MASARYKOVA UNIVERZITA

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE Stanovení polyfenolických látek v rostlinách Bakalářská práce Brno 21 Petra Elefantová

2 Poděkování Velmi děkuji Mgr. Tomášovi Kašparovskému, Ph.D. za cenné rady a odborné vedení. Dále bych velmi ráda poděkovala Mgr. Kateřině Dadákové za podporu a pomoc při realizaci projektu. Chci poděkovat Ústavu experimentální biologie MU, oddělení funkční genomiky a proteomiky za vypracovaní analýzy MS. Také děkuji mému otci za podporu při studiu. 2

3 Prohlášení Prohlašuji, že jsem pracovala samostatně pod odborným vedením Mgr. Kateřiny Rausové a Mgr. Tomáše Kašparovským, Ph.D. pouze s použitím uvedené literatury. V Brně dne 3

4 OBSAH 1. Obranné reakce rostlin Základní typy interakcí rostlin a patogenů Rostlinné mechanismy obrany Raná fáze Pozdní fáze Sekundární metabolity - POLYFENOLY Rozdělení polyfenolů Lignany Fenolové kyseliny Flavonoidy Stilbeny Resveratrol Typy resveratrolu Funkce v rostlině Biosyntéza Réva vinná Cíl práce Materiál a metody Výsledky a diskuze HPLC MS Souhrn Summary Seznam použité literatury

5 SEZNAM ZKRATEK Glc NADPH AOS HR SAR ISR PR proteiny CoASH Phe glukóza nikotinamid adenin dinukleotid fosfát active oxygen species hypersenzitivní reakce systémově získaná rezistence (systemic acquired resistence) systémově vyvolaná rezistence (induced systemic resistence) pathogen-related proteiny koenzym A fenylalanin 5

6 1. Obranné reakce rostlin TEORETICKÁ ČÁST Na rostliny působí během jejich života vnějšího okolí, to znamená i stresové faktory. Tyto faktory, např. teplota, vodní stres, toxické látky a řada dalších abiotických činitelů i působení různých mikroorganismů mohou měnit rostlinné orgány, zastavit jejich růst a množení, může dojít i k jejich uhynutí.[1,23,24] Mechanismy, které se podílí na odolnosti rostlin proti stresu jsou: Pasivní mechanismus zde si rostliny vytváří bariéru před napadením (např. silná kutikula na listech, impregnace buněčných stěn apod.). Aktivní mechanismus - mechanismy začnou pracovat až po průniku stresorů do symplastu. Coby signály regulující odpověď na biotický a abiotický stres využívají rostliny aktivní formy kyslíku. Vzhledem k toxicitě těchto látek je nutná vysoká míra kontroly jejich koncentrace a přítomnost antioxidačních obranných systémů. Tyto systémy zahrnují enzymové a neenzymové reakce. Nejčastěji se vyskytující antioxidanty jsou askorbát a redukovaný glutathion a enzymy podílející se na detoxifikaci aktivních forem kyslíku jsou např. superoxiddismutasa, peroxidasa, katalasa a jiné enzymy. [24] 1.1. Základní typy interakcí rostlin a patogenů Interakce rostliny a patogenu mohou být kompatibilní a inkompatibilní. [8] a) Při inkompatibilní reakci mikroorganismus pronikne do buňky nebo pletiva hostitele.[8] V této fázi musí dojít k obranné reakci, rostlina aktivně odpoví na útok patogenu, ten se nebude dále reprodukovat, tedy nepropukne infekce takovéto rostliny označujeme jako rezistentní [6,8,9] Rostliny mají ve svém genomu geny rezistence. [1] b) Při kompatibilní interakci se patogen po vstupu do buňky dále šíří, reprodukuje se a vznikne onemocnění. [8,1] Onemocnění je ovlivněno různými faktory, např. efektivností šíření, genotypem patogenu, který je přizpůsoben monokultuře hostitele a řadou dalších. [6,9] V tomto případě mají patogeny geny virulence. 6

7 1.2. Rostlinné mechanismy obrany Jako mechanismus obranné reakce je považováno otevírání iontových kanálků, aktivace enzymů pro reakci primárního a sekundárního metabolismu, modifikace proteinů nebo aktivace obranných genů. Průběh obranné reakce rostlin lze rozdělit na ranou a pozdní fázi Raná fáze Děje, probíhající bezprostředně po kontaktu patogenu s hostitelskou buňkou, nazýváme ranou fází obranné reakce rostlin. Ta nastává již během několika minut po interakci. Po rozpoznání patogenu se spouští signální kaskáda vedoucí ke vzniku obranné reakce. Dojde ke specifickým fyziologickým dějům, kam řadíme depolarizaci cytoplasmatické membrány. Zde dochází k toku K + a Cl - iontů z buňky a dovnitř vstupuje Ca 2+. Velmi rychlou odpovědí na stres (méně než 5 minut) je produkce AOS. Pomocí NADPH oxidasy vznikne kyslíkový radikál O - 2, který rychle přechází vlivem superoxiddismutasy na peroxid vodíku. AOS hrají roli v procesu změn ve struktuře buněčné stěny a ta se tím se stane více odolnou vůči napadení patogenu. H 2 O 2 je také důležitý prvek aktivující syntézu kyseliny salycilové a v expresi obranných genů. Za nejvýznamnější zdroj aktivních forem kyslíku jsou považovány chloroplasty, které při fotosyntéze absorbují velké množství energie, což má za následek zvýšení koncentrace kyslíku.[6,24] V rané fázi také dochází ke tvorbě NO (oxidu dusnatého), který má vliv na hypersenzitivní reakci (HR) rostlin. Při HR nedochází jen ke zničení patogenu, ale zničí se i všechny infikované a sousední buňky. HR patří mezi nejúčinnější obranné mechanismy. [6,1,11,12,24] Pozdní fáze Během pozdní fáze, která trvá několik hodin až dnů, dochází ke tvorbě kyseliny salycilové, méně často jasmonové. Tyto kyseliny indukují systémovou rezistenci, kdy je signál šířen v celé rostlině. Systémovou rezistenci dělíme na: 7

