Separační metody pro stanovení polyfenolických látek ve víně Diplomová práce

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin Separační metody pro stanovení polyfenolických látek ve víně Diplomová práce Vedoucí práce: prof. RNDr. Bořivoj Klejdus, Ph.D. Vypracovala: Markéta Jarošová Brno 2012

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Separační metody pro stanovení polyfenolických látek ve víně vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis.

3 PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych chtěla poděkovat prof. RNDr. Bořivoji Klejdusovi, Ph.D. za vzorné vedení mé diplomové práce, odborné rady a metodické vedení a především za věnovaný čas a ochotu v průběhu řešení práce.

4 ABSTRAKT Diplomová práce na téma Separační metody pro stanovení polyfenolických látek ve víně je rozčleněna do dvou oddílů. První část je věnována polyfenolickým látkám, chemickému složení vína, stručné technologii výroby a metodám pro identifikaci a kvalifikaci polyfenolických látek. Druhý oddíl se zabývá stanovením vybraných polyfenolických látek v konkrétních vzorcích metodou HPLC-MS, s využitím postupu Matějíčka a kol (2004). Stanovovaný obsah polyfenolických látek je srovnáván mezi odrůdami, ročníky a v závislosti na celkovém obsahu derivátů kyseliny benzoové a skořicové. Z výsledků vyplývá, že nejvyšší naměřenou hodnotou 5,257 mg/l byla kyselina kávová u Cabernetu Sauvignon. Celkový obsah derivátů kyseliny skořicové a benzoové byl téměř srovnatelný. Nejvíce resveratrolu bylo naměřeno u Ryzlinku rýnského, Rulandského modrého a Svatovavřineckého. Nejvyšším obsahem fenolických látek se celkově vyznačovala červená vína s 13,676 mg/l. Klíčová slova: víno, polyfenolické látky, resveratrol, vysokoúčinná kapalinová chromatografie ABSTRACT The diploma thesis called Separation Methods of Polyphenolic Substances Determination in Wine is divided into two parts. The first part is devoted to polyphenolic substances, chemical composition of wine, briefly to production technology and methods for identification and quantification polyphenolic substances. The second part is devoted to determination of selected polyphenolic substances in specific samples using the HPLC-MS method together with the technique by Matejicek and his team (2004). The determined volume of polyphenolic substances is compared among different varieties, vintages and in dependence on total volume of benzoic acid and cinnamic acid. It arises from the results that the acid with highest measured level of mg/l was the caffeic acid present in Cabernet Sauvignon. The total present amount of cinnamic acid and benzoic acid was nearly the same. The highest level of resveratrol was recorded in Ryesling, Pinot Noir, and Saint Laurent. The highest level of phenolic substances was recorded in red wines with mg/l. Keywords: wine, polyphenolic compounds, resveratrol, high performance liquid chromatography

5 OBSAH 1 ÚVOD CÍL POLYFENOLICKÉ LÁTKY Rozdělení polyfenolických látek Fenolové kyseliny Flavonoidy Flavonoly Flavanoly Proantokyanidiny Antokyanidiny Další flavonoidy Stilbeny a lignany Lignany Stilbeny CHEMICKÉ SLOŽENÍ VÍNA Voda Alkoholy Sacharidy Organické kyseliny Barviva Aromatické látky Třísloviny Enzymy Pektiny Dusíkaté látky... 30

6 4.11 Vitamíny Minerální látky Lipidy Polyfenolické látky TECHNOLOGIE VÝROBY VÍNA Drcení hroznů a příprava rmutu Nakvašování rmutu Lisování rmutu Úprava moštu před kvašením Kvašení moštu Školení vína Lahvování PŘEHLED MODERNÍCH SEPARAČNÍCH METOD Extrakční techniky Nadkritická fluidní extrakce Extrakce urychleným tokem rozpouštědla Mikrovlnná extrakce Soxhletova modifikovaná extrakční metoda Extrakce pevnou fází Extrakce disperzní tuhou fází Separační metody Chromatografické metody Elektromigrační metody MATERIÁL A METODIKA Vzorky Popis zkoumaných vzorků vín včetně základní charakteristiky odrůd... 52

7 7.2 Chemikálie Přístrojové vybavení Extrakce fenolových kyselin Stanovení obsahu polyfenolických látek VÝSLEDKY Kalibrace Statistické vyhodnocení Srovnání obsahu polyfenolických látek ve vzorcích vín Porovnání obsahu derivátů benzoové a skořicové ve vzorcích vín Posouzení vlivu stárnutí na změnu obsahových složek v odrůdovém víně Muškát moravský Vyjádření procentuálního zastoupení polyfenolických látek ve vzorcích vín Skupina I Skupina II Skupina III Porovnání vlivu barvy vína na obsah polyfenolických látek DISKUZE ZÁVĚR POUŽITÁ LITERATURA SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM GRAFŮ SEZNAM TABULEK SEZNAM ZKRATEK Příloha Příloha Příloha SEZNAM PŘÍLOH

8 1 ÚVOD S přesností nemůžeme tvrdit, kdy se s výrobou alkoholických nápojů začalo, ovšem člověk k němu byl už jakýmsi způsobem předurčen, což se také potvrdilo s objevem enzymu alkoholdehydrogenázy. První pokusy o produkci alkoholických nápojů byly pouze výsledkem náhody než složitých výrobních postupů. Alkohol se získával fermentací ovocných šťáv pomocí kvasinek vyskytujících se přirozeně ve vzduchu. Podle názoru vědců byla skutečně prvním alkoholickým nápojem medovina. Až později se začal vyrábět nápoj, který se získával nakvášením hroznů divoké vinné révy. První zmínky o výrobě vína jsou z doby před lety z oblasti dnešní Gruzie a Arménie. Později se víno díky rozsáhlému obchodu rozšířilo i do dalších částí světa, jako je Čína, Damašek, Makedonie, Írán, Egypt apod. V těchto oblastech se nalézá mnoho pozůstatků, jež svědčí o intenzivním pěstování vinné révy i pití vína. Příkladem mohou být nálezy džbánů s vínem starých let. Důvod proč se s konzumací vína započalo, asi neobjasníme, ale každý národ v něm viděl něco jiného, Řekové nápoj pro zlepšení nálady a povzbuzení inspirace, Egypťané zase zázračný lék. Hojně bylo užíváno při slavnostních událostech, náboženských obřadech i jako oběť bohům. V dnešní době se o víně hovoří především v souvislosti s jeho blahodárnými účinky na lidské zdraví. Látky v něm obsažené se v jiných alkoholických nápojích nevyskytují, nebo jsou zde zastoupeny pouze v minimálních koncentracích. Mezi účinné substance ve víně patří mimo jiné i polyfenolické látky, sekundární metabolity rostlin, které přispívají v prevenci proti nádorovým, srdečně-cévním onemocněním, nervovým poruchám apod. Pozitivní účinky polyfenolických látek na zdraví člověka byly posuzovány v řadě studií. Metody, kterými můžeme tyto látky identifikovat a kvantifikovat, dosáhly velmi vysoké úrovně. Biologicky aktivní látky, mezi které řadíme i polyfenoly, lze stanovit mnoha separačními metodami od chromatografických (HPLC a GC) až po elektromigrační (CZE a MECC). Strukturu polyfenolických látek lze studovat s využitím spektrofotometrických technik, nukleární magnetické rezonance a hmotnostní spektrometrie. Pro zvýšení účinnosti identifikace rostlinných metabolitů je vhodné využít kombinaci předešlých technik. S použitím těchto moderních metod jsme schopni ve víně spolehlivě stanovit i stopová množství polyfenolických látek. 8

9 2 CÍL Diplomová práce je orientována na kvantitativní stanovení obsahu polyfenolických látek ve vzorcích vín pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Vzhledem k tomu, že na ústavu Chemie a Biochemie již byly uskutečněny podobné výzkumy, nebylo nutné provádět zavedení nových analytických postupů pro jejich stanovení. Vybraným postupem, který navrhl Matějíček a kol. (2004) byly podrobeny i vybrané vzorky vín. Cíle práce: - stanovit celkový obsah vybraných polyfenolických látek ve vzorcích vín - posoudit procentuální zastoupení zvolených fenolových kyselin a jejich derivátů, stilbenu a flavonoidních látek v jednotlivých odrůdových vínech - porovnat zastoupení polyfenolických látek v rámci skupin červených, bílých a růžových vín - srovnat obsah derivátů kyseliny benzoové a skořicové ve vzorcích vín - popsat změnu zastoupení vybraných složek v závislosti na ročníku 9

10 3 POLYFENOLICKÉ LÁTKY Polyfenolické látky jsou přírodní látky vyskytující se v běžných potravinách. Řadíme je k sekundárním metabolitům rostlin (Handique a Baruah, 2002). Do současnosti bylo identifikováno přes 8000 polyfenolických látek. Strukturálně jsou tvořeny jedním nebo více aromatickými nebo heterocyklickými řetězci, buďto kondenzovanými nebo spojenými alifatickým řetězcem. Součástí řetězce také bývá jedna či více hydroxylových nebo methyloxylovaných skupin (Klejdus, 2004). Mezi známé vlastnosti polyfenolických látek patří antioxidační, redukční a chelatační schopnosti. Z potravinářského hlediska je nejvýznamnější jejich schopnost ovlivňovat organoleptické vlastnosti. Proto se uplatňují jako rostlinná barviva, chuťové a vonné látky (Velíšek, 2002). S polyfenolickými látkami se můžeme setkat u většiny druhů rostlin, mikroorganismů i živočichů. Z rostlinných druhů jsou významným zdrojem polyfenolických látek především vinné hrozny, rybíz, lesní plody, brokolice a cuketa (Ubeda a kol., 2011). Přestože živočichové nejsou producenty fenolických látek, dostávají se do jejich organismu sekundárně, jejich příjmem v potravě, popřípadě v rámci výrobního procesu (Shahidi a Naczk, 2004). V lidském těle plní polyfenolické látky, jako významné antioxidanty, řadu funkcí. Napomáhají v prevenci onemocnění, jako jsou rakovina prsu, prostaty, plic, tlustého střeva a konečníku, srdečně-cévní, Parkinsonovy a Alzheimerovy choroby. Dále pak mohou pozitivně ovlivňovat hladinu cholesterolu. Průměrný denní příjem polyfenolů by měl činit asi 1 g (Jones, 1998; Ala n a kol., 2011). 3.1 Rozdělení polyfenolických látek Polyfenolické látky jsou velmi rozličnou skupinou látek. Můžeme je dělit podle povahy na látky flavonoidní (antokyany, flavanoly, flavonoly, dihydroflavonoly) a neflavonoidní (hydroxybenzoové a hydroxyskořicové kyseliny a jejich deriváty, stilbeny a těkavé fenoly). Polyfenoly se mohou členit i podle svých organoleptických vlastností, na barviva, chuťové látky a vonné látky. Mnoho z nich také působí jako účinné přírodní antioxidanty. Mimo tato dělení můžeme fenolické látky podle chemické struktury rozdělovat do následujících skupin: 1. fenolové kyseliny kyselina benzoová, skořicová a jejich deriváty 2. flavonoidy flavonoly, flavony, isoflavony, flavanony, antokyanidiny, flavanoly 10

11 3. stilbeny a lignany resveratrol, matairesinol, sekoisolariciresinol (Trna a Táborská, 2011) 3.2 Fenolové kyseliny Fenolové kyseliny patří do skupiny polyfenolických látek, které jsou tvořeny uhlíkatou kostrou C 6 -C 1 (benzoová kyselina a její deriváty) a C 6 -C 3 (skořicová kyselina a její deriváty). Můžeme se s nimi často setkat v různých rostlinných materiálech (Mikeš, 2004). Mezi nejznámější deriváty benzoové kyseliny patří kyselina salicylová, p- hydroxybenzoová, vanilová, syringová, protokatechová, gallová, gentisová a veratrová (Luštinec a Žárský, 2005). Deriváty kyseliny gallové, které vznikají esterifikací polyhydroxylovými sloučeninami, nejčastěji jednoduchými cukry, se označují jako taniny. Nejrozšířenějšími zástupci v rostlinné říši jsou gallotaniny a ellagotaniny, vzniklé oxidací galloyových zbytků (Hess, 1983). Další fenolovou kyselinou je kyselina skořicová, jejíž deriváty jsou kyseliny o- kumarová, m-kumarová, p-kumarová, ferulová, sinapová a kávová. Nejběžnějším esterem kávové kyseliny je kyselina chlorogenová (5-caffeoylchinová kyselina), která je přítomná v kávě, bohatým zdrojem jsou též brambory, jablka, hrušky, meruňky, broskve a především artyčok (Trna a Táborská, 2011). Derivátem kávové kyseliny je i kyselina kaftarová, která vzniká vazbou kyseliny kávové na tartarovou. Jedná se o jednu z nejvíce se vyskytujících hydroxyderivátů skořicové kyseliny. Tato kyselina se významně podílí na antioxidačních účincích. Spolu s glutationem vytváří 2-Sglutationylkaftarové kyseliny. Tento redukční produkt hroznů významně potlačuje hnědnutí vín při stárnutí a současně stabilizuje barvu vína (Fracassetti a kol., 2011). Ze studií vyplývá, že fenolické kyseliny tvoří až jednu třetinu všech polyfenolů přijímaných v potravě. Nejvíce se na tomto příjmu podílí deriváty již zmíněných kyselin benzoové a skořicové. V menší míře se na něm podílí i jiné fenolické kyseliny jako jsou kyselina rosmarinová (ester kávové kyseliny s kyselinou 2-hydroxy-3-(3,4- dihydroxyfenyl)-propionovou, jenž se vyskytuje v majoránce a rozmarýně), chlorogenová a jí příbuzné sloučeniny, estery s kyselinou jablečnou (výskyt v brukvovitých rostlinách) a vinnou (v moštech, vínech, koření čekanky), cholin estery fenolových kyselin tzv. sinapiny (v semenech brukvovitých), glykosidy fenolových kyselin, amidy fenolových kyselin s 5-hydroxyanthranilovou kyselinou (avenanthramidy v ovsu) a kapsacinoidy (kapsaicin v paprice) (Hess, 1983). 11

12 deriváty benzoové kyseliny deriváty skořicové kyseliny deriváty skořicové kyseliny rosmarinová kyselina Obr. 1 Významné fenolové kyseliny a jejich deriváty (Švejcar, 1986). 3.3 Flavonoidy Flavonoidy jsou nejfrekventovanější skupinou sekundárních metabolitů vyšších rostlin. Jsou identifikovány v listech, květech a plodech nejrůznějších druhů rostlin (Jones, 1998). Do dnešní doby identifikovány okolo 5000 těchto látek (Velíšek a Hajšlová, 2009). Z nutričního hlediska jsou flavonoidní látky pozitivní pro lidské zdraví. Fungují jako účinné antioxidanty. Kromě antioxidačního účinky dosahují flavonoidy i účinku opačného. Jako prooxidanty působí v molekule flavonoidů především vázané ionty kovů, jako jsou ionty želena, mědi, niklu a molybdenu (Švejcar, 1986). Další funkcí těchto sekundárních metabolitů je schopnost redukovat riziko vzniku srdečně-cévních onemocnění a ateroskler zy. Působí také preventivně proti oxidaci LDL-cholesterolu, protizánětlivě, antibakteriálně, antiprostaticky a vazodilatačně (Zloch, 2011). Z chemického pohledu jsou flavonoidy látky odvozené od flavanu, který je tvořen 2H-chromenem substituovaným v poloze C 2 fenylovou skupinou. Jedná se o uspořádání C 6 -C 3 -C 6. Benzenové jádro A je tvořeno ze tří malonoyl-coa molekul a benzenové jádro B pochází ze p-kumaroyl-coa. Na kruhu A dochází v poloze meta k hydroxylaci. Šestičlenný heterocyklus s kyslíkem je odvozen nejčastěji od pyranu. Kruh C je mono-, di-, polyhydroxylovaný a může obsahovat i metyleterové skupiny (Vermerris a 12

13 Nicholson, 2006). Běžně bývají všechny tři kruhy substituované hydroxy- nebo methoxyskupinami a jednotlivé deriváty se od sebe liší pouhým stupněm substituce a oxidace (Velíšek a Hajšlová, 2009). Rostlinné flavonoidy se vyskytují v rostlinách jak volné, tak vázané. Majoritní význam ovšem mají vázané flavonoidy ve formě glykosidů, jejichž cukerná složka je tvořena D-gluk zou, D-galakt zou, L-arabin zou, nebo jinými sacharidy. Glykosyl může být do molekuly flavonoidů zapojen i vícekrát, popřípadě může být substituován hydroxylovými kyselinami (Švejcar, 1986). Flavonoidy jsou rozděleny do několika skupin na flavanoly, flavanony, flavony, flavonoly, proantokyanidiny, antokyanidiny a izoflavony, které se od sebe liší nejen strukturou a výskytem, ale také svou funkcí. Obsah flavonoidů se vyjadřuje v mg/100 g. 13

14 Obr. 2 Zástupci flavonoidů (Trna a Táborská, 2011) Flavonoly Flavonoly jsou polyfenolické látky, které se nacházejí ve slupce bobulí vinné révy (Vitis vinifera). Potravinářsky důležité flavonoly mají hydroxyskupinu navázanou v polohách C 3, C 5, C 7 a C 4 (Velíšek a Hajšlová, 2009). Nejvýznamnější flavonoly jsou 3-glykosidy myricetinu, kemferolu, izohamnetinu a kvercetinu, například myricetin 3-glukosid, kemferol 3-glukosid, izohamnetin glukosid, myricetin glukuronid, kemferol glukuronid, kemferol galaktosid apod. (Andersen a Markham, 2006). Červené odrůdy se obecně vyznačují vyšším zastoupením těchto flavonoidů, oproti tomu bílé odrůdy se kromě nižšího obsahu celkových flavonolů vyznačují absencí myricetinu. Ostatní flavonoly jako například taxifolin jsou ve srovnání s předešlými méně významné a typická je pro ně i menší intenzita zabarvení (Ribéreau-Gayon, 2000) Kvercetin Kvercetin je odvozován od struktury flavonu, pouze odlišně hydrolyzovanou. V sedmdesátých letech minulého století byl zkoumán jeho výskyt v rostlinách v souvislosti s léčbou rakovinných onemocnění, zejména léčbou rakoviny tlustého střeva. Kromě toho kvercetin velmi účinně působí protizánětlivě, protisrážlivě, antiateroskleroticky. V přirozené formě je kvercetin neaktivní. Ke zreaktivnění dojde až po přidání kvasinek do moštu, přičemž se přemění na kvercin. Přirozeně k tomuto ději dochází i činností střevní mikrofl ry v gastrointestinálním traktu (Jones, 1998). Kvercetin je možné izolovat z šalotky, cibule, p rku, česneku, kde se vyskytuje v množství od 65 do 95 mg/100 g. Celou řadou flavonoidních látek oplývá i čeleď Brassiceae, do které patří především kapusta, kedluben a zelí. Například samotný kedluben obsahuje velká množství kvercetinu až 11,5 mg/100 g a kemferolu až 23,1 mg/100 g. Je také nejběžnějším flavonolem v lesních plodech, kde se jeho obsah pohybuje od 12 do 17 mg/100g (Andersen a Markham, 2006). 14

15 Kvercetin se nemusí vyskytovat pouze ve formě volné, ale také jako glykosid, například kvercetin-3-o-glukosid a kvercetin-3-o-rhamnosid. Dalším významným glykosidem je rutin (kvercetin-3-β-rutinosid), jenž ovlivňuje pružnost a propustnost krevních kapilár (Trna a Táborská, 2011). Rutin byl identifikován nejen ve vinných bobulích, ale také v listech Vitis vinifera. Dnes je běžnou součástí potravinových doplňků. Rutin se také podílí na zvyšování hladiny kyseliny askorbové v živočišných orgánech (Velíšek a Hajšlová, 2009). Kromě rutinu byly v listech vinné révy postupně objeveny i jiné flavonové glykosidy jako luteolin 7-glukosid, apigenin 7-glukosid a kvercetin 3-gallaktosylrhamnosid. Ve slupce i ve větvích vinné révy se vyskytují astilbin (dihydrokvercetin 3-rhamnosid) a engeletin (dihydrokamferol 3-rhamnosid) (Andersen a Markham, 2006). Obr. 3 Kvercetin (Trna a Táborská, 2011) Flavanoly Flavan-3-oly se vyskytují v rostlinných materiálech jako monomery, oligomery a polymery. Nejvíce zastoupenými flavanoly v hroznovém víně jsou katechiny. Katechiny jsou zde jak volné tak kondenzované. Katechiny po kondenzaci přes mezistupně o- chinonů jsou schopny interagovat s bílkovinami a vytvářet zákaly vín, které jsou jak vratné tak nevratné (Švejcar, 1986). Ve vinných hroznech se katechiny vyskytují v semenech a slupce, ačkoliv stopová množství byla detekována i v dužině. Majoritní význam mají katechiny, epikatechiny a epikatechin-3-gallát (Andersen a Markham, 2006). Ve Vitis vinfera byl zaznamenán také gallokatechin. U jiných ne vinifera druhů se vyskytuje katechin-3-gallát a gallokatechin-3-gallát (Švejcar, 1986). Na koncentraci katechinů závisí také hnědnutí vín během stárnutí (Fracassetti a kol., 2011). 15

16 S výjimkou vína, které je výborným zdrojem katechinů (4,7 4,9 mg/l00 ml) se mohou katechiny dále nacházet ve švestkách, jablcích a čaji (Andersen a Markham, 2006). Zelený čaj obsahuje něco okolo 1 g/l katechinů. Oproti tomu černý čaj obsahuje asi poloviční množství, jelikož je jeho obsah redukován fermentací (Trna a Táborská, 2011). Katechin se vyskytuje v rostlinných materiálech v daleko vyšší míře než ostatní flavonoidní látky. Vyznačuje se silnými antioxidačními účinky. Účinně působí proti hromadění tukových plátů (Jones, 1998), snižuje riziko vzniku srdečně-cévních onemocnění a oxidace LDL-cholesterolu (Burin a kol., 2010). Obr. 4 Katechin (Trna a Táborská, 2011) Proantokyanidiny Jedná se o kondenzované taniny, které vznikly polymerací flavanolů (Fujita, 2005). Ve své molekule obsahují katechinové, epikatechinové a epikatechin-3-gallátové jednotky, tudíž se jedná částečně o galloylátové prokyanidiny. Prokyanidiny typu B obsahují tyto jednotky ve formě dimerů či trimerů (Andersen a Markham, 2006). Proantokyanidiny zodpovídají za hořkost a tříslovitou chuť vín (Fujita, 2005). V rostlinných materiálech se vyskytují pouze v polymerních stupních Mohou se vyskytovat i jako tzv. hydrolyzovatelné taniny, které jsou esterifikovány kyselinou gallovou, popřípadě kyselinou digallovou. Běžnými zdroji těchto látek jsou hrušky, jablka, čaj, čokoláda a kakao (Trna a Táborská, 2011). Dále byly tyto látky identifikovány v luštěninách, jako je zelený hrách. Proantokyanidiny se přirozeně vyskytují v červeném víně, kde reprezentují až 50 % veškerých flavonoidů (Andersen a Markham, 2006). 16

