysiologická koncentrace železa v séru je kolem 18 µ mol/l. Snížené hodnoty se vyskytují v souvislosti s krevní ztrátou rozsáhlejší poranění, menzes u žen, při nedostatku železa v potravě a u některých druhú anemie (chudokrevnosti). Ke zvýšení může docházet např. při chronickém zánětu jater a u hemolytické anemie. Spektrofotometrické stanovení s bathofenanthrolinem Sérum se deproteinuje směsí kyselin trichloroctové a chlorovodíkové s přídavkem kys. thioglykolové a sraženina se odstředí. K supernatantu, v němž je redukčním působením kys. thioglykolové veškeré železo jako dvojmocné, se přidá bathofenanthrolinové činidlo a absorbance vzniklého zabarvení se měří při 500 nm. Spektrofotometrické stanovení s ferrozinem

6 Při tomto stanovení se sérum nedeproteinuje. Smísí se s ferrozinovým činidlem, které jako redukující látky obsahuje v prostředí kys. chlorovodíkové kys. askorbovou a thiomočovinu. Absorbance vzniklého zbarvení se měří v pásu kolem 560 nm Zinek Zn je součástí značného počtu různých enzymů. Kromě toho je vázán z dosud neznámých příčin na bílkoviny. Zvlášť vysoké koncentrace se nacházejí v tkáních oka a slinivly břišní. Fysiologická koncentrace v séru je kolem 20 µmol/l. Zvýšená koncentrace se vyskytuje při hemolyse, snížená při tumorech a poškození jater. Stanovení atomovou absorpční spektrofotometrií Zn se snadno atomizuje a neuplatňují se prakticky žádné rušivé vlivy. Pro stanovení je vhodná i metoda atomové fluorescenční spektrofotometrie, poněvadž Zn lze snadno atomizovat i v relativně chladných plamenech (vodík vzduch) Měď Nejvíc mědi je obsaženo v játrech ve formě hepatocupreinu. V séru je bílkovina ceruloplasmin, která též obsahuje měď. Fysiologická koncentrace Cu v séru je kolem 16 µmol/l, tedy řádově stejná jako u železa. Měď je součástí enzymů butyryl CoA dehydrogenasy a tyrosinasy. Zvýšené hodnoty mohou být při cirrhose a zhoubném bujení, značně snížené hodnoty bývají u vzácně se vyskytující dědičné Wilsonovy choroby. Při této nemoci dochází k nadměrnému hromadění mědi v organismu a v důsledku toho k projevům její toxicity. Spektrofotometrické stanovení s bathocuproinem Bathocuproin, což je 2,9 dimethyl 4,7 difenyl 1,10 fenantrolin 3,6 disulfonan sodný, tvoří v kyselém prostředí s Cu + oranžový komplex. Stanovení se provádí po deproteinaci séra kys. trichloroctovou. K redukci dvojmocné mědi na jednomocnou se do činidla přidává hydroxylamin nebo dvojsiřičitan v kombinaci s p (N methyl)aminofenolem Mangan Mangan je aktivátorem a kofaktorem asi 60 známých enzymatických reakcí u člověka. Fysiologická koncentrace v séru je do 0,8 µg/l. Zvýšené hodnoty bývají např. u pracovníků v dolech na mangan. Zvýšená hodnota se též vyskytuje při akutním a chronickém aktivním zánětu jater a u cirrhosy. Stanovení atomovou absorpční spektrofotometrií s grafitovou píckou nebo emisni spektrofotometrií s indukčně vázaným plasmatem (ICP OES) Selen O metabolismu a funkci selenu je známo velmi málo. Fysiologická koncentrace v séru je kolem 1,4 µmol/l. Snížené hodnoty se vyskytují především při nedostatečném přívodu Se potravou.

7 Zvýšené až toxické hodnoty bývají při neuváženém nadměrném užívání přípravků obsahujících selen. Stanovení atomovou absorpční spektrofotometrií Po energické oxidaci se buď Se stanoví přímo nebo se převede na H 2 Se, který se pak atomizuje ve vyhřivané křemenné kyvetě Toxikologie vybrané anorganické analyty Otravy níže uvedenými prvky resp. jejich sloučeninami se v dřívějších dobách vyskytovaly mnohem častěji než dnes. Jednalo se především o průmyslové otravy, otravy z nedbalosti a vzácné nebyly ani otravy kriminální eventuelně sebevražedné Arsen Jako jed je As asi nejvíc známý ve formě oxidu arsenitého (arsenik, otrušík). V minulosti byl oblíbeným prostředkem k hubení hlodavců a též léčivem na přijici. Dnes se můžeme setkat s jeho použitím ve stomatologii při devitalisace zubní dřeně ( nervu ) a v kožním lékařství při léčbě lupénky. Po požití se vstřebává dlouho a pomalu. Ve vlasech a nehtech se ukládá natrvalo. Smrtná dávka je řádově 2 g. Existuje velmi různá individuální vnímavost. Stanovení As As se stanovuje atomovou absorpční spektrofotometrií bezplamenovou hydridovou technikou. Z odborného hlediska je k jeho stanovení nejvhodnější neutronová aktivační analysa, která nevyžaduje žádnou zvláštní přípravu vzorku a stanovuje i velmi nízké koncentrace. Fysiologická koncentrace As v krvi je 0,4 až 12 µg/l, v moči 2,3 až 31 µg/l Rtuť Příležitost k otravě rtutí je při výrobě teploměrů a zářivek, dále při použití chloridu rtuťnatého a zásaditého kyanidu rtuťnatého k rasantní desinfekci. Čistá kovová rtuť vzata ústy většinou není jedovatá. Dlouhodobé vdechování par ve velkém může způsobit smrt. Smrtná dávka chloridu rtuťnatého je kolem 0,5 g. Při chronické otravě bývá podobně jako u olova zánět ústní sliznice. Stanovení Hg Hg se stanovuje atomovou absorpční spektrofotometrií s použitím hydridové techniky nebo techniky chladné páry. Vyredukuje se chloridem cínatým, z roztoku se uvolní probubláváním vzduchem nebo jiným vhodným plynem a vede se do měřící kyvety. Fysiologická koncentrace v krvi je do 7 µg/l Olovo Lidská kostra akumuluje olovo. Při používání vodovodních olověných trubek může docházet k chronické intoxikaci. Průmyslové především chronické otravy mohou vzniknout při výrobě a manipulaci olověné běloby (uhličitanu olovnatého). Její smrtná dávka je 20 g. Charakteristickým příznakem bývá chronický zánět ústní sliznice a zánět dásní.