8 SAR (systemic acquired resistence) systémově získaná rezistence je nespecifická, pouze dočasná a chrání rostliny před širokou škálou biotrofních patogenů. Pro její aktivaci je nutný proces nekrózy způsobených bakteriální, houbovou či virovou infekcí [6]. Bylo dokázáno, že aby došlo k vytvoření SAR musí nejdříve dojít k nahromadění kyseliny salyciové. Přítomnost kyseliny může zvrátit citlivost v odolnosti. Mechanismus působení SAR není zcela objasněn.[24] ISR (induced systemic resistence) systémově vyvolaná rezistence rostliny jsou rezistentní vůči nekrotrofním patogenům [6]. Také dochází ke zvýšené produkci fytoalexinů. Dále jsou tvořeny tzv. pathogenrelated proteiny (PR proteiny), které se podílejí na aktivní obraně rostlin. [9,11,12] PR proteiny jsou stresové proteiny, které se nevyskytují u zdravých rostlin, ale jsou syntetizovány ve velkém množství až po napadení patogenem. Jedná se o látky kyselé (jejich isoelektrický bod je v kyselé oblasti), které jsou extracelulární, a bazické (bazická oblast), ty jsou obsaženy intracelulárně ve vakuolách. Dosud bylo identifikováno 17 skupin PR proteinů. [9,11,12,24] Třída Označení Vlastnosti PR - 1 Tobacco PR-1a - PR - 2 Tobacco PR-2 Β-1,3-glucanase PR - 3 Tobacco P, Q Chitinase type I, II, IV, V, VI, VII PR 4 Tobacco R Chitinase type I, II PR 5 Tobacco S Thaumatin-like PR 6 Tobacco Inhibitor I Proteinase-inhibitor PR 7 Tomato P 69 Endoproteinase PR 8 Cucumber chitinase Chitinase type III PR 9 Tobacco lignin-forming Peroxidasa peroxidasa PR 1 Parsley PR1 ribonuclease-like PR 11 Tobacco class chitinase Chitinase type I PR 12 Radish R s -AFP3 Defensin PR 13 Arabidopsis THI2.1 Thionin PR 14 Barely LTP4 Lipid-transfer protein Tabulka č. 1 Přehled tříd PR proteinů [6] 8

9 Fytoalexiny jsou látky s nízkou molekulovou hmotností, které se tvoří jako odpověď na útok patogenu. Jsou to něco jako rostlinná antibiotika. Struktura je na bázi polyfenolů, kumarinů, derivátů acetylenu nebo terpenoidů. Rostliny jsou schopné fytoalexiny hromadit v plodech, listech či kořenech. [9,11,12] 2. Sekundární metabolity - POLYFENOLY Jednu z nejpočetnějších a nejvíce zastoupených skupin rostlinných metabolitů jsou polyfenoly. Jedná se o různorodé látky, oligo- či polymerní a také i kombinované s jinými látkami biogenetického původu. Jsou sledovány pro jejich funkci ve fyziologii. Rostlinám slouží jednak jako stavební a strukturní složky, jsou zodpovědné za chuťové, vonné a barevné látky květů a plodů a také slouží jako obranné látky chránící před škůdci, infekcemi, chladem, mechanickým poškozením či jiným stresem. Předpokládá se, že 4% všech organicky vázaných uhlíků, které se vyskytují v biosféře, tvoří právě fenolické struktury. Mohou se vyskytovat jak v živých, tak i odumřelých organismech, které tvoří zásobárnu živin pro mikroorganismy.[1,2] Dnešní výzkumy se nejvíce zaměřují na identifikaci člověku nejprospěšnějších polyfenolických látek. [1] 2.1. Rozdělení polyfenolů Bylo identifikováno více než 8 fenolických látek v rostlinách s rozmanitými strukturami. Jedná se o produkty sekundárního metabolismu rostlin, které vznikají ze dvou hlavních syntetických drah: šikimátová (fenylpropanová) polyketidová (fenylpropanoidacetátová biosyntéza). Fenylpropanová cesta syntézy aromatických sloučenin Výchozími látkami pro metabolickou dráhu jsou erytrosa-4-fosfát a fosfoenolpyruvát. Jejich kondenzací a dalšími přeměnami vzniká meziprodukt - šikimát (3,4,5-trihydroxycyklohex-6-enová kyselina). Při kondensaci šikimátu 9

10 s fosfoenolpyruvátem vzniká chorismát. Tady se dráha větví na cestu vedoucí k aminokyselinám tryptofanu, fenylalaninu a tyrosinu. Z nich pak může vznikat mnoho stovek až tisíců derivátů, nejčastěji enzymatickými transformacemi. Důležitým meziproduktem biosyntézy je kyselina skořicová, ze které pak vznikají dalšími mechanismy, např. prodloužením propanového řetězce, zkrácením řetězce a redukcí dvojné vazby řetězce, další klíčové meziprodukty druhého stupně. [3,2] Fenylpropanoidacetátová cesta syntézy aromatických sloučenin Tato metabolická dráha vychází z acetyl-coa, který polymeruje přes meziprodukt malonyl-coa. Multienzymový komplex řetězí potřebný počet dvouuhlíkatých molekul za tvorby polyketoacylového intermediátu, jenž je pak modifikován za tvorby primárních sloučenin derivátů resorcinolu a dalších. Produkty této dráhy jsou mnohem speciálnější sloučeniny s významem omezeným vždy na úzkou skupinu organismů.[3] Obr. 1 Syntéza aromatických aminokyselin šikimátovou cestou [3] 1

11 Těmito drahami vzniká extrémně široká škála skupin látek. Přírodní polyfenoly zahrnují látky od jednoduchých fenolických molekul až k vysoce polymerizovaným sloučeninám s molekulární hmotností 3 kda. [1] Primárně obsahují jeden nebo více hydroxylových skupin, které jsou navázány na fenylovou část molekuly. Také obsahují jednu nebo více sacharidových jednotek (monosacharidy či oligosacharidy) substituovaných β-glykosidicky hydroxylovými skupinami.[2] Nejběžněji připojovaný sacharid je glukosa, také se běžně vyskytují vazby s karboxylovými a organickými kyselinami, aminy, lipidy a vazby s jinými fenoly. [1] Rostlinné polyfenoly lze klasifikovat (viz. tabulka č.2) podle počtu uhlíků a jejich vzájemných vazeb. Složení Počet uhlíků Typy fenolických látek Příklady C 6 6 Jednoduché fenoly Katechol C 6 -C 1 7 Fenolické kyseliny Kys.salycilová C 6 -C 3 9 Fenylpropanoidy Chromen C 6 -C 2 -C 6 14 Stilbeny Resveratrol C 6 -C 3 -C 6 15 Flavonoidy Kvercetin (C 6 -C 3 ) 2 18 Lignany Yatein (C 6 -C 3 -C 6 ) 2 3 Biflavonoidy Amentoflavon (C 6 -C 3 -C 6 ) n n Flavolany Gallotaniny (C 6 -C 3 ) n n Ligniny - (C 6 ) n n Katecholmelaniny Rostlinné pigmenty Tabulka č. 2 Typy fenolických látek [2] Tyto polyfenolické sloučeniny dělíme podle počtu aromatických kruhů a způsobu vazby mezi jednotlivými aromatickými kruhy do čtyř základních skupin: 1) Lignany 2) Fenolové kyseliny 3) Flavonoidy, které se dále dělí na třídy 4) Stilbeny 11