17 Obr. 5 Proantokyanidin A (Trna a Táborská, 2011) Antokyanidiny Antokyanidiny jsou aglykony antokyanů, které patří mezi jedny z nejdůležitějších barviv modrých odrůd vinné révy (Švejcar, 1986). Všechny antokyanidiny jsou odvozeny od struktury, kterou je flavyliový (2-fenylbenzopyryliový, 2- fenylchromenyliový) kationt. Uvádí se, že existuje celkem sedmnáct různých antokyanidinů. Všechny tyto sloučeniny jsou substituované v poloze C 4 hydroxylovou skupinou a vzájemně se liší substitucí v polohách 3, 5, 6, 7, 3 a 5. Z potravinářského hlediska je jich významných pouze šest, jenž mají hydroxyskupinu v poloze C 3 (Velíšek a Hajšlová, 2009). Nejznámější antokyanidiny vinné révy jsou delfinidin, malvidin, petunidin, kyanidin a peonidin. Často se ve Vitis vinifera vyskytují ve formě 3-monoglykosidů, přičemž jejich cukerná složka je tvořena gluk zou, galakt zou, arabin zou apod. Strukturou jsou podobné derivátům flavonolu, ovšem karboxylová skupina je nahrazena oxoniovou, která snadno interaguje s kyselinami, jako jsou kyseliny kávová, kumarová, malonová. Jinak je tomu u jiných druhů révy, které obsahují 3,5-diglukosidy (Švejcar, 1986; Andersen a Markham, 2006). Jejich barevnost je odvislá od příslušného aglykonu, kovu vázaného v molekule, přítomnosti kyseliny siřičité a ph. Kyselina siřičitá je schopna vytvářet bezbarvou formu antokyanidinů a ph určuje, jaké zbarvení tyto látky budou mít, jelikož mohou mít zbarvení od červené po modrou (Švejcar, 1986; Belitz a kol., 2008). Antokyanidiny se mohou nalézat ve slupkách bobulí a jejich množství v nich vzrůstá s účinkem světla. U některých odrůd jako jsou barvířky obsahuje pigmenty i dužina (například V. vinifera var. Alicante Bouschet, var. Gamay Fréaux) (Andersen a 17

18 Markham, 2006). Čím více kyselin víno obsahuje, tím je jeho intenzita zbarvení nižší (Švejcar, 1986). Průměrný obsah antokyanidinů ve víně je 26 mg/l (Šulc a kol., 2011). Antokyanidiny se kromě vinných bobulí nalézají v třešních, švestkách, rybízu, malinách, jahodách, ostružinách, jablkách, hruškách, červeném zelí, fazolích, lilku a ředkvičce (Velíšek a Hajšlová, 2009). Významnou vlastností těchto látek je chránit rostliny před negativními účinky oxidativního stresu (Šulc a kol., 2011). Příjem těchto látek s sebou nese i řadu pozitivních vlivů na lidské zdraví. Antokyanidiny působí antioxidačně, protizánětlivě, antiateroskleroticky a antikarcinogeně (Piatkowska a kol., 2011). Obr. 6 Obecný vzorek antokyanidinů (Švejcar, 1986) Další flavonoidy Mezi flavonoidní látky kromě již zmíněných skupin patří i flavony, flavanony a izoflavony. Flavony jsou strukturálně nejjednoduššími ze všech flavonoidů. Neobsahují v molekule žádné hydroxylové skupiny. Jsou spolu s flavonoly nejrozšířenějšími žlutými barvivy rostlin. Pro potraviny jsou typické flavony substituované v poloze C 5 a C 7, méně již v poloze C 6 na kruhu A a v poloze C 4 na kruhu B. Častými flavony jsou apigenin a luteolin. Mezi substituované flavony patří hispidulin, nepetin, cirisiliol, akacetin, diosmetin, chrysoeriol, limocitrin, tangeretin a nobiletin. Nejčastějším zdrojem těchto látek jsou citrusové plody. Mohou se vyskytovat ve formě O-glykosidů (např. diosmin) i C-glykosidů (např. vitelin a orientin) (Velíšek a Hajšlová, 2009). Preventivně působí proti vzniku srdečně-cévních onemocnění, ateroskler ze, osteopor ze a diabetu (Trna a Táborská, 2011). Flavanony jsou skupinou látek, známou také pod názvem citrusové flavonoidy (Trna a Táborská, 2011). Jsou buď bezbarvé, nebo světle žluté. Jako barviva nemají větší význam. Jejich chuť je závislá na substituci v jednotlivých pozicích řetězce. Zajímavé také je, že tyto látky se mohou vyznačovat sladkou chutí, ta je ovšem podmíněna přítomností volných hydroxylových skupin v pozici R 1 a R 2 na kruhu B (Belitz a kol., 2008). Jejich hlavní složkou jsou glykosidy odvozené od 5,7-18

19 dihydoxyflavanonů, jejich (2S)-izomerů, které se od sebe liší substitucí kruhu C (Velíšek a Hajšlová, 2009). Jedná se o látky typicky se vyskytující v citrusových plodech a v ovocných nápojích. Významným flavanonem v pomerančích a citr nech je hesperetin (5,7,3 -trihydroxy-4 -methoxyflavanon), který je zde zastoupen v množství 1,4 39,2 mg/100 g) (Andersen a Markham, 2006). V grapefruitech dominuje spíše naringenin (5,7,4 -trihydroxyflavanon) (Velíšek a Hajšlová, 2009). Mezi další flavanony patří likviritin (likviritigenin-4 -glukosid), který se vyskytuje v lékořici, sakuranin a prunin (naringenin-7-glukosid) v plodech slivoní, glykosidy pinocembrinu v luštěninách a pyrakanthosid v plodech hlohyně šarlatové (Velíšek a Gajšlová, 2009). Významnou podskupinou flavonoidních látek jsou také izoflavonoidy. Do současnosti bylo objeveno něco okolo 700 struktur a popsáno okolo 400 aglykonů. Struktura izoflavonoidů je tvořena 3-fenylbenzopyronovou skupinou (Bruneton, 1996). Mezi nejvýznamnější izoflavonoidy patří genistein a dadzein, formononetin, biochanin A a jejich glykosidy. Všechny tyto látky jdou identifikovány v čeledích Fabaceae, Brassicaceae (Dixon a Ferreira, 2002) a Convolvulaceae, Cyperaceae (Vacek a kol., 2008). S ja, jako typický zástupce čeledi Fabaceae, obsahuje velká množství izoflavonoidů, ovšem její úpravou se obsah jednotlivých izoflavonoidů mění. Fermentovaná s ja obsahuje především aglykony, zatímco nefermentovaná s ja obsahuje zejména β-glykosidy (Andersen a Markham, 2006). Izoflavonoidy slouží jako přirozená ochrana rostlin proti infekci, napadení hmyzem a škůdci. Jsou také účinné fytoestrogeny, přestože se nejedná o steroidy, obsahují ve své molekule hydroxylové skupiny v poloze 7 a 4, které jsou analogy k hydroxylovým skupinám estradiolů (Manach a kol., 2004). Potlačují negativní symptomy menopauzy u žen a další hormonálně podmíněná onemocnění. O toxicitě izoflavonoidů se mluví pouze při příjmu nadměrně vysoké dávky (Wang, 2002; Vacek a kol., 2008). 19

20 Obr. 7 Genistein (Trna a Táborská, 2011). 3.4 Stilbeny a lignany Tato skupina látek strukturálně podobná flavonoidům, je v potravinách zastoupena pouze v malém množství. Vyznačují se řadou biologických vlastností a můžeme je nalézat v různých druzích zeleniny, ovoce, obilovin apod Lignany Lignany jsou glykosidy, jejichž aglykon je tvořen koniferylalkoholem, produkty jeho kondenzace, či jinými fenylpropanoly (Manach a kol., 2004). Nacházejí se v různých rostlinných materiálech, ve dřevě, pryskyřicích, obilovinách, brusinkách, jahodách, kávových bobech, čajových listech, rajčatech a ořeších (Milder a kol., 2006; Andersen a Markham, 2006) apod. Nejbohatším zdrojem lignanů je lněné semínko. To obsahuje v průměru asi mg lignanů na 100 g sušiny. Dále se lignany nalézají v typickém produktu lnu a to ve lněném oleji. Lněné semínko obsahuje zejména lignany, jejichž aglykonem jsou sekoisolariciresinol a matairesinol (Velíšek, 2002). Rostlinné prekurzory savších lignanů zahrnují secoisolaricinol, laricresinol, matairesinol, 7-hydroxymatairesinol, pinoresinol a lignin (Andersen a Markham, 2006). Lignany jsou snadno rozložitelné střevní mikrofl rou v trávicím traktu člověka na tzv. enterolignany, entrolakton a enterodiol, které vykazují fytoestrogenní aktivitu (Nurmi a kol., 2003). Existuje několik mechanismů, kterými mohou fytoestrogeny chránit proti srdečně-cévním onemocněním a rakovině (Milder a kol., 2005). Enterolignany se mohou vázat na α a β estrogenní receptory nacházející se v různých tkáních. Také se uplatňují při inhibici některých enzymů, jako jsou aromatázy a 5α reduktázy. Podporují také tvorbu pohlavních hormonů vážících globulin (SHBG) (Milder a kol., 2006). Kromě estrogenní aktivity se některé glykosidy z této skupiny vyznačují 20

21 protirakovinnými, protivirovými a bakteriostatickými schopnostmi (Manach a kol., 2004) a v menší míře i antioxidačními vlastnostmi (Milder a kol, 2006). Obr. 8 Aglykony lignanů (Moravcová, 2006) Stilbeny Stilbeny jsou skupinou látek, která je produktem fenylpropanoidacetátové dráhy. Tyto sloučeniny nejsou v rostlinných materiálech příliš rozšířené, proto je lidská potrava na jejich obsah velmi chudá. Vyskytují se ve dvou formách, a to buď volné, nebo vázané jako glykosidy (Šmidrkal a kol., 2011). V posledních letech rapidně vzrostl zájem o tuto skupinu především díky jejímu nejvýznamnějšímu zástupci tj. resveratrolu (Trna a Táborská, 2011). Dalším představitelem může být jeho glukosid picerol (Fremont, 2000). trans-stilben cis-stilben Obr. 9 Trans-stilben a cis-stilben (Šmidrkal a kol., 2011) Resveratrol Resveratrol (3,4,5 trihydroxystilben), včetně svých analogů řadíme do skupiny stilbenů, která je spolu s antokyany, katechiny, proanthocyanidiny a flavonoly patří mezi polyfenolické látky. Stilbeny vyskytující se v rostlinných materiálech často obsahují směs obou izomerů resveratrolu cis- i trans-, jež jsou odlišné nejen svými biologickými účinky, ale i sílou antioxidačního účinku (Kong a kol., 2011). Vyskytuje 21

22 se také ve formě glykosidů a oligomerů, tzv. konstitutivních stilbenů, jež jsou jeho oxidativní produkty. Resveratrol má i potenciál antifungicidu. Jako antifungicid působí především proto, že patří mezi tzv. fytoalexiny, sekundární metabolity, které se začínají tvořit nebo se zvyšuje jejich koncentrace v rostlině jako odezva na stresový faktor (Jones, 1998; Šmidrkal a kol., 2011). Nejvýznamnějším stresovým činitelem pak může být poškození slupky bobulí, přičemž se začne zvyšovat koncentrace resveratrolu v rostlině, aby se zamezilo možnému napadení bobulí plísněmi (Nikfardjam, 2006). Průměrný obsah resveratrolu ve víně se pohybuje v rozmezí 0,1 8 mg/l. Vyšší obsah mívají vína, kde při výrobě docházelo k nakvášení rmutu. Koncentrace resveratrolu u červených vín je krát vyšší než u vín bílých (Jones, 1998). Vína vyráběná z modrých odrůd obsahují 2 6 mg/l, vína bílá pouze 0,2 0,8 mg/l. Jednoho miligramu je dosaženo již v 0,17 0,5 l vína. Optimální příjem resveratrolu se pohybuje od 0,2 do 0,6 mg denně. Tento obsah získáme, vypijeme-li pouze 0,2 dl vína denně (Šmidrkal a kol., 2011). Pokud bychom se zabývali jednotlivými izomery resveratrolu, bílá i červená vína obsahují přibližně stejné množství cis-resveratrolu asi okolo 0,12 0,06 mg/l, naopak trans-resveratrol je v bílých vínech zastoupen méně asi kolem 2,51 mg/l, oproti červenému vínu, kde se jeho obsah může vyšplhat až k 12,68 mg/l (Fan a kol., 2008). Přestože se resveratrol vyskytuje v mnoha rostlinných druzích, není jeho obsah pro lidský organismus příliš využitelný. Resveratrol je látkou nepolárního charakteru, která se nerozpouští ve vodě, proto je alkohol ve víně jeho optimálním nosičem. Resveratrol se podílí na organoleptických vlastnostech vína, vytváří s proteiny slin komplexy (Galgano a kol., 2011), které dodávají vínům hořkost a barvu (Jiang a kol, 2010). Záměrný přídavek resveratrolu do vína má za následek zvýšení hořkosti a barvy vína, přičemž chemické ukazatele vína se nezmění. Kromě obrany proti stresu rostlin a podílu na senzorických vlastnostech vín má tento fytofenol pozitivní vliv na lidské zdraví. Účinně se podílí na snížení rizika vzniku srdečně-cévních onemocnění (Llorach, 2010), různých druhů rakovin (Juhasz, 2010), potlačování LDL-cholesterolu, zvýšení HDL-cholesterolu (Šmidrkal a kol., 2011), ochraně proti ateroskler ze (Rocha, 2009) a některým neurologickým chorobám (Parkinsonova a Alzheimerova choroba) (Feij o a kol., 2008). S resveratrolem je také spojován tzv. Francouzský paradox, tento termín vznikl v roce 1992, a popisuje relativně nízký výskyt kardiovaskulárních chorob ve 22

23 francouzské populaci, přestože se zde setkáváme s poměrně vysokým příjmem nasycených tuků. Tento rozpor je dáván do souvislosti se zvýšenou konzumací červeného vína. Samozřejmě pouze resveratrolu samotnému tento pozitivní účinek připisovat nemůžeme (Lippi a kol.). Nadměrná konzumace vína ovšem tyto účinky ztrácí, což také vyplývá z křivky závislosti snížení rizika výskytu srdečně-cévních onemocnění na příjmu alkoholu, která má tvar velkého písmene J (Mudra a Rušavý, 2005). Obr. 10 Trans-resveratrol a cis-resveratrol (Šmidrkal a kol., 2011). 23

24 4 CHEMICKÉ SLOŽENÍ VÍNA Víno je roztok velmi pestrého složení. Do současnosti v něm bylo identifikováno více než 600 komponent (Richter, 2002), které různou měrou ovlivňují organoleptické vlastnosti a kvalitu vín. Kvalita vůně a chuti závisí na vyváženosti dílčích chutí a vůní. Jednotlivá vína se od sebe liší v závislosti na odrůdě, zralosti hroznů, podmínkách během technologického zpracování, především kvašení a také eventuálním napadením hroznů mikroorganismy (Velíšek a Hajšlová, 2009). K dalším faktorům ovlivňujícím chemické složení patří teplota a vodní režim, charakter půdy, obsah minerálních látek a hloubka půdní vrstvy (Švejcar, 1986). Víno obsahuje látky, jež se původně vyskytovaly v moštech a rmutech, látky vznikající při nakvášení a látky cizorodé, které se do vína dostávají až během technologického procesu výroby. Tyto látky pak můžeme rozdělovat na látky běžné a rušivé. K původním součástem moštů patří kyseliny, třísloviny, dusíkaté látky, minerální látky, barviva, aromatické látky a polyfenolické látky (Kraus a kol., 1997). Tab. 1 Obsah nejdůležitějších látek ve víně (v g/l) (Pavloušek, 2005). Obsahová složka Obsah [g/l] Obsahová složka Obsah [g/l] Voda minerální látky 2,5 5,0 etanol dusíkaté látky 0,2 1,4 sacharidy fenoly 0,1 2,5 kyseliny 6 15 lipidy 0,05 0,1 4.1 Voda Voda jakožto známé rozpouštědlo se uplatňuje i u vína. Nejen že je hlavní součástí tohoto nápoje, je v něm rozpuštěna i většina v něm obsažených látek. Množství vody ve víně je závislé především na kultivaru, stupni vyzrálosti a klimatických podmínkách během vegetační doby. Tvoří asi 80 až 85 % veškerého objemu. Důležité je zmínit, že je zakázáno jakoukoli vodu do vína přidávat (Švejcar, 1986). 4.2 Alkoholy Alkohol je pro lidský organizmus významným zdrojem energie. Vzniká při alkoholové fermentaci a nejčastěji se vyrábí z vinných hroznů. K nejvýznamnějším alkoholům obsažených ve víně řadíme etanol, metanol, glycerol a vyšší alkoholy. 24

25 Etanol, nebo-li vinný líh je jednomocný alkohol vznikající při enzymatickém kvašení cukrů. Obvyklé množství alkoholu se ve víně pohybuje mezi 10 až 15 obj. % (Šamánek a Urbanová, 2010). Vyšší obsah alkoholu zajišťuje větší stabilitu vína proti kvasničným zákalům i octovatění, křísovatění a mléčnému kvašení vína. Obsah 10 obj. % alkoholu je tedy minimální hranicí zajišťující optimální mikrobiologickou stabilitu vína (Kraus a kol., 1997). Metanol vzniká rozkladem pektinových látek a celul zy, které jsou obsaženy hlavně ve výliscích. Jeho výskyt ve víně je velmi malý, a to i z toho důvodu, že je vysoce jedovatý a v nadměrném množství by mohl vyvolat slepotu. Způsobem lisování lze jeho obsah regulovat. Běžný obsah metanolu ve víně je 50 mg/l, ovšem tato hladina je často překračovaná. Pokud se ve víně vyskytne vyšší obsah metanolu a vyšších alkoholů, vyvolá to u většiny konzumentů bolesti hlavy (Richter, 2002). Glycerol jakožto vyšší alkohol vzniká již na počátku alkoholového kvašení. Ve víně se vyskytuje v minimálních koncentracích. Dodává vínům plnost a zjemňuje i jejich chuť. Jedinou možností jak zvýšit obsah glycerolu ve víně je zpracovávat hrozny napadené ušlechtilou plísní Botrytis cinerea. 4.3 Sacharidy Sacharidy jakožto důležitá součást vína se spolupodílejí na vytvoření typických senzorických vlastností vína. Považují se především za chuťové složky, ale mohou se také nepřímo podílet na vytvoření barvy vína (Švejcar, 1986). Ze strukturního hlediska rozdělujeme sacharidy na jednoduché (monosacharidy) a složené (disacharidy, polysacharidy). Nutriční hledisko zohledňuje spíše výživovou hodnotu sacharidů, proto sacharidy dělíme na cukry (mono-, disacharidy, alkoholické cukry), oligosacharidy (maltooligosacharidy, ostatní oligosacharidy) a polysacharidy (škrob, neškrobové polysacharidy a fruktany) (Kvasničková, 2000). Nejvýznamnější složkou vína jsou ale cukry, tedy především D-gluk za a D- frukt za, které představují asi 99 % všech cukrů (Pavloušek, 2005). Přestože je jejich obsah v moštech vyrovnaný, v bobulích se tento obsah vyrovnává až na samém konci doby zrání. Průměrný obsah cukrů v moštech se pohybuje mezi 160 až 240 g/l, výjimečně i přes 240 g/l. V nepříznivých letech mohou mošty obsahovat i pod 150 g/l (Kraus a kol., 1997). Vysoký obsah cukrů podobně jako vysoký obsah alkoholu je jeden z limitujících faktorů funkce kvasinek. Opačným problémem je docukřování, kdy před 25

26 vlastním kvašením přidávají vinaři do moštu řepný nebo třtinový cukr, aby tak docílili optimálního obsahu alkoholu ve víně (Richter, 2002). Mezi nejvýznamnější disacharidy bychom mohli zařadit sachar zu, která představuje transportní cukr z listů do bobulí. V bobulích se následně rozštěpí na gluk zu a frukt zu, proto ji ve víně nalézáme pouze v nepatrných množstvích (Pavloušek, 2005). Pokud bychom ve víně hledali polysacharidy, mohli bychom najít pouze škrob, a to pouze v malých koncentracích, jelikož jeho obsah ve víně je nežádoucí a dostává se tam ze slupek bobulí při nešetrném drcení hroznů (Švejcar, 1986). Ve víně nejsou obsažené pouze cukry se šesti uhlíkatým řetězcem, ale také pent zy a metylpent zy. Největší význam mám ve víně L-arabin za, D-arabin za, L-xyl za a L- ramn za (Pavloušek, 2006). Celkové množství arabin zy je závislé na druhu vína. Bílá vína mají obsah arabin zy od 0,5 do 1,0 g/l, u červených vín je její množství třetinové. Podle obsahu zbytkového cukru zatřiďujeme vína do jednotlivých kategorií, jako jsou suchá (do 4 g/l), polosuchá (4 12 g/l), polosladká (12 45 g/l) a sladká (více než 45 g/l) (Velíšek a Hajšlová, 2009). Tab. 2 Obsah sacharidů ve vínech (Velíšek a Hajšlová, 2009). Sacharid Obsah [mg/dm 3 ] Sacharid Obsah [mg/dm 3 ] rib za 6,3 62 Fuk za 2 9 arabin za 1,0 242 trehal za 0 61 xyl za 0,6 146 celoboi za 2 7 gluk za malt za 1 5 mann za 2 37 sachar za 0 galakt za 6,3 249 Lakt za 1 5 frukt za melibi za stopy 1 rhamn za 2,2 121 rafin za Organické kyseliny Na tvorbě chuťových vlastností vína se významnou měrou podílí kyseliny. Kyseliny značně ovlivňují biochemické procesy při zrání vína, stejně tak působí stimulačně na některé kmeny kvasinek a inhibičně na nežádoucí skupiny mikroorganizmů, které by svou činností byly příčinou zhoršení kvalitativních parametrů vína (Malík, 2003). Nejčastěji lze organické kyseliny ve víně nalézt ve formě rozpustných solí (Švejcar, 1986). Jejich celková koncentrace ve víně se pohybuje v rozmezí od 1 do 5 g/l (Richter, 2002). 26