8 Stanovení Pb Pb se stanovuje atomovou absorpční spektrofotometrií s použitím grafitové kyvety. Fysiologická koncentrace Pb v krvi je 50 až 270 µg/l, v moči cca do 100 µg/l Thalium Tl je kov podobný olovu. V úvahu přichází v některých železných kyzech nebo v solných dolech. Ve formě síranu, který je prudkým jedem zvláště pro teplokrevné živočichy, se používalo proti hlodavcům. Octan thalný sloužil jako depilační prostředek. Thalium je buněčným jedem s afinitou zvláště k nervovým vláknům a vylučovacím orgánům. Charakteristickým příznakem účinků thalia je vypadávání vlasů. Smrtná dávka se uvádí 1 až 5 g. Stanovení Tl Tl se stanovuje atomovou absorpční spektrofotometrií s použitím grafitové kyvety. V moči se též stanovuje spektrofotometricky jako halogenkomplexy. Fysiologická koncentrace Tl v krvi je 5 µ g/l, v moči do 20 µg/l Oxid uhelnatý Oxid uhelnatý, který typicky vzniká nedokonalým spalovaním paliv, je plyn bez barvy, chuti i zápachu, je lehčí vzduchu a je hořlavý. Z uvedeného vyplývá jeho zákeřnost. Zaujímá první místo mezi náhodnými otravami v Evropě i v Severni Americe. V České republice počet výskyt otrav oxidem uhelnatým po prudkém poklesu v 80. a 90. letech v poslední době mírně stoupá. Ročně je postiženo několik tisíc lidí, z toho asi 150 smrtelně. Počet chronických intoxikací ze znečištěného ovzduší bude jistě mnohonásobně větší. Epidemiologické studie prokazuji, že cca 30% případů je během prvního vyšetření mylně diagnostikováno jako chřipka, migréna, deprese, mozková příhoda. Vdechnutý CO se velmi pevně váže na hemoproteiny, t.j. hemoglobin v červených krvinkách, myoglobin v srdečním svalu a kosterním svalstvu a cytochromy dýchacího řetězce inhibice oxidativní fosforylace. Klasifikace intoxikace a stanovení tíže onemocnění pomocí relativně běžného stanovení karbonylhemoglobinu v krvi nemusí odrážet klinickou závažnost. Stanovení CO Klinicky se obvykle provádí analysou krevního vzorku spektrofotometricky co oxymetrem nebo neinvazivně obdobou pulsní oxymetrie. Stanovení ze vzorku krve plynovou chromatografií se provádí především pro forensní účely. Ve vzduchu se CO stanovuje převážně manuální duální metodou GC TCD (plynová chromatografie s tepelně vodivostní detekcí) s mezí detekce 500 ppm. Instrumentální především on line metody stanovení CO využívají infračervené absorpční spektrometrie. V běžném prostředí je koncentrace CO kolem 10 ppm, v centrech městských aglomeracích bývá až cca 200 ppm. Koncentrace 50 ppm ve vydechovaném vzduchu odpovídá 6% COHb, 80 ppm pak 10% COHb.

9 Literatura [1] Chromý V., Fischer J.: Analytické metody v klinické chemii. Masarykova universita, fakulta přírodovědecká, Brno [2] Lothar T.:Clinical laboratory diagnostics. TH Books Verlagsgesellschaft mbh, Frankfurt/Main, 1. English Edition, Germany 1998, ISBN [3] Strassner W.: Laborwerte und ihre klinische bedeutung. VEB Verlag Volk und Gesundheit, Berlin [4] Riedl O., Vondráček V. et al: Klinická toxikologie. Avicenum, Praha [5] k [6] k Klíčová slova do rejstříku: klinická biochemie, toxikologie, sodík, draslík, chlorid, fosfor, vápník, hořčík, amonium, hydrogenuhličitan, po 2, pco 2, ph, železo, zinek, měď, mangan, selen, arsen, rtuť, olovo, thalium, oxid uhelnatý,