12 Lignany Lignany tvoří bohatě zastoupenou skupinu fenylpropanoidů. Vznikají fenylpropanovou cestou z kyseliny skořicové, popř. p-kumarové kyseliny. Jejich struktura je ekvivalentní dvěma fenylpropanovým zbytkům spojeným centrálními atomy jejich postranních řetězců v polohách C-8 a C-8. Propojením dalších vazeb C-C a C-O v různých oxidačních stavech vznikají různé strukturní formy a typy. (např. butanová, butandiolová, hemiacetalová forma a řada dalších). Následnými přeměnami ligninů vznikají další příbuzné struktury norlignany, coniody. Lignanová rodina již převyšuje tisícovku jedinců a jsou stále objevovány další. [7,5,17,2] Lignany byly nalezeny v 55 druzích cévnatých rostlin. Jejich biologická funkce není zatím dokázána, avšak existují důkazy o tom, že jsou důležité pro chemické interakce mezi rostlinami a houbami, rostlinami navzájem nebo rostlinami a hmyzem. Mají tedy roli v obranném systému hostitelských rostlin a ovlivňují spolužití organismů. Pro svoji estrogenní aktivitu je také můžeme řadit mezi fytoestrogeny. Mezi nejznámější fytoestrogeny patří: enterolakton, enterodiol. [1,5,13,17,2] Fenolové kyseliny Obsahují v molekule jeden benzenový kruh, na který jsou navázány hydroxylové a karboxylové skupiny. Fenolové kyseliny dělíme na dvě třídy: deriváty kyseliny benzoové [kyselina gallová (obr. 3), ellagová, protokatechuová a také součásti hydrolyzovaných taninů- gallotaniny a ellagotaniny] a deriváty kyseliny skořicové (kys. kávová, chlorogenová, ferulová, sinapová). [1, 21] V roslinách se ovšem deriváty kyseliny benzoové vyskytují jen zřídka. Nalezneme je v přírodě převážně vázané se sacharidy nebo organickými kyselinami. Biologické vlastnosti těchto látek dosud nebyly objasněny. [21] Deriváty kyseliny skořicové se vyskytují častěji. V rostlinném materiálu se výjimečně nacházejí ve volné formě, častěji jsou navázané na sacharidovou část nebo estericky vázané s kyselinou chininovou, šikimátovou nebo tartarovou. [1, 2] 12

13 Obr. 2 Kyselina gallová [1] Flavonoidy Jedná se o nejvýznamnější samostatnou skupinu polyfenolů. Jsou velice rozsáhlou skupinou, která se svými vlastnostmi liší od ostatních. Dodnes bylo rozpoznáno více než 64 flavonoidních látek. Název je odvozen od latinského slova flavus znamenající žlutý, protože flavonoidy rostlinám dávají barevné zbarvení. [1,22] Biosyntéza flavonoidů vychází z fenylalaninu a probíhá přes skořicovou kyselinu a jiné fenylpropanové sloučeniny. Jádro B (obr. č.3) a atomy uhlíku 2,3,4 vychází z fenylalaninu a zbylé uhlíkové atomy poskytují acetát a malonát. [1,5,23] Struktura flavonoidů: Tyto sloučeniny obsahují dvě substituovaná benzenová jádra (A a B) a kyslíkatý heterocyklus kruh odvozen od 2H pyranu (C). Heterocyklus C je napojený na kruh A a je odpovědný za typické reakce flavonoidů. Heterocyklus B může být napojen na pyranový kruh v pozici 2, což je typické pro většinu flavonoidních barviv, také v pozici 3 isoflavonoidy nebo v pozici 4 neoflavonoidy. (viz. obr.4) [1,5,22] Obr. 3 Obecná struktura flavonoidů [1] 13

14 Všechny tři uhlíkaté kruhy mohou být substituovány hydroxy- či methoxyskupinami. Dle stupně oxidace kyslíkového heterocyklu (C kruhu), alkylace či glykosylace rozeznáváme několik podtříd. Vyskytují se v glykosylované formě, která jim umožňuje vyšší rozpustnost v běžných fyziologických podmínkách rostlinných buněk a také snižuje reaktivitu. Tím sníží jejich reaktivitu a zabezpečí lepší stabilitu. Také se vyskytují v esterifikované podobě nebo jako méně běžné volné látky. Flavonoidy chrání rostlinu před UV zářením. Protože je nalezneme především ve vakuolách, tak dokážou zdeaktivovat superoxid, hydroxylový radikál či singletový kyslík, který se při záření (28-32 nm) uvolňuje. Méně pravděpodobné je, že dokážou zasáhnout přímo in vivo proti reaktivním formám kyslíku, které se uvolňují při fotosyntéze z chloroplastů. [1,4,5,22,23] Dělení flavonoidů: Podle stupně oxidace kyslíkatého kruhu C: Flavanony Isoflavony Anthokyaniny Flavony Flavonoly Flavanoly [1] Flavanony Vznikají z chalkonu, který vznikne z kyseliny p-kumarové. Tato reakce je katalyzována enzymem chalkonisomerasou. Jsou obecně glykosylovány v pozici 7, např. ruteniosou která je bezbarvá, nebo neohesperidosou, která zajišťuje hořkou chuť. Do této třídy se mezi hlavní zástupce zařazují hesperetin, naringenin a eriodictyol.[1,23] 14

15 Obr.4 Obecná struktura flavanonů [1] Isoflavony Isoflavony patří mezi podrobně prozkoumanou skupinu, která je strukturou podobná estrogenům. Obsahují hydroxylové skupiny v poloze 7 a 4. Jsou schopné se vázat k estrogenovým receptorům. Tyto látky mají antioxidační, antibakteriální, a mnohé další účinky. Některé isoflavony a jejich deriváty vykazují toxické účinky. [1,7] Významné fytoestrogeny: genistein, daidzein, glycitein. Obr. 5 Struktura isoflavonů [1] Anthokyaniny Velmi podobné flavonovým glykosidům jsou anthokyaniny. Chemicky se jedná o glykosidy, jejichž aglykon tvoří anthokyanidiny. Anthokyanidiny jsou hydroxyderiváty heterocyklu flavanu, kde v pyranovém kruhu je trojvazný uhlík. Cukerná složka je glukóza, galaktóza, rhammóza nebo arabinóza či jiné oligosacharidy. [5] Anthokyanidiny jsou v přírodě velice rozšířenou skupinou, která se nachází v buněčných vakuolách rostlin. Jsou dobře rozpustné ve vodě a jejich 15