27 Dominantní zastoupení ve víně mají kyselina vinná a jablečná (Pavloušek, 2005). Kyselina vinná má ve víně nejvyšší výskyt a její obsah je téměř neměnný. Tvoří 35 až 70 % obsahu veškerých kyselin ve víně (Richter, 2002). Minimální množství kyseliny vinné ve víně musí být, i po operaci odkyselování, alespoň 1 g/l. Další důležitou kyselinou ve víně je kyselina jablečná. Nachází se v bobulích, listech a stopkách hroznů. Na rozdíl od kyseliny vinné tato kyselina reaguje snadno s kyslíkem, především za vysoké teploty. (Švejcar, 1986) U dobrých ročníků se množství kyselin pohybuje mezi 6 až 12 g/l moštu, u špatných ročníků tento údaj vystoupá až k 20 g/l (Kraus a kol., 1997). Významný vliv na kvalitu vína má poměr obou kyselin, který je dán klimatickými podmínkami při pěstování (Pavloušek, 2005). Dobré ročníky se vyznačují vyšším obsahem kyseliny vinné. Kyselost vína je charakterizována pouze obsahem kyseliny jablečné, protože je během zrání hroznů nestabilní a podléhá snadnějšímu rozkladu než kyselina vinná. Kvašením se tato kyselina mění na oxid uhličitý a kyselinu mléčnou. Dozrálé víno tak obsahuje především kyselinu mléčnou, ale pouze malé množství kyseliny jablečné (Richter, 2002). Minoritní kyseliny obsažené ve víně jsou pak kyseliny citronová, fumarová, octová, jantarová, glykolová, šťavelová, mesovinná, dihydroxyfumarová apod. Jejich nízké obsahy jsou způsobeny činností mikroorganismů, které tyto kyseliny rozkládají během procesu kvašení (Švejcar, 1986; Kraus a kol., 1997). 4.5 Barviva Barevnost hroznových bobulí se odvíjí od obsahu jednotlivých druhů barviv. Z chemického hlediska barviva vyskytující se ve vinných hroznech tvoří tyto sloučeniny: flavanoly, antokyanidiny a flavonové glykosidy u modrých kultivarů a u bílých kultivarů poté chlorofyl, karotin a xantofyl. V plastidech obsahujících chlorofyl se postupně snižuje obsah chlorofylu a mizí až po úplném dozrání hroznů (Švejcar, 1986). Flavanoly se také podílejí na žlutavé barvě, ovšem nacházejí se především v listech a nezralých hroznech. Nejznámějšími flavanoly ve víně jsou kvercetin a jeho derivát kvercitrin. Kvercitrin se v moštu nenachází, vzniká až enzymatickým štěpením kvercetinu v průběhu kvašení. Bílá vína obsahují kvercitrinu okolo 1 mg/l, červená vína pak 30 až 50 mg/l (Kraus a kol., 1997; Švejcar, 1986). 27

28 Červené, fialové a modré zbarvení v rostlinné říši způsobují antokyany. Klasické barvivo červeného vína je oenin, který je modročervený a od počátku se nachází ve slupkách bobulí (Richter, 2002). Pro barevnost vín je velmi důležité ph prostředí. Červená vína s vyšším obsahem kyselin mají barvu světlejší a vína s nižším obsahem kyselin mají barvu tmavě červenou (Kraus a kol., 1997). Pro optimální vývoj barvy je nutné, aby víno obsahovalo optimální množství prekurzorů tříslovin. Volné antokyany reagují, přičemž vzniká velké množství barvivo-třísloviných komplexů a současně se přetvářejí bezbarvé polyfenoly na barevné látky. Tímto způsobem dochází u vín k sekundárnímu vytváření barvy (Steidl a Renner, 2003). 4.6 Aromatické látky Aromatické látky jsou snadno těkavé a způsobují typickou chuť a především vůni vín. V současnosti je známo takových látek asi 800 (Kraus a kol., 2008). Převážně se nacházejí ve slupce bobulí. Patří zde některé estery, aldehydy, acetaly, vyšší alkoholy apod. (Kraus a kol., 1997). Za nejvýznamnější aromatické látky ve víně považujeme etylacetát, izoamylacetát a etylformiát (Kraus a kol., 2008). Jejich množství ve slupce kolísá v závislosti na podmínkách prostředí a kultivaru. (Švejcar, 1986). V ranějším stádiu dozrávání hroznů se aromatické látky nejsou schopny projevovat, jelikož jsou vázané na kyselinu vinnou. Postupem zrání však jejich obsah narůstá (Kuttelvašer, 2003). V současnosti rozlišujeme čtyři typy aroma: 1. primární aroma aromatické látky se nacházejí v nepoškozených částech bobule 2. sekundární aroma aromatické látky, které se vytvářejí při zpracování hroznů nebo při chemicko-enzymatických, chemických či tepelných reakcích v révovém moštu 3. kvasný buket aromatické látky, které se vytvářejí během alkoholového kvašení 4. buket vznikající při zrání vína je způsobován chemickými reakcemi v průběhu zrání vína v láhvi (Pavloušek, 2005) 4.7 Třísloviny Třísloviny jsou polyhydroxyfenoly o různé velikosti molekul. Jejich charakteristickou vlastností je mírně kyselá, svíravá chuť. Vesměs jsou to bezbarvé amorfní látky, které se 28

29 snadno rozpouští ve vodě. Třísloviny přiřazujeme k fenolovým sloučeninám. Dělíme je na hydrolyzované a kondenzované taniny (Švejcar, 1986; Kraus a kol., 1997). Třísloviny se nacházejí v různých částech hroznů, v třapinách, semenech i slupkách, odkud se dostávají do vína (Kraus a kol., 1997). Dalším zdrojem tříslovin ve víně jsou dubové sudy, případně se jedná o taniny, které se přidávají při čeření. Vyšší obsah tříslovin mají vína červená. Jejich obvyklý obsah je 1 až 2 g/l. Bílá vína, která byla lisována rychle a opatrně, jich mají měně, okolo 0,2 g/l. Třísloviny pak zůstávají v matolinách (Richter, 2002). 4.8 Enzymy Enzymy jsou významné biokatalyzátory, vyskytující se ve slupce a dužině hroznových bobulí. Kromě těchto přirozeně vyskytujících enzymů, můžeme u vína nalézt také enzymy produkované kvasinkami během fermentace (Švejcar, 1986). Z nejvýznamnějších enzymů nacházejících se ve víně můžeme zmínit například oxidoreduktázy, hydrolázy a polyfenoloxidázy (Steidl a Leindl, 2003). Množství enzymů ve víně se dá velmi jednoduše ovlivnit rychlým lisováním s minimálním přístupem vzduchu nebo zvýšením teploty (Steidl a Leindl, 2003). U botrytických a nevyzrálých hroznů se může vyskytnout vyšší množství polyfenoloxidáz. Ty je nutné okamžitými technologickými zásahy odstranit (Švejcar, 1986). 4.9 Pektiny Pektiny jsou z chemického hlediska deriváty polygalakturonové kyseliny, jejíž karboxylové skupiny jsou esterifikovány metanolem. Ve šťávě z hroznů se nachází pouze v množství okolo 1 až 2 g/l (Kraus a kol., 1997). Pektin má ve víně funkci ochranného koloidu a ztěžuje tak koagulaci kalů, čiření a filtraci vína, což může mít i velmi negativní důsledky (Švejcar, 1986). Ve vinařské technologii je žádoucí, aby obsah pektinu byl co nejnižší, proto se využívá řady pektinolytických preparátů, které rozrušují protopektin a jeho nadbytek tím eliminují (Richter, 2002). Při odbourávání pektinů vzniká kromě jiných látek i malé množství metanolu, zvláště pokud se jedná o vína nakvašované s třapinami a druháky (Kraus a kol., 1997). 29

30 4.10 Dusíkaté látky K dusíkatým látkám ve víně patří aminokyseliny, peptidy, v menší míře pak bílkoviny, amonné soli, aminy a dusičnany (Richter, 2002). Celkový dusík ve víně se pohybuje od 0,1 do 0,35 % (Uhrová, 2002). Dusíkaté látky se dostávají do vína především z vinných hroznů, kde jsou rozmístěny nerovnoměrně. Nejvíce se jich nachází ve vnějších vrstvách slupky (Švejcar, 1986). Dusíkaté látky pravděpodobně zodpovídají za plnost vína a jeho stabilitu. Jejich syntéza je v bobulích ovlivňována především klimatickými podmínkami během vegetace. Horké a suché počasí v době od změkání do sklizně zvyšuje obsah bílkovin v bobulích a snižuje množství volných aminokyselin (Pavloušek, 2005). V 1 litru hroznové šťávy nalezneme asi 0,2 až 1,4 g dusíku, kvašením je jeho obsah rapidně redukován (až o 75 %), ovšem následnou autolýzou kvasinek opět narůstá (Richter, 2002). Za snížený obsah dusíkatých látek v hroznech vinné révy zodpovídá i Botrytis cinerea (Plíseň šedá), která je využívá pro stavbu svých buněk. Dalším nebezpečím týkajícím se výskytu dusíkatých látek je případný nadměrný obsah biogenních aminů v červených vínech. Nejvýznamnější roli hraje histamin. Histamin přijímaný ve vysokých dávkách může vyvolat bolesti hlavy a celkovou nevolnost (Richter, 2002; Švejcar, 1986). Běžně se vyskytuje ve vínech v množství nepřevyšující 1 g/l, ovšem množství nad 20 g/l je již alarmující (Salfellner, 1992). V některých vínech se můžeme setkat s vyšším obsahem tyraminu, biogenního aminu zvyšujícího krevní tlak. Naše vína mají přibližně 0,04 až 0,36 mg tyraminu na 100 ml (Richter, 2002) Vitamíny Obsah vitamínů ve víně závisí především na odrůdě hroznů. Obecně můžeme ovšem konstatovat, že mnoho vitamínů neobsahují. Významnější obsah vitamínů nalézáme jen v čerstvých hroznech (Richter, 2002). Technologickým zpracováním přechází do moštu pouze část vitamínů, zbytek zůstane nevyužit v matolinách. Vitamíny se také mohou účastnit procesu fermentace (Švejcar, 1986). V hroznovém víně nacházíme především vitamíny hydrofilní. V dužině bobulí nalezneme vitamín B 1 (thiamin), který tak má nepřímo vliv na lidské zdraví, jelikož jeho dostatek v dužině snižuje nutnost nadměrného síření vína (Richter, 2002). Obsah vitamínu B 1, stejně jako vitamínu B 2 (riboflavin), je vyšší ve vínech červených (Švějcar, 30

31 1986). Obsah vitamínu B 1 se pohybuje okolo 7 až 10 mg/l a vitamínu B 2, který ovlivňuje průběh alkoholového kvašení, pak ještě o něco výše okolo 0,5 mg/l (Hlúbik a Opltová, 2004). Kyselina panthotenová, nebo-li vitamín B 5, spolupůsobí na správném průběhu fermentace. Její obsah se kvašením výrazně snižuje až na 1,2 mg/l (Velíšek, 2002). Pyridoxin (vitamín B 6 ) se podílí na průběhu metabolismu aminokyselin během alkoholického kvašení, proto je přítomen v množství okolo 0,5 mg/l, což kryje jednu třetinu naší denní potřeby (Richter, 2002). Dalším vitamínem skupiny B je kobalamin (vitamín B 12 ) na jehož obsahu ve víně se významně podílí kvasinky (Švějcar, 1986). Jeho obsah se pohybuje od 0,05 do 0,16 mg/l (Hlúbik a Opltová, 2004). Mezi další hydrofilní vitamíny nacházející se ve víně patří biotin (Vitamín H). Jeho obsah kolísá okolo 5 mg/l (Richter, 2002). Vitamín C (kyselina askorbová) má významné redukční vlastnosti, kterých se využívá při konzervaci vína, podobně jako oxid siřičitý. Kromě bobulí hroznů jej obsahují i slupky a stonky vinné révy. Je-li víno zpracováno dobře, obsahuje až 10 mg tohoto vitamínu v 1 litru, tj. 13 % denního množství (Richter, 2002). Kyselina listová (vitamín M) je také složkou jak vinných hroznů, tak vína, ovšem její obsah se během zpracování hroznů na víno nemění (Švejcar, 1986) Minerální látky Minerální látky se do vína dostávají z půdy. Víno se může i během technologického procesu výroby o minerální látky obohacovat a to obzvláště během zpracování a ležení vína. Naopak operace jako kvašení a školení vína nápoj o minerální látky ochuzují (Švejcar, 1986; Richter, 2002). Obsah popela ve víně kolísá mezi 1,5 až 3,0 g/l, jelikož část minerálních látek spotřebují kvasinky a vápník se tvorbou vinného kamene ztrácí. Nezkvašený mošt tedy obsahuje minerálních látek více. Množství popela ve víně také závisí výraznou měrou na agrotechnice (Pavloušek, 2006; Richter, 2002; Salfellner, 1992). Minerální látky obsažené ve víně můžeme rozdělit do tří skupin podle jejich kvantitativního zastoupení: 1. s obsahem větším jak 0,1 g/l ionty draslíku, hořčíku, vápníku, sodíku, chl ru, uhličitany, fosforečnany, sírany 2. s obsahem jen několika mg/l ionty železa, b ru, křemínku, manganu, zinku 31

32 3. s obsahem menším než 1 mg/l ionty hliníku, mědi, rubidia, fosforu, vanadu, j du, titanu, kobaltu, stroncia, arzenu, olova, kadmia, molybdenu, chromu, niklu, ad. (Švejcar, 1986) Tab. 3 Průměrný obsah minerálních látek v hroznech vinné révy v mg/100 g čerstvé hmoty (Uhrová, 2002). Minerální látka Obsah [mg/100 g] Minerální látka Obsah [mg/100 g] sodík 2,2 mangan 0,08 draslík 430 železo 0,47 hořčík 14,1 j d 0,7 vápník 20,7 fosfor 24, Lipidy Tuky jsou z chemického hlediska triacylglyceroly vyšších mastných kyselin. U bobulí vinných hroznů se setkáváme jak s pevnými tak kapalnými tuky. Zdrojem olejů jsou semena bobulí vinné révy a kvasinky vyskytující se na povrchu bobulí (Richter, 2002). Obsah lipidů v semenech zráním hroznů narůstá. Maximálním přípustným limitem jejich obsahu je 18 %. Vysoký obsah tuků ve víně negativně ovlivňuje jeho senzorické vlastnosti, tedy chuť a vůni. Přesto se do vína dostává, což je způsobeno extrakcí semen během nakvášení a autolýzou kvasinek při dokvášení a zrání vína (Švejcar, 1986). Jejich přirozený obsah se tedy ve víně pohybuje v rozmezí od 0,05 do 0,1 g/l (Richter, 2002). Mezi tuhé lipidy patří vosky, které jsou směsí esterů, tvořených mastnými kyselinami a vysokomolekulárními jednosytnými alifatickými alkoholy. Na bobulích vinné révy se nacházejí v podobě políček či zrníček, které chrání bobule před vysycháním nebo naopak smočením vodou. Jejich prvořadý význam ovšem spočívá v ochraně vinné révy před napadením nejrůznějšími druhy mikroorganismů (Švejcar, 1986) Polyfenolické látky Polyfenolické látky jsou nezastupitelnou součástí hroznů vinné révy. Přestože se zde nenacházejí ve velkých množstvích, významně se podílejí na kvalitě budoucího vína. Jsou skupinou látek, která má přednostní postavení u vín vyráběných z modrých odrůd. Vysoký obsah těchto látek v bílých vínech se může podílet na hnědnutí moštů a zvyšování jejich sklonu k oxidaci (Pavloušek, 2005). Fenolické látky ovlivňují u vína 32

33 nejen barvu, ale i jeho aromatické a chuťové vlastnosti, především trpkost, svíravost a hořkost (Ferrer-Gallego a kol., 2011). Obsah polyfenolických látek ve víně je oproti jeho obsahu ve vinných hroznech snížen v důsledku zpracování hroznů a výroby vína, jelikož při všech těchto operacích dochází redukci jejich obsahu až o 40 %, zejména při filtraci (Jones, 1998). K nárůstu jejich obsahu ve víně se využívá zvýšení mikrobiální aktivity v kvasném procesu nebo extrakce těchto látek ze sudů. Další možností je zařadit do technologického postupu nakvášení, to je ovšem možné pouze u moštů pro výrobu červených vín (Li a kol., 2011). Složení a obsah fenolických látek ve víně se mění s řadou faktorů, například odrůdou, stupněm zralosti, podnebím, půdou, místem pěstování révy apod. (Ivanova a kol., 2011). Samozřejmě se na fenolickém složení podílí také samotná vinařská technologie (doba macerace, teplota, intenzita lisování, použité kvasinky a pektolytické enzymy, obsah alkoholu, zasíření) (Paixão a kol., 2007; Soleas a kol., 1997). Ve vinařské praxi se můžeme setkat s termínem fenolická zralost hroznů, která posuzuje obsah polyfenolických látek v semenech, slupce a dužině. Ukazately fenolické zralosti jsou stáří a zbarvení semen a chuťové vlastnosti slupky (Burin a kol., 2010; Pavloušek, 2007). Množství polyfenolických látek ve víně můžeme kvantifikovat v jednotkách fenolového standardu, který sjednocuje jednotlivé způsoby reprodukce analytických výsledků. Nejčastěji se výsledky vztahují na standard kyseliny gallové, z anglické zkratky GAE (gallic acid equivalents) (Zoecklein a Fugelsang, 1999). Obsah zdravotně prospěšných fenolických látek v červeném víně se pohybuje na úrovni 800 až 4000 mg/l, v bílém víně je několikanásobně nižší, v rozmezí pouze 200 až 500 mg/l (Kraus, 2005). Polyfenoly se mohou nacházet v různých částech vinných hroznů, zejména ve slupce, těsně pod ní, v semenech a u některých odrůd také v dužině ( barvířky ) (Pavloušek, 2005). Skupiny polyfenolických látek obsažené v hroznech se mohou rozdělovat podle různých kritérií. Jedním z nich je třídění na látky flavonoidní a neflavonoidní povahy. Neflavonoidní látky identifikované především v dřeni se nacházejí v hroznové šťávě ve větším množství. Je to způsobeno tím, že flavonoidní látky se do hroznového moštu dostávají až výluhem ze slupek a jader (Zoecklein a Fugelsang, 1999). Mezi nejčastěji identifikované polyfenolické látky ve víně patří skupiny látek jako fenolové kyseliny, stilbeny, antokyany a flavanoly a jejich zástupci jako kyselina 33

34 gallová, kyselina ferulová, kvercetin, myricetin, katechin, epikatechin, delfinin, kyanidin a resveratrol (Saura-Calixto a Díaz-Rubio, 2007). Látky jako tanniny a kondenzované tanniny se do vína dostávají přímo z hroznů a jejich obsah se ve víně již nemění. Další polyfenolické látky jako antokyany, flavanoly a fenolové kyseliny se dostávají do moštu, ze kterého se vyrábějí vína, pouhou extrakcí z hroznů. Tento způsob však není jediný, který by měl za následek vznik polyfenolických látek (Cheynier, 2006). Polyfenoly se tvoří také při mikrobiálním kvašení, kdy vznikají katechol a protokatechová kyselina v procesu metabolismu kyseliny benzoové, šikimové a skořicové. Možností jak víno získá fenolické látky je mnoho. Jednou z nich je výluh těchto látek z dubových sudů, kde víno zraje. Takováto vína nesou označení Barrique a vyznačují se typickou chutí a aroma (Ala n, 2011). Senzorické vlastnosti vína se vytváří během procesu stárnutí vína, který ovlivňuje i obsah a zastoupení fenolických látek (Cheynier, 2006). 34

35 5 TECHNOLOGIE VÝROBY VÍNA Technologie výroby vína je pravděpodobně nejstarší odvětví biotechnologie vůbec. První zmínky o výrobě vína pocházejí z doby před lety z oblasti dnešní Gruzie a Arménie. Později se víno díky rozsáhlému obchodu rozšířilo i do dalších částí světa, o čemž svědčí i mnoho archeologických nálezů. Příkladem mohou být džbány s vínem datované do 5. století př. n. l. Samozřejmě si tehdejší víno nesmíme spojovat s tím, jak jej známe dnes. Během vývoje technologie výroby vína se výrazně změnily požadavky na barvu, chuť, konzistenci, ale také na technologické vybavení a postupy vedoucí k jeho přípravě. Moderní výrobní postupy přípravy bílého a červeného vína lze rozdělit do dvou základních větví. Přestože je většina operací výroby obdobná, lze zde nalézt i řadu odlišností. Bílé víno na rozdíl od červeného se vyznačuje velkým podílem aromatických látek, u červeného vína je upřednostňován spíše vyšší obsah polyfenolických látek, které se podílejí na jeho barvě. (Kraus a kol., 2008). V technologii přípravy červeného vína se z modrých hroznů musejí získat polyfenoly ze slupek bobulí. Po narušení buněk slupek přechází polyfenoly do moštu. K narušení buněk bobulí se využívá teploty, působení alkoholu nebo mechanické narušení. Třetí způsob je značně neekonomický a zvyšuje množství kalu, který je nutno v následujících operacích odstranit. Kromě metody kvašení rmutu můžeme u červeného vína využít i termovinifikaci (ohřev rmutu) nebo moderní postupy kvašení a vyluhování, jako jsou macerace oxidem uhličitým, studená macerace nebo expanzní praskání buněk, tzv. cellcracking (Kraus a kol., 2008). Veškeré operace výroby červeného vína jsou tedy zaměřeny na extrakci polyfenolických látek a jejich následné udržení ve víně (Kraus a kol., 2008). Další odlišností technologie výroby je proces nakvášení, který nemusí být u výroby bílého vína zařazen. Dochází k němu v dřevěných kádích, kde se vyluhuje červené barvivo ze slupek a třísloviny z jader hroznů, čímž se vytváří typická natrpklá chuť červených vín (Mottl, 1999). Po nakvášení a náležitém dokvašování proběhne první stáčení. Druhé stáčení a školení se provádí stejným způsobem jako jako u bílých vín (Kraus a kol., 2008). Mezistupněm výroby bílých a červených vín je víno s označením klaret, které vzniká rychlým kvašením modrých hroznů bez předchozího nakvášení (Rop a Hrabě, 2009). 35

36 Výroba vína zahrnuje tyto technologické postupy: 1. drcení hroznů a příprava rmutu 2. lisování rmutu 3. úprava moštu před kvašením 4. kvašení moštu 5. školení vína 6. lahvování (Kraus a kol., 2008) 5.1 Drcení hroznů a příprava rmutu Po sběru hroznů je nutné v týž den začít surovinu zpracovávat, abychom zabránili jejímu zapaření a znehodnocení pomnožením nežádoucí mikrofl ry (Hubáček, 1996). V první fázi se provede drcení hroznů tzv. rmutování (Rop a Hrabě, 2009). Při drcení je úkolem zajistit, aby každá bobule praskla, ovšem nedošlo k rozmačkání třepiny, z níž by do rmutu přešla i nežádoucí šťáva obsahující chlorofyl a třísloviny. Obě tyto látky zhoršují kvalitu budoucího vína a podílejí se na vytvoření travnaté příchuti (Kraus a kol., 2000). K drcení a odzrnění hroznů používáme velmi sofistikovaných typů drtičů, tzv. mlýnkoodrzňovačů (Švejcar, 1986). Drcení hroznů má ovšem i řadu nevýhod, například zvyšování množství kalů v moštu, nižší obsah polyfenolů a zhoršení výsledné kvality vína. Proto se může od drcení hroznů upouštět a využívat následujících metod: 1. lisování mírně narušených hroznů využívají jej větší vinařské podniky. Vinné hrozny jsou naskladněny do sklizňových vozů, v jejichž spodní části jsou umístěné spirálovité šroubovice, které při otáčení umožňují spád mírně podrcených hroznů přímo do lisu. Další možností jak získat mírně narušené hrozny je využití vlečných vozů, které vyskladní hrozny na příjmovou plachtu, z níž jsou odstraňovány šnekovým dopravníkem do lisu. Při plnění lisu v této fázi odtéká samotok (Spence, 2002), který se mísí následně s vylisovaným moštem a výsledný produkt má širší paletu aromatických látek, více kalu a vyšší obsah polyfenolů (Kraus a kol., 2008). Samotok je možné i samostatně zpracovat na lehká, lahodná a odrůdově čistá vína. Často se také používá pro výrobu šumivých vín (Michlovský a kol., 2005). 36