16 charakteristickým působením je červená, modrofialová až modrá barva květů, listů a plodů vyšších rostlin. Barevné vlastnosti jsou dány propojením komplexů za pomoci vyšší absorbance světelných vln a tvorbu komplexů s kovy. Zbarvení ve vodných roztocích je závislé na ph a může být: červený flavyliový kation ph<2, zvýšením ph dojde ke vzniku modré chinoidní striktury. Hydratací flavyliového kationu vznikne bezbarvá hemikatelová forma, a ta posléze tautomerizuje do chalkonové formy. Dosud bylo izolováno a strukturně charakterizováno asi 1 různých zástupců. [1,5,21,22] Tyto látky jsou ve formě aglykonů značně nestabilní, proto je nutná glykosylace, převážně glukózou v pozici 3, popřípadě esterifikace s různými alifatickými či aromatickými kyselinami. Tím vzroste jejich tolerance ke světlu, ph a podmínkám oxidačního stresu. [1,21] Patří sem kyanidin, který tvoří s dvěma molekulami glukózy modré barvivo, dále pelargonidin, jehož 3-β-D-glukosid je pelargonin červené barvivo. Pigmentem červených vín je enidin. [5,21] Obr. 6 Formy anthokyaninů ve vodných roztocích v závislosti na ph [22] 16

17 Flavony Základem těchto látek jsou hydroxyderiváty flavonu, které mají v pozici 4 flavanový skelet s oxoskupinou.(viz. Obr.7). Obr.7 Struktura flavonů [1] Je známo cca 3 struktur přírodních flavonů. Vyskytují se buď ve volné nebo glykosidické či esterové formě. Jsou méně reaktivní než anthokyanidiny, jsou nerozpustné v tucích a málo rozpustné ve vodě. Mají funkci jako přírodní inhibitor, který brání před vlivem škodlivých oxidačních změn potravin. Flavony společně s flavonoly jsou žlutá barviva rostlin, ale většinou je překrývají intensivnější barevné látky. [1,5] Známými zástupci jsou chrysin, primetin, fisetin. [5] Flavonoly Flavonoly jsou přítomné přibližně z 8% u vyšších rostlin. Protože je biosyntéza stimulována světlem, nacházejí se ve vnějších obalových pletivech. Mají podobnou strukturu jako flavony, v pozici 3 mají hydroxylovou skupinu. Hlavní formou flavonolů jsou glykosidy. Cukernou složkou je glukóza nebo rhammóza. Zbarvení těchto látek je od slonovinové až po žlutou. Běžným glykosidem je rutin. Tyto látky vykazují antioxidační účinky. [1,21] Předpokládá se, že glykosidy kvercetinu hrají roli při obranně rostlin na abiotické faktory. Vystavením rostliny mechanickému poškození se jejich obsah v listech rostlin zvyšuje. [25] Kvercetin má výraznější účinky než kemferol. [27] 17

18 Nejznámější aglykony jsou kvercetin, kemferol a myricetin. Nalezneme je v čaji, víně. [1,21] Obr. 8 Kvercetin (3,5,7,3,4 -pentahydroxyflavon) Obr. 9 Kemferol (3,5,7,4 -tetrahydroxyflavon) Obr. 1 Struktura flavonolů [1] Flavanoly Flavanoly se vyskytují ve dvou podobách, buď jako monomery nebo polymery. Tyto látky netvoří glykosidy. Mezi známé monomery, vyskytující se ve volné formě, patří katechiny, které nalezneme v ovoci (např. révě vinné), dále epikatechiny, 18

19 gallokatechiny, epigallokatechiny a epigallokatechin gallát. Pravděpodobná funkce těchto látek je ochrana rostlin před patogeny. [1,21] Dimery, oligomery a polymery katechinů spojených vazbou C4 a C8 se nazývají proanthokyanidiny nebo taky kondenzované taniny. Znakem těchto látek je, že netvoří glykosidy. [1,21] Obr. 11 Struktura flavanolů [1] Stilbeny Jedná se o látky, které mají příznivý vliv na organismus. Některé stilbeny vykazují antimikrobiální vlastnosti. Díky těmto vlastnostem je můžeme řadit mezi fytoalexiny. To jsou látky nízkomolekulární povahy, jejichž syntéza je aktivována při vstupu patogenu do organismu. [19] Obr. 12 Struktura trans stilbenu [1] Nejznámější látkou této skupiny je resveratrol. 19

20 3. Resveratrol Látka, kterou lze nalézt ve více než 72 rostlinných druzích. Tyto druhy jsou dále děleny systematicky do 31 rodů a 12 čeledí. Poprvé byl resveratrol izolován z kýchavice velkokvěté, ale díky zdokonalování analytických metod je objevován ve stále větším počtu rostlinných druhů. Nejvíce je obsažen v bobulích révy vinné, dále pak v řadě druhů zeleniny a ořechách. [7] V menším množství ho lze nalézt ve víně. Jeden litr červeného vína obsahuje cca 2 6 mg resveratrolu, v bílém je menší množství. [1] 3.1. Typy resveratrolu Jedná se o 3,4,5-trihydroxystilben. Existují dva geometrické isomery: trans- a cis-, většinou se vyskytuje směs obou isomerů. V různých polohách se mohou vázat jiné látky. Např. v poloze 3 se váže β-glykosid. Také se vyskytují dehydrooligomery, jedná se o tzv. konstitutivní stilbeny (α-viniferin či ε-viniferin). V posledních letech byly čínskými vědci objeveny a popsány další deriváty (amurensin, piceatannol, pterostilben, pinosylvin). [7] Obr. 13 Trans-resveratrol 3.2. Funkce v rostlině Resveratrol je sekundární metabolit, který se tvoří de novo jako odpověď na stres, nebo při napadení rostliny nepatogenními či virulentními bakteriemi, viry nebo houbami. Má antibakteriální nebo antifungální účinky. Bohužel ale pro řadu infekcí je neúčinný. Fyziologická funkce resveratrolu zatím není zcela objasněna. 2

21 Tvorba resveratrolu je prvotní mechanismus rezistence buňky. Při napadení virem či houbami nebo při vystavení UV zářením, dojde ke tvorbě fytoalexinů, max. koncentrace trans-resveratrolu je dosaženo po hod. po vystavení. Poté jeho koncentrace klesá až dojde k vyrovnání. Při napadení révy vinné plísní Botrytis cynerea je možné pozorovat, jak se vytváří bariéra okolo napadení. V místě napadení je velmi nízká koncentrace resveratrolu, což je pravděpodobně následek toho, že dojde k rozkladu fytoalexinů. Maximální koncentrace je v okolí od místa napadení. [7] Hromadění resveratrolu pravděpodobně pouze nestačí k zastavení infekce. [26] 3.3. Biosyntéza Šikimátovou cestou vzniká prekurzor pro biosyntézu resvertrolu, fenylalanin. Pomocí enzymu fenylalanin amoniak-lyáza se přemění na kyselinu skořicovou a vzniká vedlejší produkt NH 3. Kyselina skořicová je pak oxidována cinnamát-hydroxylasou na kyselinu 4-hydroxyskořicovou. Do reakce vstupuje CoASH a za pomoci 4- kumarát-coa ligasy vznikne 4-hydroxycinnamoyl-CoA, který se kondenzací s třemi karboxylovými kyselinami a CoSCoA a pomocí trihydroxystilben-synthasy mění na resveratrol, přičemž se uvolní 4 molekuly CO 2. [7] 21

22 Obr. 14 Biosyntéza resveratrolu [7] 4. Réva vinná Révu vinnou (Vitis Vinifera) řadíme do říše Planta, podříše Tracheonbionta, oddělení Magnoliophyta, třída Rosopsida, řád Vitales, čeleď Vitaceae, rod Vitis, podrody Euvitis a Muscadinia. [15] Rod Vitis zahrnuje 3 hlavní skupiny - severoamerickou, východoasijskou a euroasijskou. Všechny druhy americké, východoasijské a planá réva evropská vykazují stejný počet chromosomů 2n = 38. [14] Většina druhů rodu Vitis jsou citlivé vůči révokazu a houbovým chorobám (oidiu, červené spále, peronospoře). Do jisté míry jsou odolné jen některé druhy z jihovýchodní oblasti Severní Ameriky (V. berlandieri Planch, V. rupestris Scheele), přičemž se rezistence zvyšuje od severu k jihu. Tato skutečnost ukazuje na to, že aktivní imunita některých 22

23 amerických druhů rodu Vitis vznikla cestou přírodního výběru. Je možno tvrdit, že u všech druhů rodu Vitis jsou vlastnosti, které je oddělují od ostatních rodů čeledi Vitaceae. [15] Čeleď Vitaceae obsahuje přibližně 1 druhů, které podle nejnovější klasifikace uspořádal pan Gallet na rody: 1. Vitis (Tournef. ) L. 2. Cissus L. 3. Ampelopsis PLANCH. 4. Pterisanthes BL. 5. Tetrastigma PLANCH. 6. Ampelocissus PLANCH. 7. Clematicissus PLANCH. 8. Landukia PLANCH. 9. Parthenocissus PLANCH. 1. Rhoicissus PLANCH. 11. Cayratia PLANCH. 12. Acareosperma GAGNEP. 13. Pterocissus URB. et EKM. 14. Cyphostemma PLANCH. 15. Puria NAIR. 16. Nothocissus LATIFF 17. Cissites HEER. 18. Paleovitis REID et CHANDLER (16) Rozdělení rodu Vitis na podrody Euvitis a Muscadinia má velký význam z pohledu studia genových zdrojů a pro šlechtění révy. Podrod Muscadinia je méně vhodný pro šlechtění, jelikož má pouze 3 divoké druhy. Zato botanické druhy podrodu Euvitis mají velký význam při vzniku nových odrůd pomocí šlechtění. 23

24 V následující tabulce č. 3 jsou uvedené divoké americké druhy rodu Vitis spp., které jsou vhodné jako zdroje rezistence a používají se ke šlechtění. Škodlivý a stresový činitel Vitis spp. Plíseň révy vinné (Plasmopara viticola) V. riparia, V. rupestris, V. lincecumii, V. labrusca, V. amurensis, V. rotundifolia, V. yenshanensis, V. pseudoreticulata, V. piasezkii, V. romaneti, V. fl exuoza, V. bryonifolia Padlí révy vinné (Erysiphe necator) V. aestivalis, V. cinerea, V. riparia, V. berlandieri,v. rotundifolia, V. labrusca Šedá hniloba révy vinné (Botrytis cinerea) V. vinifera, V. riparia, V. rupestris Mšička révokaz (Dactulosphaira vitifoliae) V. riparia, V. rupestris, V. berlandieri, V. cinerea,v. champinii, V. rotundifolia Zimní mrazy V. riparia, V. labrusca, V. amurensis, V. acerifolia, V. vulpina, V. yenshanensis, V. adstricta Sucho V. vinifera, V. rupestris, V. champinii, V. berlandieri Zasolení půd V. berlandieri, V. champinii, V.acerifolia Tabulka č. 3 Vlastnosti některých Vitis spp. z hlediska využití jako zdrojů odolnosti proti chorobám, škůdcům a nepříznivým činitelům prostředí [16] Pomocí šlechtění dojde ke vzniku nových odrůd, které se především rozmnožují pohlavně křížením, hybridizací či samoopylením. Také je možnost rozmnožení odrůd pomocí řízků či roubů. [15, 16] 24

25 5. Cíl práce Cílem práce je sledovat výskyt polyfenolických látek souvisejících s obrannou reakcí rostlin. Sledování bylo prováděno jednak před aplikací, ale také po aplikaci ochranných postřiků. Výskyt jednotlivých polyfenolických látek, především resveratrolu, byl porovnáván s neovlivněnými rostlinami. Experimenty byly prováděny s rostlinami v polních podmínkách, a to jak na klasických odrůdách, tak i na rezistentních druzích. 25