37 2. lisování celých bobulí tato metoda snižuje výtěžnost moštu. Bobule praskají až v lisu. Využívá se u zpracování ledového vína, či vína napadeného šedou plísní. 3. lisování rozdrcených hroznů bez odzrňování tato metoda byla v minulosti velmi oblíbená, dnes se využívá pouze výjimečně. Prováděla se sešlapováním hroznů nohama, popřípadě pomocí mlýnků s rýhovanými dřevěnými válci. Tímto postupem se do moštu dostalo ovšem velké množství kalů, polyfenolických a hořkých látek (Kraus a kol., 2008). U tvrdších červených vín je drcení hroznů a nakvášení drtě nedílnou součástí výrobního procesu. Docílí se tak zvýšení obsahu tříslovin u modrých odrůd s jemnou slupkou a nižším obsahem tříslovin. U bílých vín má tento postup za následek zvýšení koncentrace tříslovin, čehož se v Gruzii využívá k jejich zakonzervování (Kraus a kol., 2008). 5.2 Nakvašování rmutu Pouze v případě červených vín následuje po drcení hroznů proces nakvašování. Bílá vína se po rmutování okamžitě lisují. Výjimkou jsou pouze některé bílé aromatické, muškátové a kořeněné odrůdy (Kraus a kol., 2000), které se za účelem uvolnění aromatických látek nechávají nakvášet hodin. Nejdůležitějšími parametry pro nakvášení rmutu jsou nakvašovací teplota, optimální zralost hroznů a jejich zdravotní stav. Proces nakvašování trvá v průměru 6 20 hodin, v závislosti na teplotě (Kraus a kol., 2000). Maximální délka nakvášení je 8 10 dní. Při překročení této doby víno získává nepříjemnou chuť, hnědou barvu a dochází u něj k octovému kvašení (Rop a Hrabě, 2009). Optimální teplota se pohybuje v rozmezí C (Mottl, 1999). Při nakvášení dochází činností kvasinek k tvorbě etanolu a oxidu uhličitého, který s sebou napovrch strhává nečistoty a vytváří tak vrstvu, kterou nazýváme matolinový klobouk (koláč). Na povrchu klobouku dochází ke styku se vzdušným kyslíkem, což vyvolá octové kvašení, jež je v tomto případě nežádoucí (Kraus a kol., 2008). Z toho důvodu se musí matolinový klobouk v pravidelných intervalech zanořovat do kvasícího rmutu, průměrně dvakrát až třikrát denně, aby se z něj vyextrahovaly potřebné třísloviny a barviva (Edwards, 2001). Známo je mnoho způsobů nakvašování. Lze je rozdělit do několika skupin podle způsobu ponořování klobouku do rmutu na: 1. nakvašování v otevřených nádobách s volně plujícím kloboukem 37

38 2. kvašení v otevřených nádobách s ponořeným kloboukem 3. kvašení v uzavřených nádobách s ponořeným kloboukem 4. uvolňování barviv teplou cestou pomocí zahřátého rmutu nad 60 C 5. kvašení přes čtyři, kdy se ke rmutu přidá tolik červeného vína, aby se zvýšil obsah alkoholu nad 4 obj. %, což značně uspíší uvolňování barviv (Kuttelvašer, 2003) Nakvašování můžeme kombinovat s ošetřením rmutu pektolytickými enzymy, což následně usnadní proces lisování, zvýší výtěžnost moštu, zlepší filtrovatelnost vína a současně jeho barvu a vůni (Hubáček, 1996). 5.3 Lisování rmutu Úkolem lisování je oddělení šťávy uvolněné z buněk předchozími technologickými postupy. Stupeň vylisování závisí na typu lisu, použitém způsobu lisování, stupni zralosti hroznů a jejich odrůdě, konzistenci rmutu, která závisí na stupni odzrnění apod. (Kraus a kol., 2000; Švejcar, 1986). Princip lisování spočívá v tom, že nejprve dochází k uvolňování vzduchu a poté části šťávy. Postupným zvyšováním tlaku se zmenšuje objem lisovaného materiálu a zvyšuje odtok kapalné fáze, kterou je mošt. Lisovaný mošt odtéká otvory v koši lisu (Švejcar, 1986). Nutností pro zajištění kontinuálního odtoku moštu a dokonalého vylisování je přerušovat v určitých intervalech tlak (Kraus a kol., 2008). Existuje celá řada lisů, které můžeme dělit podle různých hledisek na: 1. dělení lisů podle způsobu práce: a. lisy s plynulým postupem práce (šnekové a pásové lisy) b. lisy s přerušovaným způsobem práce c. s poloplynulým způsobem práce (pneumatické lisy) 2. dělení lisů s přerušovaným způsobem práce podle orientace koše: a. vertikální lis b. horizontální lis 3. dělení lisů s přerušovaným způsobem práce podle způsobu vytváření tlaku: a. mechanický lis b. hydraulický lis c. samotížný lis (Steidl a kol., 2002) 38

39 d. pneumatický lis (Švejcar, 1986) 5.4 Úprava moštu před kvašením Úprava moštu pro kvasný proces zahrnuje tři základní operace, kterými jsou odkalování, úprava cukernatosti a úprava kyselosti (Kraus a kol., 2008). Cílem odkalování moštu je odstranit mechanické nečistoty, chemické přípravky, kterými byly ošetřeny plody během vegetace a především kalové látky, jako jsou úlomky slupek, třepin, peciček a zbytky dužiny, z nichž se tak nemohou vylouhovat nežádoucí látky (Kraus a kol., 2000). Důležité je vyvarovat se příliš silného odkalení, při němž by došlo k velkým ztrátám aromatických látek (Malík, 2003). V praxi se používají dva způsoby odkalování: 1. statické statické odkalování se provádí pomocí dekantace metodou přisíření nebo zchlazení na teplotu 4 8 C. Ke zlepšení dekantace se do moštu přidává moštová želatina ( ml/hl) nebo moštový bentonit (100 g/hl) nebo jiná čiřidla. Celý proces probíhá asi hodin. 2. dynamické dynamické odkalování se používá ve velkých výrobních podnicích. Metodicky se použije odstřeďování, filtrace a flotace. Ke zpevnění plovoucího kalu se do moštu odkaleného flotací přidává bentonit. Tento způsob odkalování s sebou nese řadu nevýhod. Jednou z nich je únik kvalitativních složek vína, což zhoršuje jeho senzorické vlastnosti (Kraus a kol., 2008). Stáhnuté kaly, které mohou tvořit % původního objemu, samostatně prokvasíme a získáme tím méně kvalitní víno (Malík, 2003). Úprava cukernatosti moštu spočívá ve zvýšení obsahu cukru. U přívlastkových vín na celém území České republiky je zakázáno cukernatost vína ovlivňovat. U bílých stolních vín je maximální povolenou hladinou 21 NM. Tedy zvýšení o 7 NM. Přepočtem tedy na 1 hl moštu 1,1 kg řepného cukru. Možné je také upravovat cukernatost pomocí přídavku sachar zy, zahuštěného hroznového moštu, rektifikovaného moštového koncentrátu do moštu nebo do rmutu. K měření cukernatosti se používá dvou typů moštoměrů Klosterneuburského (zvýšení o 1 KMW se dosáhne přídavkem 1,3 kg cukru) a Oechslova (zvýšení o 1 Oe se dosáhne přídavkem 0,25 kg cukru) (Kraus a kol., 2008). 39

40 Úprava kyselosti se týká pouze moštů nepříznivých ročníků, kdy se v moštu může vyskytnout i nadměrný obsah kyselin (Malík, 2003). Pokud došlo ke zvýšení obsahu kyselin nad hranici 10 g/l použije se k jeho snížení uhličitan vápenatý. Při odkyselování dochází pouze k odstraňování kyseliny vinné, přičemž se zvyšuje ph moštu. Obsah kyseliny vinné se snižuje maximálně o jednu třetinu, tedy na 6 7 g/l (Feldkamp, 2003). Pokud dojde k opačnému případu a vína jsou příliš málo kyselá (pod 0,4 g/l), můžeme kyselinu vinnou dodávat. Protože takováto vína jsou nevýrazná, neharmonická, rychle stárnou a jsou vysoce náchylná k bakteriálním onemocněním (Kraus a kol., 2008). 5.5 Kvašení moštu Kvašení je složitý enzymatický proces, při němž se gluk za a frukt za přeměňují na etanol, oxid uhličitý a vedlejší produkty kvašení (glycerol, kyselina mléčná, kyselina octová, vyšší alkoholy, metanol). Celý průběh alkoholové fermentace závisí na teplotě, složení kvasné mikrofl ry, použitých kmenech kvasinek apod. (Rop a Hrabě, 2009). Maximální koncentrace alkoholu, kterou lze při alkoholovém kvašení dosáhnout je obj. % (Michlovský a kol., 2005). Vzniklý etanol se využívá z mikrobiologického hlediska ke konzervačnímu účelu. Část vzniklého alkoholu se oxiduje, část se spotřebuje v procesu zrání vína při tvorbě sekundárního buketu. Nadměrná koncentrace alkoholu je pro kvasinky limitujícím faktorem a nedochází tak k jejich rozmnožování ani k fermentačnímu procesu (Malík, 2003). Oxid uhličitý zlepšuje senzorické vlastnosti mladého vína s vyšším obsahem kyselin. Na senzorických vlastnostech vína, plnosti, viskozitě a měkkosti, se také podílí glycerol, který vzniká na počátku kvasného procesu (Malík, 2003). Na kvasném procesu se podílí kmeny kvasinek Saccharomysces cerevisce var. vini, ale také Saccharomyces oviformis (Dudaš a kol., 1981). Souhrnně je označujeme jako čisté kultury kvasinek. Optimální teplota, při níž vinné kvasinky pracují, se pohybuje v rozmezí C (Kraus a kol., 2000). Teplota spontánního kvašení se pohybuje velmi vysoko okolo 25 C, čímž ale dochází ke ztrátě aromatických látek, přemnožení octových bakterií, rychlému ukončení kvasu. Optimální teplota je tedy okolo 20 C. Při chladném kvašení se teplota pohybuje od 12 do 18 C, využijeme proto speciálních čistých kultur kvasinek pro studené kvašení. Při řízeném kvašení se teplota pohybuje od 20 do 22 C. (Michlovský a kol., 2005). Vyjma teploty kvašení hraje při kvasícím 40

41 procesu také roli ph prostředí. Ideálním ph se pohybuje od 3,5 do 4 (Kuttelvašer, 2003). Předcházející zasíření moštu zabraňuje jeho napadení různými druhy kvasinek. Nejznámější jsou tzv. divoké kvasinky (Candida, Metschnikowia, Hansenula, Pichia a Klockera), které jsou schopny vyprodukovat až 2 g/l kyseliny octové. Nežádoucí jsou ve víně i křísové kvasinky, které se množí v přítomnosti kyslíku na hladině vín s nižším obsahem alkoholu a škodí jim (Michlovský a kol., 2005; Steidel a Renner, 2004). Počátek kvasného procesu je doprovázen vznikem rozkvašeného moštu, kterého známe pod názvem burčák. Jedná se o silně zakalenou mléčně zelenou vinnou šťávu, která obsahuje velké množství cukru (cca do 5 %) (Sedláček a Kočí, 2003). Kvašení je ukončeno v době, kdy se dosáhne minimální koncentrace tzv. nezkvasitelného cukru (Kraus a kol., 2008). 5.6 Školení vína U červených vín se mošt po vylisování stáčí a kvasničný kal a úlomky rmutu rychle sedimentují. Jakmile je sedimentace ukončena víno se stočí znovu. Dokud je víno teplé, nastartuje se proces biologického odbourávání kyseliny jablečné. Buď se rozvine samovolně, nebo je nutné přidání kmene mléčných bakterií Oenococcus oeni. Biologické odbourávání je ukončeno, až je veškerá kyselina jablečná odstraněna. Při rozkladu kyseliny jablečné v procesu jablečno-mléčného kvašení dochází kromě kyseliny mléčné také k vzniku diacetylu, který vytváří máslové aroma, jež není příjemné (Michlovský a kol., 2005). Proto po ukončení procesu jablečného kvašení následují dva týdny provzdušňování. Po ukončení jablečno-mléčného kvašení nastává školení vína (Kraus a kol., 2008). U bílého vína dochází po ukončení kvasného procesu ke školení ihned (Michlovský a kol., 2005). Pod pojmem školení vína si představme operace jako zlepšování, uchování jeho vlastností, úprava jeho kvality scelováním, síření, čiření vína, jeho stabilizace, filtrace apod. (Malík, 2003). V případě metody síření vína se využívá stabilizačního účinku oxidu siřičitého, který se může použít v různých fázích výroby (Malík, 2003). Síření pomáhá vytvářet víno, udržovat ho ve svěžím a zdravém stavu. Podílí se příznivě na tvorbě buketu i chuťových vlastností budoucího vína, ovlivňuje jeho jakost a stabilitu (Kraus a kol., 2000). Oxid siřičitý se navíc vyznačuje bakteriocidními a fungicidními účinky, proto usměrňuje průběh kvašení a potlačuje rozvoj nežádoucí mikrofl ry (Kraus a kol., 2008). 41

42 Maximální povolené množství oxidu siřičitého ve víně je 40 mg volného a 200 mg celkového v jednom litru (Uhrová, 2002). Zlepšování vína se provádí především scelováním, tj. mícháním vín vhodného složení se záměrem dosáhnout vína s požadovanými vlastnostmi. Částečných úprav hroznového vína dosáhneme úpravou obsahu cukru, kyselosti, v některých případech i barvou, obsahem alkoholu a oxidu uhličitého (Kraus a kol., 2008). Scelovaním chceme dosáhnout harmonie jednotlivých složek, kyselin, cukru, alkoholu a extraktu. Nikdy nesmíme scelovat vína, která jsou napadena chorobami, či mají odlišný charakter. Optimální doba pro scelování je při stáčení vín, protože pak dochází k lepšímu spojení charakteristických vlastností obou vín, víno se rychleji čistí a lépe vyzrává (Kraus a kol., 2008). Při skladování dochází k samovolnému čiření vína, ovšem tento poměrně zdlouhavý proces může vést až k nežádoucím změnám kvality produktu. Jako náhrada samovolného čiření se používají čiřící prostředky, které musí ovšem splňovat požadavky na zdravotní nezávadnost, chemickou neutralitu a sorpční schopnosti. Intenzitu čiření ovlivňují teplota a kyselost vína. Optimální hodnoty ph jsou 2,8 3,2 a teplota do 25 C. Čiřící prostředky se dají rozdělit do dvou kategorií a to na: 1. čiřidla s kladným elektrickým nábojem vaječný bílek (k čiření jemných červených vín), želatina (nejběžnější prostředek, používá se ve spojení s gaminem) apod. 2. čiřidla se záporným elektrickým nábojem tanin (může být příčinou pozdějších zákalů), mléko, kasein, aktivní uhlí (používají se nejčastěji k odstraňování vad chuti), odtučněné mléko (nutno předem vyzkoušet na vzorcích vína), bentonit (odstraňuje z vína především termolabilní bílkoviny), kaolín, křemičitá sůl apod. (Uhrová, 2002). Stabilizace vína se provádí za účelem odstranění zákalů. Musí se provést způsobem, který nezmění kvalitu a odrůdový charakter hroznového vína. Ve víně nalézáme celou řadu zákalů, např. bílkovinný, tvořený dusíkatými látkami, kovové zákaly, krystalické zákaly atd. (Malík, 2003). Poslední úpravou vína je filtrace, při níž se také odstraní zákal a získá se jiskrnost vína. Filtraci ovlivňují především filtrační materiál a použité zařízení (Kraus a kol., 2008). Využíváme buď filtraci průtokovou, nebo filtraci s adsorpčním účinkem filtračního materiálu. Nejpoužívanější druhy filtrů jsou vakuový rotační filtr, tlakový 42

43 filtr a cross-flow filtr (ostrá filtrace za vzniku sterilního moštu). Jako filtrační materiál se ve vinařské technologii používá celul za, křemelina a perlit (Trioli a Holmann, 2009). Při stabilizaci vína můžeme také využít činnosti enzymů mikroorganismů jako je například lakáza z Polyporus versicolor, která je po třech hodinách schopna odstranit až 70 % katechinů a 90 % antokyanů (Kvasničková, 2011). 5.7 Lahvování Lahvování je významným krokem v technologii výroby vína. Zabezpečuje především jeho kvalitu, kterou víno dosáhlo při zrání v sudech. Původní odrůdový a kvasný buket mladých vín se postupně mění zráním na buket zralých vín, který ukazuje na lahvovou zralost. Optimum kvality dosahuje víno při dosažení vrcholu lahvové zralosti, kdy se dotvoří chuť sušeného ovoce a povidel, které přecházejí v chutě karamelu a pečiva. Po jeho překročení se aromatické a chuťové vjemy postupně zhoršují (Kuttervašer, 2003). Pro lahvování jsou vhodná především vína vyškolená, jiskrná a stabilizovaná. Kvalita vína po nalahvování závisí kromě použitých materiálů sklenic, také na použitých typech uzávěrů (Malík, 2003). Nabízí se více možností, například přírodní korek, lisovaný korek, plastová zátka, korunkový uzávěr a šroubovací uzávěr, který je běžný ve Švýcarsku (Steidl a kol., 2002). Nejvhodnější materiál pro uzavírání vinných lahví je korek. Korek si svými vlastnostmi, kterými jsou nízká hustota, nízká propustnost tekutin, schopnost držet se povrchu skla, stlačitelnost, odolnost, pružnost, chemická inertnost, mikrobiální odolnost, získal majoritní podíl mezi materiály používanými k uzavírání lahví (Fernandes a kol., 2011). Délka korkové zátky určuje pro jaká vína je uzávěr určen. Archivní vína mají korkovou zátku dlouhou okolo 7 cm, na rozdíl od běžných vín, která mají korek dlouhý pouze od 26 do 40 mm. Ze stavu korkové zátky usuzujeme také kvalitu vína (Sedláček a Kočí, 2003). Klobouček (záklopka, čepička) není povinný, ale kvalitní vína by ho měla mít (Sedláček a Kočí, 2003). Po nalahvování vína následuje proces etiketování. Přičemž musí být splněny všechny požadavky správného označování výrobků odpovídající platné normě (Malík, 2003). Víno v lahvích dále zraje a díky malým stopám kyslíku urychluje i jeho proces stárnutí, při kterém se tvoří žlutohnědavé až hnědavé odstíny (Kuttervašer, 2003). 43

44 6 PŘEHLED MODERNÍCH SEPARAČNÍCH METOD 6.1 Extrakční techniky Nadkritická fluidní extrakce Nadkritická fluidní extrakce (Supercritical Fluid Extraction SFE) je jedna z nejběžněji užívaných extrakčních technik vhodná pro analýzu a přípravu vzorku, která využívá nadkritickou tekutinu (Xu a kol., 2011). Definicí nadkritických tekutin je sloučenina, jež se nachází nad svým kritickým tlakem (P c ) a kritickou teplotou (T c ). Z fyzikálně-chemického hlediska se nejedná o plyn ani kapalinu, pouze jakýsi přechod mezi těmito skupenskými stavy. Díky této skutečnosti získávají nadkritické tekutiny mnoho význačných vlastností, jako jsou vysoká hustota a vysoká solvatační schopnost. V nadkritickém stavu mají tekutiny také velmi nízkou viskozitu, vysokou difuzitu a postrádáme u nich povrchové napětí, což jim umožňuje lépe pronikat tuhou hmotou (Poustka, 2007). Změnami podmínek extrakce (teplota, tlak, přídavek modifikačních látek alkoholy, acetonitril, hexan, kyselina mravenčí) lze měnit jednotlivé výstupy extrakce a to jak solvatační sílu, extrakční výtěžnost, tak selektivitu (Štulík a kol., 2006). Tato metoda, sloužící k zakoncentrování vzorku do malého objemu superkritického rozpouštědla, často využívá oxid uhličitý. Oxid uhličitý jako superkritické rozpouštědlo se vyznačuje těmito parametry: T c = 31,1 C, P c = 7,38 MPa, ρ = 0,469 g/cm 3, M r = 44,01 g/mol (Poustka, 2007). Jedná se o látku chemicky inertní a samozřejmě ji lze z extraktu odstranit následnou dekompresí (Siqueira a kol., 2011). Z potravinářského hlediska je možné využít oxid uhličitý a to pro jeho zdravotní nezávadnost. Ekonomický pohled zohledňuje spíše jeho nízkou cenu a snadnou dostupnost (Klouda, 2003). K dalším nadkritickým tekutinám patří například oxid dusný, amoniak, metanol, etan a acetylen (Ježová a kol., 2005). Původně byla superkritická fluidní extrakce navržena pro pevné vzorky, až později se začala využívat k analýzám kapalných, zejména vodných vzorků (Štulík a kol., 2006). Rozeznáváme u ní dva typy uspořádání statická (extrakční cela je fluidní kapalinou naplněna a systém je ponechán v klidu) a dynamická (přes extrakční celu je čerpána nadkritická kapalina) (Ježová a kol., 2005). Jednou z mnoha výhod této metody je doba jejího trvání. Dříve používané extrakční techniky probíhaly několik hodin, dokonce dní. Superkritická fluidní extrakce zkrátila potřebný čas analýzy až na 44

45 konečných 30 minut. Zařízení pro extrakci superkritickou tekutinou lze následně spojit s kapalinovou, plynovou i nadkritickou fluidní chromatografií (Klouda, 2003) Extrakce urychleným tokem rozpouštědla Extrakce urychleným tokem rozpouštědla (Accelerated Solvent Extraction ASE nebo také Pressurized Liquid Extraction PLE) je extrakční technika, která se odehrává v systému pevná látka kapalina. Celá extrakce probíhá po dobu 5 až 20 minut, při teplotě nad bodem varu samotného rozpouštědla ( C) a vysokém tlaku (10 15 MPa). Pevný vzorek nanesený do extrakčních cel z oceli se extrahuje pomocí organického rozpouštědla za vysoké teploty a tlaku. Nakonec je vzorek vytlačen do sběrné nádoby pomocí inertního plynu, nejčastěji dusíku (Klejdus, 2004; Ghani, 2007; Ježová a kol., 2005). Teplota extrakce významným způsobem ovlivňuje průběh celého procesu, ať už se jedná o snížení viskozity rozpouštědla, tak zvýšení jeho rozpouštěcí kapacity. Teplota urychluje difúzi, snižuje povrchové napětí analytu, matrice i rozpouštědla, což umožní snazší průnik k p rům matrice a analyt může rychleji přecházet do rozpouštědla. (Klejdus, 2004; Ježová a kol., 2005). Druhým faktorem ovlivňující ASE je extrakční tlak, který udržuje rozpouštědlo v kapalné fázi i při vyšších teplotách (Riddellová, 2007). Extrakce urychleným tokem rozpouštědla patří k nejrychlejším, nejekonomičtějším a nejšetrnějším metodám vůbec. Můžeme volit mezi dvěma mody předehřívací a předplnící (Ježová a kol., 2005). ASE slouží k získání hrubého extraktu, proto je nutné za ni zařadit následné předčištění. Kromě ekonomické stránky, přináší tato technika lepší opakovatelnost, nižší spotřebu rozpouštědla a zkrácení doby potřebné na extrakci. Její efektivita se uplatňuje v enviromentální analýze i při extrakci sekundárních metabolitů rostlin, mezi které patří i polyfenolické látky (Ramos a kol., 2002; Riddellová, 2007; Dionex, 2009) Mikrovlnná extrakce Mikrovlnná extrakce (Microwave-Assisted Extraction MAE) na rozdíl od běžných extrakčních technik využívá mikrovlnné energie pro zahřátí média, což významně zkracuje čas extrakce pod 30 někdy i pod 12 minut (Franke a kol., 1996). Kromě zkrácení doby extrakce tato metoda snižuje spotřebu organického rozpouštědla na jednu extrakci pod 40 ml (Liu a kol., 2008). Běžně se používá teplota 40 až 260 C a tlak 2 až 10 MPa. Principiálně zde působí mikrovlny na kapalinu v extrakční cele a pohlcená energie způsobí rozkmitání molekul. 45

46 V MAE se můžeme prakticky setkávat se dvěma systémy uspořádání, otevřeným a uzavřeným. Každý se vyznačuje jinými podmínkami průběhu. V uzavřeném systému extrakce probíhá pod vyšším tlakem i teplotou, což urychluje reakci, ovšem před samotným otevřením mikrovlnného extraktoru je nutné ho vychladit na pokojovou teplotu, což následně extrakční čas vyrovná. Této skutečnosti musí být přizpůsoben i vlastní extraktor, který je nejčastěji vyroben z teflonu. Pro optimalizaci MAE se bere v potaz nejen teplota extrakce, složení extrakčního média, jeho objem, doba průběhu extrakce, ale i charakter vlastní matrice (Klejdus, 2004). Vzhledem ke značné úspoře času a energie, je tato metoda vhodná pro rychlé extrakce a extrakce velkých sérií vzorků (Ganzle a kol., 1986). Dalšími výhodami této metody jsou jednoduchost, větší přesnost, redukce spotřeby rozpouštědla a vyšší výtěžnost ve srovnání s klasickou Soxletovou metodou a extrakcí nadkritickou tekutinou (Hao a kol., 2002; Proestos a Komaitis, 2008) Soxhletova modifikovaná extrakční metoda Jedná se o extrakční metodu získávání organických látek z pevných materiálů pomocí extrakčních rozpouštědel. Klasická Soxhletova metoda využívá k extrakci tzv. Soxhletův extraktor, který pro svou účinnost vyžaduje velké množství rozpouštědla. Doba průběhu extrakce se pohybuje od 1 do 10 hodin. Vzniklý extrakt je následně nutné přečistit (Bielská, 2006). Z tohoto důvodu došlo k modifikaci této metody, která by zkrátila extrakční čas takovým způsobem, aby se mohla tato technika vyrovnat ostatním moderním extrakčním metodám (Luque de Castro a García-Ayuso, 1998). Modifikací byla změno umístění vzorku, který již není extrahován za atmosférického tlaku v extrakční patroně, nýbrž je umístěn za stejných podmínek v prostoru mezi extrakční nádobou a chladičem. Celý průběh extrakce se odehrává nad teplotou varu použitého rozpouštědla (n-acetonhexan, DCM-hexan). Nejen, že tím dojde ke zvýšení účinnosti extrakce na minimálně 90 %, zkrátí se tak i extrakční čas na 60 minut (Bielská, 2006). Novými technikami Soxhletovy extrakce mohou být i úpravy jednotlivých parametrů průběhu extrakce. Může se využívat vysokého tlaku, mikrovln, či ultrazvuku (Luque de Castro a Priego-Capote, 2010). Jmenovat můžeme například modifikace jako jsou Soxtec Systém HT a Soxwave-100 (Luque de Castro a García-Ayuso, 1998). 46

47 6.1.5 Extrakce pevnou fází Extrakce pevnou fází (Solid Phase Extraction SPE) je rutinní metoda využívaná pro rychlou a selektivní přípravu vzorků (Wu a kol., 2011). Principiálně zde jde o zadržování skupiny látek procházející pevnou fází, která je umístěna ve formě sloupce nebo membrány v krátké kolonce cartridge (Popl a Fähnrich, 1999). Nejčastěji je tato technika používaná pro kapalné vzorky, především pro extrakci mírně těkavých a netěkavých látek (Labicom, 2004). Stanovovaná látka se na pevnou fázi váže nejčastěji adsorpcí a iontovou výměnou, méně častými způsoby jsou vazby molekulového rozpoznání a rozpouštění. Ze sorbentu se stanovovaná látka uvolňuje buďto elucí vhodným rozpouštědlem a/nebo teplotou (Labicom, 2004). Sorbent umístěný v kolonkách je nejčastěji složen z chemicky modifikovaných částic silikagelu. Při této modifikaci, způsobené vazbou nejrůznějších funkčních skupin na silanolové skupiny, získává sorbent specifické vlastnosti. Navázanými skupinami mohou být jak skupiny polární, nepolární, tak iontově výměnné. Sorbentem pro SPE nemusí být nezbytně silikagely, mohou je tvořit také alumina, grafitové uhlí, porézní grafit, aktivní uhlí a jiné organické polymery (Klouda, 2003). Moderními sorbenty jsou tzv. extrakční disky, které jsou vyráběny ze skelných vláken a tvoří tak matrici pro skupiny silikagelu nebo jeho modifikovaných forem. V kolonce před tyto disky může být vložena i předfiltrační vrstva. Výhodou moderních sorbentů je vysoká účinnost, nižší spotřeba rozpouštědla, vysoká reprodukovatelnost, zkrácení času přípravy vzorků paralelním použitím několika těchto disků a oproti klasickým SPE kolonkám zde nedochází k ucpávání p rů (Riddellová, 2011) Extrakce disperzní tuhou fází Extrakce disperzní tuhou fází (Matrix Solid Phase Dispersion MSPD) slouží k izolaci a předčištění pevných, polotuhých a/nebo vysoce visk zních biologických vzorků (Barker, 2007). Odebraný vzorek rozetřeme s vhodným sorbentem. Tímto vzniklým sorbentem naplníme kolonu a naneseme druhý sorbent. Samotná matrice se tak stává novou sorpční fází. Po stlačení již následuje promývání systému vhodným rozpouštědlem (Riddellová, 2007). Oproti extrakci tuhou fází má tato metoda řadu výhod. Jednou z nich je nízká spotřeba sorbentu. Vzorek po MSPD je dokonaleji přečištěn, jelikož sorbent má velkou 47

48 plochu, která vzniká rozetřením vzorku s prvním sorbentem (Jandeková, 2008). Výhodami metody je nízká spotřeba rozpouštědla, lepší účinnost a selektivita, také úspora času na přípravu vzorku (Riddellová, 2007; Dawidowicz a Rado, 2010). 6.2 Separační metody Chromatografické metody Chromatografie je separační technikou, při níž se oddělují jednotlivé složky ve vzorku. V chromatografii dochází k dělení látek mezi dvě nemísitelné fáze, stacionární a mobilní. Stacionární fáze, jak již sám název vypovídá je nepohyblivá a mobilní fáze je pohyblivá. Vzorek se nanáší na začátek stacionární fáze (sorbent) a je vlivem průtoku mobilní fáze (eluent) posouvána po stacionární fázi. O tom, jak dlouho bude látka na stacionární fázi zadržována, rozhoduje pouze její afinita k této fázi. Čím větší je afinita látky k sorbentu, tím déle na ní setrvává. Na tomto principu se separují jednotlivé složky vzorku s větší či menší afinitou ke stacionární fázi (Snyder a kol., 2010). Chromatografické metody se rozdělují podle skupenství mobilní fáze (plynová, kapalinová), podle uspořádání fází (plošné, kolonové) a podle povahy převládajícího děje na koloně (rozdělovací, adsorpční, iontově-výměnné, gelové a afinitní) (Klouda, 2005) Plynová chromatografie V plynové chromatografii (Gas Chromatography GC) dochází k distribuci složek vzorku mezi dvě fáze, mobilní fází je nosný plyn, stacionární fází je pevná látka. Abychom mohli vzorek touto metodou stanovovat, musí se co nejrychleji přeměnit na plyn. Proto má tato metoda výsadní postavení pro snadno těkavé látky, které se při bodu varu vzorku nesmí vypařit (Kolb a Ettre, 2006). Maximálním limitem většiny chromatografů je teplota 400 C. Jelikož snadno těkavých látek je asi okolo 30 %, je možné převést jen málo těkavé látky na jejich snadněji těkavé deriváty (Štulík, 2006). Hlavní výhodou této metody je jednoduchost a rychlost stanovení a malé množství vzorku potřebné k analýze. Existuje celá řada chromatografů, které se liší použitým typem stacionární fáze, například adsorpční chromatografie (GSC) a rozdělovací chromatografie (GLC) (Jančářová a Jančář, 2003). Kromě plynných látek se v praxi tato metoda využívá ke stanovování také organokovových látek, většiny nedisociovaných kapalin a pevných organických látek. Po rozdělení látek v koloně složky putují k detektoru, kde dochází k vyhodnocení signálu. Kvantitativní a kvalitativní 48

49 vyhodnocení se provede v závislosti na časového průběhu detekovaného signálu (Klouda, 2005) Kapalinová chromatografie V kapalinové chromatografii (Liqiud Chromatography LC) se využívá jako mobilní fáze kapalina. O separaci látek v tomto případě nerozhoduje samotná afinita separované látky k sorbentu, ale i použitá mobilní fáze. Stejně jako u plynové chromatografie vzorek se separuje v koloně vlivem afinity ke stacionární fázi. Podle mechanismu separace se tato technika dělí na adsorpční, rozdělovací, afinitní a iontově-výměnnou. Podle umístění stacionární fáze se kapalinová chromatografie rozděluje na tenkovrstevnou, kolonovou a papírovou (Klouda, 2005; Jančářová a Jančář, 2003). Na rozdíl od plynové chromatografie je možné u této metody stanovovat tepelně nestálé a netěkavé látky. Což tedy umožňuje separovat více než 80 % všech známých látek. Přestože je tato metoda náročnější co do přístrojového vybavení, tak ekonomických nákladů, je to jedna z nejfrekventovanějších technik vůbec (Štulík, 2006). V dnešní době je mnohonásobně účinnější a rychlejší vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High Performance Liqiud Chromatography HPLC). Výhodou této metody je, že může probíhat i při pokojové teplotě a není tedy nutné temperování u všech druhů separovaných látek. Celá analýza trvá pouze v rozsahu několika minut, běžně 2 4 minuty (Snyder a kol., 2010). Největším problémem kapalinové chromatografie je stanovení polárních látek, které jsou rozpustné ve vodné fázi, která může způsobovat v koloně dewetting. Proto se mnohem častěji než HPLC s normální fází používá RP-HPLC, tedy vysokoúčinné chromatografie s reverzní fází. Kde dochází k obrácení smyslu stacionární a mobilní fáze. Stacionární fáze je v tomto případě nepolární a mobilní fáze polární. Tento systém umožňuje separaci jak látek polárních tak nepolárních. K separaci polárních látek můžeme použít i systém HILIC (hydrofobní interakční kapalinová chromatografie), iont-párovou a iontově-výměnnou chromatografii Elektromigrační metody Elektromigrační metody využívají elektroforézy a elektroosm zy. V roztoku s nabitými částicemi s pevnými povrchy stýkající se s roztokem, které mohou nést elektrické náboje, se vytvářejí elektrické dvojvrstvy. Rovnoměrné rozložené náboje ve 49

50 stejnosměrném elektrickém poli se začínají pohybovat. Separace je tedy založena na odlišné elektroforetické pohyblivosti jednotlivých složek vzorku (Klouda, 2005) Elektroforéza Elektroforéza je elektromigrační separační metou, která využívá migrace iontu v elektrickém poli. Toto pole se vytváří vkládáním konstantního napětí mezi elektrody. Původně byla tato metoda určena pro aminokyseliny a anorganické ionty. Může pracovat v různých modech a využívat odlišných prostředí jako je papír, gel a kapilára. Vyseparované látky nejsou většinou viditelné, proto je nutná jejich vizualizace (Klouda, 2005). Základním modem je kapilární z nová elektroforéza (Capillary Zone Electrophoresis CZE), kdy je vzorek nanášen do určitého místa systému, které je tvořeno elektrolytem a elektrodami. Kationty se pohybují k zápornému p lu, anionty ke kladnému a neutrální molekuly se pohybují jen částečně. Oddělené z ny vzorku se tvoří po separaci složek podle jejich mobility. Dalšími mody jsou kapilární gelová elektroforéza (Capillary Gel Electrophoresis CGE), micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography MECC), kapilární elektrochromatografie (Capillary Electrochromatography CEC), kapilární izoelektrická fokusace (Capillary Isoelectric Focusing CIEF) a kapilární izotachoforéza (Capillary Isotachophoresis CITP) (Pazourek, 2003; Coufal a Suchánková, 2000). Revolucí v elektroforéze jsou především elektroforetické čipy, které umožňují analyzovat stovky vzorků za méně než minutu. Využívají pouze pikolitry vzorku. Od devadesátých let se využívá k separaci fragmentů DNA, krátkých oligonukleotidů, PCR produktů a fluorescenčně značených aminokyselin. Vzorky se separují pomocí vysokého napětí, zatímco je vkládán na vzorek potenciál. K detekci se využívá flourescenční detektor, nebo jiných detekčních principů (Dolník a kol., 2000). Elektroforéza tak našla své využití nejen v kriminalistice při analýze DNA, ale i v proteinovém a enzymovém inženýrství (Pazourek, 2003) Izotachoforéza Izotachoforéza (Isotachophoresis ITP) je elektromigrační metodou, která využívá odlišné pohyblivosti látek. Vzorek je nanášen mezi dva elektrolyty vedoucí a koncový. Všechny ionty vzorku nesmí mít větší mobilitu než vedoucí a menší 50

51 pohyblivost než koncový elektrolyt (Everaerts a kol., 1976). Výsledkem této elektroforetické metody je, že v rovnovážném stavu se z ny uspořádají podle elektroforetické pohyblivosti a posunují se konstantní rychlostí k detektoru, přičemž je jejich koncentrace upravena podle koncentrace vedoucího elektrolytu. Proto je možné při této technice docílit i zakoncentrování výchozích velmi zředěných vzorků (Pazourek, 2003). Izotachoforézou nelze separovat současně kationty i anioty, pouze jeden druh iontů. Na rozdíl od elektroforézy se v izotachoforéze pracuje s konstantním proudem, nikoliv napětím. V ustáleném stavu je rychlost pohybu z n konstantní a z ny na sebe navazují, a nikdy se nepřekrývají, jelikož mezi sebou vytváří ostré rozhraní. Z ny se od sebe také liší potenciálovým spádem, který závisí na pohyblivosti iontů (Klouda, 2005). 51

52 7 MATERIÁL A METODIKA 7.1 Vzorky Vzorky vín určené pro stanovení polyfenolických látek byly zakoupeny ve Vinařství WINBERG Mikulov, s. r. o. Testované vzorky vína z révy vinné (Vitis vinifera L.) byly roztříděny do skupin podle barvy. Třídění vín podle barvy upravuje Vinařský zákon č. 115/1995 Sb., v pozdějším znění. Mezi vybranými vzorky bílých vín byl Ryzlink rýnský, Muškát moravský, Rulandské bílé a Sauvignon. Tato vína byla vyrobena zpracováním bílých a červených odrůd vinné révy. Růžová vína reprezentuje Rulandské modré rosé, jenž se vyrábí z hroznů krátkou dobu naležených. Červená vína zde zastupují Cabernet Sauvignon, Rulandské modré, Neronet a Svatovavřinecké, která pocházejí z modrých odrůd zpracovaných jejich nakvášením. Pro přehlednost je popis zkoumaných vzorků, včetně základní charakteristiky jejich odrůd, uveden v kapitole Vinné hrozny pro výrobu zmíněných odrůdových vín byly vypěstovány na viniční trati pod Svatým kopečkem v Mikulově. Odrůdy, které na této trati nebyly vypěstovány, byly zakoupeny od sousedních vinohradníků Popis zkoumaných vzorků vín včetně základní charakteristiky odrůd Bílá odrůdová vína Ryzlink rýnský kategorie: jakostní s přívlastkem výběr z hroznů, polosuché obsah alkoholu: 11,97 obj. %, zbytkový cukr: 21,8 g/l, kyseliny: 8,8 g/l ročník: 2010, obsah: 750 ml; cena: 120,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava podoblast Mikulovská původ odrůdy: Německo, patrně kříženec Heunische a Tramínu označení pro analýzu: RR Muškát moravský kategorie: jakostní s přívlastkem pozdní sběr, suché obsah alkoholu: 11,77 obj. %, zbytkový cukr: 1,8 g/l, kyseliny: 7,3 g/l ročník: 2010, obsah: 750 ml; cena: 90,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava podoblast Mikulovská 52

53 původ odrůdy: Česká republika, kříženec Muškátu Ottonel a Prachttraube označení pro analýzu: MM Rulandské bílé kategorie: jakostní s přívlastkem pozdní sběr, polosuché obsah alkoholu: 12,82 obj. %, zbytkový cukr: 27,5 g/l, kyseliny: 9,9 g/l ročník: 2010, obsah: 750 ml; cena: 130,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava podoblast Mikulovská původ odrůdy: Německo, pupenová mutace Rulandského šedého označení pro analýzu: RB Muškát moravský kategorie: mladé svěží víno, suché obsah alkoholu: 12,0 obj. %, zbytkový cukr: 4,0 g/l, kyseliny: 5,7 g/l ročník: 2011, obsah: 750 ml; cena: 90,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava podoblast Mikulovská původ odrůdy: Česká republika, kříženec Muškátu Ottonel a Prachttraube označení pro analýzu: MM11 Sauvignon kategorie: jakostní s přívlastkem pozdní sběr, polosuché obsah alkoholu: 13,38 obj. %, zbytkový cukr: 18,4 g/l, kyseliny: 10,1 g/l ročník: 2010, obsah: 750 ml; cena: 100,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava podoblast Mikulovská původ odrůdy: Francie, pravděpodobně kříženec Chenin blanc a Tramínu červeného označení pro analýzu: SVG Růžová odrůdová vína Rulandské modré rosé kategorie: jakostní s přívlastkem pozdní sběr, polosuché obsah alkoholu: 12,08 obj. %, zbytkový cukr: 17,4 g/l, kyseliny: 8,9 g/l ročník: 2010, obsah: 750 ml; cena: 130,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava podoblast Mikulovská původ odrůdy: Francie, kříženec Rulandského bílého a Rulandského modrého označení pro analýzu: RM rosé 53

54 Červená odrůdová vína Svatovavřinecké kategorie: jakostní s přívlastkem pozdní sběr, suché obsah alkoholu: 12,0 obj. %, zbytkový cukr: 1,7 g/l, kyseliny: 6,4 g/l ročník: 2002, obsah: 750 ml; cena: 50,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava podoblast Mikulovská původ odrůdy: Francie, pravděpodobně semenáč burgundských odrůd označení pro analýzu: VAV Cabernet Sauvignon kategorie: jakostní s přívlastkem pozdní sběr, suché obsah alkoholu: 13,0 obj. %, zbytkový cukr: 3,8 g/l, kyseliny: 5,4 g/l ročník: 2007, obsah: 750 ml; cena: 130,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava podoblast Mikulovská původ odrůdy: Francie, patrně kříženec Cabernetu France a Sauvignonu označení pro analýzu: CS Rulandské modré kategorie: jakostní s přívlastkem pozdní sběr, suché obsah alkoholu: 12,35 obj. %, zbytkový cukr: 2,7 g/l, kyseliny: 5,9 g/l ročník: 2009, obsah: 750 ml; cena: 130,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava podoblast Mikulovská původ odrůdy: Francie, patrně kříženec Mlynářky a Tramínu označení pro analýzu: RM Neronet kategorie: jakostní, suché obsah alkoholu: 13,0 obj. %, zbytkový cukr: 2,3 g/l, kyseliny: 7,0 g/l ročník: 2007, obsah: 750 ml; cena: 120,- Kč oblast pěstování: Vinařská oblast Morava podoblast Mikulovská původ odrůdy: Česká republika, kříženec (Svatovařinecké x Modrý Portugal a Alicante Bouschet x Cabernet Sauvignon) označení pro analýzu: N 54

55 7.2 Chemikálie Všechny použité chemikálie dosahovaly čistoty p. a. a rozpouštědla použité jako mobilní fáze čistoty HPLC gradient grade. Standardy pro stanovení kyseliny gallové, protokatechové, p-hydroxybenzoové, chlorogenové, vanilové, kávové, siringové, p- kumarové, salicylové, ferulové, sinapové, o-kumarové, derivátů kyseliny benzoové a skořicové 3,4-dihydroxybenzaldehydu a vanilinu, stilbenu resveratrolu a flavonoidů rutinu, hyperosidu a apigeninu byly zakoupeny u firmy Sigma-Aldrich, s. r. o. (Praha, Česká republika). Kyselina mravenčí, octová, metanol a dietylether byly dodány firmou Labicom, s. r. o. (Olomouc, Česká republika). Demineralizovaná voda byla vyrobena na přístroji Milli Q RG (Millipore, Massachusetts, USA). Polymerní sorbent pro SPE RP- 105 Resin byl zakoupen od firmy Applied Separations (Allentown, Illinois, USA). 7.3 Přístrojové vybavení Pro extrakci fenolových kyselin byla použita odparka R-215 A advanced (Maneko, Praha, Česká republika) a třepačka Vortex Genius 3 (Biotech, Praha, Česká republika). Vlastní separace probíhala na chromatografu HP 1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, USA), který byl sestaven z vakuové odplyňovací jednotky (model G1322A), kvarterního čerpadla mobilní fáze (G1311A) a automatického dávkovače vzorku (G1313A). Vysokoúčinný kapalinový chromatograf byl propojen s UV-VIS detektorem (G1314A) a kvadrup lovým hmotnostním detektorem s ESI. Celý proces měření a vyhodnocování byl prováděn pomocí softwaru Chemstation (Rev. A 10,02). 7.4 Extrakce fenolových kyselin Pro extrakci fenolových kyselin na pevné fázi (SPE) byla použita metoda dle Matějíčka a kol. (2004). Byly vybrány RP-105 SPE kolonky, které byly kondicionovány 3 ml metanolu a následně 3 ml vody. Poté byly na kolonku naneseny 2 ml vzorku. Po extrakci jsme získali kolonku se vzorkem, která byla vysoušena po dobu 10 minut. Následně bylo na kolonku aplikováno 10 ml dietyletheru. Takto připravený vzorek byl přelit ze zkumavky do 50 ml baňky s plochým dnem a vyhrnutým okrajem a před uzavřením skleněným víkem do něj byly přidány 2 ml metanolu o čistotě HPLC gradient grade. Solvent byl odpařován pomocí rotační vakuové odparky při teplotě 50 C. Po vysušení byl extrakt smíchán s 500 μl mobilní fáze a důkladně homogenizován 55

56 na třepačce. Finálně byl do systému HPLC-MS injekován 1 μl takto připraveného vzorku. Pro statistické zpracování byl celý proces opakován třikrát. 7.5 Stanovení obsahu polyfenolických látek Samotné stanovení probíhalo na již popsaném vysokúčinném kapalinovém chromatografu HP 1100 na reverzní fázi. K separaci byla použita kolona Zorbax SB- C18 o rozměrech 50 x 2,1 mm a velikosti částic 1,8 μm (Agilent Technologies, USA). Separační proces probíhal gradientovou elucí, přičemž mobilní fází byla směs metanolu (A) a 0,2 % kyseliny octové nebo 0,05 % kyseliny mravenčí (B), při objemovém průtoku 0,6 ml/min. Teplota separace byla 45 C a tlak 600 barrů. Do systému byl dávkován 1 μl vzorku, popřípadě vzorku upraveného SPE. Celková doba detekce byla 4,5 minuty s postkolonovým časem 1 minutu. K identifikaci vybraných polyfenolických látek byly použity retenční časy jejich standardů. 56