26 PRAKTICKÁ ČÁST 6. Materiál a metody Materiál Jako materiál byly použity listy révy vinné (Vitis vinifera) z vinohradu v Kloboukách u Brna. Listy byly sbírány v ranních hodinách, aby se zde resveratrol nerozkládal. Vzorky pochází ze dvou odrůd révy vinné Modrý Portugal a Hibernal. První odběr byl ještě před prvním postřikem , druhý po postřiku Rostliny byly postříkány přípravky Falconem proti houbovým chorobám a Akrobatem k ochraně proti širokému spektru hub rodu Oomycetes. Z každé odrůdy bylo odstřiženo po 1 listech, od malých po velké, které byly zamrazeny na -8 C, aby bylo možné je použít ke stanovení polyfenolických látek. Hibernal je bílá moštová odrůda, která vznikla křížením odrůd Seidelu a Ryzlinku rýnského. Majitel této vinice má odrůdu vyšlechtěnou, tedy z cca 7 % rezistentní proti peronospoře a z cca 99 % vůči oidiu. Tato odrůda nebyla ošetřena žádným chemickým přípravkem. Odrůda Modrý Portugal je odolnější vůči révokazu než bíle odrůdy, proto se častěji vysazuje, ale je náchylná na napadení houbami. Metody Příprava vzorku Nejprve byl extrahován resveratrol z listu révy vinné. Po zkušebních pokusech byla zvolena jako nejoptimálnější navážka,1 g listu. Po vytažení z mrazáku, kde byl uložen při -8 C, byl vzorek zmražený v kapalném dusíku. Vzorek byl homogenizován v drtiči buněk (Takken). Po rozdrcení bylo do mikrozkumavky přidáno 3 µl metanolu nebo při kontrole výtěžnosti metody 3 µl standardního roztoku resveratrolu, který byl připraven rozpuštěním 1,2 mg standardního resveratrolu v 1 ml methanolu a naředěn na 1 µg/ml. Vzorky byly krátce centrifugovány (shortspin). Bylo odebráno 15 µl supernatantu a k němu přidáno 1 µl deionizované vody. Poté byla provedena centrifugace 26

27 při 12 g, při 4 C po dobu 15 minut. Z mikrozkumavek bylo odebráno opět 15 µl supernantantu, který byl následně použit jako vzorek při dávkování do kolony HPLC. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Analýza byla provedena pomocí přístroje HPLC s použitím kolony Supelcosil LC-18-DB. Mobilní fázi tvořila rozpouštědla methanol a voda. Gradientová eluce methanol/voda byla: (viz. tabulka č.4) Čas Gradientová eluce methanol/voda min. 5% MetOH a 95% vody 2 min. 83% MetOH a 17% vody 2,1 3 min. 1% MetOH a % vody 3,1 4 min. 5% MetOH a 95% vody. Tabulka č. 4 Přehled gradientové eluce methanol/voda Byl použit DAD detektor. Absorbance byla měřena při vlnových délkách 21 ± 8 nm a 32 ± 8 nm. Referenční vlnová délka byla 5 ± 5 nm. Hmotnostní spektrometrie (MS) MS byla provedena na pracovišti Ústavu experimentální biologie, oddělení funkční genomiky a proteomiky. Vzorky byly analyzované pomocí auto-ms-ms režimu s možností SmartFrag, který umožnil vhodnou fragmentaci. MS a MS n spektra byla zaznamenávána v rozsahu 5-1 m/z. Pro měření byl použit pozitivní mód (pozorované signály proto představují převážně ionty ve tvaru [M+H] +, [M+Na] +, případně ionty s vyšším nábojem). Bylo měřeno v 2x zředěném roztoku (1:1 zředěno) vzorku okyseleného,1% FA (ph~3) a to do cca 1 minut od naředění vzorku. V MS spektrech byly preferenčně analyzovány signály očekávaných látek a jejich variant s navázanými cukernými jednotkami. [18] 27

28 7. Výsledky a diskuze 7.1. HPLC Methanolické extrakty připravené z révy vinné byly podrobeny analýze HPLC, kde byly prokázány polyfenolické látky. Na chromatografickém záznamu methanolického extraktu (obr.15 a 16), odrůdy Modrý Portugal a Hibernal, se vyskytují píky, které byly dále více zkoumány. Bylo odebráno 6 frakcí v čase t [min], kde se předpokládal výskyt polyfenolických látek. Ty byly následně identifikovány pomocí metody MS. Přítomnost konkrétního flavonoidu bylo podloženo pouze omezeně na základě fragmentů v MS n spektrech, jelikož nebylo možné je srovnat se standardem. Obr. 15 Chromatogram - záznam vzorku odrůdy Modrý Portugal Obr. 16 Chromatogram - záznam vzorku odrůdy Hibernal 28

29 Podle absorpčního spektra (obr.17 a 18) frakce byly stanoveny absorpční maxima látek. U frakce č.3 a 5 byly určeny hodnoty 256 nm a 356 nm. U frakce č.4 a nm a 358 nm. Tyto hodnoty byly porovnány se známou hodnotou polyfenolických látek a předpokládalo se, že se jedná o kvercetin (obr.17) a kemferol (obr.18). Absorpční spektra konkrétních frakcí odrůd Modrý Portugal a Hibernal se nelišily. Obr. 17 Absorpční spektrum révy vinné (frakce č. 3 a 5) Obr. 18 Absorpční spektrum révy vinné (frakce č. 4 a 6) U frakce č.1 (obr. 19) se předpokládal piceatannol, který nebyl analýzou MS potvrzen. 29

30 Obr. 19 Absorpční spektrum révy vinné (frakce č. 1) Frakce č.2 (obr.2) vykazuje přítomnost zatím neznámé látky. Obr. 2 Absorpční spektrum révy vinné (frakce č. 2) 7.2. MS Hledané látky pro analýzu MS byly piceatanol (MW 244 Da, +1x Glc: MW 46 Da, +2x Glu: MW 568 Da), kvercetin (MW 32 Da, +1x Glc: MW 464 Da, +2x Glu: MW 626 Da) a kemferol (MW 286 Da, +1x Glc: MW 448 Da, +2x Glc: MW 61 Da). Pro danou frakci je vždy uvedeno MS spektrum podávající souhrnnou informaci o vzorku. Dále jsou uvedena MS n spektra vybraných signálů z MS spektra. Hodnoty m/z, u kterých byla provedena MS n analýza, odpovídají pravděpodobně odštěpení cukerných jednotek. Ke spektru je uvedeno MS n spektrum, které bylo 3

31 získáno po izolaci daných iontů a jejich fragmentaci. Z dat nelze určit v jaké pozici je cukerná složka vázána. Frakce vína Hibernal pomocí MS Frakce č. 1 Intens. [%] MS,.1-1.1min #(2-9) Obr. 21 MS spektrum frakce č m/z Frakce č. 2 Intens. [%] MS,.-.4min #(1-27) m/z Obr. 22 MS spektrum frakce č. 2 U frakcí č. 1 a 2 zatím nebyly identifikované hledané látky. 31