57 8 VÝSLEDKY Pro separaci vybraných polyfenolických látek ve vzorcích vín bylo použito vysokúčinné kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí. Konkrétně byly ve vínech analyzovány tyto polyfenolické sloučeniny: kyselina gallová, protokatechová, p-hydroxybenzoová, chlorogenová, vanilová, kávová, siringová, p-kumarová, salicylová, ferulová, sinapová, o-kumarová, deriváty kyseliny benzoové a skořicové 3,4-dihydroxybenzaldehyd a vanilin, stilben resveratrol a flavonoidy rutin, hyperosid, a apigenin. Retenční časy, přechody, fragmentace a kolizní energie sledovaných látek jsou uvedeny v tabulce 4. Chromatogramy zkoumaných polyfenolických standardů lze nalézt v příloze 1. Chromatogramy separovaných polyfenolických sloučenin ve skutečných vzorcích jsou demonstrovány na víně Neronet a jsou uvedeny v příloze 3. Tab. 4 Přehled retenčních časů, přechodů, fragmentací a kolizních energií stanovovaných látek. t r [min] Sloučenina Přechod Fragmentace [V] Kolizní energie [V] 0,25 kyselina gallová ,39 kyselina protokatechová ,54 3,4-dihydroxybenzaldehyd ,62 kyselina p-hydroxybenzoová ,72 kyselina chlorogenová ,89 kyselina vanilová ,87 p-hydroxybenzaldehyd ,90 kyselina kávová ,21 kyselina syringová ,30 vanilin ,66 kyselina p-kumarová ,21 kyselina ferulová ,97 kyselina salicylová ,47 kyselina sinapová ,78 kyselina o-kumarová ,36 resveratrol ,64 rutin ,57 hyperosid ,06 apigenin

58 8.1 Kalibrace Před vlastním stanovením vybraných fenolových kyselin a jejich derivátů, flavonoidů a stilbenu byly provedeny kalibrace na konkrétní koncentrace těchto látek. Pro kalibrace byla zvolena metoda přímého stanovení. Koncentrační rozsah byl od 0,2 do 5 ng/ml. Parametry provedených kalibrací jsou uvedeny v tabulce 5. Tab. 5 Parametry pro kvantitativní RRLC-MS/MS analýzu (n=6) v MRM modu. Sloučenina Kalibrační rovnice R 2 LOD LOQ [ng/ml] [ng/ml] kyselina gallová y 10658,59x 135, 15 0,9997 0,33 0,98 kyselina protokatechová y 11111,18x 165, 55 0,9994 0,22 0,74 3,4-dihydroxybenzaldehyd y 2981,70x 374, 63 0,9935 0,07 0,23 kyselina p-hydroxybenzoová y 31813, 23x 0,9991 0,44 1,33 kyselina chlorogenová y 22002,50x 74, 81 0,9999 0,21 0,77 kyselina vanilová y 5984,62x 277, 29 0,9988 0,27 0,92 p-hydroxybenzaldehyd y 7456, 75x 0,9975 0,24 0,71 kyselina kávová y 31463,19x 500, 88 0,9999 0,22 0,76 kyselina syringová y 11535,17x 294, 74 0,9994 0,20 0,66 vanilin y 22190,92x 783, 42 0,9994 0,42 1,33 kyselina p-kumarová y 19418,41x 222, 87 0,9998 0,52 1,68 kyselina ferulová y 13566, 06x 0,9993 0,29 0,95 kyselina salicylová y 45633,97x 1208, 87 0,9971 0,44 1,42 kyselina sinapová y 11689,83x 50, 29 0,9999 0,15 0,46 kyselina o-kumarová y 34387,85x 334, 26 0,9997 0,52 1,68 hyperosid y 26084,57x 53, 56 0,9999 1,96 5,88 apigenin y 45,08x 11, 98 0, ,12 60,36 [μg/ml] [μg/ml] resveratrol y 3005,32x 85, 28 0,9996 0,21 0,63 [pg/ml] [pg/ml] rutin y 116,66x 35, 89 0, ,86 80, Statistické vyhodnocení Získané výsledky z HPLC-MS byly statisticky zpracovány a jsou uvedeny v příloze 2. Průměrné obsahy polyfenolických látek jsou pro větší přehlednost uvedeny v tabulce 6. 58

59 Tab. 6 Průměrné hodnoty stanovovaných polyfenolických látek ve vzorcích vín v mg/l. Vzorky vín Sloučenina RR RB MM MM11 SVG RM rosé RM VAV N CS kyselina gallová 0,080 0,068 0,058 0,114 0,022 0,068 0,102 0,928 4,941 2,189 kyselina protokatechová 0,121 0,194 0,248 0,068 0,108 0,166 0,325 0,149 0,976 1,399 3,4-dihydroxybenzaldehyd 0,006 0,007 0,006 0,000 0,006 0,006 0,012 0,041 0,000 0,000 kyselina p-hydroxybenzoová 0,054 0,097 0,057 0,043 0,005 0,052 0,012 0,054 0,170 0,198 kyselina chlorogenová 0,004 0,000 0,017 0,004 0,001 0,874 0,001 0,032 0,001 0,003 p-hydroxybenzaldehyd 0,007 0,008 0,013 0,000 0,005 0,006 0,012 0,020 0,000 0,000 kyselina vanilová 0,138 0,136 0,098 0,059 0,085 0,506 0,592 1,047 4,651 2,189 kyselina kávová 0,948 2,059 0,924 0,126 1,139 1,218 1,365 3,575 3,807 5,257 kyselina syringová 0,118 0,255 0,064 0,030 0,047 0,625 n.d. 1,953 2,843 0,659 vanilin 0,003 0,003 0,003 0,000 0,003 0,003 0,000 0,006 0,000 0,000 kyselina p-kumarová 0,211 0,407 1,021 0,002 0,001 0,726 0,139 2,293 n.d. 1,449 kyselina salicylová 0,061 0,233 0,095 0,100 0,251 0,066 0,053 0,069 0,141 2,272 kyselina ferulová 0,313 0,187 0,258 0,015 0,322 0,368 0,000 0,370 0,275 1,790 kyselina sinapová 0,005 0,005 0,004 0,000 0,004 0,004 n.d. 0,020 0,000 0,009 kyselina o-kumarová 0,000 n.d. n.d. 0,055 0,181 n.d. n.d. n.d. 0,295 0,442 resveratrol 0,263 0,302 0,198 0,062 0,138 0,516 1,198 2,278 0,471 1,554 rutin 0,001 0,000 n.d. 0,002 0,002 0,001 0,000 0,001 0,001 n.d. hyperosid 0,000 0,000 0,000 n.d. 0,000 0,000 0,000 n.d. 0,000 0,000 apigenin 0,002 0,000 0,001 0,000 0,003 0,000 0,001 0,001 0,001 0,001 59

60 8.3 Srovnání obsahu polyfenolických látek ve vzorcích vín Tabulka 6 podává celkový přehled průměrných obsahů vybraných polyfenolických látek ve vzorcích vín. Nejvýraznější složkou, identifikovanou u všech vzorků vín, byla kyselina kávová. Nejnižší hodnoty dosáhla u Muškátu moravského ročníku 2011, pouhých 0,126 mg/l. Tato skutečnost byla nejspíše způsobena tím, že Muškát moravský nesplňuje parametry vína, jedná se o tzv. mladé svěží víno, u kterého se až stárnutím projevují všechny buketní složky. V maximální koncentraci byla naměřena u vína Cabernet Sauvignon 5,257 mg/l. Hodnotu 1 mg/l překročila i u odrůdových vín Rulandské bílé, Sauvignon, Rulandské modré rosé, Rulandské modré, Svatovavřinecké a Neronet. U odrůdového vína Svatovavřinecké byl pozorován vysoký obsah kyseliny p- kumarové, na úrovni 2,293 mg/l. Další významná množství této kyseliny byla identifikována u Muškátu moravského ročníku 2010 a Cabernetu Sauvignon. Kyselina p-kumarová se ve velmi nízkém množství vyskytovala u vín Muškát moravský ročníku 2011, Neronet a Sauvignon. Poměrně vyrovnaně u vzorků působí obsah kyseliny ferulové. Zřejmé je to u vín Ryzlink rýnský, Sauvignon, Rulandské modré rosé a Svatovavřinecké, u nichž se pohybuje v rozmezí 0,313 až 0,370 mg/l. Výrazněji se projevila tato kyselina u vína Cabernet Sauvignon 1,790 mg/l, naopak nízkých hodnot dosahovala u Rulandského modrého. Tutéž tendenci pozorujeme i u obsahu kyseliny protokatechové, jejíž obsah se u většiny vín pohybuje v rozmezí od 0,108 do 0,194 mg/l. Nejvíce tendenci pozorujeme u odrůdových vín Ryzlink rýnský, Sauvignon, Rulandské bílé, Rulandské modré rosé a Svatovavřinecké. Tomuto fenoménu se vymykají vína Neronet, Cabernet Sauvignon a Muškát moravský ročníku 2011 s 0,976, 1,399 a 0,068 mg/l. Kyselina sinapová působila vyrovnaně především u odrůdových vín Ryzlink rýnský, Rulandské bílé a Rulandské modré, kde se pohybovala v rozmezí od 5,129 do 5,768 μg/l. Maximální koncentrace bylo dosaženo u Svatovavřineckého, který téměř přesáhl hranici 20 μg/l. Opačným trendem vyrovnanosti se vyznačoval resveratrol. V rozsahu od 1,198 do 2,278 mg/l byl tento stilben nalezen u odrůdových vín Rulandské modré, Svatovavřinecké a Cabernet Sauvignon. Nejvyšší množství resveratrolu bylo zaznamenáno u odrůdového jakostního vína s přívlastkem Svatovavřinecké. Nezanedbatelný obsah byl detekován i u odrůdových vín Neronet a Rulandské modré 60

61 rosé, což napovídá, že výskyt resveratrolu je spojen spíše s červenými než s bílými víny, kde se sice nachází, ale jeho množství nepřevyšuje 0,302 mg/l. Výskyt kyseliny syringové ve vínech je dáván do souvislosti s odrůdovým vínem Neronet, jelikož je v něm jeho koncentrace nejvyšší 2,843 mg/l. Hojně se tato kyselina nalézá u Svatovavřineckého v množství až 1,953 mg/l. Překvapivý je ve vzorcích poměrně vysoký obsah kyseliny gallové, který se pohyboval od 0,022 do 4,941 mg/l. Odrůdová vína Svatovavřinecké, Neronet a Cabernet Sauvignon se vyznačují vyšším obsahem této kyseliny. Méně se již vyskytuje v Rulandském bílém, Sauvignonu, Muškátu moravském ročníku 2010, Rulandském modrém rosé a Ryzlinku rýnském. Proto můžeme předpokládat, že obsah kyseliny gallové je spojen s barvou vína a jeho koncentrace pak s procesem vinifikace. Kyselina chlorogenová se nevyskytuje u vzorků ve vysokých hladinách. Výjimkou může být značný obsah této kyseliny u odrůdového vína Rulandské modré rosé 0,874 mg/l. U ostatních vzorků kyselina chlorogenová nepřevyšuje množství 32,075 μg/l. Kyseliny salicylové se ve vzorcích nalézá od 0,053 do 0,095 μg/. Přesto zde byly zaznamenány i výjimky, zejména u vín Cabernet Sauvignon 2,272 mg/l, Sauvignon 0,251 mg/l, Neronet 0,0141 mg/l, Rulandské bílé 0,233 mg/l a Muškát moravský ročníku 2011, kde byl zjištěn obsah 0,100 mg/l. Podobný případ byl zaznamenán u kyseliny o-kumarové, která se nejvíce nacházela ve víně Cabernet Sauvignon, ovšem pouze v množství 0,442 μg/l. Za zmínku stojí i obsah kyseliny p-hydroxybenzoové. Obsah této kyseliny byl ve vzorcích naměřen v rozmezí od 5,203 do 198,168 μg/l. Nejvyšší množství bylo zjištěno u odrůdového vína Cabernet Sauvignon. Vyrovnaně působí i řada vín Ryzlink rýnský, Muškát moravský ročníku 2010, Rulandské modré rosé a Svatovavřinecké, kde se obsah této kyseliny pohybuje v rozsahu od 52,319 do 57,098 μg/l. Opomenout nelze ani kyselinu vanilovou, která nejvyššího množství dosahovala u odrůdového vína Neronet s 4,651 mg/l. Podobně působí obsah této kyseliny ve vínech Rulandské modré a Rulandské modré rosé, stejně tak jako u Ryzlinku rýnského a Rulandského bílého. Ostatní deriváty kyseliny benzoové a skořicové se vyskytovaly ve velmi nízkých hodnotách, jež nepřekračovaly 48,051 μg/l. Ve vínech bylo také zjišťováno zastoupení flavonoidů. Prvním stanovovaným flavonoidem byl rutin. Jeho obsah se pohyboval do 2,321 μg/l. Nejvyšší množství tohoto flavonoidu bylo překvapivě detekováno u odrůdového vína Muškát moravský 61

62 ročníku Muškát moravský ročníku 2010 a Cabernetu Sauvignon rutin nevykazovaly. Následně byl stanoven obsah hyperosidu. Nejvyšší koncentrace tohoto flavonoidu byla zjištěna u odrůdového vína Ryzlink rýnský, a to v množství 55,072 ng/l. Druhou nejnižší zaznamenanou složkou vína byl apigenin. Jeho koncentrace dosáhla maxima 2,557 μg/l u bílého vína Sauvignon. 8.4 Porovnání obsahu derivátů benzoové a skořicové ve vzorcích vín U vzorků vín bylo provedeno srovnání obsahů derivátů kyseliny benzoové a skořicové. Mezi deriváty kyseliny benzoové řadíme kyselinu gallovou, protokatechovou, p- hydroxybenzoovou, vanilovou, swingovou, salicylovou a 3,4-dihydroxybenzaldehyd. Celkový obsah derivátů benzoové kyseliny byl 28,395 mg/l. Deriváty skořicové kyseliny jsou kyselina chlorogenová, kávová, p-kumarová, o-kumarová, ferulová, sinapová a vanilin. Jejich celkový obsah byl 32,563 mg/l. Graf 1 Stanovení obsahu derivátů kyseliny benzoové a skořicové ve vzorcích vín v mg/l. Porovnáním těchto hodnot docházíme k závěru, že celkový obsah derivátů kyseliny skořicové a benzoové je takřka srovnatelný. Potvrzena je tato skutečnost u odrůdového vína Cabernet Sauvignon. U ostatních vzorků se tyto hodnoty neshodují. Deriváty kyseliny skořicové u většiny vzorků převyšují obsah derivátů kyseliny benzoové téměř dvakrát. Vyšší obsah derivátů kyseliny benzoové pozorujeme pouze u vína Neronet, kde je jejich zastoupení téměř trojnásobné. 62

63 Maximální obsah derivátů kyseliny skořicové byl zaznamenán u odrůdového vína Cabernet Sauvignon 8,964 mg/l. Nejnižší pak u vína Muškát moravský ročníku ,210 mg/l. Vysoké množství derivátů kyseliny benzoové bylo zjištěno u vína Neronet 13,799 mg/l. Nejnižší obsah derivátů kyseliny benzoové byl naměřen u vína Svatovavřinecké s 0,419 mg/l. Celkově z grafu 1 vyplývá, že obě skupiny fenolových kyselin se vyskytují jak u bílých, tak červených vín. Přesto vyššího množství bylo dosaženo u vín červených. 8.5 Posouzení vlivu stárnutí na změnu obsahových složek v odrůdovém víně Muškát moravský Pro porovnání změny zastoupení polyfenolických látek ve vínech vlivem stárnutí byly k dispozici dva ročníky odrůdového vína Muškát moravský ročníků 2010 a Graf 2 Porovnání obsahu polyfenolických látek ve dvou ročnících Muškátu moravského v μg/l. Při porovnání obsahu jednotlivých polyfenolických látek je z grafu 2 na první pohled patrné, že obsah polyfenolů se stárnutím vína zvyšuje. Výjimkou byl obsah kyseliny gallové, který se během jednoho roku snížil téměř na polovinu z 0,115 na 0,058 mg/l, obsah rutinu, který se z 2,321 μg/l snížil natolik, že jej nebylo možno detekovat. Také obsah kyseliny o-kumarové klesl z původních 0,055 mg/l pod úroveň detekce. 63

64 Nejlepším příkladem narůstání obsahu vlivem stárnutí může být obsah kyseliny p- kumarové. V mladém víně, kterým je ročník 2011, byla tato kyselina detekována v množství 2,027 μg/l. Po roce byl už její obsah 1,021 mg/l. Stejně tak kyselina kávová stárnutím zvýšila svůj obsah z 0,126 na 0,924 μg/l. Téměř nepatrný nárůst za dobu jednoho roku byl pozorován u p- hydroxybenzaldehydu, vanilinu a flavonoidů hyperosidu a apigeninu. 8.6 Vyjádření procentuálního zastoupení polyfenolických látek ve vzorcích vín Na následujících výsečových grafech můžeme pozorovat odlišnou procentuální četnost vybraných polyfenolických látek v jednotlivých odrůdových vínech. Pro lepší orientaci byly grafy rozděleny do čtyř skupin podle jejich odrůdové příslušnosti. Odrůda vinné révy, ze které bylo víno vyrobeno, má jeden z nejvýznamnějších vlivů na obsah stanovovaných složek. Při rozdělování do zmíněných skupin byl brán v potaz také vliv ročníku. Jak již bylo zmíněno dříve, stárnutí navyšuje obsah polyfenolických látek ve vínech. Současně tak do jedné skupiny mohla být zařazena vína bílá i červená. Proto zde lze posuzovat vliv nejen původní odrůdy vinné révy, ze kterého šlechtěním vznikla stávající odrůda, ale i účinek který s sebou přináší technologie zpracování vinných hroznů v procesu vinifikace Skupina I První skupina, kterou tvoří vína Neronet a Svatovavřinecké, byla označena velkou římskou číslicí I. Tato skupina je charakteristická zejména barvou, jelikož se jednalo o červená vína s výrazným sytým odstínem. Při porovnávání těchto odrůdových vín byla velkou překážkou jejich rozdílná kvalita, protože Neronet není jakostní víno s přívlastkem. Původní odrůdu této skupiny neznáme. Jednalo se pravděpodobně o semenáče burgundských odrůd. Víno Neronet, které bylo na první pohled sytěji zbarvené a současně i chuťově méně atraktivní, po provedení HPLC-MS analýzy se ukázalo, že 71 % tvoří kyseliny gallová, kávová a vanilová. Za zmínku u tohoto vína poté stojí i 15 % podíl kyseliny syringové. Přestože toto víno bylo vyrobeno v roce 2007, podíl resveratrolu nevykazoval předem očekáváné vyšší hodnoty. Ostatní složky v tomto víně jsou z hlediska jejich procentuálního množství zanedbatelné (viz. graf 3) 64

65 Graf 3 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Neronet. Svatovavřinecké, které je o pět let starším vínem než Neronet, mělo své složení naprosto odlišné. Majoritní složkou zde byla kyselina kávová s 28 %. Překvapivý byl i vyrovnaný obsah resveratrolu, kyseliny p-kumarové a syringové, jež tvořil shodně 15 % celkového obsahu stanovovaných látek (viz. graf 4). Graf 4 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Svatovavřinecké Skupina II Do skupiny II byla zařazena vína Cabernet Sauvignon a Sauvignon. Jak již vyplývá z jejich názvu, Cabernet Sauvignon vzešel z křížení odrůdy Sauvignon a Cabernet 65

66 France. Sauvignon je bílé a Cabernet Sauvignon červené víno. Jakkoli jsou si označením tato vína podobná, složením se značně liší. Cabernet Sauvignon, jenž je suchým vínem z roku 2007, obsahoval 11 % kyseliny gallové a 12 % kyseliny salicylové. Dále zde byl zjištěn 27 % podíl kyseliny kávové. Společným znakem u těchto dvou vín pak může být nízký obsah stilbenu resveratrolu, jenž se zde pohybuje na 8 % a u vína Sauvignon na 6 %. Stanovované flavonoidní látky jako hyperosid, apigenin a rutin netvoří ani jedno 1 % z celkového obsahu polyfenolů (viz. graf 5). Graf 5 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Cabernet Sauvignon. Odrůdové víno Sauvignon se na rozdíl od Cabernetu Sauvignon vyznačuje 50 % obsahem kyseliny kávové. Obsah ostatních fenolových kyselin nepřekročil hranici 14 %. Víno Sauvignon bylo vyrobeno ze sklizně roku 2010, z čehož plyne, že u něj nemůžeme předpokládat další nárůst srovnávaných složek (viz. graf 6). 66

67 Graf 6 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Sauvignon Skupina III Skupinu III tvoří odrůdoví kříženci Tramínu, a to Rulandské modré a Ryzlink rýnský. Následně zde byli přiřazeni i Rulandské bílé a Rulandské modré rosé. Rulandské bílé je pouze pupenová mutace Rulandského šedého a Rulandské modré rosé vzniklo křížením Rulandského bílého a modrého, nikoli mícháním již vyrobených vín. Graf 7 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Rulandské bílé. 67

68 Graf 8 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Ryzlink rýnský. Graf 9 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Rulandské modré rosé. Skupina III jako celek je charakteristická vysokým obsahem kyseliny kávové. Tato fenolová kyselina tvořila téměř 50 % celkového obsahu. Ovšem zajímavé je zjištění, že u odrůdového křížence, kterým je Rulandské modré rosé, se obsah kyseliny kávové snížil na pouhých 24 % (viz. graf 9). Četnost resveratrolu je v této skupině poněkud nižší, v průměru se pohybuje okolo 10 %. Výjimkou je pouze odrůdové víno Rulandské modré, které se vyznačuje vyšším obsahem tohoto stilbenu, 32 %. Vyšší obsah resveratrolu můžeme přisuzovat stárnutí 68

69 vína, jelikož se jedná o ročník Jak již bylo dokázáno na odrůdovém víně Muškát moravský, nárůst obsahu resveratrolu během jednoho roku může být více než dvojnásobný. Složka je ve víně velmi ceněna, neboť působí pozitivně na lidské zdraví. Ostatní fenolové kyseliny tvořily pouze minoritní podíly, které nepřesahovaly hodnotu 14 % (viz. graf 10). Graf 10 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Rulandské modré. Skupina IV Skupina IV má dva zástupce odrůdového vína Muškát moravský, v ročnících 2010 a Odrůda Muškát moravský je odrůdovým křížencem Muškátu Ottonel a Prachttraube. Na grafech 11 a 12 můžeme názorně pozorovat, jak dochází ke změně významných podílů ve vínech během jednoho roku. Víno z roku 2011 bylo tvořeno z 18 % kyselinou kávovou, z 16 % kyselinou gallovou a ze 14 % kyselinou salicylovou. Naopak ročník 2010 je již charakteristický vysokým zastoupením derivátů kyseliny skořicové až 89 %. Kyselina p-kumarová tvoří 34 % z celkového obsahu polyfenolických látek. U tohoto ročníku je také typické vyšší zastoupení kyseliny kávové s 31 %. Při porovnání podílů resveratrolu a kyseliny protokatechové můžeme vnímat snížení o 2 %. Ostatní fenolové kyseliny, jako ferulová a vanilová, nepřevyšovaly 9 %. 69

70 Graf 11 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Muškát moravský ročník Garf 12 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Muškát moravský ročník Porovnání vlivu barvy vína na obsah polyfenolických látek Graf 13 naznačuje rozdílné zastoupení vybraných polyfenolických látek u barevných variant vín. Celkově nejvyšší úroveň polyfenolů mají vína červená 13,676 mg/l, dále pak růžová 5,141 mg/l. Ovšem hodnota v kategorii růžových vín není průkazná, jelikož má pouze jednoho zástupce, a to Rulandské modré rosé. 70

71 Graf 13 Srovnání průměrného obsahu polyfenolických látek u bílých, růžových a červených vín. Skupina růžových vín může být do značné míry ovlivněna metodou výroby vína. Existuje významný rozdíl v obsahu fenolických látek mezi víny, které vznikly mícháním červených a bílých vín a mícháním modrých a bílých hroznů naležením na rmutu. Námi zvolené víno bylo vyrobeno technikou, při které se nechají modré hrozny vzniklé odrůdovým křížením pouze krátkou dobu naležet. Nejnižším celkovým obsahem polyfenolických látek jsou charakteristická bílá vína 2,384 mg/l. U všech variant vín byl pozorován vysoký obsah kyseliny kávové, který se pohyboval v rozmezí od 1,039 do 3,501 mg/l. Červená vína byla charakteristická vysokým obsahem resveratrolu o průměru 1,375 mg/l. Bílá vína vykazovala nižší zastoupení resveratrolu, pouze 0,193 mg/l. Červená vína se vyznačovala také vysokým obsahem kyseliny protokatechové 0,712 mg/l, chlorogenové 0,874 mg/l, p-hydroxybenzaldehydové 0,109 mg/l, vanilové 2,120 mg/l, syringové 1,364 mg/l, salicylové 0,603 mg/l, ferulové 0,609 mg/l a p- kumarové 0,970 mg/l. Kyselina gallová, jež je spojována s červenými víny, je v nich zastoupena v průměrném množství 2,040 mg/l. Bílá vína oproti tomu obsahovala této kyseliny pouze 0,0613 mg/l. Ostatní fenolové kyseliny a flavonoidní látky nepřekročily hodnotu 0,1 mg/l. 71

72 9 DISKUZE Velká pozornost je v současnosti věnována ochranné funkci antioxidantů, mezi které řadíme i polyfenolické látky. Současnými metodami pro jejich stanovení jsou vysokoúčinná kapalinová chromatografie, plynová chromatografie a elektromigrační metody. V předkládané práci bylo použito vysokoúčinné kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí, poněvadž tato metoda má velmi vysokou citlivost a rozlišovací schopnost (Da Costa a kol., 2000). Obsah fenolických látek ve vybraných vzorcích vín vykazuje značnou rozličnost. Odchylky ve fenolickém složení jsou způsobeny mnoha faktory, mezi nimi jmenujme odrůdu hroznů, vlivy životního prostředí (viz. tabulka 7), zralost hroznů, lisovací režim, rozsah a teplotu macerace, teplotu kvašení hroznů, používání různých druhů enzymů, vliv skladování a stárnutí vína. Všechny zmíněné účinky jsou s to ovlivňovat nejen fenolické složení vín, ale i jejich barvu a antioxidační aktivitu. Víno je tedy komplexní matricí obsahující celou řadu organických, anorganických sloučenin i enzymů, které působí na jeho biologickou aktivitu (Granato a kol., 2011). Při posouzení obsahu polyfenolických kyselin, jsme zjistili značné množství kyseliny gallové. Přítomnost kyseliny byla očekávána především u červených vín, protože fenolové kyseliny tvoří hydrolýzou flavonoidů gallát estery, jež do značné míry postrádáme u bílých vín, neboť se nacházejí především ve slupkách. Při vyhodnocování výsledků byl také zaznamenán pozoruhodně vysoký obsah kyseliny kávové. Zmíněné kyseliny mají podle mnoha studií nejvyšší antioxidační aktivitu, o něco menší aktivitu mají i rutin a resveratrol. Antioxidační aktivita zde přímo souvisí s počtem hydroxylových skupin v molekule (Minussi a kol., 2003). Výsledky měření resveratrolu se u analyzovaných vzorků vín značně lišily. V diplomové práci byl stanovován pouze trans-izomer resveratrolu. Přesto studie mluví o obou izomerních formách. Resveratrol je stilben, vyskytující se především u červených vín, kde se jeho obsah liší v závislosti na odrůdě vína a použité vinařské technologii. Celkové množství resveratrolu se ve studiích pohybuje u červených vín v rozmezí 0,35 až 4,85 mg/l (Atanacković a kol., 2012). Úroveň námi určeného trans-resveratrolu byla mezi 0,062 a 2,278 mg/l. Nejvyšší obsah jsme pozorovali u Svatovavřineckého, zatímco nejnižší hodnota byla nalezena u Muškátu moravského ročníku Podle zahraničních studií by mělo mít nejvyšší hodnotu víno Cabernet Sauvignon (Cvejić a kol., 2001), nicméně tato skutečnost se nepotvrdila. Vzhledem k tomu, že analyzované 72

73 vzorky pochází z České republiky, můžeme v nich očekávat vyšší obsah transresveratrolu, než je tomu u vín pocházejících z jižní Evropy. Přesněji řečeno, chladnější a vlhčí klimatické podmínky přispívají k navýšení obsahu trans-resveratrolu (Kolouchová-Hanzlíková a kol., 2004). Přestože cis-resveratrol nebyl zkoumán, s jistotou je přítomen ve všech vínech, bez ohledu na původ vína i vinařskou technologii. Existuje i korelace mezi využitou vinařskou technologií a obsahem resveratrolu ve víně (Atanacković a kol., 2012). K navýšení obsahu resveratrolu dojde pomocí termovinifikace, popřípadě i nadrcením 50 % hroznů. Celkový obsah resveratrolu je ovlivňován extrakcí během vinifikace. Maximální výtěžnosti dosáhneme při teplotě 60 C po dobu 30 minut, ovšem další zvýšení teploty tuto hodnotu nenavýší (Netzel a kol., 2003). Množství flavonoidů a fenolových kyselin lze navýšit podmínkami macerace. Výzkumy dokazují, že obsah těchto polyfenolů se zvyšuje prodloužením doby a snížením teploty macerace (Hernanz a kol., 2007). Úpravou technologie by bylo možné navýšit obsah flavonoidů ve víně až sedmkrát. Tato skutečnost je podpořena vysokým obsahem flavonoidů ve slupce vinných hroznů. Ve vinifikačním procesu dojde ke ztrátě až 26 % veškerých obsažených flavonoidů (G mez-míguez a kol., 2007). Což by naznačovalo, že námi stanovená hodnota apigeninu, hyperidinu a rutinu by mohla dosáhnout významných hodnot. Obsah fenolových kyselin se úpravou technologie podle tohoto klíče zvýší pouze čtyřikrát. Při technologii výroby vína může hrát roli rovněž použitý způsob odkalování, kdy jsou zaznamenány rozdílné obsahy polyfenolů při použití bentonitu oproti aktivnímu uhlí, popřípadě skladování vína v dubových sudech (Makris a kol., 2006). Se stárnutím vína, které jsme posuzovali u odrůdového vína Muškát moravský, vyrobeného v letech 2010 a 2011, došlo k navýšení obsahu polyfenolických látek. To podporuje teorii, že obsah polyfenolů se navyšuje zráním vína v lahvích. Potvrzuje to i studie, která se zabývá navýšením obsahu derivátů kyseliny skořicové ve vztahu k době zrání. Obsah flavonoidů by se měl podle Monagasové a kol. (2007) zráním snižovat, tuto skutečnost jsme pozorovali pouze u množství rutinu. Celkové flavonoidní profily vín byly velmi nízké. Tento fakt je způsoben technologií výroby vína, při které dochází k jejich hydrolýze. Přítomnost flavonoidů je tedy ve víně téměř nulová a zaznamenány jsou pouze ve formě glykosidů. Příkladem může být stanovený obsah rutinu. Podle Rodriguez-Bernaldo de Quir se a kol. (2009) by se měl obsah rutinu pohybovat mezi 5,6 až 18,6 mg/l. Dále se literatura zmiňuje o 73

74 obsahu apigeninu ve vínech 0,6 mg/l, experimentálně však bylo zjištěno pouze 2,557 μg/l. Barva vína také souvisí s obsahem jednotlivých polyfenolických látek. Majoritní význam na intenzitě odstínu vín mají antokyaniny, které ovšem nebyly předmětem měření. Obsah fenolických sloučenin souvisí přímo s fenoménem hnědnutí vín. U bílých i červených vín byla naměřena významná množství derivátů kyseliny skořicové, které mohou být oxidačními substráty a důvodem hnědnutí vín (Torchio a kol., 2011). Přestože fenoly hrají u rostlin důležitou roli v ochraně proti UV-záření, nemocem a obraně proti predaci, u vína se tyto látky podílí na senzorických vlastnostech. Proto i podmínky skladování mohou ovlivňovat obsah fenolových sloučenin (Mulero a kol., 2010). U tohoto faktoru pozorujeme dvě proměnné, a to jak teplotu, tak i vliv polohy láhve při uskladnění. Pokud teplota skladování vína není vyhovující, ba i kolísající, může docházet k předčasnému stárnutí vína, při kterém dochází ke značným ztrátám fenolických látek. Faktor polohy lahví při skladování ve studiích nebyl doposud potvrzen (Recamales a kol., 2006). Vliv skladování se projevuje především z důvodu hydrolýzy, oxidace a polymerace ve víně obsažených sloučenin. Při vysoké teplotě a nízké vlhkosti skladování dochází k degradaci zmíněných složek (Atanasova a kol., 2002). U kyseliny ferulové, kávové, p-kumarové koncentrace s časem narůstá, což také potvrdil experiment. Za pokles derivátů kyseliny skořicové jsou s největší pravděpodobností zodpovědné oxidační procesy. S časem můžeme také pozorovat snížení obsahu flavonoidu rutinu, jež po dvanácti měsících skladování není téměř detekovatelný. Tab. 7 Obsah vybraných polyfenolů v odrůdě Cabernet Sauvignon vypěstované v různých oblastech v mg/l (Gambelli a Santaroni, 2004). Cabernet Sauvignon Apigenin Resveratrol Kyselina kávová Kyselina gallová Původ Chile 4,7 < 0,2 7,3 46,0 7,7 Kalifornie 3,1 3,1 4,9 33,9 9,4 Kyselina p- kumarová 74

75 10 ZÁVĚR Polyfenolické látky jsou jedny z látek, které určují organoleptické vlastnosti potravin. Jsou součástí prevence rakovinných, srdečně-cévních onemocnění, Parkinsonovy a Alzeimerovy choroby, v pozitivním smyslu ovlivňují i hladinu cholesterolu a jeho frakcí v krvi. V rámci diplomové práce se právě tyto látky staly předmětem zkoumání ve vybraných odrůdových vínech (Ryzlink rýnský, Rulandské bílé, Rulandské modré, Rulandské modré rosé, Svatovařinecké, Neronet, Sauvignon, Cabernet Sauvignon, Muškát moravský), vypěstovaných ve vinařské oblasti Morava v Mikulovské podoblasti. Vína byla zakoupena od firmy Winberg Mikulov, s. r. o. Ke zjištění obsahu fenolických sloučenin byla nejprve u derivátů kyseliny benzoové a skořicové (kyselina gallová, protokatechová, p-hydroxybenzoová, chlorogenová, vanilová, kávová, siringová, p-kumarová, salicylová, ferulová, sinapová, o-kumarová, 3,4-dihydroxybenzaldehyd, vanilin) provedena extrakce na pevné fázi podle Matějíčka a kol. (2004). Následně byly všechny polyfenolické látky separovány pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí. U vzorků vín byl posuzován obsah polyfenolických látek a poměr mezi množstvím derivátů kyseliny benzoové a skořicové. Přičemž platí, že fenolické složení vín je ovlivňováno nejen odrůdou, ale i původem, agrotechnikou, vinařskou technologií, podmínkami skladování a dobou stárnutí. Dále byl porovnáván vliv stárnutí vína a jeho barvy na zastoupení polyfenolických látek. Na základě výsledků měření můžeme říci, že nejfrekventovanější složkou zkoumaných vzorků byla kyselina kávová. V případě Cabernetu Sauvignon množství dosahovalo hodnoty 5,257 mg/l. Za zmínku u tohoto vína stojí i vyrovnaný poměr kyseliny gallové a vanilové. Neméně bohatým vínem na polyfenolické látky bylo jakostní víno Neronet, a to zejména díky výraznému obsahu kyseliny gallové, vanilové, kávové a syringové. Flavonoidy, ve vínech velmi ceněné látky, tvořily ve vzorcích pouze minoritní podíly. Rutin, jenž byl identifikován v bobulích a listech révy vinné, se v testovaných nápojích nacházel pouze v rozmezí 0,488 až 2,231 μg/l. Vína Muškát moravský ročníku 2011 a Cabernet Sauvignon tímto glykosidem kvercetinu neoplývala. Srovnáním obsahů derivátů kyseliny skořicové a benzoové byly zjištěny téměř srovnatelné hodnoty, 32,563 mg/l a 28,398 mg/l. Tento poměr byl zachován i u odrůdového vína Cabernet Sauvignon. U ostatních vzorků se stejné schéma nepotvrdilo. 75

76 Dokonce byl u nich pozorován vyšší obsah derivátů kyseliny skořicové. Opačný trend vykazovalo pouze víno Neronet. Na odrůdovém víně Muškát moravský došlo k potvrzení, že stárnutí vína významně ovlivňuje koncentraci jeho obsažených složek. Všechny fenolické látky, s výjimkou kyseliny gallové, o-kumarové a rutinu, zaznamenaly během dvanácti měsíců významné navýšení svého obsahu. Pro posouzení procentuálního zastoupení fenolických látek ve vínech byly vzorky rozděleny podle původních odrůd do čtyř skupin. Třetí skupina tvořená Rulandským bílým, Rulandským modrým, Rulandským modrým rosé a Ryzlinkem rýnským byla z velké části tvořena kyselinou kávovou. Největší rozmanitost složení měla vína Cabernet Sauvignon, Muškát moravský ročníku 2011, Neronet a Svatovavřinecké. Resveratrol, který výrazně ovlivňuje senzorické vlastnosti vín, tvořil nejvyšší podíly u vinných vzorků Ryzlinku rýnského, Rulandského modrého a Svatovavřineckého. Dalším zkoumaným atributem byla u vzorků barva. Přestože je tato vlastnost spojována s obsahem antokyaninů, podílí se na ni i celá řada jiných fenolických sloučenin. Zkoumaná červená vína vykazovala vysoké zastoupení fenolických látek, obsahovala až 13,676 mg/l. Takto vysoký podíl je spojován s metodou zpracování hroznů a technologií výroby červených vín. Rulandské modré rosé mělo podle očekávání nižší obsah stanovovaných látek, jelikož bylo vyrobeno krátkým naležením modrých hroznů. Bílá vína měla pouze 2,384 mg/l fenolických látek. Obecně tak lze spojovat barevnost vín s obsahem jejich fenolických látek. 76

77 11 POUŽITÁ LITERATURA ALAÑÓN, M. E., a kol. A study of the antioxidant capacity of oak wood used in wine ageing and the correlation with polyphenol composition. LWT : Food Chemistry. 2011, 128, s ANDERSEN, Ø. M. MARKHAM, K. R. Flavonoids : chemistry, biochemistry, and applications. 1. vyd. USA: Taylor & Francis Group, s. ISBN ATANACKOVIĆ, A. a kol. Influence of winemaking techniques on the resveratrol content, total phenolic content and antioxidant potential of red wines. Food Chemistry. 2012, 131, s Dostupné z: WWW: < ATANASOVA, V. a kol. Effect of oxygenation on polyphenol changes occurring in the course of wine-makin. Analytica Chimica Acta. 2002, 458, s Dostupné z WWW: < BARKER, S. A. Matrix solid phase dispersion (MSPD). Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 2007, 70, 2, s Dostupný z WWW: < BELITZ, H. -- GROSCH, W. -- SCHIEBERLE, P. Food chemistry. 4. vyd. New York: Springer, s. ISBN BIELSKÁ, L. Metody analytické extrakce perzistentních organických polutantů z pevných matric. Brno, s. Bakalářská práce. Masarykova univerzita. BRUNETON J., Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants, Lavoisier, Paříž, BURIN, V. M., a kol. Colour, phenolic content and antioxidant activity of grape juice. Ciencia e Tecnologia de Alimentos. 2010, 30, 4, s Dostupný z WWW: < COUFAL, P. -- SUCHÁNKOVÁ, J. Kapilární elektroforesa biologicky aktivních látek. Biologické listy : Biochemická fyzikálně-chemické metody. 2000, 3-4, 65, s Dostupný z WWW: 77

78 < CVEJIĆ, J. a kol. Isoflavone composition in F1 soybean progenies. Food Research Internationa. 2001, 44, Dostupné z WWW: < DA COSTA, C. T. -- HORTON, D. -- MARGOLIS, S. S.. Analysis of anthocyanins in foods by liquid chromatography, liquid chromatography mass spectrometry and capillary electrophoresi. Journal of Chromatography A. 2000, 881, s Dostupné z WWW: < DAWIDOWICZ, A. L. -- RADO, E. Matrix solid-phase dispersion (MSPD) in chromatographic analysis of essential oils in herbs. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2010, 52, 1, s Dostupný z WWW: < DIXON R. A., Ferreira D., Phytochemistry. 2002, 60, s DOLEŽAL, P. Lexikon českého vinařství : historie a současnost pěstování vína v českých zemích. Nový Bydžov: Petr + Iva, s. ISBN DOLEŽAL, V. Víno a zdraví [online]. [cit ]. Dostupné z WWW: < DOLNÍK, V. -- LIU, S. -- JOVANOVICH, S. Capillary Electrophoresis on microchip. Electrophoresis , 21, s Dostupný z WWW: < DÖRR, H. -- RÖDER, K. -- JOHN, F. Co nevíte o víně : 133 odpovědí pro milovníky vín. 1. vyd. Praha: Ikar, s. ISBN DUDAŠ, F., a kol. Skladování a zpracování rostlinných výrobků. Praha, s. EDWARDS, M. Červené víno : Průvodce pro znalce. 1. vyd. Praha: Slovart, s. ISBN EVERAERTS, F. M. -- BECKERS, J. L. -- VERHEGGEN, Th. P. E. M. Isotachophoresis : Theory, Instrumentation and Application. Elsevier Scientific Publishihng Company : Journal of Chromatography Library volume vyd. Netherlands, 1976, s. Dostupný z WWW: < 78

79 FAN, E. G, a kol. Beneficial Effects of Resveratrol on Atherosclerosis. Journal of Medicinal Food. 2008, 11, s FEIJÓO, O., a kol. Content of trans- and cis- resveratrol in Galician white and red wines. Journal of Food Composition and Analysis. 2008, 21, s FELDKAMP, H. Domácí výroba vína : vlastní víno z hroznů, ovoce, bylinek a květů. Praha: Víkend, s. ISBN FERNANDES, A., a kol. Analysis of phenolic compounds in cork from Quercus suber L. by HPLC-DAD/ESI-MS. LWT : Food Chemistry. 2011, 125, s FERRER-GALLEGO, R., a kol. Determination of phenolic compounds of grape skins during ripening by NIR spectroscopy. LWT : Food Science and Technology. 2011, 44, s Firemní katalog společnosti Dionex, Accelerated Solvent Extraction. ASE Systems. USA: Dionex, Dostupný z WWW: < Firemní katalog společnosti Labicom s. r. o., SPE Catalog. Applied Separations, FORREST, T. Všechno, co potřebujete vědět o víně. 1. vyd. Praha: Ottovo nakladatelství, s. ISBN FRACASSETTI, D., a kol. Quantification of glutathione, catechin and caffeic acid in grape juice and wine by a novel ultra-performance liquid chromatography method. Food Chemistry [online]. 2011, 128, 4, s. Dostupný z WWW: < FRANKE, M. -- WINEK, Ch. L. -- KONGSTON, H. M. Extraction of selected drugs from serum using microwave irradiation. Forensic Science International. 1996, 81, 1, s Dostupný z WWW: < FREMONT L. Biological effects of resveratrol. Life Science. 2000, 66, s FUJITA, A. a kol. Anthocyanidin Reductase Gene Expression and Accumulation of Flavan-3-ols in Grape Berry. American Journal of Enology and Viticulture, 2005, 56, 4. s

80 GALGANO, F., a kol. Authentication of Italian red wines on the basis of the polyphenols and biogenic amines. Eur Food Res Technol. 2011, 232, s GAMBELLI, L. -- SANTARONI, G. P. Polyphenols content in some Italian red wines of different geographical origins. Journal of Food Composition and Analysis. 2004, 17, s Dostupné z WWW: < GANZLE, K. -- SALGÓ, A. -- VALKÓ, K. Microwave extraction : A novel sample preparation method for chromatography. Journal of Chromatography A. 1986, 331, s Dostupný z WWW: < GHANI, N. M., a kol. Accelerated Solvent Extraction Method with One-Step Clean-Up for Hydrocarbons in Soil. The Malaysian Journal of Analytical Sciences. 2007, 11, 1, s Dostupný z WWW: < GÓMEZ-MÍGUEZ, M. J. a kol. Effects of prefermentative skin contact conditions on colour and phenolic content of white wines.journal of Food Engineering. 2007, 78, Dostupné z WWW: < GRANATO, D. -- KATAYAMA, F. Ch. U. -- ALVES DE CASTRO, I. Phenolic composition of South American red wines classified according to their antioxidant activity, retail price and sensory quality. Food Chemistry. 2011, 129. Dostupné z: WWW: < HANDIQUE, J.G. -- BARUAH, J.B. Polyphenols compounds. Reactive and Functional Polymers, 2002, 52, s HAO, J., a kol. Microwave-assisted extraction of artemisinin from Artemisia annua L. Separation and Purification Technology. 2002, 28, 3, s Dostupný z WWW: < HERNANZ, D. a kol. Phenolic composition of white wines with a prefermentative maceration at experimental and industrial scale.journal of Food Engineering. 2007, 80, Dostupné z WWW: < HESS, D. Fyziologie rostlin. Academia, Praha