32 Frakce č. 3 Intens. [%] MS,.-.5min #(1-42) Obr. 23 MS spektrum frakce č m/ z Nejdříve byly získány ionty o m/z 479,1 z MS spektra (obr. 23), které byly nadále fragmentovány a z přítomných fragmentů byl získán ion o m/z 33,1 (obr. 24), který pravděpodobně odpovídá glykosidu oxidované glukózy kvercetinu nebo kvercetin-omethyl Glc. Následnou fragmentací (obr. 25) vznikly ionty méně kvalitní, mající velmi nízkou intenzitu spektra. Intens. [%] 1 +MS2(479.1),.1-.2min #(1-9) m/z Obr. 24 MS 2 spektrum frakce č. 3 32

33 Intens. [%] 1 +MS3(479.1->33.1),.1-.5min #(1-1) m/z Obr. 25 MS 3 spektrum frakce č. 3 Frakce č. 4 Intens. [%] MS,.1-.4min #(2-31) m/z Obr. 26 MS spektrum frakce č. 4 Byly získány ionty o m/z 463,1 z MS spektra (obr. 26), které byly nadále fragmentovány. Z přítomných fragmentů byl získán ion o m/z 287,1 (obr. 27), který pravděpodobně odpovídá glykosidu oxidované glukózy kemferolu nebo kemferol-omethyl Glc. Následnou fragmentací (obr. 28) vznikly ionty méně kvalitní, mající velmi nízkou intenzitu spektra. 33

34 Intens. [%] 1 +MS2(463.1),.1-.3min #(1-13) m/z Obr. 27 MS 2 spektrum frakce č. 4 Intens. [%] 1 +MS3(463.1->287.1),.1-.5min #(1-11) m/z Obr. 28 MS 3 spektrum frakce č. 4 Frakce č. 5 Intens [% MS,.1-.5min #( m/

35 Obr. 29 MS spektrum frakce č. 5 U Frakce č. 5 byly získány ionty o m/z 465,1 a 611,1 z MS spektra (obr. 29), které byly nadále fragmentovány. Další fragmentací byl získán ion o m/z 33,1 (obr. 3), které pravděpodobně odpovídá glykosidu glukózy kvercetinu. U m/z 611,1 byly ještě získány ionty 449 a 465,1, které pravděpodobně naznačují přítomnost kvercetin-odiglykosidu (obr. 31). Intens. [%] 1 +MS2(465.1),.1-.2min #(1-9) m/z Obr. 3 MS 2 spektrum frakce č. 5 o m/z 465,1 Intens. [%] 1 +MS2(611.1),.1-1.2min #(1-49) m/ z Obr. 31 MS 2 spektrum frakce č. 5 o m/z 611,1 35

36 Frakce č. 6 Intens. [%] MS,.-.4min #(1-26) Obr. 32 MS spektrum frakce č. 6 Byl získán ion o m/z 449,1 z MS spektra (obr. 32), který byl nadále fragmentován. Další fragmentací byl získán ion o m/z 287,1 (obr. 33), které pravděpodobně odpovídá glykosidu glukózy kemferolu. Následnou fragmentací (obr. 34) vznikly ionty méně kvalitní, mající velmi nízkou intenzitu spektra. Intens. [%] MS2(449.1),.1-.2min #(1-8) m/z m/z Obr. 33 MS 2 spektrum frakce č. 6 36

37 Intens. [%] 1 +MS3(449.1->287.1),.1-.9min #(1-19) m/z Obr. 34 MS 3 spektrum frakce č. 6 Frakce vína Modrý Portugal pomocí MS MS spektra frakce č. 1 až 4 odrůdy Modrý Portugal byly velice podobné s MS spektry odrůdy Hibernal a obsahovaly stejné ionty těchto látek. MS spektrum frakce č. 5 ještě obsahoval ion o m/z 33,1 (viz. obr. 35), který odpovídá pravděpodobně čistému kvercetinu. Intens [% MS,.-.5min #( m/ 951. Obr. 35 MS spektrum frakce č. 5 odrůdy U odrůdy Modrý Portugal bylo také odlišné MS spektrum frakce č. 6 (viz. obr. 36). Toto spektrum obsahoval další ion o m/z 595,1, který pravděpodobně odpovídá kemferol-o-diglykosidu (obr. 37). 37

38 Intens [% MS,.1-.8min #( m/ Obr. 36 MS spektrum frakce č. 6 Intens. [%] 1 +MS2(595.1),.1-.4min #(1-14) m/ z Obr. 37 MS 2 spektrum frakce č. 6 o m/z 595,1 38

39 8. Souhrn Většina flavonoidů vykazují pasivní obranu proti mechanickému poškození. Současné studie se zaměřují na biosyntézu fenolových látek v reakci na biotický stres. Na aktivní obranné reakci rostlin se nejvíce podílí resveratrol. Je dokázáno, že se resveratrol vyskytuje v různém množství v hroznové slupce révy vinné. V rámci bakalářské práce byla snaha nalézt resveratrol v listech. Jedná se o fytoalexin, který je syntetizován v živých buňkách rostlin po útoku patogena. Dle hypotézy se resveratrol rozkládá na světle. Proto byl odběr vzorků nutný nad ránem. I přesto, že byly vzorky sbírány v noci, ve vzorcích nebyl resveratrol nalezen. S největší pravděpodobností z toho důvodu, že nebyly k dispozici vzorky, které by byly napadeny patogenem, jelikož na vinici nepropukla žádná infekce. Tedy nelze potvrdit, že se resveratrol v listech vyskytuje. Očekávaly se dále látky flavonoidních struktur jako kvercetin, piceatannol a kemferol. Předpokládá se, že glykosidy kvercetinu hrají pasivní roli při obranných reakcí rostlin. Akumulace fenolických látek by mohla být specifická pro každou infekci. Po analýze MS byly identifikované glykosidy kemferolu a kvercetinu. U odrůd Modrý Portugal a Hibernal se nenalezly u frakcí č. 1 a 2 žádné očekávané látky. U frakce č. 3 obou odrůd byly zaznamenány glykosidy oxidované Glc kvercetinu nebo kvercetin-o-methyl Glc. Frakce č. 4 obou druhů odpovídala glykosidům oxidované Glc kemferolu nebo kemferol-o-methyl Glc. Odlišnost nastala u frakce č. 5 a 6. Frakce č. 5 odrůdy Hibernalu obsahovala glykosid Glc kvercetinu a pravděpodobně kvercetin-o-diglykosid. Odrůda Modrý Portugal ještě navíc obsahoval čistý kvercetin. U frakce č. 6 odrůdy Hibernal byl zaznamenán glykosid Glc kemferolu. Odrůda Modrý Portugal obsahovala navíc kemferol-o-diglykosid. Z toho vyplývá, že rezistentní i nerezistentní odrůdy obsahují stejné flavonoly. Je nutné provést další experimenty, aby byli zjištěny látky podílející se na aktivní obranné reakci rostlin v listech révy vinné. 39