81 HLÚBIK, P., OPLTOVÁ, L. Vitaminy. Praha: Grada, s. ISBN HUBÁČEK, V. Výroba révového vína. 1. vyd. Praha: Institut výchovy a vzdělávání Ministerstva zemědělství ČR, s. Ekonomika. ISBN HUBÁČKOVÁ, M. Základy pěstování révy vinné. 1. vyd. V Praze: Institut výchovy a vzdělávání Ministerstva zemědělství ČR, s. ISBN CHEYNIER, V. Flavonoids in Wine. In Flavonoids: Chemistry, Biochemistry and Applications. Boca Raton: CRC Press, Kapitola 5, , ISBN: IVANOVA, V., a kol. Polyphenolic content of Vranec wines produced by different vinification conditions. Food Chemistry. 2011, 124, 1, s Dostupný z WWW: < JANČÁŘOVÁ, I. -- JANČÁŘ, L. Analytická chemie. 1. vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, s. ISBN JANDEKOVÁ, R. Fytoremediace metribuzinu z půdy. Brno, s. Diplomová práce. Masarykova univerzita. JEŽOVÁ, V., a kol. Informační zpravodaj : Úloha extrakčních a chromatografických technik v analýze explosiv a jejich reziduí [online]. Lázně Bohdaneč : Institut ochrany obyvatelstva v Lázních Bohdane, 2005 [cit ]. Dostupné z WWW: < JIANG, L. Y., a kol. Resveratrol and Its Oligomers from Wine Grapes Are Selective (1)O(2) Quenchers: Mechanistic Implication by High-Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry and Theoretical Calculation. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 2010, 58, s JONES, F. Víno : Každý den sklenku pro zdraví. 1. vyd. Praha: Knižní klub, s. ISBN

82 JUHASZ, B., a kol. Resveratrol: A Multifunctional Cytoprotective Molecule. Current Pharmaceuticals Biotechnology. 2010, 11, s Dostupný z WWW: < KLEJDUS, B. Separace a identifikace isoflavonů v rostlinném materiálu. Habilitační práce. Univerzita Palackého v Olomouci, s. KLOUDA, P. Moderní analytické metody. 2. vyd. Ostrava: Pavel Klouda, s. ISBN KOLB, B. -- ETTRE, L. S. Static Headspace-Gas Chromatography : Theory and Practise. 2. New Jersey : John Wiley and sons, Inc., s. Dostupné z WWW: < KOLOUCHOVÁ-HANZLÍKOVÁ, I. a kol. Rapid method for resveratrol determination by HPLC with electrochemical and UV detections in wine. Analytical, Nutritional and Clinical Methods. 2004, 87, s Dostupné z WWW: < KONG, Q. J., a kol. Identification of isomers of resveratrol dimer and their analogues from wine grapes by HPLC/MS and HPLC/DAD-UV. Food Chemistry. 2011, 127, s KRAUS, V. -- HUBÁČEK, V. -- ACKERMANN, P. Rukověť vinaře. 1. vyd. Praha: Květ, s. ISBN KRAUS, V. -- KUTTELVAŠER, Z. -- VURM, B. Encyklopedie českého a moravského vína. 1. vyd. Praha: Melantrich, s. ISBN KRAUS, V. a kol. Encyklopedie českého a moravského vína 2. díl. Praha: Mystica, s. ISBN KRAUS, V. a kol. Nová encyklopedie českého a moravského vína : 1. díl. 1. vyd. Praha: Praga Mystica, s. ISBN KUTTELVAŠER, Z. Abeceda vína. 1. vyd. Praha: Radix, s. ISBN KVASNIČKOVÁ, A. Stabilizace vína [online]. [cit ]. Dostupné na WWW: < 82

83 LI, Z., a kol. Comparison on phenolic compounds in Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon wines from five wine-growing regions in China. Food Chemistry. 2011, 125, 1, s Dostupný z WWW: < LIPPI, G., a kol. Moderate Red Wine Consumption and Cardiovascular Disease Risk: Beyond the "French Paradox. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 2010, 36, s Dostupný z WWW: < LIU, E. a kol. Advances of Modern Chromatographic and Electrophoretic Methods in Separation and Analysis of Flavonoids. Molecules, 2008, 13, 10, p LLORACH, R., a kol. Resveratrol From dietary intake to promising therapeutic molecule. Agro Food Industry Hi-Tech. 2010, 21, s LUQUE DE CASTRO, M. D. -- GARCÍA-AYUSO, L. E. Soxhletextraction of solid materials: an outdated technique with a promising innovative future. Analytica Chimica Acta. 1998, 369, 1-2, s Dostupný z WWW: < LUQUE DE CASTRO, M. D. -- PRIEGO-CAPOTE, F. Soxhlete xtraction: Past and present panacea. Journal of Chromatography A. 2010, 1217, 16, s Dostupný také z WWW: < LUŠTINEC, J. ŽÁRSKÝ, V. Úvod do fyziologie vyšších rostlin, 1. vyd., kap. 9 Karolinum, Univerzita Karlova v Praze, Praha MAKRIS, D. P. -- KALLITHRAKA, S. -- KEFALAS, P. Flavonols in grapes, grape products and wines: Burden, profile and influential parameters. Journal of Food Composition and Analysis. 2006, 19, s Dostupné z WWW: < MALÍK, F. Ze života vína. Pardubice: Filip Trend, s. ISBN MANACH C., a kol. How shoudl we assess the effects of exposure to dietary polyphenols in vitro? AM. J. Clin. Nutr., 2004, 80, s MATĚJÍČEK, D., a kol. Changes in contents of phenolic compounds during maturit of barrique red wines. LWT : Food Chemistry. 2005, 90, s

84 MEJSTŘÍK, J. -- HURNÍK, L. Hovory o víně. 1. vyd. Praha: Mladá fronta, s. ISBN MICHLOVSKÝ, M. LUKEŠ, V. ANDRESOVÁ, I. Slabikář vinařství. 1. vyd. Praha: Great Step, s. ISBN X. MIKEŠ, O. Sledování změn obsahu fenolikcýh kyselin v průběhu barikování vín. Vinařský obzor, 2004, 3, s MILDER, I. E. J., a kol. Intakes of 4 dietary lignans and cause-specific and all-cause mortality in the Zutphen Elderly Study. American Journal of Clinical Nutrition. 2006, 84, 2, s Dostupný z WWW: < MILDER, I. E. J., a kol. Lignan contents of Dutch plant foods: a database including lariciresinol, pinoresinol, secoisolariciresinol and matairesinol. American Journal of Clinical Nutrition. 2005, 93, 3, s Dostupný z WWW: < MINUSSI, R. C a kol. Phenolic compounds and total antioxidant potential of commercial wines. Food Chemistry. 2003, 82, s Dostupné z WWW: < MONAGAS, M., a kol. Effect of the modifier (Graciano vs. Cabernet sauvignon) on blends of Tempranillo wine during ageing in the bottle. II. Colour and overall appreciatio. LWT. 2007, 40, Dostupné z WWW: < MORAVCOVÁ, J. Biologicky aktivní přírodní látky. VŠCHT. Ústav chemie přírodních látek. Praha, 2006, s MOTTL, J. Nápoje : výroba, ošetřování, podávání. 2. vyd. Praha: Grada, s. Hotely a restaurace. ISBN MUDRA, J. -- RUŠAVÝ, Z. Alkohol a diabetes. VIA Practica. 2005, 1, s MULERO, J. -- PARDO, F. -- ZAFRILLA, P. Antioxidant activity and phenolic composition of organic and conventional grapes and wines. Journal of Food Composition and Analysis. 2010, 23, Dostupné z WWW: < 84

85 NETZEL, M. a kol. Effect of grape processing on selected antioxidant phenolics in red wine.journal of Food Engineering. 2003, 2-3, Dostupné z WWW: < NIKFARDJAM, M. S. P., a kol. Resveratrol-derivatives and antioxidative capacity in wines made from botrytized grapes. Food Chemistry. 2006, 96, s NURMI, T., a kol. Lignans in selected wines. Food Chemistry. 2003, 83, 2, s Dostupný z WWW: < Olomouc(CZ) : Labicom, Dostupný z WWW: < PAIXÃO, N. -- PERESTRELO, R. -- MARQUES, J. C. Relationship between antioxidant capacity and total phenolic content of red, rosé and white wine. Food Chemistry, 105, 2007, PAVLOUŠEK, P. Encyklopedie révy vinné. 1. vyd. Brno: Computer Press, s. ISBN PAVLOUŠEK, P. Pěstování révy vinné v zahradách. 1. vyd. Brno: CP Books, s. ISBN PAVLOUŠEK, P. Výroba vína u malovinařů. 1. vyd. Praha: Grada, s. ISBN PAZOUREK, J. Moderní elektroforetické analytické metody [online]. Brno : VFU, s. Přednášky pro magisterské studium. VFU. Dostupné z WWW: < >. PIATKOWSKA, E. -- KOPEC, A. -- LESZCZYNSKA, T. Anthocyanins - their profile, occurrence, and impact on human organism. Zywnosc. Nauka Technologia Jakosc. 2011, 18, 4, s Dostupný také z WWW: < POPL, M. -- FÄHNRICH, J. Analytická chemie životního prostředí. 4. přeprac. vyd. Praha: Vysoká škola chemicko-technologická, 1999, 218 s. ISBN

86 POUSTKA, J. Extrakce tekutinou v nadkritickém stavu : (Supercritical Fluid Extraction - SFE). In [online]. Praha : VŠCHT, 2007 [cit ]. Dostupné z WWW: < PROESTOS, Ch. -- KOMAITIS, M. Application of microwave-assisted extraction to the fast extractionof plant phenolic compounds. LWT - Food Science and Technology. 2008, 41, 4, s Dostupný z WWW: < RAMOS, L. -- KRISTENSON, E. M. -- BRINKMAN, U. A. T. Current use of pressurised liquid extraction and subcritical water extraction in environmental analysis. Journal of Chromatography A, 2002, 975, 1, p Dostupný z WWW: < RECAMALES, Á. F. a kol. The effect of time and storage conditions on the phenolic composition and colour of white wine. Food Research International. 2006, 39, s Dostupné z WWW: < RIBÉREAU-GAYON, P. a kol. Handbook of Enology. Volume 1: Microbiology of Wine and Vinifications. England: Chichester, s. ISBN RIDDELLOVÁ, K. Extrakce (LE, ASE, MASE) In Izolační a separační metody [online]. Praha : VŠCHT, 2007 [cit ]. Dostupné z WWW: < RIDDELLOVÁ, K. Extrakce (MSPD, QuEChERS) In Izolační a separační metody [online]. Praha : VŠCHT, 2007 [cit ]. Dostupné z WWW: < RIDDELLOVÁ, K. Extrakce (SPE DISKY). In Izolační a separační metody [online]. Praha : VŠCHT, 2011 [cit ]. Dostupné z WWW: < RICHTER, J. Léčení vínem Dobré víno náš nejlepší lék. Bratislava: Eko-konzult, s. ISBN RICHTER, M. -- LUDVÍKOVÁ, I. Malý obrazový atlas odrůd ovoce : Réva vyd. Lanškroun: TG tisk, s. ISBN

87 RODRIGUEZ-BERNALDO DE QUIRÓS, A. -- LAGE-YUSTY, M. A. -- LÓPEZ- HERNÁNDEZ, J. HPLC-analysis of polyphenolic compounds in Spanish white wines and determination of their antioxidant activity by radical scavenging assay. Food Research Internationa. 2009, 42, s Dostupné z WWW: < ROCHA, K. K. R., a kol. Resveratrol toxicity: Effects on risk factors for atherosclerosis and hepatic oxidative stress in standard and high-fat diets. Food and Chemical Toxicology. 2009, 47, s ROP, O., HRABĚ, J. Nealkoholické a alkoholické nápoje. Zlín: UTB, s. ISBN SALFELLNER, H. Víno a medicína. Praha: Vitalis, s. ISBN SAURA-CALIXTO, F. -- DÍAZ-RUBIO, M. E., Polyphenols associated with dietary fibre in wine. A wine Polyphenols gap? Food Research International, 40, 2007, Sborník přednášek společnosti Dionex, Accelerated Solvent Extraction. ASE Systems. USA: Dionex, Dostupný z WWW: < SEDLÁČEK, I. -- KOČÍ, L. Nápoje : příprava a podávání. 1. vyd. Brno: Computer Press, s. Hobby. ISBN SHAHIDI, F. -- NACZK, M. Phenolics in food and nutraceuticals. Boca Raton: CRC Press, 2004, ISBN SIQUEIRA, S., a kol. Biological activities of Solanum paludosum Moric. extracts obtained by maceration and supercritical fluid extraction. Journal of Supercritical Fluids. 2011, 58, 3, s Dostupný z WWW: < ISSN SLANINA, J. -- TÁBORSKÁ, E. Příjem, biologická dostupnost a metabolismus rostlinných polyfenolů u člověka. Chemické listy, 2004, 9, s

88 SNYDER, L. R. -- KIRKLAND, J. J. -- DOLAN, J. W. Introduction to Modern Liquid Chromatography. 3. New Jersey : John Wiley and sons, Inc., s. Dostupné z WWW: < SOBOTNÍKOVÁ, J. Natur.cuni [online] [cit ]. Instrumentální metody analytické chemie. Dostupné z WWW: < SOLEAS, G. J., DIAMANDIS, E.P., GOLDBURG, D.M. Wine as a Biological Fluid: History, Production, and Role in Disease Prevention. Journal of Clinical Laboratory Analysis, 1997, 11, s SPENCE, G. Bílé víno : Průvodce prp znalce. 1. vyd. Praha: Slovart, s. ISBN STANĚK, J. Víno není vinno : kapitoly z dějin vína. 1. vyd. Praha: Pasek, s. ISBN STEIDL, R. -- LEINDL, G. Cesta ke špičkovému vínu. 1. vyd. Valtice: Národní salon vín, s. ISBN STEIDL, R. -- RENNER, W. Moderní příprava červeného vína. 1. vyd. Valtice: Národní salon vín, s. ISBN STEIDL, R. -- RENNER, W. Problémy kvašení vín. 1. vyd. Valtice: Národní salon vín, s. ISBN STEIDL, R., a kol. Sklepní hospodářství. 1. vyd. Valtice: Národní salon vín, s. ISBN Superkritické kapaliny [online] [cit ]. Dostupný z WWW: < ŠAMÁNEK, M. -- URBANOVÁ, Z. Víno na zdraví. 1. vyd. Praha: Agentura Lucie, s. ISBN ŠMIDRKAL, J., a kol. Resveratrol. Chemické Listy. 2011, 95, s

89 ŠTULÍK, K., a kol. Vysokoúčinné analytické separace [online]. Praha : VŠCHT, 2006 [cit ]. Dostupné z WWW: < ŠULC, M., LACHMAN, J., PIVEC V. Obsah antokyanů v hroznech českého vinařského regionu [online]. [cit ]. Dostupné z WWW: < ublikace.info>. ŠVEJCAR, V. Vinařství : Základy technologie : Určeno pro posl. zahradnické fak. 1. vyd. Brno: Vysoká škola zemědělská, s. TORCHIO, F. a kol. Changes in chromatic characteristics and phenolic composition during winemaking and shelf-life of two types of red sweet sparkling wines. Food Research International. 2011, 44, Dostupné z WWW: < UBEDA, C., a kol. Evaluation of antioxidant activity and total phenols index in persimmon vinegars produced by different processes. LWT : Food Science and Technology. 2011, 44, s UHROVÁ, H. Děláme si sami víno: rybízové, jahodové, šípkové, trnkové, révové a jiná ovocná vína, šťávy a mošty. 1. vyd. Vimperk: Víkend, s. ISBN TRIOLI, G. -- HOFMANN, U. Kodex dobrého ekologického vinohradnictví : Orwine. Brno: Svaz ekologické a integrované produkce vína Ekovín, s. TRNA, J. -- TÁBORSKÁ, E. Přírodní polyfenolické antioxidanty [online].[cit ]. Dostupné z WWW: < VACEK, J., a kol. Moderní instrumentální metody studia isoflavonů. Čes. slov. Farm. 2008, 57, s Dostupný z WWW: < 57.2_s pdf?id=355187#page=33>. VELÍŠEK, J. -- HAJŠLOVÁ, J. Chemie potravin vyd. Tábor: OSSIS, s. ISBN

90 VELÍŠEK, J. -- HAJŠLOVÁ, J. Chemie potravin vyd. Tábor: OSSIS, s. ISBN VELÍŠEK, J. Chemie potravin 2. Tábor: Ossis, s. ISBN VELÍŠEK, J. Chemie potravin vyd. Tábor: Ossis, 2002, 368 s. ISBN X. VERMERRIS, W. -- NICHOLSON, R. Phenolic Compound Biochemistry. 1. vyd. Springer, s. ISBN WANG H. Z., a kol. Nutrition Biochemistry. 2002, 13, s WU, X., a kol. Aptamer-targeted magnetic nanospheres as a solid-phase extraction sorbent for determination of ochratoxin A in food samples. Journal of Chromatography A. 2011, 1218, 41, s Dostupný z WWW: < XU, L. L., a kol. Recent advances on supercritical fluid extraction of essential oils. Chemie Ingenieur Technik. 2011, 5, 9, s Dostupný z WWW: < ZLOCH, Z. Krátká historie bioflavonoidů [online].[cit ]. Dostupné z WWW: < ZOECKLEIN, B. W. -- FUGELSANG, K. C. Wine analysis and production. New York: Aspen Publisher, 1999, ISBN:

91 12 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1 Významné fenolové kyseliny a jejich deriváty Obr. 2 Zástupci flavonoidů Obr. 3 Kvercetin Obr. 4 Katechin Obr. 5 Proantokyanidin A Obr. 6 Obecný vzorek antokyanidinů Obr. 7 Genistein Obr. 8 Aglykony lignanů Obr. 9 Trans-stilben a cis-stilben Obr. 10 Trans-resveratrol a cis-resveratrol

92 13 SEZNAM GRAFŮ Graf 1 Stanovení obsahu derivátů kyseliny benzoové a skořicové ve vzorcích vín v mg/l Graf 2 Porovnání obsahu polyfenolických látek ve dvou ročnících Muškátu moravského v μg/l Graf 3 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Neronet Graf 4 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Svatovavřinecké Graf 5 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Cabernet Sauvignon Graf 6 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Sauvignon Graf 7 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Rulandské bílé Graf 8 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Ryzlink rýnský Graf 9 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Rulandské modré rosé Graf 10 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Rulandské modré Graf 11 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Muškát moravský ročník Garf 12 Zobrazení procentuálního zastoupení vybraných polyfenolických látek v odrůdovém víně Muškát moravský ročník Graf 13 Srovnání průměrného obsahu polyfenolických látek u bílých, růžových a červených vín

93 14 SEZNAM TABULEK Tab. 1 Obsah nejdůležitějších látek ve víně (v g/l) (Pavloušek, 2005) Tab. 2 Obsah sacharidů ve vínech (Velíšek a Hajšlová, 2009) Tab. 3 Průměrný obsah minerálních látek v hroznech vinné révy v mg/100 g čerstvé hmoty Tab. 4 Přehled retenčních časů, přechodů, fragmentací a kolizních energií stanovovaných látek Tab. 5 Parametry pro kvantitativní RRLC-MS/MS analýzu (n=6) v MRM modu Tab. 6 Průměrné hodnoty stanovovaných polyfenolických látek ve vzorcích vín v mg/l Tab. 7 Obsah vybraných polyfenolů v odrůdě Cabernet Sauvignon vypěstované v různých oblastech v mg/l

94 15 SEZNAM ZKRATEK ASE CEC CGE CIEF CITP CS CZE DMC DNA ESI GC GLC GSC GRP HILIC HPLC ITP LC LOD LOQ MAE extrakce urychleným tokem rozpouštědla (Accelerated Solvent Extraction) kapilární elektrochromatografie (Capillary Electrochromatography) kapilární gelová (Capillary Gel Electroph oresis) kapilární izoelektrická fokusace (Capillary Isoelectric Focusing) kapilární izotachoforéza (Capillary Isotachophoresis) Cabernet Sauvignon kapilární z nová elektroforéza (Capillary Zone Electrophoresis) dimetylkarbonát (Dimethyl Carbonate) deoxyribonukleová kyselina (Deoxyribonucleic Acid) ionizace elektrosprejem (Electrospray Ionization) plynová chromatografie (Gas Chromatography) rozdělovací chromatografie (Gas-Liquid Chromatography) absorpční chromatografie (Gas-Solid Chromatography) redukční produkt hroznů (Grapes Reduction Product) hydrofobní interakční kapalinová chromatografie (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High-Performance Liquid Chromatography) izotachoforéza (Isotachophoresis) kapalinová chromatografie (Liquid Chromatography) limit detekce (Limit of Detection) limit kvantifikace (Limit of Quatification) mikrovlnná extrakce (Microwave Assisted Extraction) MECC micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography) MM Muškát moravský MM11 Muškát moravský ročník

95 MRM přechod prekurzorového na produktový iont (Multiple Reaction Monitoring) MS MSPD N n.d. hmotnostní detektor (Mass Spectrometry Detector) extrakce disperzní tuhou fází (Matrix Phase Dispersion) Neronet nebylo detekováno (Not Detected) p. a. pro analýzu P c PCR PLE R 2 RB RM rosé RM RP-HPLC RR kritický tlak (Critical Pressure) polymerázová řetězová reakce (Polymerase Chain Reaction) extrakce tlakem kapaliny (Pressurized Liquid Extraction) koeficient determinace Rulandské bílé Rulandské modré rosé Rulandské modré vysokoúčinná kapalinová chromatografie na obrácené fázi (Reversed Phase High-Performance Liquid Chromatography) Ryzlink rýnský RRLC urychlená kapalinová chromtografie (Rapid Resolution Liqiud Chromatography) RSD SFE SPE SVG T c TIC VAV relativní směrodatná odchylka (Relative Standard Deviatin) superkritická fluidní extrakce (Supercritical Fluid Extraction) extrakce na pevné fázi (Solid Phase Extraction) Sauvignon kritická teplota (Critical Temperature) chromatogram celkového toku iontů (Total Ion Chromatogram) Svatovavřinecké 95

96 PŘÍLOHY

97 Příloha 1 MRM chromatogramy standardů separovaných látek ESI TIC MRM (** **) 1 ) 2 ) 3 ) 4 ) 5 ) 6 ) 7 ) 8 ) 9 ) ESI MRM ( ) 1 ) ESI MRM ( ) 2 ) ESI MRM ( ) 3 ) ESI MRM ( ) 4 ) ESI MRM ( ) 5 ) ESI MRM ( ) 6 ) ESI MRM ( ) 7 ) ESI MRM ( ) 8 ) Counts (%) vs. Acquisition Time (min) 97

98 ESI MRM ( ) 9 ) ESI MRM ( ) 10 ESI MRM ( ) 11 ESI MRM ( ) 12 ESI MRM ( ) 13 ESI MRM ( ) 14 ESI MRM ( ) 15 Counts (%) vs. Acquisition Time (min) Obr. 1 MRM chromatogramy standardů fenolových kyselin. Identifikace píku: 1. kyselina gallová, 2. kyselina protokatechvá, 3. 3,4-dihydroxybenzaldehyd, 4. p- hydroxybenzoová, 5. kyselina chlorogenová, 6. p-hydroxybenzaldehyd, 7. kyselina vanilová, 8. kyselina kávová, 9. kyselina syringová, 10. vanilin, 11. kyselina p-kumarová, 12. kyselina salicylová, 13. kyselina ferulová 14. kyselina sinapová, 15. kyselina o-kumarová. 98

99 ESI MRM ( ) 1 Counts (%) vs. Acquisition Time (min) ESI MRM ( ) 2 Counts (%) vs. Acquisition Time (min) 99

100 ESI MRM ( ) 3 Counts (%) vs. Acquisition Time (min) ESI MRM ( ) 4 Obr. 2 MRM chromatogramy standardů flavonoidů a resveratrolu. Identifikace píku: 1. hyperosid, 2. rutin, 3. apigenin, 4. resveratrol. Counts (%) vs. Acquisition Time (min) 100