40 9. Summary Most flavonoids exhibit passive defense against mechanical damage. Current studies focus on the biosynthesis of phenolics in response to biotic stress. Resveratrol is most actively involved in plant defense response. There is evidence that resveratrol is found in varying quantities in grape skins vine. The thesis was an attempt to find the resveratrol in the leaves. This is a phytoalexin that is synthesized in living cells of plants after pathogen attack. By hypothesis, resveratrol extends the light. Therefore, the sampling required in the early morning. Even though the samples were collected at night, in the samples was found resveratrol. Most likely because they were not available samples, which were attacked by a pathogen, because the vineyard was no infection.therefore can not confirm that resveratrol is found in the leaves. Expecting further substances flavonoid structures such as quercetin, piceatannol and kaempferol. It was found that quercetin increases the exposure of plants to sunlight. It is assumed that quercetin glycosides play a role in defense reactions in plants. Accumulation of phenolic compounds could be specific for each infection. Aftter MS analysis were indentified following substances: glykosides kaempferol and quercetin. We can find them in resistant variety of Hibernal and in susceptible Portugieser Blau. It is necessary to carry out further experiments to clarify the substances were involved in an active plant defense response in leaves of grapevine.. 4

41 1. Seznam použité literatury [1] Mandelová, L. (26): Antimutagenní aktivita obsahových látek v zelenině a v ovoci, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity v Brně, Katedra biochemie, Brno, [2] Trna, J., Táborská E.: Přírodní polyfenolové antioxidanty ( [3] SekundMetab-1.htm (29) [4] Motáčková, M. (26): Význam ovoce v lidské výživě, bakalářská práce, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity v Brně, Katedra biochemie, Brno, 11 [5] Vodrážka, Z.: Biochemie, 2. vyd., Praha : Academia, 1999 [6] Buchanan, B. B., Gruissem, W., Jones, R. L. (2): Biochemistry & Molecular Biology of Plants, American Society of Plant Physiologists, Rockville, [7] Šmidrkal, J., Filip, V., Melzoch, K., Hanzlíková, I., Buckiová, D., Křísa, B. (21): Resveratrol, Chem.listy 95, [8] Sedlářová M., Lebeda A.(21) : Buněčné mechanismy podmiňující interakce rostlin a patogenů, [9] Rausová, K. (29): Vliv ochranného postřiku na obrannou reakci révy vinné, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity v Brně, Katedra biochemie, Brno, 7-15 [1] Lochman, J. (26): Molecular-Biological Markers of Plant-Pathogen Interaction, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity v Brně, Katedra biochemie, Brno, 5-7 [11] Balcarová, H. (29): Studium rané fáze obranné reakce rostlin vyvolané kurantními proteiny Cryptogeinu, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity v Brně, Katedra biochemie, Brno, 7 41

42 [12] Starý, T. (29): Metageneze a izolace rekombinantního proteinu I63F, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity v Brně, Katedra biochemie, Brno, 1-12 [13] Šmidrkal J., Krs V., Filip, V. (26): Isoflavony, struktura a vlastnosti, 1-12 [14] Mullins, M.G., Bouquet, A., Williams, L.E. (1992): Biology of the grapevine, Cambridge University Press, 239 [15] Blaha, J. (1961): Réva vinná, Nakladatelství Československé akademie věd, 7-15 [16] Pavloušek, P. (27): Encyklopedie révy vinné, Computer Press, a.s., 1-18 [17] Harmatha,J. (25): Strukturní bohatství a biologický význam ligninů a jim příbuzných rostlinných fenylpropanoidů, Chem.listy 99, [18] Literáková, P., Kašparovský, T., Lochman, J., Zdráhal, Z., Prokop, Z., Mikeš, V. (21): Determination of Capsidiol in Tabacco Cells Culture by HPLC, Journal of Chromatographic Science, 48 [19] Horejtníková, H., Kubínová, R.: (23) Přírodní látky ovlivňující mezibuněčnou komunikaci, Chem.lisy 97, [2] Harmatha, J.: (25) Strukturní bohatství a biologický význam lignanů a jim příbuzných rostlinných fenylpropanoidů, Chem. Listy 99, [21] Ondrejovič, M., Maliar, T., Polívka, L., Šilhár, S.: (29) Polyfenoly jabľk, Chem. Listy 13, [22] Heinrich, J., Švarcová, I., Valentová, K.: (28) Plody Lonicera caerulea: Perspektivní funkční potravina a zdroj biologicky aktivních látek, Chem. Listy 12, [23] Adámková, Š., Luhová, L., Petřivalský, M., Peč, P.: (26) Role L-fenylalaninamoniumlyasy při obranné reakci rostlin, Chem. Listy 1,

43 [24] Piterková, J., Tománková, K., Luhová, L., Petřivalský, M., Peč, P.: (25) Oxidativní stres: Lokalizace tvorby aktivních forem kyslíku a jejich degradace v rostlinném organismu, Chem. Listy 99, [25] Koskimäki, J., Hokkanen, J., Jaakola, L., Suorsa, M., Tolonen, A., Mattila, S., Pirttilä, A., Hohtola, A.: (29) Flavonoid biosynthesis and degradation play a role in early defence responses of bilberry (Vaccinium myrtillus) against biotic stress, Springer Netherlands, [26] Schnee, S., Viret, O., Gindro, K.: (28) Role of stilbenes in the resistance of grapevine to powdery mildew, Agroscope Changins-Wädenswil, Route de Duillier, CH-126 Nyon, Switzerland [27] O Neill, B., Zangerl, A., Dermody, O., Bilgin, D., Casteel, C., Zavala, J., DeLucia, E., Berenbaum, M.:(21) Impact of Elevated Levels of Atmospheric CO 2 and Herbivory on Flavonoids of Soybean (Glycine max Linnaeus), SPRINGER, VAN GODEWIJCKSTRAAT 3, 3311 GZ DORDRECHT, NETHERLANDS 43